CN1442423A - 对大肠杆菌o107型的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O107型(Escherichiacoli O107)的O－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O107型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长13188个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O107型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O107型的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O107型的方法。

Description

对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O107型(Escherichia coli O107)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O107型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O107型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

大肠杆菌O107于1997年首先在芬兰发现可引起婴幼儿和旅游者腹泻，属肠产毒性大肠杆菌，其潜在的爆发性流行的危险很大[Keskimaki M，Saari M，Heiskanen T.Shiga toxin-producing Escherichia coli in finland from 1990 through1997：prevalence and characteristics of isolates[J].J Clin Microbiol，1998，36(12)：3641-3646]，急需一个可以快速、准确检测大肠杆菌O107的方法。

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Joumal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测志大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification ofthe Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf7，orf8，orf9，orf10基因；糖合成路径基因，包括gne基因。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf7，orf8，orf9，orf10基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因、源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O107型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O107型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O107型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O107型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O107型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长13188个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸，其由11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf9、orf10基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的4604至5821碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的5814至7136碱基的核苷酸；orf7是SEQID NO：1中的7129至7926碱基的核苷酸；orf8是SEQ ID NO：1中的7913至8857碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1中的8854至9915碱基的核苷酸；orf10是SEQ ID NO：1中的9912至10679碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf7、orf8、orf9、orf10基因；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的4649至4666碱基的核苷酸和5664至5681碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4700至4717碱基的核苷酸和5626至5643碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4753至4770碱基的核苷酸和5266至5283碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5864至5882碱基的核苷酸和6852至6869碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5895至5916碱基的核苷酸和6813至6831碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的6072至6090碱基的核苷酸和6762至6779碱基的核苷酸；源于orf7基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的7141至7158碱基的核苷酸和7737至7754碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7167至7185碱基的核苷酸和7710至7727碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7190至7207碱基的核苷酸和7686至7703碱基的核苷酸；源于orf8基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的7936至7954碱基的核苷酸和8774至8791碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的8029至8046碱基的核苷酸和8652至8669碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的8101至8118碱基的核苷酸和8623至8640碱基的核苷酸；源于orf9基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的8862至8879碱基的核苷酸和9774至9791碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的8916至8933碱基的核苷酸和9681至9697碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9025至9043碱基的核苷酸和9647至9664碱基的核苷酸；源于orf10基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的9942至9959碱基的核苷酸和10586至10603碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10019至10036碱基的核苷酸和10502至10520碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10095至10112碱基的核苷酸和10454至10471碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O107型的O-抗原，并成为细菌疫苗。

前述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。

前述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O107型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟，之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O107型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O107型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应，合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5a细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨卞青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率，剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O107型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O107型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf7、orf8、orf9、orf10基因设计引物；在每个基因内各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf7、orf8、orf9、orf10基因对大肠杆菌O107型的O-抗原都是高度特异的。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长13188个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf9、orf10基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括gne基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O107型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf9、orf10基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O107型为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物。所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O107型的O-抗原是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O107型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的4604至5821碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的5814至7136碱基的核苷酸)；orf7基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的7129至7926碱基的核苷酸)；orf8基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的7913至8857碱基的核苷酸)；orf9基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的8854至9915碱基的核苷酸)；orf10基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的9912至10679碱基的核苷酸)；源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O107型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O107型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O107型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O107型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O107型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O107型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O107型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O107型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O107型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCTGGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long TemplatePCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇文库。实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率。剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O107型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O107型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf5编码的蛋白含有12个潜在跨膜片段，通过Eisenberg等的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984)“Analysis of membraneand surface protein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179：125-142]也发现Orf5有12个潜在的穿膜区，而且与许多Wzx蛋白相似，例如，和E.coli的Wzx在290个氨基酸中有23％的相同性，45％的相似性，另外和S.thermophilus，B.fragilis的Wzx相似性也很高，我们将这四个Wzx序列进行BLOCKMAKER分析，找到4个保守的基序(分别由6，18，37，45个氨基酸组成)，将得到的一致序列运行3个循环的PSI-BLAST程序，除了提交的序列外，还和很多其它来源的Wzx的序列有很高的相似性(E值≤5×e^-14)，所以可以确定orf5是wzx基因，命名为wzx。orf6含有11个潜在跨膜片段，它的内膜的拓扑结构具有众所周知的O-抗原聚合酶(Wzy)的典型特征。此外，它与E.coli编码O-抗原聚合酶的Wzy在415个氨基酸中有24％的相同性，45％的相似性，说明它们之间有一定的同源性，所以命名orf6为wzy基因。orf7通过blast比较，与L.interrogans的糖基转移酶有41％的相同性，63％的相似性，说明它们之间有高度的同源性，可以推测orf7也为糖基转移酶基因，暂命名为orf7。orf8通过blast比较，与L.plantarum的糖基转移酶有35％的相同性，53％的相似性，说明它们之间有高度的同源性，可以推测orf8也为糖基转移酶基因，暂命名为orf8。orf9与T.tengcongensis的糖基转移酶基因在317个氨基酸中有27％的相同性，51％的相似性，所以推测orf9是一个糖基转移酶基因，暂命名为orf9。orf10与S.enterica的糖基转移酶基因在249个氨基酸中有48％的相同性，65％的相似性，所以推测orf10是一个糖基转移酶基因，暂命名为orf10。

