CN100345968C - 对大肠杆菌o15型的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O15型(Escherichia coli O15)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌型中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长11893个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O15型的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O15型的方法。

Description

对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O15型(Escherichia coli O15)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O15型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O15型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rib)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3基因。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O15型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O15型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O15型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O15型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O15型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长11893个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸，其是由命名为orf1，wzx，orf3，wzy，fnlA，fnlB，fnlC，orf8，orf9的9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述基因中具有高度特异性的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的2430至3674碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的4707至5885碱基的核苷酸；orf3是SEQ ID NO：1中的3671至4657碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸，其中它还包括源于所述的wzx基因、wzy基因基因；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的3092至3112碱基的核苷酸和3429至3450碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的2475至2492碱基的核苷酸和2966至2984碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5464至5483碱基的核苷酸和5840至5860碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4996至5016碱基的核苷酸和5444至5461碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O15型的O-抗原，及制备细菌疫苗中的应用。

前述的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。

前述的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O15型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O15型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O15型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O15型的O-抗原的高度特异性；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O15，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O15的灵敏度。

前述的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O15型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O15型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O15型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bi0-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bi0-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O15型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O15型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到9个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O15的第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O15型的O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O15的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的3092至3112碱基的核苷酸和3429至3450碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的2475至2492碱基的核苷酸和2966至2984碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5464至5483碱基的核苷酸和5840至5860碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4996至5016碱基的核苷酸和5444至5461碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O15的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长11893个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由命名为orf1，wzx，orf3，wzy，fnlA，fnlB，fnlC，orf8，orf9的9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O15型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O15型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O15型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的2430至3674碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的4707至5885碱基的核苷酸)。源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O15型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O15型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O15型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O15型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O15型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O15型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O15型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O15型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O15型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGTTCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCRPreps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O15型的基因组作5个LongPCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O15型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到9个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf2和orf4是大肠杆菌O15种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。orf2编码的蛋白与大肠杆菌(BAA15879)的O-抗原转移酶有27％的序列一致性和49％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf2为wzx。orf4编码的蛋白与Caenorhabditis elegans(AAO16303)的O-抗原聚合酶有23％的一致性和46％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有10个跨膜片段，并且有一个大的胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf4为wzy。

orf3基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有35％的序列一致性和53％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族2的共有序列的同源性预期值为7×e^-15，因此我们推测这个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆菌O15的O-抗原的寡糖单位可能由二个单糖组成。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf3。

orf5，6，7编码的蛋白与Escherichia coliO-抗原基因簇中fnlABC基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性(71％-90％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf5，6，7编码的蛋白与已知的Fnl1，2，3蛋白的共有序列的同源性预期值非常高，因此我们将这三个基因暂命名为fnlA，B，C。Orf8编码的蛋白与大肠杆菌(AAN60464)中的编码的L-fucosamine transferase有72％的氨基酸序列一致性和84％的相似性，因此我们推测这个基因编码L-fucosamine transferase。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为命名为Orf8。Orf1编码的蛋白与大肠杆菌(AAC61885)抗原基因簇中编码的H repeat-associated蛋白有97％的氨基酸序列一致性和98％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf1编码的蛋白与已知的H repeat-associated蛋白的共有序列的同源性预期值为5.1×e^-48，由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf1。Orf9编码的蛋白与大肠杆菌(AAN60465)O-抗原基因簇中编码的WbuC蛋白有70％的氨基酸序列一致性和87％的相似性，由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf9。

实施例6：特异基因的筛选：

针对大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O15组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O15型的O-抗原都是高度特异的；这些基因在核苷酸序列中的位置见表1所示。

实施例7：引物灵敏度的检测。

购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O15的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的3092至3112碱基的核苷酸和3429至3450碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的2475至2492碱基的核苷酸和2966至2984碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5464至5483碱基的核苷酸和5840至5860碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4996至5016碱基的核苷酸和5444至5461碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O15的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology 1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O15的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

根据本发明的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ IDNO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表1列出了大肠杆菌O15型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O15型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共12组，它们的来源都列于表中。

在第13组中含有大肠杆菌O15型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O15型及其O-抗原是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O15型中筛选到对大肠杆菌O15型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O15型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O15型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O15型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇的结构，共由9个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O15型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

              SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>对大肠杆菌O15型的O抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O15型的O抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>11893

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

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acgataaaaa ataccattct gaattttttt gcggtgtggt gcttgctcgt tttatattaa    2700

