CN1583779A - 对大肠杆菌o86型的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O86型(Escherichiacoli O86)的O－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长14156个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O86型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O86型的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定大肠杆菌O86型的方法。

Description

对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O86型(Escherichia coli O86)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O86型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O86型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.  MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.and Reeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichiacoli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards andEwing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The  Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)：681-684]。

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf2、orf9、orf11、orf12基因。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因(表1)；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-25nt；它们对大肠杆菌O86型的O-抗原是高度特异的；而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O86型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或作为探针用于杂交反应，或用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O86型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O86型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于：其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长14156个碱基；或者所述具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ IDNO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸，其中包括命名为gne，orf2，gmd，fcl，gmm，manC，manB，wzx，orf9，wzy，orf11，orf12的12个基因组成，都位于JUMPStart序列和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述基因中具有高度特异性的基因是：转运酶基因，其包括wzx基因；聚合酶基因，其包括wzy基因；糖基转移酶基因，其包括orf2、orf9、orf11、orf12基因；其中所述的基因：wzx是SEQIDNO：1中的8601至9803碱基的核苷酸；wzy是SEQID NO：1中的10491至11831碱基的核苷酸；orf2是SEQ ID NO：1中的2113至3129碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1中的9806至10510碱基的核苷酸；orf11是SEQIDNO：1中的11843至12586碱基的核苷酸；orf12是SEQIDNO：1中的12598至13506碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸，其中还包括源于所述的wzx基因、wzy基因以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其中源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的8987至9008碱基的核苷酸和9399至9419碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9108至9130碱基的核苷酸和9532至9556碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ IDNO：1中的11055至11075碱基的核苷酸和11766至11786碱基的核苷酸；SEQID NO：1中的10674至10692碱基的核苷酸和11319至11339碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。

前述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O86型的O-抗原，及制备细菌疫苗中的应用。

前述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌。

前述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O86型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O86型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O86型的基因组为模板通过LongPCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该longPCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：将LongPCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物：在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O86型的O-抗原的高度特异性；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O86，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O86的灵敏度。

前述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O86型，离心收集细胞。用500μl 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10μl 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10μl 10mg/mL的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3μl 20mg/mL的蛋白酶K、15μl 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3μl 10mg/mL的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30μl TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O86型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O86型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JUMPStart序列设计上游引物(#w1-1098-ATTGGT AGC TGT AAG CCA AGG GCG GTA GCG T)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGTTCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，

退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCRPreps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9μl 0.1MMnCl₂，1μl 1∶2000稀释的1mg/mL的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2μl 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18μl水中，随后在此混合物中加入2.5μl dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25μl 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80μl，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90μl。其中有9μl的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30μl水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3μl连接产物与50μl感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1mL的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O86型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O86型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的Orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用Blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国Sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对痢大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O86组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O86型的O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O86的冻存菌液接种到有20mL LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200mL LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3mL菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μlMQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的444至459碱基的核苷酸和936至951碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的285至304碱基的核苷酸和1079至1094碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的3898至3913碱基的核苷酸和4205至4220碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的3807至3823碱基的核苷酸和4258至4273碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，0个和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O86的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长14156个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它包括命名为gne，orf2，gmd，fcl，gmm，manC，manB，wzx，orf9，wzy，orf11，orf12的12个基因组成，都位于JUMPStart序列和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因(orf2、orf3、orf6、orf11基因)。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O86型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因和wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸(表1)，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O86型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O86型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的8601至9803碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的10491至11831碱基的核苷酸)；源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O86型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O86型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如Southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O86型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O86型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如Southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O86型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O86型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，l989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O86型，离心收集细胞。用500μl50mM Tris-HCl(pH8.0)和10μl 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10μl 10mg/mL的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3μl 20mg/mL的蛋白酶K、15μl 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3μl 10mg/mL的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30μl TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O86型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O86型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JUMPStart序列设计上游引物(#w1-1098-ATT GGT AGC TGT AAG CCA AGG GCG GTA GCG T)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNGCCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand LongTemplate PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒， 退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9μl 0.1M MnCl₂，1μl1∶2000稀释的1mg/mL的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2μl 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18μl水中。随后在此混合物中加入2.5μl dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25μl100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80μl，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90μl。其中有9μl的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30μl水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5mL的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2mL培养物转接到200mL的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200mL吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100mL吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1mL冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50μl一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3μl连接产物与50μl感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1mL的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Stadenpackage软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O86型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O86型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的Orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用Blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国Sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。通过检索和比较，发现orf1编码的蛋白与Yersinia enterocolitica(type 0:8)中的gne基因编码的蛋白有57％的一致性和72％的相似性，大肠杆菌O86的O-抗原的结构是已知的，从结构来看，确实需要有与gne功能类似的基因的存在，因此，我们命名orf1为gne。

orf3、4、5、6、7编码的蛋白与Escherichia coliO-抗原基因簇中gmd、fcl、gmm、manC、manB基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性(85-99％)。这五个基因被鉴定过是用来合成海藻糖，而在Escherichia coli O86的O-抗原结构中确实存在海藻糖这个糖，我们命名orf3、4、5、6、7为gmd、fcl、gmm、manC、manB。

Orf8和orf10是大肠杆菌O86种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。Orf8编码的蛋白与Staphylococcus aureus的O-抗原转移酶有23％的序列一致性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf8为wzx。Orf10编码的蛋白与Shigella boydii的O-抗原聚合酶有21％的一致性，42％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有9个跨膜片段，并且有一个大的(61个氨基酸)胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf10为wzy。Orf2，9，11，12四个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有24-47％的序列一致性和44-68％的序列相似性。因此我们推测这四个基因编码糖基转移酶。由于这四个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这四个基因暂命名为orf2，orf9，orf11和orf12。

实施例6：特异基因的筛选。

针对大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O86组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O86型的O-抗原都是高度特异的；这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

实施例7：引物灵敏度的检测。

购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O86的冻存菌液接种到有20mL LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200mLLB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3mL菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的8987至9008碱基的核苷酸和9399至9419碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9108至9130碱基的核苷酸和9532至9556碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的11055至11075碱基的核苷酸和11766至11786碱基的核苷酸；SEQ IDNO：1中的10674至10692碱基的核苷酸和11319至11339碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，55℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，0个和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O86的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

通过对O-抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O-抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O-抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O-抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明大肠杆菌O86的O-抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

根据本发明的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ IDNO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O-抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表1列出了大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中转运酶基因和聚合酶基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共12组，它们的来源都列于表中。

在第5组中含有大肠杆菌O86型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25μl。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10μlPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第5组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O86型及其O-抗原是高度特异的。而这些基因内的任何一段10-25nt的寡核苷酸对大肠杆菌O86型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O86型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O86型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的结构，共由12个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是JUMPStart序列和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)

           SEQUENCE LISTING

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>14156

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc atgcgtccaa gaacgcggtc    60

gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctcttc ttgaacaacg tgtgaagcgt    120

caactgttgg cggaagtaca gtcgatctgc ccgccgggcg taaccattat gaacgtgcgt    180

cagggcgaac ctttaggttt gggccactcc attttatgtg cacgacccgc cattggtgac    240

aacccatttg tcgtggtact gccagacgtt gtgatcgacg acgccagcgc tgacccgctg    300

cgttacaacc ttgctgccat gattgcgcgc ttcaacgaaa cgggccgtac ccaggtgctg    360

gcaaaacgta tgccgggcga cctctcggaa tactccgtta ttcagaccaa agagccgctg    420

gatcgcgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaattcatcg aaaagccgga tcagccgcag    480

acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg    540

gaacttgaac gcactcagcc tggtgcatgg gggcgtattc aactgactga tgccattgct    600

gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgcc atgctgatga caggtgacag ctacgactgc    660