实施例6：特异基因的筛选：

针对大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf7、orf8、orf9、orf10基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

表1列出了大肠杆菌O107型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O107型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物#101(-TTC ATC CTAAAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后从166株大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组，它们的来源都列于表中。

在第24组中含有大肠杆菌O107型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在94℃预变性2分钟后，94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy、orf7、orf8、orf9、orf10基因，每个基因都有三对引物被检测，每对引物除了在第24组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy、orf7、orf8、orf9、orf10基因对大肠杆菌O107型及其O-抗原是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O107型中筛选到对大肠杆菌O107型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy和三个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O107型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O107型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O107型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的结构，共由11个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。序列列表<110>南开大学<120>对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸<130>对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>13188<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc    60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaacagcg cgtgaagcgt   120caactgctgg cggaagtaca atctatctgt ccgccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt   180cagggtgaac ctttaggttt gggccactcc attttgtgtg cacgccccgc cattggcgac    240aacccatttg tcgtggtgct gccggacgtt gttatcgatg atgccagcgc cgacccgctg    300cgctacaacc ttgctgctat gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggccgtag tcaagtgctg    360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca tccagaccaa agaaccgctg    420gaccgtgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag    480acgctggact cagacatcat ggccgtaggt cgttatgtgc tttctgccga tatttggccg    540gaacttgaac gcactcaacc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccattgct    600gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgca atgctgatga ctggtgacag ctacgactgc    660ggtaaaaaaa tgggttatat gcaggcgttt gtgaagtatg gcttacgcaa cctgaaagaa    720ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg    780atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaggat tcgtggcgaa agtaatttgt    840tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag    900gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt    960agcgtttgaa tttttcgagt taagcgcgag tgggtaacgc tcgtcacatc gtagacatgc   1020atgcagtgct ctggtagctg taaagccagg ggcggtagcg tgcattaata cctctattaa   1080tcaaactaag agccgcttat ttcacagcat gctctgaagt aatatggaat aaaagagtga   1140agatacttgt tactggtggc gcaggattta ttggttctgc tgtagttcgt cacattataa   1200ataatacgca ggatagtgtt gttaatgtcg ataaattaac gtacgccgga aacctggaat   1260cacttgctga tgtttctgat tctgaacgct atatttttga acatgcggat atttgcgatg   1320ctgctgcaat ggcacggatt tttgctcagc atcagccgga tgcagtgatg cacctggcag   1380ctgaaagcca tgttgaccgt tcaattacag gtcctgcggc atttattgaa accaatattg   1440ttggtactta tgtccttttg gaagccgctc gcaattactg gtctgctctt gatagcgaca   1500agaaaaatag cttccgtttt catcatattt ctactgacga agtctatggt gatttgcctc   1560atccagatga agtaaataat aacgaagaat tacccttatt tactgagacg acagcttacg   1620caccaagcag cccttattcc gcatcaaaag catccagcga tcatttagtc cgcgcgtgga   1680aacgtaccta tggtttaccg accattgtga ctaactgttc gaataactac ggtccttatc   1740actttccgga aaaattgatt ccactagtaa ttcttaatgc tctggaaggt aaggcattac   1800ctatttatgg caaaggggat caaattcgtg actggctgta tgttgaagat catgcgcgtg   1860cgttatatac cgtcgtaacc gaaggtaaag cgggtgaaac ttataacatt ggtggacaca   1920acgaaaagaa