CN100355892C - 对大肠杆菌o84型的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O84型(Escherichia coli O84)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌型中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15440个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O84型的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定大肠杆菌O84型的方法。

Description

对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O84型(Escherichia coli O84)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O84型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O84型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，etal.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trendsin Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于JUMPStart序列和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequenceanalysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implication forEscherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“TheEscherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：geneclusters encoding the same colitose-containing O antigen are highlyconserved”.Journal of Bacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfbby polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiologicalinvestigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused bydry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producingEscherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.and Reeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)clusterof Escherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，nichespecific selection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of theEnterobacteriaceae”.Elsevier Science Publishers，Amsterdam，TheNetherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships betweenthe enteroinvasive Escherichia coli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and Shigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf4，orf6，orf7，orf12基因。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因(表1)；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O84型的O-抗原是高度特异的；而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O84型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O84型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O84型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于：其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15440个碱基；或者所述具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸，其中包括命名为wzx，orf2，orf3，orf4，wzy，orf6，orf7，gmd，fcl，gmm，manC，orf12，manB的13个基因组成，都位于JUMPStart序列和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述基因中具有高度特异性的基因是：转运酶基因，其包括wzx基因；聚合酶基因，其包括wzy基因；糖基转移酶基因，其包括orf4，orf6，orf7，orf12基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的164至1558碱基的核苷酸；wzy是SEQ IDNO：1中的4226至5377碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO：1中的3085至4224碱基的核苷酸；orf6是SEQ ID NO：1中的5379至6500碱基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO：1中的6497至7768碱基的核苷酸；orf12是SEQ ID NO：1中的11727至12473碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸，其中还包括源于所述的wzx基因、wzy基因以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其中源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的558至577碱基的核苷酸和1334至1353碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的431至449碱基的核苷酸和1057至1076碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的4723至4742碱基的核苷酸和5258至5276碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4472至4491碱基的核苷酸和5007至5026碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。

前述的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O84型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。

前述的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。

前述的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O84型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O84型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O84型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O84型的O-抗原的高度特异性；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O84，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O84的灵敏度。

前述的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O84型，离心收集细胞。用500μl 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10μl 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10μl 10mg/mL的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3μl 20mg/mL的蛋白酶K、15μl 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3μl 10mg/mL的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30μl TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O84型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O84型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JUMPStart序列设计上游引物#wl-1098-ATT GGTAGC TGT AAG CCA AGG GCG GTA GCG T，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用BoehringerMannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，55℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9μl 0.1M MnCl₂，1μl 1∶2000稀释的1mg/mL的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2μl 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18μl水中，随后在此混合物中加入2.5μl dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25μl 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80μl，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90μl。其中有9μl的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30μl水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3μl连接产物与50μl感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1mL的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O84型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O84型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的Orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用Blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国Sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O84组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O84型的O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O84的冻存菌液接种到有20mL LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200mL LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3mL菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μl上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的558至577碱基的核苷酸和1334至1353碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的431至449碱基的核苷酸和1057至1076碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4723至4742碱基的核苷酸和5258至5276碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4472至4491碱基的核苷酸和5007至5026碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O84的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长15440个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它包括命名为wzx，orf2，orf3，orf4，wzy，orf6，orf7，fcl，gmm，manC，orf12，manB的13个基因组成，都位于JUMPStart序列和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因(orf4，orf6，orf7，orf12基因)。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，本发明涉及的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O84型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因和wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸(表1)，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx wzy基因对大肠杆菌O84型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O84型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的164至1558碱基的核苷酸)、wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的4226至5377碱基的核苷酸)；源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O84型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因；(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O84型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如Southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O84型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因；(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O84型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如Southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因；(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O84型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O84型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O84型，离心收集细胞。用500μl 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10μl 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10μl 10mg/mL的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3μl20mg/mL的蛋白酶K、15μl 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3μl 10mg/mL的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30μl TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O84型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O84型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JUMPStart序列设计上游引物(#w1-1098-ATT GGT AGC TGT AAG CCA AGG GCG GTA GCG T)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTAAGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，55℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的WizardPCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9μl 0.1M MnCl₂，1μl 1∶2000稀释的1mg/mL的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2μl 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18μl水中。随后在此混合物中加入2.5μl dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25μl 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80μl，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90μl。其中有9μl的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30μl水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5mL的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2mL培养物转接到200mL的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200mL吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100mL吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1mL冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50μl一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3μl连接产物与50μl感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1mL的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O84型的基因组作5个LongPCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O84型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的Orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用Blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国Sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf2编码的蛋白与Rhizobium leguminosarum bv.viciae 3841中编码的putative acetyltransferase的氨基酸序列有40％的一致性和59％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf2编码的蛋白与已知的Bacterial transferase hexapept ide PF00132共有序列的同源性预期值为6.9×e^-11，由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf2。orf3编码的蛋白与Rhizobium leguminosarum bv.viciae 3841中编码的putative UDP-glucose-4-epimerase的氨基酸序列有33％的一致性和52％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf3编码的蛋白与已知的NAD dependent epimerase/dehydratase family PF01370的共有序列的同源性预期值为2.0×e^-14。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf3。orf8编码的蛋白与Yersiniapseudotuberculosis(type 0：1b)中gmd编码的Gmd蛋白的氨基酸序列有85％的一致性和94％的相似性，因此我们可以确定该基因为gmd。orf9编码的蛋白与Yersinia pseudotuberculosis(type 0：1b)中fcl编码的Fcl蛋白的氨基酸序列有76％的一致性和85％的相似性，因此我们将其暂命名为fcl。orf10编码的蛋白与Salmonella typhimurium中gmm编码的Gmm的氨基酸序列有52％的一致性和67％的相似性，因此我们将这个基因暂命名为gmm。orf11编码的蛋白与Escherichia coli中manC编码的ManC的氨基酸序列有81％的一致性和91％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf11编码的蛋白与已知的Nucleotidyl transferase PF00483的共有序列的同源性预期值为4.3×e^-126，因此我们将这个基因命名为manC。orf13编码的蛋白与Shigellaboydii中manB编码的ManB的氨基酸序列有95％的一致性和98％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf13编码的蛋白与已知的Phosphoglucomutase PF02878的共有序列的同源性预期值为2.1×e^-32。因此我们可以确定该基因为manB。