ggtaaaaaaa tggggtatat gcaggcattt gtgaagtatg gactacgcaa cctcaaagaa    720

ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataaaaatt aatcatccat    780

atatggtgga ttgaataaaa atagaacggc agtgaacatt caaaagcaga gatgcttaca    840

ttataagaat gttcctgtct tttatttaaa gtatttaata acaataagtt accgcaagta    900

tcgctcgggc atagattttc cttgtatcta acttcgtttg gttagacaat tggaaaatag    960

tgaaaagtat taaatgctta gtacctatga ttcattttca gtgagttggt aactgttaag    1020

ccaagggcgg tagcgtgtgt ttttctctca atcctcatgg taaaggaggt ttatatggtg    1080

attttcgtaa caggcggtgc aggatatatt ggatcccata ccatacttga gttacttaat    1140

aatggtcatg atgtcgtttc gatagataat tttgtcaatt cctctataga atcattaaaa    1200

agagtagagc aaataactaa taagaaaatt atttcttatc aaggtgatat ccgtgataaa    1260

aatctacttg atgagatttt ttcaagacac catatcgatg ctgtaattca ctttgcatcg    1320

ttaaaatctg taggtgagtc taagttaaag cccttagagt attattctaa taatgttggt    1380

ggaactttag tattacttga atgcatgaag agatataaca ttaataaaat gatatttagc    1440

tcttctgcta ctgtttatgg gagtaacagt atccctcccc atacggaaga tagacgaatt    1500

ggtgaaacta caaacccata tgggacatcg aaatttataa tagaaataat tttgagtgat    1560

tattgtgata gtgataataa taaatcagta attgcactgc gttactttaa tccaatcgga    1620

gcacataagt ccgggatgat tggtgaaaat cctaacggga tccctaataa tctggttcct    1680

tatatatcta aagttgcaca aaatcaactt cctgtattaa atatttatgg caacgattat    1740

ccaactaaag atggtacagg agtaagagac tatatacatg tctgtgattt ggctaaaggg    1800

catgttaaag cattagaata tatgttttta aatgatgtca attatgaagc ttttaattta    1860

ggtactggtc aaggttattc tgttttagag attgtaaaaa tgtttgagat agtcactaaa    1920

aagagtatac ctgttgctat ttgtaataga cgtgaggggg atgttgcgga gtcatgggcg    1980

tctgctgatt tggcacataa aaagctttcc tggaaagcgg aaaaaaattt gaaagaaatg    2040

atcgaagatg tatggcgttg gcaaacaaac aatccaaatg gatataaaaa ataatttttg    2100

gaattttgat atatgaaaaa tgttggtttt attgttacaa aatcagaaat tggtggtgca    2160

caaacatggg taaatgaaat atctaacctt attaaagagg aatgtaatat atttcttatt    2220

acatctgaag aaggatggct cacacataaa gatgtctttg ccggagtttt tgtcatacca    2280

ggtattaaaa aatattttga cttccttaca ttgtttaaat tgagaaaaat tttaaaagaa    2340

aataacattt caacgttaat agcaagttct gctaatgccg gagtttatgc caggttagtt    2400

cgattactag tcgactttaa atgtatttat gtttcgcatg gatggtcttg tttatataat    2460

ggtggtcgcc taaaatcaat tttttgcatt gttgaaaaat acctttcttt attaactgat    2520

gttatatggt gtgtttccaa aagtgatgaa aaaaaggcaa ttgagaatat tggtataaaa    2580

gaaccaaaga taatcacagt atcgaattca gtgcctcaga tgccgagatg taataataaa    2640

caactccagt ataaggttct gtttgttggt aggttaacac accctaagcg ccccgaattg    2700

ttagcgaatg taatatcgaa aaagccccag tatagcctcc atatcgtagg agggggggaa    2760

aggttagaat cattgaagaa acaattcagt gaatgtgaaa atattcattt tttgggtgag    2820

gtcaataatt tttataacta tcatgagtat gatttatttt cactgatatc cgatagtgaa    2880

ggtttgccta tgtcaggcct tgaggctcac acagctgcaa taccactcct gttaagtgat    2940

gtgggcggat gttttgaatt aattgagggt aatgggttac ttgtggaaaa tactgaagac    3000

gacattggat ataaattgga taaaatattc gatgactatg aaaattatcg ggaacaggca    3060

attcgtgcct ccgggaaatt tgttatcgag aactatgctt cagcatataa aagcattatt    3120

ttaggttgag tatttttaag aacaggaaat gtaaaatggc taaagtcgct ctcattactg    3180

gcataaccgg acaagacggt tcttacctgg cagagtttct gctggaaaaa ggttacgagg    3240

tgcatggtat caagcgtcgt gcatcgtcat tcaacaccga gcgcgtggat catatctatc    3300

aggatccgca cacctgcaac ccgaaattcc atctgcatta tggcgatctg acagatacct    3360

ccaacctgac gcgcattttg tgtgaagtgc agccggatga agtgtacaac ctgggcgcaa    3420

tgagtcacgt tgcggtttct tttgagtcac cggaatatac cgctgacgtc gatgcgatgg    3480

gtacgctgcg cctgctggag gcgatccgct tcctcggtct ggaaaagaaa acccgttttt    3540

atcaggcttc cacttctgaa ctgtatggtc tggtgcagga aattccccag aaagagacca    3600

caccgttcta cccgcgatct ccgtatgcag tcgccaaact gtacgcctac tggatcaccg    3660

ttaactaccg cgaatcctac ggcatgtacg cctgcaacgg tattctcttt aaccatgaat    3720

ccccgcgccg cggcgaaact ttcgttaccc gcaaaatcac ccgcgcaatc gccaacatcg    3780

cccaggggct ggaatcgtgc ctgtacctcg gcaatatgga ttccctgcgt gactggggcc    3840

atgccaaaga ctacgtaaaa atgcagtgga tgatgctgca acaggaacag ccggaagatt    3900

tcgtcattgc taccggcgtt cagtactccg tgcgtcagtt cgtggaaatg gcggcggagc    3960

gagtcggtat caaactgcgt tttgaaggca caggtgtaga tgagaagggg atagtggttt    4020

ctgttaatgg tgaggatgct ccagcagtta aacctggaga tgtaatcgtt aaggttgatc    4080

cgcgttactt ccgtccggct gaagttgaaa cgctgctcgg tgacccgacc aaagcgcacg    4140

aaaaactggg ctggaaacca gaaatcaccc tcagagagat ggtgtctgaa atggtggcta    4200

atgacctcga agcggcgaaa aaacactctc tgctgaaatc tcacggctac gacgtggcga    4260

tcgcgctgga gtcataagca tgagtaaaca acgcattttt atcgctggcc atcgcgggat    4320

ggtcggttct gccatcaggc ggcagctcga acagcgcggt gatgtggaac tggtattacg    4380

cacccgcgac gagctgaacc tgctggacag ccgcgccgtg catgatttct ttgccagcga    4440

acgtattgac caggtctatc tggcggcggc gaaagtgggc ggcattgttg ccaacaacac    4500

gtatccggcg gatttcatct atcagaacat gatgattgag agcaacatca ttcacgccgc    4560

gcatcagaac gacgtgaaca aactgctgtt tctcggatcg tcctgtatct acccgaaact    4620

ggcaaaacag ccaatggcag aaagtgagtt attgcagggc acgctggagc cgaccaacga    4680

accttatgcc attgccaaaa tcgccgggat caaactgtgc gaatcttaca accgtcagta    4740

cggacgcgat taccgctcgg tcatgccgac caacctgtac gggccgcacg acaacttcca    4800

tccgagtaac tcgcatgtga tcccagcatt gctgcgtcgc ttccacgagg cgacggcaca    4860

gaatgcgccg gacgtggtgg tgtggggcag cggtacgccg atgcgtgaat ttctgcacgt    4920

cgatgatatg gcggcggcga gcattcatgt gatggagctg gcgcacgaag tctggctgga    4980

gaacacccag ccgatgttgt cgcacattaa cgtcggcacg ggcgttgact gcactatccg    5040

cgagctggcg caaaccatcg ccaaagtggt gggttacaaa ggtcgggtgg tttttgatgc    5100

cagcaaaccg gatggcacac cgcgcaaact gctggatgtg acgcgcctgc atcagcttgg    5160

ctggtatcac gaaatctcac tggaagcggg gcttgccagc acttaccagt ggttccttga    5220

gaatcaagac cgctttcggg ggtaatgatg tttttacgtc aggaagactt tgccacggta    5280

gtgcgctcca ctccgcttgt ctctctcgac tttattgttg agaacagtcg cggcgagttt    5340

ctgcttggca aaagaaccaa ccgcccggcg cagggttact ggtttgtgcc gggagggcgc    5400

gtgcagaaag acgaaacgct ggaagccgca tttgagcggc tgacgatggc ggaactgggt    5460

ctgcgtctac cgataacagc aggccagttt tacggtgtct ggcagcactt ttatgacgat    5520

aacttctccg gcacggattt caccacgcac tatgtggtgc tcggttttcg cttcagagtc    5580

gcggaagaag agctgttact gccggatgag cagcatgtcg attaccgctg gctgacgccg    5640

gacgcgctgc tcgccagtaa caatgttcac gctaacagcc gagcttattt taatcatgat    5700

ccaagtgctg tttttggttt agataaaaag gatgtcaaaa atgtctgatg taccgttgat    5760

tgctgttgta atggctggtg gtacgggtag ccgtctttgg cccctctcaa gagagcacta    5820

tccgaagcaa tttctgcaat tatcaggtga gaatacttta ttacagtcaa ctttattacg    5880

actatccccg ctttcttgcg aaactccatt agtaataact aacgagcagc atcgttttgt    5940

ggtcgcagaa caattgcgtc aaataaacca attaagcgat aacattattc ttgaaccatg    6000

tggaagaaat actgcaccag ctatagcact ttcagcattt acagccttaa agcgtaatga    6060

acaacaagat cctatacttt tagttcttgc agctgaccat gttataaaca aaacagatgt    6120

tttttgtaat gctattaaaa attccatttc aattgttgaa caaggaaata ttttaacatt    6180