tgctaattgc agctattata ctcataatac tctgtttttt ttatgttttt aacgacgtta    2760

agtatttgtt atgtgttggt tttctgtccg taattgcagg tgttttcaat ccaaattggt    2820

ttttgcaagg taaggaaatg atgagtgtga tggctgtgct gtcactattt tcacgaggca    2880

tagcagtcgt tgcagtttat ctaattataa aacccgcaac gccgatgtac atcagtgcct    2940

tattattgag catgccatat attttgtatt cattctgtgg cgttgcctac ttacttatta    3000

tcaaggagat ttttttatgt aggccaccga taaagaaaat tcaagtaatt ttaaaaaatg    3060

gatttcattt tttttgttca acacttgcga ctagtgcata cacaatgttg acccctcttg    3120

tattgggtgg cgtatctgga aagtttgatg taggcatctt taactcagct aacatgatca    3180

aacaaggttt ggctggactt gcatcaccat tagtccaagc tttttatcca agaattaaca    3240

ttttgcaaag agagaatcca tatattgcaa acttaaaatc tagaatgatt cttaaatact    3300

tgcttgtttt ttacatggct ttagcaatgc catttttact ttttgccaac caattatcat    3360

tattaatatt cggcatgaaa ggtgaagtaa ttgcaggtgc aatgcaatta atgacattgc    3420

ttcctatatt cataggtttt aatacagttg tcgggttact tgtattagta cctaatggga    3480

tgcaaaaaca gtatttcaaa tctattttcc taggaactat tacttgttta agcatagttt    3540

atccagcatg taaatattat ggagcaacgg gtgcgattgt gagtcttatt gtagctgaaa    3600

ttttcgttgg catgggaatg cttaaacaat tcattaaagt aaataaaact gtatgtaggc    3660

ctcataaatt atgaatatct cggtaataat atctgtttgg aaacgcccag ttcaattaga    3720

attgattctc tctgagctcg attctcaggc taaagacaat agtctacacc tagaagtaat    3780

tgtttccgat agtcatagtg gtaaagaaat tgatgatgta gttgctgata atattcataa    3840

aaagaaaaat attaatatta tccatcaaca tactaaaaat atactctccg ctaagcgcaa    3900

tttcggagca tccctagccc atggggatta tttaatattt cttgatgatg attgtatacc    3960

cgcaagtgga tatatatcat cgttgctgaa ctatttaaaa aaaatgaata gtaaaagcgt    4020

attatgtggg gaagttagat tcgaaaatga actcattgag accagcaatt actatcgcta    4080

caggaactct ttacacccta agtttagtga tagtcatgat atctctatga atgcctggac    4140

ttttgtcgca atgaattgtg ttcttgatag aaaggcattt tcatcaggta tagtttcata    4200

taatgaaaat tttattggtt atggttgtga agatcatgag tttgggtggc aacttgaaaa    4260

aaatgacttc aaaattattt ttgctgattt taaaatatta catcacgaat acagtggcga    4320

tatagaagga tatacaaaaa aaattcgtgc tacagcacgt gatggtatga atgtattaag    4380

caaagtaaga cctgaaatgt tttctactaa taaaaaatta ttcctggttg agaaaatatt    4440

tagtaaacac aaaatgttta gtaaaatatg ccaatcaata tttttcaata aatttatttt    4500

taaaaaaata atacaatttt taaaaaaaac agatgcaaat aaaaaactct atttcccaat    4560

tctttacaga tatgtgttga tttcggcata tatacatggt attggagagc gtggcacctc    4620

aaaaacagat gaattgctta agaactggta tatatagatg atgctatctt catttattaa    4680

gacatttgta tggaaggtaa aagacaatga agtataatgc attgatggct tttttattat    4740

tttttgttgt tttttttaga ttgtcgctga taataccttt cttatatttg gcatttattc    4800

ctgcattttt tggtattatg tatttagtgc gtaattttat gattactatg ggcaatggat    4860

tggtatctat agatcgtaaa aatttgttgc tgttatctat attcataatt atttttttat    4920

tttgtatggt tttcgattcg tttcaaaaaa gccaatcttt tcaaagctat tttaccgtta    4980

gattatttat gttgttttta ttttcatttg ttcctgcgta ttatttagta aatagattca    5040

taaagggtga cttgaaatta atggagcgaa tattagtgta ttctctctgg gttcaaatag    5100

ttattttttt tggtatgtat ataagtccag agttaaaaag attgttatat actttctttg    5160

gtatgtctga ctcagttaat ctttgggaac aaaatgctaa agtaagagga tttgggttgt    5220

cgggtgaaat aaatttcatg acaccatttt tgatgatcta tatgtcattt tttatgatga    5280

aaaggcgtta tgctttaatt actttaattt gtcttactca aatcgtaaat tctaacatgg    5340

ctgtgattgc agccattatt ggtatcggtt gctctagact taatattaat ataaaaattg    5400

caacagtatt ggttttggga gttttagttt atagcttagg agcggtgttc ttccctcgat    5460

tttatgatga gttcgtttct ggagatggca caagaactct ggatatctta ttacagcaac    5520

atgtgtttgt tgtaggtaat ttagattttt ttaatattat atttggatta cagcaaaaca    5580

tatcttcatc aatccccgat attaaacaaa gttcggatat gggctgggtt atactgttta    5640

attacggtgg gttaacattt attacactct ttttattttt aatctttact atttctattg    5700

cgacatttgg aatgacatat caagcaatta tatggatgtt aattgggata attttcaata    5760

ccaaaggttt agttttagga tctaacggct atttctttct atcttttata tatatgtttt    5820

tgaatagagt aacacttagt ggacagagtt caattactaa taagttaggc caagtaagta    5880

aatagcttcc agagtatatt tgtcaataat ttgaggttcg gttattatgt tttcatctaa    5940

aacactgtta attactggtg gtactggctc tttcgggaat gctgtattaa atagatttct    6000

tgatacagat attgcagaaa tccgtatatt tagtcgtgat gaaaaaaaac aagatgatat    6060

gcggaaaaaa tacaataatc aaaaattaaa gttctatatt ggtgatgtca gagattaccg    6120

tagtattttg aatgcgactc gcggtgttga ttttatatat catgcagcgg cacttaagca    6180

agttccatca tgtgaatttc atcctatgga agccgttaaa actaatatcc ttggtacgga    6240

aaatgttctt gaagcagcta tagcgaatga agtgaagagg gttgtatgcc taagtactga    6300

taaagctgta tacccgatta acgcaatggg tatttcaaaa gctatgatgg aaaaggtcat    6360

ggtcgcgaaa tcccgtaatg ttgatcgcaa taaaacagta atatgtggta cccgttatgg    6420

gaatgttatg gcatctcgcg gttcagttat tccattattt gttgatctta ttagagcggg    6480