aaacatcgat gtagtgctca ctatttgtga tttgttggat gagattgtac   1980cgaaagagaa atcttatcgt gagcaaatta cttatgttgc cgaccgcccg ggacatgatc   2040gccgttatgc gattgatgct gagaagatta gccgcgaatt gggttggaaa ccacaggaaa   2100cgtttgagag cgggattcgt aaaacagtgg aatggtacct gtccaataca aaatgggttg   2160ataatgtgaa aagtggtgcc tatcaatcgt ggattgaaca gaactatgag ggccgccagt   2220aatgaatatc ctccttttcg gcaaaacagg gcaggtaggt tgggaactac agcgtgctct   2280ggcacctctg ggtaatttga ttgctcttga tgttcactcc actgattact gtggtgattt   2340tagtaatcct gaaggtgtag ctgaaaccgt aagaagcatt cggcctgata ttattgtcaa   2400cgcagcagct cacaccgcag tagacaaagc agaatcagaa ccggagtttg cacaattact   2460taacgcgacg agtgtcgaag cgatcgcgaa agcagccaat gaagtcggcg catgggttat   2520tcactactct actgactacg tatttccggg gaccggtgaa ataccatggc aggaggcgga   2580tgcaaccgca ccgctaaatg tttacggtga aaccaagtta gctggagaaa aagcattaca   2640agagcattgt gcgaagcacc ttatttttcg taccagctgg gtatatgcag gtaaaggaaa   2700caattttgcc aagacaatgt tacgtctggc aaaagagcgc gaagaattag ctgtcattaa   2760cgatcagttt ggtgcaccaa caggtgctga actgctggct gattgtacgg cacatgcaat   2820tcgtatggca ctgaataaac cagaagtcgc aggcttgtac catctggtag ccagtggtac   2880cacaacctgg cacgattatg ctgcgctggt ttttgaagag gcacgaaaag caggtattcc   2940ccttgcactc aacaagctca aggcagtacc aacaacagcc tatcctacac cagctcgtcg   3000tccacataac tctcgcctta atacagaaaa atttcagcag aattttgcgc ttgtcttgcc   3060tgactggcag gttggtgtga aacgaatgct caacgaatta tttacgacta cagcaattta   3120atagtttttg catcttgttc gtgatggtgg agcaagatga attaaaagga atgatgaaat   3180gaaaacgcgt aaaggtatta ttttagcggg tggttctggt acacgtcttt atcctgtgac   3240tatggctg~c agtaaacagc tattacctat ttatgataag ccgatgatct attacccgct   3300ctctacactg atgttggcgg gtattcgcga tattctgatt attagtacgc cacaggatac   3360tcctcgtttt caacaactgc tgggtgacgg tagccagtgg gggctaaatc ttcagtacaa   3420agtgcaaccg actccagatg ggcttgcgca ggcgtttatt atcggtgaag agtttatcgg   3480tggtgatgat tgtgctttgg tacttggtga taatatcttc tacggtcacg acctgcctaa   3540gttaatggat gccgctgtta acaaagaaag tggtgcaacg gtatttgcct atcacgttaa   3600tgatcctgaa cgctacggtg tcgttgagtt tgataaaaac ggtacggcga tcagcctgga   3660agaaaaaccg ctacaaccaa aaagtaatta tgcggtaacc gggctttatt tctatgataa   3720cgacgttgtc gaaatggcga aaaatcttaa gccttctgcc cgcggtgaac tggaaattac   3780cgatattaac cgtatttata tggaacaggg gcgtttatcc gttgccatga tgggacgtgg   3840ttatgcatgg ctggacacgg ggacacatca aagtcttatt gaagcaagca acttcattgc   3900aacaattgaa gagcgtcaag gcttgaaagt ttcctgcccg gaaga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aa aggtccttcc attatgcctg  12300gtggccagaa agaagcctat gaactggttg ctccgatcct gaccaaaatc gccgcagtag  12360ctgaagacgg tgagccatgc gttacctata ttggtgccga tggcgcaggt cactatgtga  12420agatggttca caacggtatt gaatacggtg atatgcagct gattgctgaa gcctattctc  12480tgcttaaagg tggcctgaat ctctctaacg aagaactggc acagaccttt accgagtgga  12540ataacggtga actgagcagc tacctgatcg acatcaccaa agacatcttc actaaaaaag  12600atgaaggcgg taactacctg gttgatgtga tcctggatga agcggctaac aaaggtaccg  12660gtaaatggac cagccagagc gcgctggatc tcggcgaacc gctgtcgctg attaccgagt  12720ctgtgtttgc acgttatatc tcttctctga aagatcagcg cgttgccgca tctaaagttc  12780tctctggtcc gcaagctcag tcagcaggcg acaaggctga gttcatcgaa aaagttcgcc  12840gtgcgctgta tctgggcaaa atcgtttctt acgctcaggg cttctctcag ctacgcgccg  12900cgtctgaaga gtacaactgg gatctgaact acggcgaaat cgcgaagatt ttccgtgctg  12960gctgcatcat ccgtgcgcag ttcctgcaga aaatcaccga tgcttatgcc gaagatccgc  13020agatcgctaa cctgctgctg gctccgtact tcaagcaaat tgccgatgac taccagcagg  13080cgctgcgcga tgtcgttgct tatgcagtac aaaacggtat cccggttccg accttcgccg  13140ctgcggttgc ctattacgat agctaccgtg ccgctgttct gcctgcga               13188表1 大肠杆菌O107型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的