tggtattatt cctgattatg cagaaaccgg ttacggttat atagaaaaag ggagtatagt    6240

taaagaatca caacgtggag ttggtaatac attctatcac gtggaacaat ttgttgaaaa    6300

acctaatcgc tcaagggctg aagagtatat ctcctcaggt aaatatctct ggaatagtgg    6360

gatgtttatg ttcaaagcat cagtatattt agaggagtta aaaaaataca gacctgatat    6420

atacgatata tgtgaaaaaa caatttcttc gtcctaccat gatcttgatt ttatacgact    6480

ttcgaaagat gtttttcaaa attgtccatc ggaatcaatt gattttgcag taatggaaaa    6540

aacaaagcgt tgtatagtct atcccgttga tattggttgg aacgatgttg gatcttggca    6600

atcattgtgg gacgttagtg ataaaacccc tacaggggac gtttgcaaag gtgatatcct    6660

gacctataat acaaaaaata attatattca ttcggagtca gccttagtag ccgctgtagg    6720

tgtggaagat attgttattg ttcagacgaa agatgcaatt ctagtttcaa aaaaatccga    6780

agttcaggat gttaagaaaa ttgttcaaat gcttaaaatg caagaacgtt ctgaatatct    6840

atcacatcgc gaggagtttc ggccttgggg aaagtttgat gctatagaac agggagatcg    6900

atataaggtc aaaaagattg tcgttaaacc aggggaaggg ctatccttac gtatgcatca    6960

tcatcgttca gagcattgga ttgtcctttc aggtacagca aaagtaacgt taaataacaa    7020

aactttctta gttactgcta atgaatccgt ttatattcct ctgggtgcta cttatagcct    7080

tgaaaatcca ggtataattc ctctcaatct tattgaagtt agttcaggag attatttagg    7140

tgaggatgat attgttcgtc aaaaagaacg ttacaaaata gatgactaat aaatgaaaaa    7200

attaacctgc tttaaagcct acgatattcg cgggaaatta ggcgaagaat tgaatgaaga    7260

tattgcctgg cgcattggtc gcgcttatgg cgaatttctc aaaccgaaaa ccattgtgtt    7320

aggcggtgat gtccgcctca ccagcgaaac cttaaaactg gcgctggcga aaggtttaca    7380

ggatgcgggc gtcgatgtgc tggatattgg tatgtccggc accgaagaga tctatttcgc    7440

cacgttccat ctcggcgtgg atggcggcat tgaagttacc gccagccata atccgatgga    7500

ttacaacggc atgaagctgg tgcgcgaagg ggctcgcccg atcagcggcg ataccggact    7560

gcgcgatgtc cagcgcctgg cagaagccaa cgactttcct cccgttgatg aaaccaaacg    7620

cggtcgctat cagcaaatca acctgcgtga tgcatacgtt gatcacctgt tcggttatat    7680

caacgtcaaa aacctcacgc cgctcaagct ggtgatcaac tccgggaacg gcgcagcggg    7740

tccggtagtt gacgccatcg aagcccgctt taaagccctc ggcgcacccg tggaattgat    7800

caaagtgcac aacacgccgg acggaaattt ccccaacggt attcctaacc cgctgctgcc    7860

ggaatgccgc gacgacaccc gcaatgcggt catcaaacat ggcgcggata tgggcattgc    7920

ttttgatggc gattttgacc gctgtttcct gtttgacgaa aaagggcagt ttatcgaggg    7980

ctactacatt gtcggcctgc tggcagaagc gttcctcgaa aaaaatcccg gcgcgaagat    8040

catccacgat ccgcgtctaa tttggaacac cgttgatgtg gtgagtgccg caggtggcac    8100

cccggtaatg tcgaaaaccg gacacgcctt tattaaagaa cgtatgcgca aggaagacgc    8160

catctacggt ggcgaaatga gcgcccacca ttacttccgt gatttcgctt actgcgacag    8220

cggcatgatc ccgtggctgc tggtagccga actggtgtgt ctgaaaggaa aaacgctggg    8280

cgaacttgtg cgtgaccgga tggcagcttt tccagcaagt ggggaaatta atagcacgtt    8340

ggaagatcca ttatgtgcta tcgcacgggt tgaaagttat tatgcaaata aggcaattga    8400

gatcgatcgt acagatggta taagtatgac ttttaatgga tggcgcttta acttacgttc    8460

ttctaatacg gaacccgtag tccggttaaa cgttgaatct agaggagatg tggccgcaac    8520

taaaaaatat acaggcttca tattagactt attaaattat aaaaagtcaa tatcatctta    8580

acaagtaaat gtgagttatt atgataaagt tgctttttag ttcatcttta ttaaagatgg    8640

gtgttgtttt attaaatttg cttattcctg caataataat acgattctat tcagagtatg    8700

attttggaat ttattcttat ttactaacat acgcaatcgt tatttctgtt ttacaaaacg    8760

gcatcactgc aagcttccgt aatctgatat caaatttaga aaaaaatgat ttgcttgatt    8820

atttattata ttcagtgagg aaaataacgt atccattctt attaataata ttttgtttat    8880

tattggctac gctttatgta gttgggtttg atacgttata tggtaaaata tgttttttta    8940

ttgctgtatc gttaataaat atatattatc cagtggttgc ttcatattat gatgctacag    9000

gtaaaacgct caattttgta ctacttgaaa taatattttt actcgtattc attgcaggcg    9060

tgggcatttt aatttactac aaagtgagta tttacattgt ttgcatttta actgctaact    9120

acagaggggt ttatgcaata ttattaataa tgaagaagtg tgttattttt aaacaaataa    9180

ggcttaagaa aaaggggggg tataaaattt tttgttctga tgatatgatt tttattataa    9240

ttcaattaat aaatgttagt aatacattat tatttatgaa cgtgtttgca aaattttacg    9300

gtgtagtggc gtttggggta ttttcagtat attacagatt tgttgctttt ccccaacaag    9360

tgataagctt ttcctcgtcg ttaatatgga ttaactttcg tcaagtccat gttaataaca    9420

gggttgctgc catgcaacta ttaaagagat tattttttat ttttactcta ttgcttatta    9480

tatggggagg gtgcgttcat ttttttatag acaaagtcgt atatctttat tcatccaaac    9540

ctttagaata cccaggtgtg ttgtgttttc taaatattat ggtttgcttg atgttgctaa    9600

aagacttttc aagtataata ctcaatgcat taactttata taaagaacaa atgataatga    9660

atgctttact ttgtttacta aacgttattt ttttcttttt ttataatgaa acgaattttg    9720

ataccatata tctaatcttc gtttcactgt taacattgat gtttgtattt gtaaatttat    9780

cactaattaa aagcaggctc tgaagatggt tattaatata ttttatatat gcacaggcga    9840

atataaaagg ttttttgata aattttattt atcttgtgag gataaattta taccagagtt    9900

tgaaaaaaaa tattatgtgt ttaccgattc tgataggatt tattttagta aatatctgaa    9960

tgttgaagta attaatgttg aaaaaaattg ctggccgctt aatacgttat tacgtttttc    10020

atattttttg aaggttattg ataagttaca aactaactca tatacttttt tctttaatgc    10080

aaatgcagtt attgtcaaag agattccttt tagtacattt atggagagtg atttaatcgg    10140

tgttattcat ccagggtata agaatcgtat atcgattctt tacccttggg aaagaagaaa    10200

aaatgcgacc tgctatcttg ggtatttaaa gaaaggtatt tattatcaag gttgtttcaa    10260

tggaggtaaa acagcgtcat ttaagagatt aatacaaatt tgtaatatga tgacaatggc    10320

tgatttgaaa aaaaacctga ttgctaaagt acatgatgag tcatatttga attattatta    10380

ttactacaat aagccactat tactttctga attgtactca tggcctgaaa aatatggtga    10440

aaataaagac gccaagatta ttatgcgtga taaggaaaga gaaagttggt atggtaatat    10500

caagaagtaa ttatagaaat atatgttcat atactttttt tatggtgaat ttatttatct    10560

taattttatc cgtaatcaat gaaggttttt gtgagattgc ctatgtaata ataagtgttt    10620

cttctgttct tttttgtgta atcataatct gccttgaaag gcaagggggc tttctcaacc    10680

caatgacttt ctgtattata tctgtctttt tctttatctt aatcagacct gtcttttttt    10740

cgcaaaatat aacagagaat ttaaacgaag taataactgc tggtttagaa attgatgaga    10800

tatatgtttt ttattcgtta gctgttgtaa acattccctt ggcttttact gtattactgt    10860

attcagtaca aaaaggtact gtttccaagt tagtagggca gttacctgat ttgttttttt    10920

ataataaaca attgtcaatg attttattat ggggggggct tttctctgct attttcttaa    10980

ttaaatcata caaaaaattt attatattag gtcaggtttc agtatttgag gctgacgcgt    11040

atggactata tgatgagtta ttttggttca ccctttcaaa atattgttat atattgtctt    11100

tgcttttttc taaaaataaa aatttcatac tatattcttt actgatattt ataacatcga    11160

taggttacat tttagtggga ttaagaggct atacaatcgc atatggtttc ttattgttat    11220

tttttctaga tataagatat aggcttaaga tcaaatggtt gttgttagta gctatattgg    11280

taacgaccat ttcttcactg ttccttaact atagaatagg tatagaagta aatagcggat    11340

tattaggaat tatttttaat ccattattac agcaaggtgc ttcatttgaa accgtttatg    11400

gtgctttgaa atacaatgaa aaaatattaa gttgcatatc ttactatgat tattttttta    11460

caaataaaga tatcggttct tgtattgaca tcgctcgtgg tgtttatttt aaagaaggag    11520

gaagtttcgc atcaagtttt tacagtgagc taatatattt ggggtggatc attggaagtg    11580

ttgctttatt actatttgca ttttctctag cttttgttca atcttgttat gagaaaataa    11640

taaaaaattc aatgaataat aaattggcat atacatatcg tttgatcatt tttttagcgc    11700

taccaaatct tatatatttt gcccgctcat cattatttga ttttattact aaggttttat    11760