caagccactc acaataactg atcctaatat gacccgcttt atgatgactc ttgaggatgc    6540

ggtagattta gttctttatg cgtttgaaca tggtaataat ggtgatatct ttgtgcaaaa    6600

agcacctgca gcaactattg acacattagc tattgcttta aaggaattac taaatgttcc    6660

agaccatccg gtaaatgtca ttggaacgcg tcatggcgag aaattatatg aagctctact    6720

tagtcgtgag gaaatgatcg ctgctataga tatgggtgat tattaccgtg tcccgccaga    6780

tcttcgtgac cttaattatg gcaaatatgt tgagcaaggt gatagccgaa tatctgaaat    6840

agaagattat aactctcata atactcaacg gttagatgtt gaaggcatga aagagctctt    6900

gctaaaatta gcctttattc gagcaattcg tgctggtgaa aaatataatc tggattcatg    6960

atatgaaaat attagttact ggtgcaaatg gttttattgg tcgtaattta tgtttgaggc    7020

ttgaggaact tggttataaa gatcttatta gaatcgatcg agaatcaacg aagcaagatc    7080

ttgaacaagg cttacaggat gccgatttta tttatcactt agctggtatc aatagaccta    7140

agactgatga tgagtttatt tctggaaaca gtgatttaac aaagcatata gttgagtatc    7200

tcctttctat tggtaagaat acaccaatta tgctaagttc ttcgatacaa gctgaactta    7260

ataatgctta tggggttagc aaagctgtag ctgaaagcta tgtccaaaaa tatgctgctg    7320

ctagtggttc ttcgtattat attttcagat atccaaacgt ttttggtaaa tggtgtaagc    7380

caaactataa ttcttttata gcaacttttt gctacaatat ttccaatgat attgagatta    7440

ctatcaatga tgcatcagcg ccagtcaaac tggtttatat tgatgatgtt tgtactgatg    7500

ctatagctct tctctctggg acggttgaaa gcggatataa agttgttgca ccaatttatt    7560

caacaacagt tggtgaagtt gcagaattaa tttatagctt caaaaatagc cgttccaccc    7620

tgatcacaga ggctgtcggg gcgggattta cccgtgcatt gtattctaca tggctgagtt    7680

atttaccagc agagaagttt gcgtacaagg taccttttta tggggatgcc cgcggagtct    7740

tttgtgagat gttgaaaacg ccttcagcgg ggcagttttc attttttact gctcaccctg    7800

gtattacgcg tggcggacat taccatcaca gtaaaaatga gaagtttttg gtcattcgag    7860

gtcaggcatg ctttaaattt gaacatgtga ttaccggtga gcgatatgaa ctgcaagttt    7920

catcgggtga gtttaagatt gttgaaacag ttcctggttg gacacatgac attacaaata    7980

ttggaactga tgaattaata gtcatgctct gggcaaatga aattttcaac cgtgatgagc    8040

ccgatactat tgcgagacct ctataatgaa aaaattaaaa gttatgtctg ttgttggaac    8100

ccgtcctgag attatccgtt tgtcgagggt tcttgctaag tttgatgaat actgcgagca    8160

tattattgtc catactggtc aaagttatga ttacgaatta aatgaagtgt tcttcaatga    8220

cttgggtgtt cgaaaacctg attatttttt aaatgcagcg ggtaaaaatg cggcggaaac    8280

cattggccag gttattatta aggtagatga agtattagaa atcgaaaaac ctgaagcaat    8340

actggtattg ggcgatacga attcatgtat ttctgccatt ccggccaaac gccgtaaagt    8400

gcctatattt catatggaag caggtaaccg gtgtttcgat caacgcgtgc ctgaagaaac    8460

caacagacgt attgttgacc atacggctga tatcaatatg acctacagtg atattgctcg    8520

tgaatatctc ttggctgaag gtatcccagc tgatcggatc ataaaaactg gtagccctat    8580

gtttgaggtt ctttcatatt atatgcccca aattgatggt tcagatgtgc tatcgcgttt    8640

gaatctacag tctggtgagt tttttgtagt aagtgcgcat cgtgaagaga atgttgattc    8700

gccaaaacag ctcgtaaagc ttgcgaacat tctaaatact gttgctgaaa aatataacct    8760

tccagttatt gtctccacac acccaaggac acgtaaccga atccgtgagc aaggaattga    8820

atttcattca aatataaatc tactaaaacc attgggtttc catgattata accacttgca    8880

gaagaactca cgagctgtgc tttcagatag cggtactatc actgaagagt catccatcat    8940

gaatttccca gcggtaaaca tccgggaagc gcatgagcgt ccggaaggct ttgaggaagc    9000

atccgtcatg atggtggggt tagagtgtga acgcgtatta caagcgctgg atattctggc    9060

aacacaaccg agaggtgaag tccgtctttt acgtcaggtt agtgattaca gcatgccaaa    9120

tgtgtcggat aaagttgtca gaattgttca ctcttacaca gattatgtta agagagtcgt    9180

ctggaaagaa tattgatgaa acttgcttta atcatagatg attacctgcc caacagtact    9240

cgtgttggtg caaaaatgtt tcatgaactt gctcaagaat ttatccagcg tgggcacgat    9300

gttacggtaa ttactcctgg tacgggcatg caagaagaga tttcttttga tacctttcag    9360

ggggtaaaaa catggcgttt taaaagcggg ccgctcaagg atgtaagtaa aattcagcga    9420

gcgatcaatg aaacgctttt gtcctatcgg gcgtggaaag ccatcaaaaa atgggtaaaa    9480

aaagagacct ttgagggggt gatttattat tcaccttcca tattctgggg gcatttagtt    9540

aaaaaaatta aagctcgttg ccaatgtcct gcttatctta ttttaagaga tatgtttcca    9600

caatgggtaa ttgatgcagg aatgcttaat gctggttccc caatagaacg ctactttcgt    9660

ctttttgaaa aaatatctta tcgtcaggca aattttattg gacttatgtc tgataagaat    9720

cttgatgttt ttcggaaaga taataaaggc tatccgtgcg aagttttgcg taattgggcc    9780

tccctaacac caacgatcat acccaaggat tatataccac tacgtaagcg acttggccta    9840

gaggataaaa ccattttctt ctatggtgga aacataggtc atgcacagga catgacaaac    9900

ttgatgcgac ttgtgagaaa catggcagca tatcctcaag ctcatttcct atttattggc    9960

cagggggatg aagttgaatt aattaattca ttagcctctg agtgggcatt gacgaatttc    10020

acctatttgc cctcggttaa tcaggatgaa tttaagttca ttttgtcgga aatggatatc    10080

ggcttgtttt ctctttccgc taggcactct tcccataatt ctcctggtaa gttattaggc    10140

tatatggttc agtcgctacc tattttaggt agcgtaaatg ccggaaatga tttgctcgac    10200