引物及PCR数据

                基因的碱基                                PCR产物 产生正确  PCR的退基因      功能                      正向引物    反向引物              大小电泳  火温度

                  位置                                    的长度  带的组数   (℃)Wzx      转运酶      4604-5821      4649-4666    5664-5681      1033    0^*       48

                                4700-4717    5626-5643      943     0^*       52

                                4753-4770    5266-5283      530     0^*       48Wzy      聚合酶      5814-7136      5864-5882    6852-6869      1006    0^*       52

                                5895-5916    6813-6831      934     0^*       52

                                6072-6090    6762-6779      708     0^*       53orf7     糖基转移酶  7129-7926      7141-7158    7737-7754      614     0^*       52

                                7167-7185    7710-7727      561     0^*       53

                                7190-7207    7686-7703      514     0^*       51orf8     糖基转移酶  7913-8857      7936-7954    8774-8791      856     0^*       52

                                8029-8046    8652-8669      641     0^*       53

                                8101-8118    8623-8640      540     0^*       50orf9     糖基转移酶  8854-9915      8862-8879    9774-9791      930     0^*       51

                                8916-8933    9681-9697      782     0^*       54

                                9025-9043    9647-9664      640     0^*       53orf10    糖基转移酶  9912-10679     9942-9959    10586-10603    662     0^*       52

                                10019-10036  10502-10520    502     0^*       48

                                10095-10112  10454-10471    377     0^*       52^*在大肠杆菌O107型中得到正确的一条带表2  166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源组号                      该组中含有的菌株                               来源1     野生型大肠杆菌O1，O2，O3，O4，O10，O16，O18，O39                  IMVS^a2     野生型大肠杆菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100             IMVS3     野生型大肠杆菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137      IMVS4     野生型大肠杆菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12              IMVS5     野生型大肠杆菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22            IMVS6     野生型大肠杆菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30              IMVS7     野生型大肠杆菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42              IMVS8     野生型大肠杆菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53              IMVS9     野生型大肠杆菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61              IMVS10    野生型大肠杆菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70              IMVS11    野生型大肠杆菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81              IMVS12    野生型大肠杆菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90              IMVS13    野生型大肠杆菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101             IMVS14    野生型大肠杆菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118      IMVS15    野生型大肠杆菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171      See b16    野生型大肠杆菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132，    See c17    野生型大肠杆菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143      IMVs18    野生型大肠杆菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152      IMVS19    野生型大肠杆菌O153，0154，O155，O156，O157，O158，O159，          IMVS20    野生型大肠杆菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111                IMVS21    野生型大肠杆菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110            IMVS22    鲍氏志贺氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14               See d23    鲍氏志贺氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18    See d24    痢疾志贺氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8                       See d25    痢疾志贺氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13                                 See d26    弗氏志贺氏菌F6a，F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：7)F5(v：4)    See d27    宋内氏志贺氏菌D5，DR                                                   See da.   Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab.   O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.   172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd.  中国预防医学科学院流行病学研究所表3大肠杆菌O107型O抗原基因结构图