ttatagctct attcataggt gggctaagca tagtgagaca tattgcttta aatataaaaa    11820

aatgtcattg agaatattag atatgatttc agtaataatg gctgtacacc gatatgataa    11880

atatgttgat atttcaattg atagtatctt aaatcagaca tactctgact ttgagttaat    11940

aataattgca aatggagggg attgtttcga gatagcaaaa cagctgaagc attatacaga    12000

gctggataac agagttaaaa tttatacatt agaaataggg cagttatcgt ttgcattaaa    12060

ttacgcagta actaagtgta aatactctat tattgccaga atggattccg acgatgtttc    12120

actgccgtta cgtctagaaa aacaatatat gtatatgttg cagaatgatt tagaaatggt    12180

ggggactggg atcagactta tcaatgaaaa cggtgagttt attaaagaat taaaatatcc    12240

aaatcataat aagataaata agatacttcc ttttaaaaat tgttttgcgc atcctacttt  12300

gatgttcaag aaagatgtta tactaaagca gcgaggttat tgtggtggtt ttaattcaga  12360

agattatgat ctatggctca gaatcttaaa tgaatgtccg aatatacgct gggataatct  12420

aagtgagtgt ttgctaaatt atcgaattca taacaaatct acgcaaaaat cagcactcgc  12480

atattatgaa tgtgctagtt attctctgcg agaattctta aaaaaaagaa ctattacgaa  12540

ttttctttct tgcctctatc atttttgtaa agcactaata aaataaaggt tgacgctatg  12600

tatagttgtt tgtctggtgg attaggtaat caaatgtttc agtatgctgc ggcatatatc  12660

ttacagagaa agcttaaaca aagatcatta gttttagacg atagctattt tttagattgc  12720

tcaaatcgtg atacacgtag aagatttgaa ttgaatcaat ttaacatatg ttatgatcgt  12780

ctgactacaa gtaaggaaaa aaaagagata tccataatac gacatgtaaa tagatatcgt  12840

ttgcccttat ttgttacaaa ttctatattt ggagttctac taaaaaaaaa ctatttgcct  12900

gaagcaaaat tttatgaatt tttgaacaac tgtaaattac aggttaaaaa tggttattgt  12960

ctattttctt atttccagga tgctacattg atagatagtc atcgtgatat gattctccca  13020

ttattccaga ttaatgaaga tttgctcaat ttatgtaatg acttgcatat ttacaaaaaa  13080

gtgatatgtg agaatgctaa cacaacttca ctacatatca ggcgtggaga ctacatcacc  13140

aaccctcacg cctctaaatt tcatggggtg ttgcccatgg attactatga aaaggctatt  13200

cgttatattg aggatgttca aggagaacag gtgattatcg tattttcaga tgatgtgaaa  13260

tgggctgaga atacatttgc taatcaacct aattattacg ttgttaataa ttctgaatgc  13320

gagtacagtg cgattgatat gtttttaatg tcaaagtgta aaaacaatat aatagccaat  13380

agtacatata gttggtgggg ggcatggtta aatactttcg aagataaaat agttgtttcc  13440

cctcgtaagt ggtttgctgg aaataataaa tctaagttga ccatggatag ttggattaat  13500

ctttgattat gctgtgtgtt ttttttaaaa tatgatatcc attcataatt tgtaattttg  13560

atatattatt tttagactaa aatgtcaatc tgcaacattc cgtagtaatc cctgacagga  13620

gtaaacaatg tcaaagcaac agatcggcgt agtcggtatg gcagtgatgg ggcgtaacct  13680

tgcgctcaac atcgaaagcc gtggttatac cgtctctatt ttcaaccgct cccgtgagaa  13740

aacggaagaa gtaattgccg aaaacccggg caagaaactg gttccttact atacggtgaa  13800

agagtttgtt gaatctctgg aaacgcctcg tcgcatcctg ttaatggtga aagcaggtgc  13860

aggcacggat gctgctattg attccctcaa gccatacctc gataaaggtg acatcatcat  13920

tgatggcggt aacaccttct tccaggacac cattcgtcgt aaccgtgagc tttctgccga  13980

aggctttaac ttcattggta ccggtgtttc cggtggtgaa gagggcgcgc tgaaaggtcc  14040

ttccattatg cctggtggcc agaaagaagc ctatgaactg gttgctccga tcctgaccaa  14100

aatcgccgca gtagctgaag acggtgagcc atgcgttacc tatattggtg ccgatg      14156

表1大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中的寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

                                                                产生正

                  基因的碱基                                             PCR的退

基因    功能                                         PCR产物    确大小

                               正向引物     反向引物                     火温度

                  位置                                的长度    电泳带

                                                                的组数    (℃)

wzx   转运酶    8601-9803      8987-9008    9399-9419   433        0^*    60

                               9108-9130    9532-9556   449        0^*    60

wzy   聚合酶    10491-11831    11055-11075  11766-11786 732        0^*    60

                               10674-10692  11319-11339 666        0^*    54

^*只在大肠杆菌O86型中得到正确的一条带

表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号                 该组中含有的菌株                                             来源

1、野生型大肠杆菌   O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，        IMVS^a

                    O19ab，O20，O21，O22，O23，O24

2、野生型大肠杆菌                  O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，    IMVS^a

                                   O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43

3、野生型大肠杆菌                  O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，    IMVS^a

                                   O57，O58，O60，O61，O62，O53

4、野生型大肠杆菌                  O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，        IMVS^a

                                   O79，O80，O81，O82，O83，O68

5、野生型大肠杆菌                  O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，        IMVS^a

                                   O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97

6、野生型大肠杆菌                  O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，           IMVS^a

                                   O115，O116，O118，O120，O123，O126，O128，O117

7、野生型大肠杆菌                  O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，         IMVS^a

                                   O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140

8、野生型大肠杆菌                  O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，         IMVS^a

                                   O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153                 b

9、野生型大肠杆菌                  O168，O169，O170，O171，O172，O173，                           c

痢疾志贺氏菌                       D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13         d

10、鲍氏志贺氏菌                   B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， d

                                   B16，B17，B18

11、福氏志贺氏菌                   F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，     d

                                   DS，DR

12、野生型大肠杆菌                 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，IMVS^a

                                   O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119

13、第6组菌株加上大肠杆菌标准菌株  O86                                                            IMVS^a

为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阳性对照

a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia

 b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3大肠杆菌O86型O抗原基因结构图

orf# galF  gne   orf2    gmd    fcl    gmm  manC      manB      wzx      orf9   wzy  orf11  orf12    gnd

G+C％52.2  33.2  34.2    52.5     56.2 52.2 36.4      50.5      27.8     28.2   28.6 31.3   32.3     50.5

content

表4大肠杆菌O86型O-抗原基因簇基因位置

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ATGCGTCCAA GAACGCGGTC    60

GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTTC TTGAACAACG TGTGAAGCGT    120

CAACTGTTGG CGGAAGTACA GTCGATCTGC CCGCCGGGCG TAACCATTAT GAACGTGCGT    180

CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT GGGCCACTCC ATTTTATGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC    240