attgtcaatc aaaataatgc cggattaatc catgtcaatg gtgaggatga taaattatgt    10260

caatctgcgc tattaatgtt gcatgatatt gatgtgcgcc ggcaacttgg ttcgggggcg    10320

aatatattgt tgaaagaaca attctccgtt gagtctgcgg cacagacgat agaaatgagg    10380

ttggaggcat gcaatgcgat taattgataa tgaccaactc gacgaattat atgatcaagc    10440

cgggcaatcg gaacgtttac gttcccacct tatgatgcac ggctcgcatc aagaaaaggt    10500

acagcgttta cttattgcat tagtaaaggg cagctatgtt gaaccgcatt atcacgaact    10560

tcctcatcag cgggaaatgt tcattgttat ggaggggcaa cttaaggttt gtttatatgg    10620

tagaaatggt gaggttataa agcaatttat agcaggagat aatactggaa taagcattgt    10680

ggagttttct ccgggcgata tacacagtgt cgaatgccta tctccgcgtg ctcttatggt    10740

ggaagttaag gaggggccat ttgacccttc ttttgcaaaa tcgttcgtgt gatgcttgtc    10800

taaagtacat cttctgctat ctacccaagc taaacctgag ttaacatcca taccatattt    10860

caagctgcgc atatcttgcg cggtgaccac ccctgacagg agtaaacaat gtcaaagcaa    10920

cagatcggcg tcgtcggtat ggcagtgatg gggcgcaatc ttgcgcttaa catcgaaagc    10980

cgtggttata ccgtctctat tttcaaccgt tcccgtgaaa agacggaaga agtgattgcc    11040

gaaaatccag gcaaaaaact ggttccttac tatacggtga aagagttcgt tgaatctctg    11100

gaaacgcctc gtcgcatcct gttaatggtt aaagcaggtg caggcacgga tgctgctatt    11160

gattccctca aaccatatct cgataaaggt gacatcatca ttgatggtgg taacaccttc    11220

ttccaggaca ctattcgtcg taaccgtgag ctttctgcag aaggctttaa cttcatcggt    11280

accggtgttt ccggcggtga agagggggcg ctgaaagggc cttccattat gcctggtggg    11340

cagaaagaag cctatgaact ggttgctccg atcctgacca aaatcgccgc cgttgctgaa    11400

gatggcgaac cgtgcgttac ctatattggt gccgatggcg cgggtcacta tgtgaagatg    11460

gttcacaacg gtattgaata cggtgatatg caactgattg ctgaagccta ttctctgctt    11520

aaaggtggcc tgaatctttc caacgaagaa ctggcgcaga cgtttaccga gtggaataac    11580

ggtgaactga gcagctacct gatcgacatc accaaagaca tcttcactaa aaaagatgaa    11640

gacggtaact acctggttga tgtgatcctg gatgaagcgg ctaacaaagg taccggtaaa    11700

tggaccagcc agagcgcgct tgatctcggc gaaccgctgt cgctgattac cgagtctgtg    11760

tttgcacgat acatctcttc tctgaaagag cagcgtgttg ccgcatttaa agttctttct    11820

ggtccgcaag cgcagcctgc tggcgacaaa ggtgaattca tcgaaaaagt tcgccgtgcg    11880

ctgtatctgg gta                                                       11893

表1大肠杆菌O15型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物	反向引物	PCR产物的长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								Wzx	O-抗原转运酶	2430-3674	3092-3112	3429-3450	359bp	0*	56
			2475-2492	2966-2984	510bp	0*	62
								Wzy	O-抗原聚合酶	4707-5885	5464-5483	5840-5860	397bp	0*	56
			4996-5016	5444-5461	466bp	0*	56

^*只在大肠杆菌O15型中得到正确的一条带

表2166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号

该组中含有的菌株

来源

1、野生型大肠杆菌2、野生型大肠杆菌3、野生型大肠杆菌4、野生型大肠杆菌5、野生型大肠杆菌6、野生型大肠杆菌7、野生型大肠杆菌8、野生型大肠杆菌9、野生型大肠杆菌痢疾志贺氏菌10、鲍氏志贺氏菌11、福氏志贺氏菌12、野生型大肠杆菌13、第1组菌株加上大肠杆菌标准菌株O15

O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O16，O17，O18，O19ab，O20，O21，O22，O23，O24O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，O57，O58，O60，O61，O62，O53O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81，O82，O83，O68O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153O168，O169，O170，O171，O172，O173，D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B17，B18F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v:4)，F5(v:7)，F6，DS，DRO3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119

IMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSabcdddIMVSaIMVSa

为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阳性对照

a.Institute of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3大肠杆菌O15型O抗原基因结构图

E.coloi O15 O-antigen gene claster

      

#orf   galF          orf1        wzx      orf3       wzy       fnl4      fnlB     fnlC     orf8    orf9     gnd

％G+C                42％        34％     31％       29％      37％      38％     41％     40％    43％

content

表4大肠杆菌O15型O抗原基因簇基因位置

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC    60

GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTTC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT    120

CAACTGCTTG CGGAAGTGCA GTCCATCTGT CCACCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT    180

CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTATGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC    240

AATCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGACG ACGCCAGCGC CGACCCGCTG    300

CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCACGA TTCAACGAAA CGGGTCGTAG CCAGGTGCTG    360

GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCGGTCA TCCAGACCAA AGAACCACTG    420

GACCGTGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG    480

ACGTTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG    540

GAACTTGAAC GCACGCAGCC AGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCCATCGCT    600