                           IKborf#        1       2       3      4      5      6       7      8      9      10      11表4大肠杆菌O107型O抗原基因簇基因位置attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc     60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaacagcg cgtgaagcgt    120caactgctgg cggaagtaca atctatctgt ccgccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt    180cagggtgaac ctttaggttt gggccactcc attttgtgtg cacgccccgc cattggcgac    240aacccatttg tcgtggtgct gccggacgtt gttatcgatg atgccagcgc cgacccgctg    300cgctacaacc ttgctgctat gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggccgtag tcaagtgctg    360gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca tccagaccaa agaaccgctg    420gaccgtgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag    480acgctggact cagacatcat ggccgtaggt cgttatgtgc tttctgccga tatttggccg    540gaacttgaac gcactcaacc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccattgct    600gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgca atgctgatga ctggtgacag ctacgactgc    660ggtaaaaaaa tgggttatat gcaggcgttt gtgaagtatg gcttacgcaa cctgaaagaa    720ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg    780atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaggat tcgtggcgaa agtaatttgt    840tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag    900gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt    960agcgtttgaa tttttcgagt taagcgcgag tgggtaacgc tcgtcacatc gtagacatgc   1020atgcagtgct ctggtagctg taaagccagg ggcggtagcg tgcattaata cctctattaa   1080

                                                       orf1起始tcaaactaag agccgcttat ttcacagcat gctctgaagt aatatggaat aaaagagtga   1140agatacttgt tactggtggc gcaggattta ttggttctgc tgtagttcgt cacattataa   1200ataatacgca ggatagtgtt gttaatgtcg ataaattaac gtacgccgga aacctggaat   1260cacttgctga tgtttctgat tctgaacgct atatttttga acatgcggat atttgcgatg   1320ctgctgcaat ggcacggatt tttgctcagc atcagccgga tgcagtgatg cacctggcag   1380ctgaaagcca tgttgaccgt tcaattacag gtcctgcggc atttattgaa accaatattg   1440ttggtactta tgtccttttg gaagccgctc gcaattactg gtctgctctt gatagcgaca   1500agaaaaatag cttccgtttt catcatattt ctactgacga agtctatggt gatttgcctc   1560atccagatga agtaaataat aacgaagaat tacccttatt tactgagacg acagcttacg   1620caccaagcag cccttattcc gcatcaaaag catccagcga tcatttagtc cgcgcgtgga   1680aacgtaccta tggtttaccg accattgtga ctaactgttc gaataactac ggtccttatc   1740actttccgga aaaattgatt ccactagtaa ttcttaatgc tctggaaggt aaggcattac    1800ctatttatgg caaaggggat caaattcgtg actggctgta tgttgaagat catgcgcgtg    1860cgttatatac cgtcgtaacc gaaggtaaag cgggtgaaac ttataacatt ggtggacaca    1920acgaaaagaa aaacatcgat gtagtgctca ctatttgtga tttgttggat gagattgtac    1980cgaaagagaa atcttatcgt gagcaaatta cttatgttgc cgaccgcccg ggacatgatc    2040gccgttatgc gattgatgct gagaagatta gccgcgaatt gggttggaaa ccacaggaaa    2100cgtttgagag cgggattcgt aaaacagtgg aatggtacct gtccaataca aaatgggttg    2160