AACCCATTTG TCGTGGTACT GCCAGACGTT GTGATCGACG ACGCCAGCGC TGACCCGCTG    300

CGTTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGC TTCAACGAAA CGGGCCGTAC CCAGGTGCTG    360

GCAAAACGTA TGCCGGGCGA CCTCTCGGAA TACTCCGTTA TTCAGACCAA AGAGCCGCTG    420

GATCGCGAAG GCAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTCATCG AAAAGCCGGA TCAGCCGCAG    480

ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG    540

GAACTTGAAC GCACTCAGCC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AACTGACTGA TGCCATTGCT    600

GAACTGGCGA AAAAACAGTC CGTTGATGCC ATGCTGATGA CAGGTGACAG CTACGACTGC    660

GGTAAAAAAA TGGGGTATAT GCAGGCATTT GTGAAGTATG GACTACGCAA CCTCAAAGAA    720

GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAAAAATT AATCATCCAT    780

ATATGGTGGA TTGAATAAAA ATAGAACGGC AGTGAACATT CAAAAGCAGA GATGCTTACA    840

TTATAAGAAT GTTCCTGTCT TTTATTTAAA GTATTTAATA ACAATAAGTT ACCGCAAGTA    900

TCGCTCGGGC ATAGATTTTC CTTGTATCTA ACTTCGTTTG GTTAGACAAT TGGAAAATAG    960

TGAAAAGTAT TAAATGCTTA GTACCTATGA TTCATTTTCA GTGAGTTGGT AACTGTTAAG    1020

                                                          gne起始

CCAAGGGCGG TAGCGTGTGT TTTTCTCTCA ATCCTCATGG TAAAGGAGGT TTAT ATGGTG  1080

ATTTTCGTAA CAGGCGGTGC AGGATATATT GGATCCCATA CCATACTTGA GTTACTTAAT    1140

AATGGTCATG ATGTCGTTTC GATAGATAAT TTTGTCAATT CCTCTATAGA ATCATTAAAA    1200

AGAGTAGAGC AAATAACTAA TAAGAAAATT ATTTCTTATC AAGGTGATAT CCGTGATAAA    1260

AATCTACTTG ATGAGATTTT TTCAAGACAC CATATCGATG CTGTAATTCA CTTTGCATCG    1320

TTAAAATCTG TAGGTGAGTC TAAGTTAAAG CCCTTAGAGT ATTATTCTAA TAATGTTGGT    1380

GGAACTTTAG TATTACTTGA ATGCATGAAG AGATATAACA TTAATAAAAT GATATTTAGC    1440

TCTTCTGCTA CTGTTTATGG GAGTAACAGT ATCCCTCCCC ATACGGAAGA TAGACGAATT    1500

GGTGAAACTA CAAACCCATA TGGGACATCG AAATTTATAA TAGAAATAAT TTTGAGTGAT    1560

TATTGTGATA GTGATAATAA TAAATCAGTA ATTGCACTGC GTTACTTTAA TCCAATCGGA    1620

GCACATAAGT CCGGGATGAT TGGTGAAAAT CCTAACGGGA TCCCTAATAA TCTGGTTCCT    1680

TATATATCTA AAGTTGCACA AAATCAACTT CCTGTATTAA ATATTTATGG CAACGATTAT    1740

CCAACTAAAG ATGGTACAGG AGTAAGAGAC TATATACATG TCTGTGATTT GGCTAAAGGG    1800

CATGTTAAAG CATTAGAATA TATGTTTTTA AATGATGTCA ATTATGAAGC TTTTAATTTA    1860

GGTACTGGTC AAGGTTATTC TGTTTTAGAG ATTGTAAAAA TGTTTGAGAT AGTCACTAAA    1920

AAGAGTATAC CTGTTGCTAT TTGTAATAGA CGTGAGGGGG ATGTTGCGGA GTCATGGGCG    1980

TCTGCTGATT TGGCACATAA AAAGCTTTCC TGGAAAGCGG AAAAAAATTT GAAAGAAATG    2040

                                                          gne终止

ATCGAAGATG TATGGCGTTG GCAAACAAAC AATCCAAATG GATATAAAAA A TAATTTTTG  2100

           orf2起始

GAATTTTGAT AT ATGAAAAA TGTTGGTTTT ATTGTTACAA AATCAGAAAT TGGTGGTGCA  2160

CAAACATGGG TAAATGAAAT ATCTAACCTT ATTAAAGAGG AATGTAATAT ATTTCTTATT    2220

ACATCTGAAG AAGGATGGCT CACACATAAA GATGTCTTTG CCGGAGTTTT TGTCATACCA    2280

GGTATTAAAA AATATTTTGA CTTCCTTACA TTGTTTAAAT TGAGAAAAAT TTTAAAAGAA    2340

AATAACATTT CAACGTTAAT AGCAAGTTCT GCTAATGCCG GAGTTTATGC CAGGTTAGTT    2400

CGATTACTAG TCGACTTTAA ATGTATTTAT GTTTCGCATG GATGGTCTTG TTTATATAAT    2460

GGTGGTCGCC TAAAATCAAT TTTTTGCATT GTTGAAAAAT ACCTTTCTTT ATTAACTGAT    2520

GTTATATGGT GTGTTTCCAA AAGTGATGAA AAAAAGGCAA TTGAGAATAT TGGTATAAAA    2580

GAACCAAAGA TAATCACAGT ATCGAATTCA GTGCCTCAGA TGCCGAGATG TAATAATAAA    2640

CAACTCCAGT ATAAGGTTCT GTTTGTTGGT AGGTTAACAC ACCCTAAGCG CCCCGAATTG    2700

TTAGCGAATG TAATATCGAA AAAGCCCCAG TATAGCCTCC ATATCGTAGG AGGGGGGGAA    2760

AGGTTAGAAT CATTGAAGAA ACAATTCAGT GAATGTGAAA ATATTCATTT TTTGGGTGAG    2820

GTCAATAATT TTTATAACTA TCATGAGTAT GATTTATTTT CACTGATATC CGATAGTGAA    2880

GGTTTGCCTA TGTCAGGCCT TGAGGCTCAC ACAGCTGCAA TACCACTCCT GTTAAGTGAT     2940

GTGGGCGGAT GTTTTGAATT AATTGAGGGT AATGGGTTAC TTGTGGAAAA TACTGAAGAC     3000

GACATTGGAT ATAAATTGGA TAAAATATTC GATGACTATG AAAATTATCG GGAACAGGCA     3060

ATTCGTGCCT CCGGGAAATT TGTTATCGAG AACTATGCTT CAGCATATAA AAGCATTATT     3120

    orf2终止                          gmd起始

TTAGGT TGAG TATTTTTAAG AACAGGAAAT GTAAA ATGGC TAAAGTCGCT CTCATTACTG 3180

GCATAACCGG ACAAGACGGT TCTTACCTGG CAGAGTTTCT GCTGGAAAAA GGTTACGAGG     3240

TGCATGGTAT CAAGCGTCGT GCATCGTCAT TCAACACCGA GCGCGTGGAT CATATCTATC     3300

AGGATCCGCA CACCTGCAAC CCGAAATTCC ATCTGCATTA TGGCGATCTG ACAGATACCT     3360

CCAACCTGAC GCGCATTTTG TGTGAAGTGC AGCCGGATGA AGTGTACAAC CTGGGCGCAA     3420

TGAGTCACGT TGCGGTTTCT TTTGAGTCAC CGGAATATAC CGCTGACGTC GATGCGATGG     3480

GTACGCTGCG CCTGCTGGAG GCGATCCGCT TCCTCGGTCT GGAAAAGAAA ACCCGTTTTT     3540

ATCAGGCTTC CACTTCTGAA CTGTATGGTC TGGTGCAGGA AATTCCCCAG AAAGAGACCA     3600

CACCGTTCTA CCCGCGATCT CCGTATGCAG TCGCCAAACT GTACGCCTAC TGGATCACCG     3660

TTAACTACCG CGAATCCTAC GGCATGTACG CCTGCAACGG TATTCTCTTT AACCATGAAT     3720

CCCCGCGCCG CGGCGAAACT TTCGTTACCC GCAAAATCAC CCGCGCAATC GCCAACATCG     3780

CCCAGGGGCT GGAATCGTGC CTGTACCTCG GCAATATGGA TTCCCTGCGT GACTGGGGCC     3840

ATGCCAAAGA CTACGTAAAA ATGCAGTGGA TGATGCTGCA ACAGGAACAG CCGGAAGATT     3900

TCGTCATTGC TACCGGCGTT CAGTACTCCG TGCGTCAGTT CGTGGAAATG GCGGCGGAGC     3960

GAGTCGGTAT CAAACTGCGT TTTGAAGGCA CAGGTGTAGA TGAGAAGGGG ATAGTGGTTT     4020

CTGTTAATGG TGAGGATGCT CCAGCAGTTA AACCTGGAGA TGTAATCGTT AAGGTTGATC     4080

CGCGTTACTT CCGTCCGGCT GAAGTTGAAA CGCTGCTCGG TGACCCGACC AAAGCGCACG     4140

AAAAACTGGG CTGGAAACCA GAAATCACCC TCAGAGAGAT GGTGTCTGAA ATGGTGGCTA     4200

ATGACCTCGA AGCGGCGAAA AAACACTCTC TGCTGAAATC TCACGGCTAC GACGTGGCGA     4260

             gmd终止  fcl起始

TCGCGCTGGA GTCA TAAGC A TGAGTAAACA ACGCATTTTT ATCGCTGGCC ATCGCGGGAT 4320

GGTCGGTTCT GCCATCAGGC GGCAGCTCGA ACAGCGCGGT GATGTGGAAC TGGTATTACG     4380

CACCCGCGAC GAGCTGAACC TGCTGGACAG CCGCGCCGTG CATGATTTCT TTGCCAGCGA     4440

ACGTATTGAC CAGGTCTATC TGGCGGCGGC GAAAGTGGGC GGCATTGTTG CCAACAACAC     4500

GTATCCGGCG GATTTCATCT ATCAGAACAT GATGATTGAG AGCAACATCA TTCACGCCGC     4560

GCATCAGAAC GACGTGAACA AACTGCTGTT TCTCGGATCG TCCTGTATCT ACCCGAAACT     4620