GAACTGGCGA AAAAACAGTC CGTTGATGCC ATGCTGATGA CAGGTGACAG CTACGACTGC    660

GGTAAAAAAA TGGGTTATAT GCAGGCATTT GTGAAGTATG GACTACGCAA CCTGAAAGAA    720

GGGGCGAAGT TCCATAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG    780

ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT    840

TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG    900

GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT    960

AGCGTTTGAA TTTTTCGAGC TAAGCGCGAG TGGGTAACGC TCGTCACATC GTAGACATGC    1020

ATGCAGTGCA CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG AGCGGTAGCG TGTCTAGGGG CAGGGAAAGA    1080

TTATCAGAAG TACACTTTTT GTACTAAATA ATTCGCATTT TATGTTCAAA AATTGAGATA    1140

TCCCTCATTA CCTAAAACTG TTTTTCACAG CTTATATATG ATCAAATACT CCTTGCTTAA    1200

                    orf1的起始

ATAAGGAGAA CAAA ATGGAA CTTAAAAAAT TGATGGAACA TATTTCTGTT ATTCCCGATT  1260

ACAGACAAGC CTGGAAAGTG GAACATAATT TGTCGGATAT TCTACTGTTG ACTATTTGTG    1320

CCGTCATTTC TGGTGCAGAA GGCTGGGAAG ATATAGAGGA TTTTGGGGAA ACACATCTCG    1380

ATTTTTTGAA GCAATATGGT GATTTTGAAA ATGGTATTCC TGTTCACGAT ACCATTGCCA    1440

GAGTTGTATC CTGTATCAGT CCTGCAAAAT TTCACGAGTG CTTTATTAAC TGGATGCGTG    1500

ACTGCCATTC TTCAGATGAT AAAGACGTCA TTGCAATTGA TGGAAAAACG CTCCGGCACT    1560

CTTATGACAA GAGTCGCCGC AGGGGAGCGA TTCATGTCAT TAGTGCGTTC TCAACAATGC    1620

ACAGTCTGGT CATCGGACAG ATCAGGACGG ATGAGAAATC CAATGAGATT ACAGCTATCC    1680

CTGAACTTAT TAACATGCTG GATATTAAAG GAAAAATCAT CACAACTGAT GCGATGGGTT    1740

GCCAGAAAGA TATTGCAGAG AAGATACAAA AACAGGGATG TGATTATTTA TTCGCGGTAA    1800

AAGGAAACCA GGGGCGGCTA AATAAAGCCT TTGAGGAAAA ATTTCCGCTG AAAGAATTAA    1860

ATAATCCAGA GCATGACAGT TACGCAATTA GTGAAAAGAG TCACGGCAGA GAAGAAATCC    1920

GTCTTCATAT TGTTTGCGAT GTCCCTGATG AACTTATTGA TTTCACGTTT GAATGGAAAG    1980

GACTGAAAAA ATTATGTGTG GCAGCCTCCT TTCGGTCAAT AATAGCAGAA CAAAAGAAAG    2040

AGCCAGAAAT GACGGTCAGA TATTATATCA GTTCTGCTGA TTTAACCGCA GAGAAGTTCG    2100

CCACAGCAAT CCGAAACCAC TGGCACGTGG AGAATAAGCT GCACTGGCGT CTGGACGTGG    2160

TAATGAATGA AGACGACTGC AAAATAAGAA GAGGAAATGC AGCAGAATTA TTTTCAGGGA    2220

TACGGCACAT CGCTATTAAT ATTTTGACGA ATGATAAGGT ATTCAAGGCA GGGTTAAGAC    2280

GTAAGATGCG AAAAGCAGCC ATGGACAGAA ACTATCTGGC GTCAGTCCTT GCGGGGAGCG    2340

         orf1的终止

GGCTTTCG TA ATCTTGCCCT GAATAAACAA CTTATTGATT CATGTGAATA AGTTACTCGA  2400

                            orf2的起始

ATGATATCTG TTGTATATGG GGCACTTCA T TGAGCAAAAC TAAACTAAAT GTTCTTTACC  2460

TTGCAATAAG TCAGGGTGCC AATTACCTAC TGCCATTATT AATTTTTCCT TATCTTGTTA    2520

GAGTCATTGG TGTATCGAAT TTTGGTGATC TGAGTTTTTC ATTGATAACT ATACAAGTGT    2580

TGTTAATGGT TGTTGAATAT GGTTTTGGAT ATAGTGGGAC AAGAGAAATA GCACTAAATA    2640

ACGATAAAAA ATACCATTCT GAATTTTTTT GCGGTGTGGT GCTTGCTCGT TTTATATTAA    2700

TGCTAATTGC AGCTATTATA CTCATAATAC TCTGTTTTTT TTATGTTTTT AACGACGTTA    2760

AGTATTTGTT ATGTGTTGGT TTTCTGTCCG TAATTGCAGG TGTTTTCAAT CCAAATTGGT    2820

TTTTGCAAGG TAAGGAAATG ATGAGTGTGA TGGCTGTGCT GTCACTATTT TCACGAGGCA    2880

TAGCAGTCGT TGCAGTTTAT CTAATTATAA AACCCGCAAC GCCGATGTAC ATCAGTGCCT    2940

TATTATTGAG CATGCCATAT ATTTTGTATT CATTCTGTGG CGTTGCCTAC TTACTTATTA    3000

TCAAGGAGAT TTTTTTATGT AGGCCACCGA TAAAGAAAAT TCAAGTAATT TTAAAAAATG    3060

GATTTCATTT TTTTTGTTCA ACACTTGCGA CTAGTGCATA CACAATGTTG ACCCCTCTTG    3120

TATTGGGTGG CGTATCTGGA AAGTTTGATG TAGGCATCTT TAACTCAGCT AACATGATCA    3180

AACAAGGTTT GGCTGGACTT GCATCACCAT TAGTCCAAGC TTTTTATCCA AGAATTAACA    3240

TTTTGCAAAG AGAGAATCCA TATATTGCAA ACTTAAAATC TAGAATGATT CTTAAATACT    3300

TGCTTGTTTT TTACATGGCT TTAGCAATGC CATTTTTACT TTTTGCCAAC CAATTATCAT    3360

TATTAATATT CGGCATGAAA GGTGAAGTAA TTGCAGGTGC AATGCAATTA ATGACATTGC    3420

TTCCTATATT CATAGGTTTT AATACAGTTG TCGGGTTACT TGTATTAGTA CCTAATGGGA    3480

TGCAAAAACA GTATTTCAAA TCTATTTTCC TAGGAACTAT TACTTGTTTA AGCATAGTTT    3540

ATCCAGCATG TAAATATTAT GGAGCAACGG GTGCGATTGT GAGTCTTATT GTAGCTGAAA    3600

TTTTCGTTGG CATGGGAATG CTTAAACAAT TCATTAAAGT AAATAAAACT GTATGTAGGC    3660

    orf3的起始  orf2的终止