                                                        off1终止ataatgtgaa aagtggtgcc tatcaatcgt ggattgaaca gaactatgag ggccgccagt    2220orf2起始aatgaatatc ctccttttcg gcaaaacagg gcaggtaggt tgggaactac agcgtgctct    2280ggcacctctg ggtaatttga ttgctcttga tgttcactcc actgattact gtggtgattt    2340tagtaatcct gaaggtgtag ctgaaaccgt aagaagcatt cggcctgata ttattgtcaa    2400cgcagcagct cacaccgcag tagacaaagc agaatcagaa ccggagtttg cacaattact    2460taacgcgacg agtgtcgaag cgatcgcgaa agcagccaat gaagtcggcg catgggttat    2520tcactactct actgactacg tatttccggg gaccggtgaa ataccatggc aggaggcgga    2580tgcaaccgca ccgctaaatg tttacggtga aaccaagtta gctggagaaa aagcattaca    2640agagcattgt gcgaagcacc ttatttttcg taccagctgg gtatatgcag gtaaaggaaa    2700caattttgcc aagacaatgt tacgtctggc aaaagagcgc gaagaattag ctgtcattaa    2760cgatcagttt ggtgcaccaa caggtgctga actgctggct gattgtacgg cacatgcaat    2820tcgtatggca ctgaataaac cagaagtcgc aggcttgtac catctggtag ccagtggtac    2880cacaacctgg cacgattatg ctgcgctggt ttttgaagag gcacgaaaag caggtattcc    2940ccttgcactc aacaagctca aggcagtacc aacaacagcc tatcctacac cagctcgtcg    3000tccacataac tctcgcctta atacagaaaa atttcagcag aattttgcgc ttgtcttgcc    3060

                                                         orf2终止tgactggcag gttggtgtga aacgaatgct caacgaatta tttacgacta cagcaattta    3120

                                                         orf3起始atagtttttg catcttgttc gtgatggtgg agcaagatga attaaaagga atgatgaa at    3180gaaaacgcgt aaaggtatta ttttagcggg tggttctggt acacgtcttt atcctgtgac    3240tatggctgtc agtaaacagc tattacctat ttatgataag ccgatgatct attacccgct    3300ctctacactg atgttggcgg gtattcgcga tattctgatt attagtacgc cacaggatac    3360tcctcgtttt caacaactgc tgggtgacgg tagccagtgg gggctaaatc ttcagtacaa    3420agtgcaaccg actccagatg ggcttgcgca ggcgtttatt atcggtgaag agtttatcgg    3480tggtgatgat tgtgctttgg tacttggtga taatatcttc tacggtcacg acctgcctaa    3540gttaatggat gccgctgtta acaaagaaag tggtgcaacg gtatttgcct atcacgttaa    3600tgatcctgaa cgctacggtg tcgttgagtt tgataaaaac ggtacggcga tcagcctgga    3660agaaaaaccg ctacaaccaa aaagtaatta tgcggtaacc gggctttatt tctatgataa    3720cgacgttgtc gaaatggcga aaaatcttaa gccttctgcc cgcggtgaac tggaaattac    3780cgatattaac cgtatttata tggaacaggg gcgtttatcc gttgccatga tgggacgtgg    3840ttatgcatgg ctggacacgg ggacacatca aagtcttatt gaagcaagca acttcattgc    3900aacaattgaa gagcgtcaag gcttgaaagt ttcctgcccg gaagaaattg ctttcaggaa    3960agggtttatt gatgctgagc aggtgaaagt gttagccgaa ccgctgaaga aaaatgctta    4020

                          orf3终止，     orf4起始tggtcagtat ctgctcaaaa tgattaaagg tga ttaataa a atgaacgta attaaaacag    4080aaattccaga tgtactgatt tttgaaccaa aagtgtttgg ggatgaacgt ggttttttta    4140tggaaagctt taatcaacga caatttgaag aaattgttgg acgcaaaatt tcgtttgttc    4200aggataatca ttcaaagtca aaaaaaggtg ttttacgtgg ccttcattat cagttgcctc    4260catttgcaca aggtaaatta gttagatgta tcaatggtga agtatatgat gttgcagttg    4320atctacgacc tgaatcaatt aattatggta aatgggtagg catcattctt tctgctgaaa    4380ataagaagca gctatggata ccagaaggtt ttgcacatgg ttttttagtt ataagcgaat    4440ttgctgaatt tgcgtacaaa accacaaatt attattcaaa agaaagtgaa agaggcatac    4500gttggaatga tccaacgata aatatccaat ggccaaaaat gggacaatat ttactttctc    4560