GGCAAAACAG CCAATGGCAG AAAGTGAGTT ATTGCAGGGC ACGCTGGAGC CGACCAACGA     4680

ACCTTATGCC ATTGCCAAAA TCGCCGGGAT CAAACTGTGC GAATCTTACA ACCGTCAGTA     4740

CGGACGCGAT TACCGCTCGG TCATGCCGAC CAACCTGTAC GGGCCGCACG ACAACTTCCA     4800

TCCGAGTAAC TCGCATGTGA TCCCAGCATT GCTGCGTCGC TTCCACGAGG CGACGGCACA     4860

GAATGCGCCG GACGTGGTGG TGTGGGGCAG CGGTACGCCG ATGCGTGAAT TTCTGCACGT     4920

CGATGATATG GCGGCGGCGA GCATTCATGT GATGGAGCTG GCGCACGAAG TCTGGCTGGA     4980

GAACACCCAG CCGATGTTGT CGCACATTAA CGTCGGCACG GGCGTTGACT GCACTATCCG     5040

CGAGCTGGCG CAAACCATCG CCAAAGTGGT GGGTTACAAA GGTCGGGTGG TTTTTGATGC     5100

CAGCAAACCG GATGGCACAC CGCGCAAACT GCTGGATGTG ACGCGCCTGC ATCAGCTTGG     5160

CTGGTATCAC GAAATCTCAC TGGAAGCGGG GCTTGCCAGC ACTTACCAGT GGTTCCTTGA     5220

                   fcl终止     gmm起始

GAATCAAGAC CGCTTTCGGG GG TAATGATG TTTTTACGTC AGGAAGACTT TGCCACGGTA   5280

GTGCGCTCCA CTCCGCTTGT CTCTCTCGAC TTTATTGTTG AGAACAGTCG CGGCGAGTTT     5340

CTGCTTGGCA AAAGAACCAA CCGCCCGGCG CAGGGTTACT GGTTTGTGCC GGGAGGGCGC     5400

GTGCAGAAAG ACGAAACGCT GGAAGCCGCA TTTGAGCGGC TGACGATGGC GGAACTGGGT     5460

CTGCGTCTAC CGATAACAGC AGGCCAGTTT TACGGTGTCT GGCAGCACTT TTATGACGAT     5520

AACTTCTCCG GCACGGATTT CACCACGCAC TATGTGGTGC TCGGTTTTCG CTTCAGAGTC     5580

GCGGAAGAAG AGCTGTTACT GCCGGATGAG CAGCATGTCG ATTACCGCTG GCTGACGCCG     5640

GACGCGCTGC TCGCCAGTAA CAATGTTCAC GCTAACAGCC GAGCTTATTT TAATCATGAT     5700

                                       manC起始   gmm终止

CCAAGTGCTG TTTTTGGTTT AGATAAAAAG GATGTCAAAA  ATGTC TGATG TACCGTTGAT 5760

TGCTGTTGTA ATGGCTGGTG GTACGGGTAG CCGTCTTTGG CCCCTCTCAA GAGAGCACTA     5820

TCCGAAGCAA TTTCTGCAAT TATCAGGTGA GAATACTTTA TTACAGTCAA CTTTATTACG     5880

ACTATCCCCG CTTTCTTGCG AAACTCCATT AGTAATAACT AACGAGCAGC ATCGTTTTGT     5940

GGTCGCAGAA CAATTGCGTC AAATAAACCA ATTAAGCGAT AACATTATTC TTGAACCATG     6000

TGGAAGAAAT ACTGCACCAG CTATAGCACT TTCAGCATTT ACAGCCTTAA AGCGTAATGA     6060

ACAACAAGAT CCTATACTTT TAGTTCTTGC AGCTGACCAT GTTATAAACA AAACAGATGT     6120

TTTTTGTAAT GCTATTAAAA ATTCCATTTC AATTGTTGAA CAAGGAAATA TTTTAACATT     6180

TGGTATTATT CCTGATTATG CAGAAACCGG TTACGGTTAT ATAGAAAAAG GGAGTATAGT     6240

TAAAGAATCA CAACGTGGAG TTGGTAATAC ATTCTATCAC GTGGAACAAT TTGTTGAAAA     6300

ACCTAATCGC TCAAGGGCTG AAGAGTATAT CTCCTCAGGT AAATATCTCT GGAATAGTGG     6360

GATGTTTATG TTCAAAGCAT CAGTATATTT AGAGGAGTTA AAAAAATACA GACCTGATAT     6420

ATACGATATA TGTGAAAAAA CAATTTCTTC GTCCTACCAT GATCTTGATT TTATACGACT     6480

TTCGAAAGAT GTTTTTCAAA ATTGTCCATC GGAATCAATT GATTTTGCAG TAATGGAAAA     6540

AACAAAGCGT TGTATAGTCT ATCCCGTTGA TATTGGTTGG AACGATGTTG GATCTTGGCA     6600

ATCATTGTGG GACGTTAGTG ATAAAACCCC TACAGGGGAC GTTTGCAAAG GTGATATCCT     6660

GACCTATAAT ACAAAAAATA ATTATATTCA TTCGGAGTCA GCCTTAGTAG CCGCTGTAGG     6720

TGTGGAAGAT ATTGTTATTG TTCAGACGAA AGATGCAATT CTAGTTTCAA AAAAATCCGA     6780

AGTTCAGGAT GTTAAGAAAA TTGTTCAAAT GCTTAAAATG CAAGAACGTT CTGAATATCT     6840

ATCACATCGC GAGGAGTTTC GGCCTTGGGG AAAGTTTGAT GCTATAGAAC AGGGAGATCG     6900

ATATAAGGTC AAAAAGATTG TCGTTAAACC AGGGGAAGGG CTATCCTTAC GTATGCATCA     6960

TCATCGTTCA GAGCATTGGA TTGTCCTTTC AGGTACAGCA AAAGTAACGT TAAATAACAA     7020

AACTTTCTTA GTTACTGCTA ATGAATCCGT TTATATTCCT CTGGGTGCTA CTTATAGCCT     7080

TGAAAATCCA GGTATAATTC CTCTCAATCT TATTGAAGTT AGTTCAGGAG ATTATTTAGG     7140

                                               manC终止  manB起始

TGAGGATGAT ATTGTTCGTC AAAAAGAACG TTACAAAATA GATGAC TAAT AA ATGAAAAA 7200

ATTAACCTGC TTTAAAGCCT ACGATATTCG CGGGAAATTA GGCGAAGAAT TGAATGAAGA     7260

TATTGCCTGG CGCATTGGTC GCGCTTATGG CGAATTTCTC AAACCGAAAA CCATTGTGTT     7320

AGGCGGTGAT GTCCGCCTCA CCAGCGAAAC CTTAAAACTG GCGCTGGCGA AAGGTTTACA     7380

GGATGCGGGC GTCGATGTGC TGGATATTGG TATGTCCGGC ACCGAAGAGA TCTATTTCGC     7440

CACGTTCCAT CTCGGCGTGG ATGGCGGCAT TGAAGTTACC GCCAGCCATA ATCCGATGGA     7500

TTACAACGGC ATGAAGCTGG TGCGCGAAGG GGCTCGCCCG ATCAGCGGCG ATACCGGACT     7560

GCGCGATGTC CAGCGCCTGG CAGAAGCCAA CGACTTTCCT CCCGTTGATG AAACCAAACG     7620

CGGTCGCTAT CAGCAAATCA ACCTGCGTGA TGCATACGTT GATCACCTGT TCGGTTATAT     7680

CAACGTCAAA AACCTCACGC CGCTCAAGCT GGTGATCAAC TCCGGGAACG GCGCAGCGGG     7740

TCCGGTAGTT GACGCCATCG AAGCCCGCTT TAAAGCCCTC GGCGCACCCG TGGAATTGAT     7800

CAAAGTGCAC AACACGCCGG ACGGAAATTT CCCCAACGGT ATTCCTAACC CGCTGCTGCC     7860

GGAATGCCGC GACGACACCC GCAATGCGGT CATCAAACAT GGCGCGGATA TGGGCATTGC     7920

TTTTGATGGC GATTTTGACC GCTGTTTCCT GTTTGACGAA AAAGGGCAGT TTATCGAGGG     7980

CTACTACATT GTCGGCCTGC TGGCAGAAGC GTTCCTCGAA AAAAATCCCG GCGCGAAGAT     8040

CATCCACGAT CCGCGTCTAA TTTGGAACAC CGTTGATGTG GTGAGTGCCG CAGGTGGCAC     8100

CCCGGTAATG TCGAAAACCG GACACGCCTT TATTAAAGAA CGTATGCGCA AGGAAGACGC     8160

CATCTACGGT GGCGAAATGA GCGCCCACCA TTACTTCCGT GATTTCGCTT ACTGCGACAG     8220

CGGCATGATC CCGTGGCTGC TGGTAGCCGA ACTGGTGTGT CTGAAAGGAA AAACGCTGGG     8280

CGAACTTGTG CGTGACCGGA TGGCAGCTTT TCCAGCAAGT GGGGAAATTA ATAGCACGTT     8340

GGAAGATCCA TTATGTGCTA TCGCACGGGT TGAAAGTTAT TATGCAAATA AGGCAATTGA     8400

GATCGATCGT ACAGATGGTA TAAGTATGAC TTTTAATGGA TGGCGCTTTA ACTTACGTTC     8460

TTCTAATACG GAACCCGTAG TCCGGTTAAA CGTTGAATCT AGAGGAGATG TGGCCGCAAC     8520

                                                         manB终止

TAAAAAATAT ACAGGCTTCA TATTAGACTT ATTAAATTAT AAAAAGTCAA TATCATCT TA   8580

                   wzx起始

ACAAGTAAAT GTGAGTTATT  ATGATAAAGT TGCTTTTTAG TTCATCTTTA TTAAAGATGG   8640

GTGTTGTTTT ATTAAATTTG CTTATTCCTG CAATAATAAT ACGATTCTAT TCAGAGTATG     8700

ATTTTGGAAT TTATTCTTAT TTACTAACAT ACGCAATCGT TATTTCTGTT TTACAAAACG     8760

GCATCACTGC AAGCTTCCGT AATCTGATAT CAAATTTAGA AAAAAATGAT TTGCTTGATT     8820

ATTTATTATA TTCAGTGAGG AAAATAACGT ATCCATTCTT ATTAATAATA TTTTGTTTAT     8880

TATTGGCTAC GCTTTATGTA GTTGGGTTTG ATACGTTATA TGGTAAAATA TGTTTTTTTA     8940

TTGCTGTATC GTTAATAAAT ATATATTATC CAGTGGTTGC TTCATATTAT GATGCTACAG     9000