CTCATAAATT  ATGAATATCT CGGTAATAAT ATCTGTTTGG AAACGCCCAG TTCAATTAGA  3720

ATTGATTCTC TCTGAGCTCG ATTCTCAGGC TAAAGACAAT AGTCTACACC TAGAAGTAAT    3780

TGTTTCCGAT AGTCATAGTG GTAAAGAAAT TGATGATGTA GTTGCTGATA ATATTCATAA    3840

AAAGAAAAAT ATTAATATTA TCCATCAACA TACTAAAAAT ATACTCTCCG CTAAGCGCAA    3900

TTTCGGAGCA TCCCTAGCCC ATGGGGATTA TTTAATATTT CTTGATGATG ATTGTATACC    3960

CGCAAGTGGA TATATATCAT CGTTGCTGAA CTATTTAAAA AAAATGAATA GTAAAAGCGT    4020

ATTATGTGGG GAAGTTAGAT TCGAAAATGA ACTCATTGAG ACCAGCAATT ACTATCGCTA    4080

CAGGAACTCT TTACACCCTA AGTTTAGTGA TAGTCATGAT ATCTCTATGA ATGCCTGGAC    4140

TTTTGTCGCA ATGAATTGTG TTCTTGATAG AAAGGCATTT TCATCAGGTA TAGTTTCATA    4200

TAATGAAAAT TTTATTGGTT ATGGTTGTGA AGATCATGAG TTTGGGTGGC AACTTGAAAA    4260

AAATGACTTC AAAATTATTT TTGCTGATTT TAAAATATTA CATCACGAAT ACAGTGGCGA    4320

TATAGAAGGA TATACAAAAA AAATTCGTGC TACAGCACGT GATGGTATGA ATGTATTAAG    4380

CAAAGTAAGA CCTGAAATGT TTTCTACTAA TAAAAAATTA TTCCTGGTTG AGAAAATATT    4440

TAGTAAACAC AAAATGTTTA GTAAAATATG CCAATCAATA TTTTTCAATA AATTTATTTT    4500

TAAAAAAATA ATACAATTTT TAAAAAAAAC AGATGCAAAT AAAAAACTCT ATTTCCCAAT    4560

TCTTTACAGA TATGTGTTGA TTTCGGCATA TATACATGGT ATTGGAGAGC GTGGCACCTC    4620

                                       orf3的终止

AAAAACAGAT GAATTGCTTA AGAACTGGTA TATATAGATG ATGCTATCTT CATTTATTAA    4680

                          orf4的起始

GACATTTGTA TGGAAGGTAA AAGACA ATGA AGTATAATGC ATTGATGGCT TTTTTATTAT  4740

TTTTTGTTGT TTTTTTTAGA TTGTCGCTGA TAATACCTTT CTTATATTTG GCATTTATTC    4800

CTGCATTTTT TGGTATTATG TATTTAGTGC GTAATTTTAT GATTACTATG GGCAATGGAT    4860

TGGTATCTAT AGATCGTAAA AATTTGTTGC TGTTATCTAT ATTCATAATT ATTTTTTTAT    4920

TTTGTATGGT TTTCGATTCG TTTCAAAAAA GCCAATCTTT TCAAAGCTAT TTTACCGTTA    4980

GATTATTTAT GTTGTTTTTA TTTTCATTTG TTCCTGCGTA TTATTTAGTA AATAGATTCA    5040

TAAAGGGTGA CTTGAAATTA ATGGAGCGAA TATTAGTGTA TTCTCTCTGG GTTCAAATAG    5100

TTATTTTTTT TGGTATGTAT ATAAGTCCAG AGTTAAAAAG ATTGTTATAT ACTTTCTTTG    5160

GTATGTCTGA CTCAGTTAAT CTTTGGGAAC AAAATGCTAA AGTAAGAGGA TTTGGGTTGT    5220

CGGGTGAAAT AAATTTCATG ACACCATTTT TGATGATCTA TATGTCATTT TTTATGATGA    5280

AAAGGCGTTA TGCTTTAATT ACTTTAATTT GTCTTACTCA AATCGTAAAT TCTAACATGG    5340

CTGTGATTGC AGCCATTATT GGTATCGGTT GCTCTAGACT TAATATTAAT ATAAAAATTG    5400

CAACAGTATT GGTTTTGGGA GTTTTAGTTT ATAGCTTAGG AGCGGTGTTC TTCCCTCGAT    5460

TTTATGATGA GTTCGTTTCT GGAGATGGCA CAAGAACTCT GGATATCTTA TTACAGCAAC    5520

ATGTGTTTGT TGTAGGTAAT TTAGATTTTT TTAATATTAT ATTTGGATTA CAGCAAAACA      5580

TATCTTCATC AATCCCCGAT ATTAAACAAA GTTCGGATAT GGGCTGGGTT ATACTGTTTA      5640

ATTACGGTGG GTTAACATTT ATTACACTCT TTTTATTTTT AATCTTTACT ATTTCTATTG      5700

CGACATTTGG AATGACATAT CAAGCAATTA TATGGATGTT AATTGGGATA ATTTTCAATA      5760

CCAAAGGTTT AGTTTTAGGA TCTAACGGCT ATTTCTTTCT ATCTTTTATA TATATGTTTT      5820

TGAATAGAGT AACACTTAGT GGACAGAGTT CAATTACTAA TAAGTTAGGC CAAGTAAGTA      5880

   orf4的终止                                   orf5的起始

AA TAGCTTCC AGAGTATATT TGTCAATAAT TTGAGGTTCG GTTATT ATGT TTTCATCTAA  5940

AACACTGTTA ATTACTGGTG GTACTGGCTC TTTCGGGAAT GCTGTATTAA ATAGATTTCT      6000

TGATACAGAT ATTGCAGAAA TCCGTATATT TAGTCGTGAT GAAAAAAAAC AAGATGATAT      6060

GCGGAAAAAA TACAATAATC AAAAATTAAA GTTCTATATT GGTGATGTCA GAGATTACCG      6120

TAGTATTTTG AATGCGACTC GCGGTGTTGA TTTTATATAT CATGCAGCGG CACTTAAGCA      6180

AGTTCCATCA TGTGAATTTC ATCCTATGGA AGCCGTTAAA ACTAATATCC TTGGTACGGA      6240

AAATGTTCTT GAAGCAGCTA TAGCGAATGA AGTGAAGAGG GTTGTATGCC TAAGTACTGA      6300

TAAAGCTGTA TACCCGATTA ACGCAATGGG TATTTCAAAA GCTATGATGG AAAAGGTCAT      6360

GGTCGCGAAA TCCCGTAATG TTGATCGCAA TAAAACAGTA ATATGTGGTA CCCGTTATGG      6420

GAATGTTATG GCATCTCGCG GTTCAGTTAT TCCATTATTT GTTGATCTTA TTAGAGCGGG      6480

CAAGCCACTC ACAATAACTG ATCCTAATAT GACCCGCTTT ATGATGACTC TTGAGGATGC      6540

GGTAGATTTA GTTCTTTATG CGTTTGAACA TGGTAATAAT GGTGATATCT TTGTGCAAAA      6600

AGCACCTGCA GCAACTATTG ACACATTAGC TATTGCTTTA AAGGAATTAC TAAATGTTCC      6660