                                orf4终止，  orf5起始cgaaagatgc gttagcacca tttatagaat taagaattga  ttaatggaaa acaagaaaaa    4620tcatatttat ggaattgtaa ataatattat tgtgatgtta tctcccatta taataattcc    4680gtttgcaatt aaaaatgtcg gcattgatga atatggctat tttgtacaag ttaatataat    4740ttattcgtgt ttgatatcca tattcactgc ttctctatcg ggatatttta taaagagcta    4800tcttgagaaa aaattatcct ttcatgatat ttttataatt caattgttta ttaatttgtt    4860ctccactgcg atcataggta tatatatact gctaagattt gatgtcgttg ctccgtatat    4920atttgttgtt gctatgctaa ctaatacttt aaatttcgaa tggttttttc atgcaattgg    4980cgcacagaaa caattattaa taaggaattt aattataaaa acaatgtttg taattatagc    5040aatatttatc ttagaagtat ataaaaatat tgctgtttat tttgttattt ttgggttgaa    5100tattattatt gcaaattttt tattgggtat atatagtttt acgaaaataa aaaataagga    5160atatatactt ttttccaatg ggaggggggg gaatcggttg ttttgtttta ttaaggatgc    5220aaaattcttc tttttgtcac cgacaattgg tgcagtatat caatatggcg atcaaatatt    5280agtttcatta ttattcccaa aaactgcttt ggtttttata aatttagcta aacaaataat    5340tggtgcgtca gtgatggtgt cgggtactct atgtagagtt gaacaaaaga acattttttc    5400atctgagaaa attgaaagat tgacaaaaat aaaaaaaaca cttatggcat atgtttttta    5460tttgatgact acatctatat taataatatt aattggtcct ttaattcttg gcatgttaat    5520taaagaaact gtatcacttg gattaaacta ttacattcta attgctggta tatatgtctt    5580tacttcattg agtatattta tcgattatat aataggattg actttcagga ctgagcatta    5640cacttctatt tcgaatattt gttgtgcaac catagttact ttattgaacg caatgttttt    5700agaaaaatat ggtgcaactt tttcgctttt ttcattattc attggagagc ttttggtttt    5760

                                               orf6起始，orf5终止tattttatta tctacaatgc attatataaa tataaagcga aggacatatt ata atggtta    5820atattctgtt atgtattaat ataataatac tcttgatttg catttgtatc tatttgatcg    5880ccttaaaaag taaaaaagct ccacgtttat tcgcactata tttaggagct tttattcttt    5940ttattgagtc ccacataatt ctagcaataa caacttcttt taattttggt acgtcagaat    6000ggttttttaa tggagagttt gattataata caaaaacaga agttataaca agcatcaatc    6060tatttataat aggtatgata ttaggttcgg tatttattgc atcaacaata acctataaaa    6120gttcttccta tgatgtgact tttgagaaca aatcgatagc tagattttcg tggctactgt    6180tagtatctat cttaccattt gtagttgttt atttaattaa tttaatagct tttatttcat    6240caaacggttt ttattcttta tatattaacg gtaataaaat atcgggtgga tacattcttg    6300atttgttttt tctaacactt tactcattat tgatatcttt aaaaaataag aaaaagatac    6360tgttcattat cttgtgtgta gcctgtgttt atttattcat aggaacaaga ttggaattta    6420tgtttaaagt atttcctgtg ttaatctatt atatacttat ttcaaaaaat atacacaaat    6480atttcaggtt gaaaaatatc cttgctatat caatactctt ttggggttta atatttagta    6540tgcaatactc ggtttcagca agagataata ttgaaatggg gtcgaatatc atcacaacgt    6600tcttaaaaca acaaggcgta tcagtcaatg ttattggtat tgctataaag gacaaaaata    6660attcattatt aagtgaatct gtgattttgt cgccactata tgatagtgct atttctttag    6720ctaattcttt agtaggtgtc caaagcaatg gaaattcggt agagttcgca gagaattcat    6780tctcattgtc gcacaaattg agttatttag aagatccttc agcatacctt gctggctatg    6840gtgttggggg agccgctatt gctgagctgt acatagttgg tggttacttg gcttgtttaa    6900ttggaggtat gcttacatat atttttatct ctatactaga aaaaatcgcc aaaaaatcct    6960tttttaattt tatttttgtt atgttgataa ctgggaaaat attatactca cctcgagggg    7020agtttctttc atttatgtct gctgacagaa tgttaatatt atttttaatt tttacgtttt    7080