GTAAAACGCT CAATTTTGTA CTACTTGAAA TAATATTTTT ACTCGTATTC ATTGCAGGCG     9060

TGGGCATTTT AATTTACTAC AAAGTGAGTA TTTACATTGT TTGCATTTTA ACTGCTAACT     9120

ACAGAGGGGT TTATGCAATA TTATTAATAA TGAAGAAGTG TGTTATTTTT AAACAAATAA     9180

GGCTTAAGAA AAAGGGGGGG TATAAAATTT TTTGTTCTGA TGATATGATT TTTATTATAA     9240

TTCAATTAAT AAATGTTAGT AATACATTAT TATTTATGAA CGTGTTTGCA AAATTTTACG     9300

GTGTAGTGGC GTTTGGGGTA TTTTCAGTAT ATTACAGATT TGTTGCTTTT CCCCAACAAG     9360

TGATAAGCTT TTCCTCGTCG TTAATATGGA TTAACTTTCG TCAAGTCCAT GTTAATAACA     9420

GGGTTGCTGC CATGCAACTA TTAAAGAGAT TATTTTTTAT TTTTACTCTA TTGCTTATTA     9480

TATGGGGAGG GTGCGTTCAT TTTTTTATAG ACAAAGTCGT ATATCTTTAT TCATCCAAAC     9540

CTTTAGAATA CCCAGGTGTG TTGTGTTTTC TAAATATTAT GGTTTGCTTG ATGTTGCTAA     9600

AAGACTTTTC AAGTATAATA CTCAATGCAT TAACTTTATA TAAAGAACAA ATGATAATGA     9660

ATGCTTTACT TTGTTTACTA AACGTTATTT TTTTCTTTTT TTATAATGAA ACGAATTTTG     9720

ATACCATATA TCTAATCTTC GTTTCACTGT TAACATTGAT GTTTGTATTT GTAAATTTAT     9780

                     wzx终止  orf9起始

CACTAATTAA AAGCAGGCTC  TGAAG ATGGT TATTAATATA TTTTATATAT GCACAGGCGA 9840

ATATAAAAGG TTTTTTGATA AATTTTATTT ATCTTGTGAG GATAAATTTA TACCAGAGTT     9900

TGAAAAAAAA TATTATGTGT TTACCGATTC TGATAGGATT TATTTTAGTA AATATCTGAA     9960

TGTTGAAGTA ATTAATGTTG AAAAAAATTG CTGGCCGCTT AATACGTTAT TACGTTTTTC     10020

ATATTTTTTG AAGGTTATTG ATAAGTTACA AACTAACTCA TATACTTTTT TCTTTAATGC     10080

AAATGCAGTT ATTGTCAAAG AGATTCCTTT TAGTACATTT ATGGAGAGTG ATTTAATCGG     10140

TGTTATTCAT CCAGGGTATA AGAATCGTAT ATCGATTCTT TACCCTTGGG AAAGAAGAAA     10200

AAATGCGACC TGCTATCTTG GGTATTTAAA GAAAGGTATT TATTATCAAG GTTGTTTCAA     10260

TGGAGGTAAA ACAGCGTCAT TTAAGAGATT AATACAAATT TGTAATATGA TGACAATGGC     10320

TGATTTGAAA AAAAACCTGA TTGCTAAAGT ACATGATGAG TCATATTTGA ATTATTATTA     10380

TTACTACAAT AAGCCACTAT TACTTTCTGA ATTGTACTCA TGGCCTGAAA AATATGGTGA     10440

                                                     wxy起始

AAATAAAGAC GCCAAGATTA TTATGCGTGA TAAGGAAAGA GAAAGTTGGT  ATGGTAATAT   10500

       orf9终止

CAAGAAG TAA TTATAGAAAT ATATGTTCAT ATACTTTTTT TATGGTGAAT TTATTTATCT   10560

TAATTTTATC CGTAATCAAT GAAGGTTTTT GTGAGATTGC CTATGTAATA ATAAGTGTTT     10620

CTTCTGTTCT TTTTTGTGTA ATCATAATCT GCCTTGAAAG GCAAGGGGGC TTTCTCAACC     10680

CAATGACTTT CTGTATTATA TCTGTCTTTT TCTTTATCTT AATCAGACCT GTCTTTTTTT     10740

CGCAAAATAT AACAGAGAAT TTAAACGAAG TAATAACTGC TGGTTTAGAA ATTGATGAGA     10800

TATATGTTTT TTATTCGTTA GCTGTTGTAA ACATTCCCTT GGCTTTTACT GTATTACTGT     10860

ATTCAGTACA AAAAGGTACT GTTTCCAAGT TAGTAGGGCA GTTACCTGAT TTGTTTTTTT     10920

ATAATAAACA ATTGTCAATG ATTTTATTAT GGGGGGGGCT TTTCTCTGCT ATTTTCTTAA     10980

TTAAATCATA CAAAAAATTT ATTATATTAG GTCAGGTTTC AGTATTTGAG GCTGACGCGT     11040

ATGGACTATA TGATGAGTTA TTTTGGTTCA CCCTTTCAAA ATATTGTTAT ATATTGTCTT     11100

TGCTTTTTTC TAAAAATAAA AATTTCATAC TATATTCTTT ACTGATATTT ATAACATCGA     11160

TAGGTTACAT TTTAGTGGGA TTAAGAGGCT ATACAATCGC ATATGGTTTC TTATTGTTAT     11220

TTTTTCTAGA TATAAGATAT AGGCTTAAGA TCAAATGGTT GTTGTTAGTA GCTATATTGG     11280

TAACGACCAT TTCTTCACTG TTCCTTAACT ATAGAATAGG TATAGAAGTA AATAGCGGAT     11340

TATTAGGAAT TATTTTTAAT CCATTATTAC AGCAAGGTGC TTCATTTGAA ACCGTTTATG     11400

GTGCTTTGAA ATACAATGAA AAAATATTAA GTTGCATATC TTACTATGAT TATTTTTTTA     11460

CAAATAAAGA TATCGGTTCT TGTATTGACA TCGCTCGTGG TGTTTATTTT AAAGAAGGAG     11520

GAAGTTTCGC ATCAAGTTTT TACAGTGAGC TAATATATTT GGGGTGGATC ATTGGAAGTG     11580

TTGCTTTATT ACTATTTGCA TTTTCTCTAG CTTTTGTTCA ATCTTGTTAT GAGAAAATAA     11640

TAAAAAATTC AATGAATAAT AAATTGGCAT ATACATATCG TTTGATCATT TTTTTAGCGC     11700

TACCAAATCT TATATATTTT GCCCGCTCAT CATTATTTGA TTTTATTACT AAGGTTTTAT     11760

TTATAGCTCT ATTCATAGGT GGGCTAAGCA TAGTGAGACA TATTGCTTTA AATATAAAAA     11820

       wzy终止     orf11起始

AATGTCAT TG AGAATATTAG AT ATGATTTC AGTAATAATG GCTGTACACC GATATGATAA 11880

ATATGTTGAT ATTTCAATTG ATAGTATCTT AAATCAGACA TACTCTGACT TTGAGTTAAT     11940

AATAATTGCA AATGGAGGGG ATTGTTTCGA GATAGCAAAA CAGCTGAAGC ATTATACAGA     12000

GCTGGATAAC AGAGTTAAAA TTTATACATT AGAAATAGGG CAGTTATCGT TTGCATTAAA     12060

TTACGCAGTA ACTAAGTGTA AATACTCTAT TATTGCCAGA ATGGATTCCG ACGATGTTTC     12120

ACTGCCGTTA CGTCTAGAAA AACAATATAT GTATATGTTG CAGAATGATT TAGAAATGGT     12180

GGGGACTGGG ATCAGACTTA TCAATGAAAA CGGTGAGTTT ATTAAAGAAT TAAAATATCC     12240

AAATCATAAT AAGATAAATA AGATACTTCC TTTTAAAAAT TGTTTTGCGC ATCCTACTTT     12300

GATGTTCAAG AAAGATGTTA TACTAAAGCA GCGAGGTTAT TGTGGTGGTT TTAATTCAGA     12360

AGATTATGAT CTATGGCTCA GAATCTTAAA TGAATGTCCG AATATACGCT GGGATAATCT     12420

AAGTGAGTGT TTGCTAAATT ATCGAATTCA TAACAAATCT ACGCAAAAAT CAGCACTCGC     12480

ATATTATGAA TGTGCTAGTT ATTCTCTGCG AGAATTCTTA AAAAAAAGAA CTATTACGAA     12540

                                            orf11终止   orf12起始

TTTTCTTTCT TGCCTCTATC ATTTTTGTAA AGCAC TAATA AAATAAAGGT TGACGCT ATG 12600

TATAGTTGTT TGTCTGGTGG ATTAGGTAAT CAAATGTTTC AGTATGCTGC GGCATATATC     12660

TTACAGAGAA AGCTTAAACA AAGATCATTA GTTTTAGACG ATAGCTATTT TTTAGATTGC     12720

TCAAATCGTG ATACACGTAG AAGATTTGAA TTGAATCAAT TTAACATATG TTATGATCGT     12780

CTGACTACAA GTAAGGAAAA AAAAGAGATA TCCATAATAC GACATGTAAA TAGATATCGT     12840

TTGCCCTTAT TTGTTACAAA TTCTATATTT GGAGTTCTAC TAAAAAAAAA CTATTTGCCT     12900

GAAGCAAAAT TTTATGAATT TTTGAACAAC TGTAAATTAC AGGTTAAAAA TGGTTATTGT     12960

CTATTTTCTT ATTTCCAGGA TGCTACATTG ATAGATAGTC ATCGTGATAT GATTCTCCCA     13020

TTATTCCAGA TTAATGAAGA TTTGCTCAAT TTATGTAATG ACTTGCATAT TTACAAAAAA     13080

GTGATATGTG AGAATGCTAA CACAACTTCA CTACATATCA GGCGTGGAGA CTACATCACC     13140

AACCCTCACG CCTCTAAATT TCATGGGGTG TTGCCCATGG ATTACTATGA AAAGGCTATT     13200

CGTTATATTG AGGATGTTCA AGGAGAACAG GTGATTATCG TATTTTCAGA TGATGTGAAA   13260

TGGGCTGAGA ATACATTTGC TAATCAACCT AATTATTACG TTGTTAATAA TTCTGAATGC   13320