AGACCATCCG GTAAATGTCA TTGGAACGCG TCATGGCGAG AAATTATATG AAGCTCTACT      6720

TAGTCGTGAG GAAATGATCG CTGCTATAGA TATGGGTGAT TATTACCGTG TCCCGCCAGA      6780

TCTTCGTGAC CTTAATTATG GCAAATATGT TGAGCAAGGT GATAGCCGAA TATCTGAAAT      6840

AGAAGATTAT AACTCTCATA ATACTCAACG GTTAGATGTT GAAGGCATGA AAGAGCTCTT      6900

                                                             orf5的终止

GCTAAAATTA GCCTTTATTC GAGCAATTCG TGCTGGTGAA AAATATAATC TGGATTCA TG    6960

  orf6的起始

ATATGAAAAT ATTAGTTACT GGTGCAAATG GTTTTATTGG TCGTAATTTA TGTTTGAGGC      7020

TTGAGGAACT TGGTTATAAA GATCTTATTA GAATCGATCG AGAATCAACG AAGCAAGATC      7080

TTGAACAAGG CTTACAGGAT GCCGATTTTA TTTATCACTT AGCTGGTATC AATAGACCTA      7140

AGACTGATGA TGAGTTTATT TCTGGAAACA GTGATTTAAC AAAGCATATA GTTGAGTATC      7200

TCCTTTCTAT TGGTAAGAAT ACACCAATTA TGCTAAGTTC TTCGATACAA GCTGAACTTA      7260

ATAATGCTTA TGGGGTTAGC AAAGCTGTAG CTGAAAGCTA TGTCCAAAAA TATGCTGCTG      7320

CTAGTGGTTC TTCGTATTAT ATTTTCAGAT ATCCAAACGT TTTTGGTAAA TGGTGTAAGC      7380

CAAACTATAA TTCTTTTATA GCAACTTTTT GCTACAATAT TTCCAATGAT ATTGAGATTA      7440

CTATCAATGA TGCATCAGCG CCAGTCAAAC TGGTTTATAT TGATGATGTT TGTACTGATG      7500

CTATAGCTCT TCTCTCTGGG ACGGTTGAAA GCGGATATAA AGTTGTTGCA CCAATTTATT      7560

CAACAACAGT TGGTGAAGTT GCAGAATTAA TTTATAGCTT CAAAAATAGC CGTTCCACCC      7620

TGATCACAGA GGCTGTCGGG GCGGGATTTA CCCGTGCATT GTATTCTACA TGGCTGAGTT      7680

ATTTACCAGC AGAGAAGTTT GCGTACAAGG TACCTTTTTA TGGGGATGCC CGCGGAGTCT      7740

TTTGTGAGAT GTTGAAAACG CCTTCAGCGG GGCAGTTTTC ATTTTTTACT GCTCACCCTG      7800

GTATTACGCG TGGCGGACAT TACCATCACA GTAAAAATGA GAAGTTTTTG GTCATTCGAG      7860

GTCAGGCATG CTTTAAATTT GAACATGTGA TTACCGGTGA GCGATATGAA CTGCAAGTTT      7920

CATCGGGTGA GTTTAAGATT GTTGAAACAG TTCCTGGTTG GACACATGAC ATTACAAATA      7980

TTGGAACTGA TGAATTAATA GTCATGCTCT GGGCAAATGA AATTTTCAAC CGTGATGAGC      8040

                   orf6的终止  orf7的起始

CCGATACTAT TGCGAGACCT CTA TAATGAA AAAATTAAAA GTTATGTCTG TTGTTGGAAC    8100

CCGTCCTGAG ATTATCCGTT TGTCGAGGGT TCTTGCTAAG TTTGATGAAT ACTGCGAGCA      8160

TATTATTGTC CATACTGGTC AAAGTTATGA TTACGAATTA AATGAAGTGT TCTTCAATGA      8220

CTTGGGTGTT CGAAAACCTG ATTATTTTTT AAATGCAGCG GGTAAAAATG CGGCGGAAAC      8280

CATTGGCCAG GTTATTATTA AGGTAGATGA AGTATTAGAA ATCGAAAAAC CTGAAGCAAT      8340

ACTGGTATTG GGCGATACGA ATTCATGTAT TTCTGCCATT CCGGCCAAAC GCCGTAAAGT      8400

GCCTATATTT CATATGGAAG CAGGTAACCG GTGTTTCGAT CAACGCGTGC CTGAAGAAAC      8460

CAACAGACGT ATTGTTGACC ATACGGCTGA TATCAATATG ACCTACAGTG ATATTGCTCG      8520

TGAATATCTC TTGGCTGAAG GTATCCCAGC TGATCGGATC ATAAAAACTG GTAGCCCTAT      8580

GTTTGAGGTT CTTTCATATT ATATGCCCCA AATTGATGGT TCAGATGTGC TATCGCGTTT      8640

GAATCTACAG TCTGGTGAGT TTTTTGTAGT AAGTGCGCAT CGTGAAGAGA ATGTTGATTC      8700

GCCAAAACAG CTCGTAAAGC TTGCGAACAT TCTAAATACT GTTGCTGAAA AATATAACCT      8760

TCCAGTTATT GTCTCCACAC ACCCAAGGAC ACGTAACCGA ATCCGTGAGC AAGGAATTGA      8820

ATTTCATTCA AATATAAATC TACTAAAACC ATTGGGTTTC CATGATTATA ACCACTTGCA      8880

GAAGAACTCA CGAGCTGTGC TTTCAGATAG CGGTACTATC ACTGAAGAGT CATCCATCAT      8940

GAATTTCCCA GCGGTAAACA TCCGGGAAGC GCATGAGCGT CCGGAAGGCT TTGAGGAAGC      9000

ATCCGTCATG ATGGTGGGGT TAGAGTGTGA ACGCGTATTA CAAGCGCTGG ATATTCTGGC      9060

AACACAACCG AGAGGTGAAG TCCGTCTTTT ACGTCAGGTT AGTGATTACA GCATGCCAAA      9120

TGTGTCGGAT AAAGTTGTCA GAATTGTTCA CTCTTACACA GATTATGTTA AGAGAGTCGT      9180

       orf7的终止  orf8的起始

CTGGAAAGAA TAT TGATGAA ACTTGCTTTA ATCATAGATG ATTACCTGCC CAACAGTACT    9240

CGTGTTGGTG CAAAAATGTT TCATGAACTT GCTCAAGAAT TTATCCAGCG TGGGCACGAT      9300

GTTACGGTAA TTACTCCTGG TACGGGCATG CAAGAAGAGA TTTCTTTTGA TACCTTTCAG      9360

GGGGTAAAAA CATGGCGTTT TAAAAGCGGG CCGCTCAAGG ATGTAAGTAA AATTCAGCGA      9420

GCGATCAATG AAACGCTTTT GTCCTATCGG GCGTGGAAAG CCATCAAAAA ATGGGTAAAA      9480

AAAGAGACCT TTGAGGGGGT GATTTATTAT TCACCTTCCA TATTCTGGGG GCATTTAGTT      9540

AAAAAAATTA AAGCTCGTTG CCAATGTCCT GCTTATCTTA TTTTAAGAGA TATGTTTCCA      9600