                                             orf7起始，orf6终止cttataaatt tctattggca acttcaaata aaaaaatgag ttttaaaa at gaa tgaactt    7140gtatctataa ttataccgtt atacaaccaa ggagagtata tcgaggaaac tctgaattcg    7200gtcaagcaac agtcttattc aaattatgaa ttgatcattg tagatgatgg cagtaacgat    7260caattcacaa ttgaaaagat aaaagaactc aggttcaaag gatatacgat tatctcaaag    7320caaaacggcg gattagcatc agcaagaaat gaaggtatta gaaatgctat aggcaaatat    7380attattgttc ttgattctga tgatataatt catcgcgatt atattaaaaa tcttcttgaa    7440gttataacta atacaaaagc acgaatcgta tatagtaagg ctttattgtt tgaatacaga    7500acgggaatgt ggatgctacc atcatttaca atgcgaagaa tgctgaaaag taatattatt    7560ttttgttctg ctatgtatta tcgtgaagat tggtttaatg tgggaggcta tgatgaatct    7620ttaagaacag gccttgagga ctgggatttt tggctatcat taataggttt atacaataat    7680cataacgata tcgttgcgag ggtaaataag cctctgtttt tttatcgaat tagaaaggaa    7740ttcaatgcta agataaatta cactgaaaaa gaaaaaattg ttaattatat acataaaaaa    7800cacattcaat tatttgaact gtataaagtt aagcccctta tttatagtaa acagaattta    7860

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以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1、一种对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长13188个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ IDNO：1的核苷酸。

2、按照权利要求1所述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是由11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

3、按照权利要求2所述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf9、orf10基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的4604至5821碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的5814至7136碱基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO：1中的7129至7926碱基的核苷酸；orf8是SEQ ID NO：1中的7913至8857碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1中的8854至9915碱基的核苷酸；orf10是SEQ ID NO：1中的9912至10679碱基的核苷酸。

4、按照权利要求1或2所述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，它是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf7、orf8、orf9、orf10基因；以及它们的混合或它们的重组。

5、按照权利要求4所述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的4649至4666碱基的核苷酸和5664至5681碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4700至4717碱基的核苷酸和5626至5643碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4753至4770碱基的核苷酸和5266至5283碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5864至5882碱基的核苷酸和6852至6869碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5895至5916碱基的核苷酸和6813至6831碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的6072至6090碱基的核苷酸和6762至6779碱基的核苷酸；源于orf7基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的7141至7158碱基的核苷酸和7737至7754碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7167至7185碱基的核苷酸和7710至7727碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7190至7207碱基的核苷酸和7686至7703碱基的核苷酸；源于orf8基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的7936至7954碱基的核苷酸和8774至8791碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的8029至8046碱基的核苷酸和8652至8669碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的8101至8118碱基的核苷酸和8623至8640碱基的核苷酸；源于orf9基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的8862至8879碱基的核苷酸和9774至9791碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的8916至8933碱基的核苷酸和9681至9697碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9025至9043碱基的核苷酸和9647至9664碱基的核苷酸；源于orf10基因的寡核苷酸对是：SEQ IDNO：1中的9942至9959碱基的核苷酸和10586至10603碱基的核苷酸；SEQ IDNO：1中的10019至10036碱基的核苷酸和10502至10520碱基的核苷酸；SEQID NO：1中的10095至10112碱基的核苷酸和10454至10471碱基的核苷酸。

6、权利要求1所述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

7、权利要求1所述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O107型的O-抗原，并成为细菌疫苗。

8、按照权利要求1所述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。

9、权利要求1所述的对大肠杆菌O107型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O107型，离心收集细胞，用500ul 50mMTris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟，之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O107型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O107型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA AT-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的NovagenDNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应，合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的TthDNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾，此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5a细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨卞青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率，剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O107型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O107型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因的筛选：针对痢大肠杆菌O107型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf7、orf8、orf9、orf10基因设计引物；在每个基因内各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、or、orf8、orf9、orf10基因对大肠杆菌O107型的O-抗原都是高度特异的。