GAGTACAGTG CGATTGATAT GTTTTTAATG TCAAAGTGTA AAAACAATAT AATAGCCAAT   13380

AGTACATATA GTTGGTGGGG GGCATGGTTA AATACTTTCG AAGATAAAAT AGTTGTTTCC   13440

CCTCGTAAGT GGTTTGCTGG AAATAATAAA TCTAAGTTGA CCATGGATAG TTGGATTAAT   13500

  orf12终止

CTT TGATTAT GCTGTGTGTT TTTTTTAAAA TATGATATCC ATTCATAATT TGTAATTTTG 13560

ATATATTATT TTTAGACTAA AATGTCAATC TGCAACATTC CGTAGTAATC CCTGACAGGA   13620

GTAAACAATG TCAAAGCAAC AGATCGGCGT AGTCGGTATG GCAGTGATGG GGCGTAACCT   13680

TGCGCTCAAC ATCGAAAGCC GTGGTTATAC CGTCTCTATT TTCAACCGCT CCCGTGAGAA   13740

AACGGAAGAA GTAATTGCCG AAAACCCGGG CAAGAAACTG GTTCCTTACT ATACGGTGAA   13800

AGAGTTTGTT GAATCTCTGG AAACGCCTCG TCGCATCCTG TTAATGGTGA AAGCAGGTGC   13860

AGGCACGGAT GCTGCTATTG ATTCCCTCAA GCCATACCTC GATAAAGGTG ACATCATCAT   13920

TGATGGCGGT AACACCTTCT TCCAGGACAC CATTCGTCGT AACCGTGAGC TTTCTGCCGA   13980

AGGCTTTAAC TTCATTGGTA CCGGTGTTTC CGGTGGTGAA GAGGGCGCGC TGAAAGGTCC   14040

TTCCATTATG CCTGGTGGCC AGAAAGAAGC CTATGAACTG GTTGCTCCGA TCCTGACCAA   14100

AATCGCCGCA GTAGCTGAAG ACGGTGAGCC ATGCGTTACC TATATTGGTG CCGATG       14156

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1、一种对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于：其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长14156个碱基；或者所述具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ IDNO：1的核苷酸。

2、按照权利要求1所述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于：其包括命名为gne，orf2，gmd，fcl，gmm，manC，manB，wzx，orf9，wzy，orf11，orf12的12个基因组成，都位于JUMPStart序列和gnd基因之间。

3、按照权利要求2所述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特异性的基因是：转运酶基因，其包括wzx基因；聚合酶基因，其包括wzy基因；糖基转移酶基因，其包括orf2、orf9、orf11、orf12基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的8601至9803碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的10491至11831碱基的核苷酸；orf2是SEQID NO：1中的2113至3129碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1中的9806至10510碱基的核苷酸；orf11是SEQ ID NO：1中的11843至12586碱基的核苷酸；orf12是SEQ ID NO：1中的12598至13506碱基的核苷酸。

4、按照权利要求1或2所述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于：其还包括源于所述的wzx基因、wzy基因以及它们的混合或它们的重组。

5、按照权利要求4所述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其中源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的8987至9008碱基的核苷酸和9399至9419碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9108至9130碱基的核苷酸和9532至9556碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的11055至11075碱基的核苷酸和11766至11786碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10674至10692碱基的核苷酸和11319至11339碱基的核苷酸。

6、权利要求1所述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。

7、权利要求1所述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O86型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。

8、按照权利要求1所述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌。

9、权利要求1所述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O86型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O86型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O86型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O86型的O-抗原的高度特异性；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O86，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O86的灵敏度。

10、根据权利要求9所述的对大肠杆菌O86型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O86型，离心收集细胞；用pH值为8.0的500μl 50mMTris-HCl和10μl 0.4MEDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10μl 10mg/mL的溶菌酶继续保温20分钟；之后加入3μl 20mg/mL的蛋白酶K、15μl 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3μl 10mg/mL的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，酚∶氯仿∶异戊醇的混合体积比例为25∶24∶1；上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30μl TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O86型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O86型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JUMPStart序列设计上游引物为#wl-1098-ATTGGT AGC TGT AAG CCA AGG GCG GTA GCG T，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物为#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGTTCG C；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，

退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCRPreps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9μ1 O.1M MnCl₂，1μl 1∶2000稀释的1mg/mL的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2μl 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇的混合溶液抽提一次，酚∶氯仿∶异戊醇的混合体积比例为25∶24∶1再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18μl水中，随后在此混合物中加入2.5μldNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25μl 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80μl，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾；此混合物经等体积氯仿：异戊醇的混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90μl，氯仿∶异戊醇的混合体积比例为24∶1；其中有98μl的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的pH值为5.2的3M NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30μl水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3μl连接产物与50μl感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1mL的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O86型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O86型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心的Orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用Blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国Sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O86型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O86组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O86型的O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用；将10μl大肠杆菌O86的冻存菌液接种到有20mL LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200mL LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h；从培养好的菌液中取3mL菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板；用寡核苷酸对进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，55℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环；反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性；参入了5×10³，5×10²，5×10¹，0个和5个活菌的每份猪肉馅均在引物的PCR反应中得到阳性结果；参入0个活菌的猪肉馅在引物的PCR反应中得到阴性结果；说明使用上述方法时，引物对猪肉馅中大肠杆菌O86的检测灵敏度均为0.25个菌/g。