CAATGGGTAA TTGATGCAGG AATGCTTAAT GCTGGTTCCC CAATAGAACG CTACTTTCGT      9660

CTTTTTGAAA AAATATCTTA TCGTCAGGCA AATTTTATTG GACTTATGTC TGATAAGAAT      9720

CTTGATGTTT TTCGGAAAGA TAATAAAGGC TATCCGTGCG AAGTTTTGCG TAATTGGGCC      9780

TCCCTAACAC CAACGATCAT ACCCAAGGAT TATATACCAC TACGTAAGCG ACTTGGCCTA      9840

GAGGATAAAA CCATTTTCTT CTATGGTGGA AACATAGGTC ATGCACAGGA CATGACAAAC      9900

TTGATGCGAC TTGTGAGAAA CATGGCAGCA TATCCTCAAG CTCATTTCCT ATTTATTGGC      9960

CAGGGGGATG AAGTTGAATT AATTAATTCA TTAGCCTCTG AGTGGGCATT GACGAATTTC      10020

ACCTATTTGC CCTCGGTTAA TCAGGATGAA TTTAAGTTCA TTTTGTCGGA AATGGATATC      10080

GGCTTGTTTT CTCTTTCCGC TAGGCACTCT TCCCATAATT CTCCTGGTAA GTTATTAGGC      10140

TATATGGTTC AGTCGCTACC TATTTTAGGT AGCGTAAATG CCGGAAATGA TTTGCTCGAC      10200

ATTGTCAATC AAAATAATGC CGGATTAATC CATGTCAATG GTGAGGATGA TAAATTATGT      10260

CAATCTGCGC TATTAATGTT GCATGATATT GATGTGCGCC GGCAACTTGG TTCGGGGGCG      10320

AATATATTGT TGAAAGAACA ATTCTCCGTT GAGTCTGCGG CACAGACGAT AGAAATGAGG      10380

             orf9的起始  orf8的终止

TTGGAGGCAT GCA ATGCGAT TAAT TGATAA TGACCAACTC GACGAATTAT ATGATCAAGC  10440

CGGGCAATCG GAACGTTTAC GTTCCCACCT TATGATGCAC GGCTCGCATC AAGAAAAGGT      10500

ACAGCGTTTA CTTATTGCAT TAGTAAAGGG CAGCTATGTT GAACCGCATT ATCACGAACT      10560

TCCTCATCAG CGGGAAATGT TCATTGTTAT GGAGGGGCAA CTTAAGGTTT GTTTATATGG      10620

TAGAAATGGT GAGGTTATAA AGCAATTTAT AGCAGGAGAT AATACTGGAA TAAGCATTGT      10680

GGAGTTTTCT CCGGGCGATA TACACAGTGT CGAATGCCTA TCTCCGCGTG CTCTTATGGT    10740

                                                     orf9的终止

GGAAGTTAAG GAGGGGCCAT TTGACCCTTC TTTTGCAAAA TCGTTCGTGT G ATGCTTGTC  10800

TAAAGTACAT CTTCTGCTAT CTACCCAAGC TAAACCTGAG TTAACATCCA TACCATATTT    10860

CAAGCTGCGC ATATCTTGCG CGGTGACCAC CCCTGACAGG AGTAAACAAT GTCAAAGCAA    10920

CAGATCGGCG TCGTCGGTAT GGCAGTGATG GGGCGCAATC TTGCGCTTAA CATCGAAAGC    10980

CGTGGTTATA CCGTCTCTAT TTTCAACCGT TCCCGTGAAA AGACGGAAGA AGTGATTGCC    11040

GAAAATCCAG GCAAAAAACT GGTTCCTTAC TATACGGTGA AAGAGTTCGT TGAATCTCTG    11100

GAAACGCCTC GTCGCATCCT GTTAATGGTT AAAGCAGGTG CAGGCACGGA TGCTGCTATT    11160

GATTCCCTCA AACCATATCT CGATAAAGGT GACATCATCA TTGATGGTGG TAACACCTTC    11220

TTCCAGGACA CTATTCGTCG TAACCGTGAG CTTTCTGCAG AAGGCTTTAA CTTCATCGGT    11280

ACCGGTGTTT CCGGCGGTGA AGAGGGGGCG CTGAAAGGGC CTTCCATTAT GCCTGGTGGG    11340

CAGAAAGAAG CCTATGAACT GGTTGCTCCG ATCCTGACCA AAATCGCCGC CGTTGCTGAA    11400

GATGGCGAAC CGTGCGTTAC CTATATTGGT GCCGATGGCG CGGGTCACTA TGTGAAGATG    11460

GTTCACAACG GTATTGAATA CGGTGATATG CAACTGATTG CTGAAGCCTA TTCTCTGCTT    11520

AAAGGTGGCC TGAATCTTTC CAACGAAGAA CTGGCGCAGA CGTTTACCGA GTGGAATAAC    11580

GGTGAACTGA GCAGCTACCT GATCGACATC ACCAAAGACA TCTTCACTAA AAAAGATGAA    11640

GACGGTAACT ACCTGGTTGA TGTGATCCTG GATGAAGCGG CTAACAAAGG TACCGGTAAA    11700

TGGACCAGCC AGAGCGCGCT TGATCTCGGC GAACCGCTGT CGCTGATTAC CGAGTCTGTG    11760

TTTGCACGAT ACATCTCTTC TCTGAAAGAG CAGCGTGTTG CCGCATTTAA AGTTCTTTCT    11820

GGTCCGCAAG CGCAGCCTGC TGGCGACAAA GGTGAATTCA TCGAAAAAGT TCGCCGTGCG    11880

CTGTATCTGG GTA                                                       11893

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1、一种对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于：其wzx序列为SEQ ID NO：1中的2430至3674碱基的核苷酸或wzy序列为SEQ IDNO：1中的4707至5885碱基的核苷酸或者具有上述序列插入、缺失或取代一个或多个核苷酸，但保持wzx、wzy核苷酸特异性检测大肠杆菌O15型的O-抗原功能的寡核苷酸。

2、一种对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于，其为源于wzx基因的寡核苷酸对：SEQ ID NO：1中的3092至3112碱基的核苷酸和3429至3450碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的2475至2492碱基的核苷酸和2966至2984碱基的核苷酸；或源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ IDNO：1中的5464至5483碱基的核苷酸和5840至5860碱基的核苷酸，SEQ IDNO：1中的4996至5016碱基的核苷酸和5444至5461碱基的核苷酸。

3、权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的寡核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原中的应用。

4、按照权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O15型的O-抗原特异的寡核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测体外及环境中的细菌。