orf1和orf5是大肠杆菌O84中仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。orf1编码的蛋白与Escherichia coli O157：H7编码的O-抗原转移酶的氨基酸序列有29％的一致性和57％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf1为wzx。orf5编码的蛋白与Escherichia coli的O-抗原聚合酶有22％的一致性和47％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有11个跨膜片段，并且有一个大的胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf5为wzy。

orf4，orf6，orf7，orf12四个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有29-67％的序列一致性和48-83％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这四个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶的共有序列的同源性预期值很高，因此我们推测这四个基因编码糖基转移酶。由于这四个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这四个基因暂命名为orf4，orf6orf7和orf12。

实施例6：特异基因的筛选。

针对大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O84组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O84型的O-抗原都是高度特异的；这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

实施例7：引物灵敏度的检测。

购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O84的冻存菌液接种到有20mL LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200mL LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3mL菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μl上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的558至577碱基的核苷酸和1334至1353碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的431至449碱基的核苷酸和1057至1076碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4723至4742碱基的核苷酸和5258至5276碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4472至4491碱基的核苷酸和5007至5026碱基的核苷酸。，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O84的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

通过对O-抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O-抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O-抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O-抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明大肠杆菌O84的O-抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

当分子探针核苷酸序列与靶DNA序列同源性大于85％时，可以准确的将目的序列杂交出来。在低严谨性的Southern杂交中要求两者的同源性大于65％(《分子克隆实验指南》第三版，第509页，低严谨性杂交)。本发明中的特异核苷酸序列在Genebank中的同源性搜索显示没有同源性大于65％的其他基因存在。所以在杂交实验中，本发明中的特异核苷酸序列作为分子探针将只能对目的细菌得出阳性结果。Southern杂交法对于分子探针的长度并没有严格要求，本发明中的特异核苷酸序列中从20bp或以上的寡核苷酸到整个序列都可以在杂交中应用。在一项Southern实验中，利用沙门氏菌的相关特异基因(1000bp以上)做分子探针，成功的分辨出该细菌(Liu D，Verma NK，RomanaLK，Reeves PR.，1991 Relationships among the rfb regions of Salmonellaserovars A，B，and D.J Bacteriol.173(15)：4814-4819.)，很多本领域的实验都表明1000-2000bp左右的基因序列可以用做分子探针。基因芯片与Southern杂交法的原理一样，在选用分子探针的要求上也相似，所以本发明中的特异核苷酸序列以及其中的寡核苷酸片段都可以在杂交反应中作为分子探针检测该目的细菌，包括Southern、基因芯片等多种杂交的常规方法。

根据本发明的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O-抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表1列出了大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇中转运酶基因和聚合酶基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共12组，它们的来源都列于表中。

在第13组中含有大肠杆菌O84型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25μl。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10μlPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O84型及其O-抗原是高度特异的。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O84型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O84型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O84型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇的结构，共由13个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是JUMPStart序列和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密编码子和终止密编码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密编码子有两个：ATG和GTG。

SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)

SEQUENCE LISTING

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>15440

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

aaactattaa agaaattatt ggtagctgta agccaagggc ggtagcgtgg aaaaattaaa     60

atgaaactct ttgtaaaaat aaaaagctgt ggatgtcgga atagtaaaag tataaattat    120

catggttcta tattgagctt tataactcaa caatgagata tgtatgctgt caaaaataaa    180

aaatgtgata gatcggatag ttattatatt taaaccaata gcggcagatt tgacacagaa    240

agaaaaagat gaagttatta gattacgtgg agtttatctg actgctatca tatctttgtt    300

gtcaaagatt atttctatga tatctatatt tataactatt ccagcaatat taaattactt    360

aggtgaggaa ttgttcggga tttggatgac attaagttcc attattgcga tgttgacttt    420

tgcagatatg gggattggga atggagttgt aaataaatta tcaaaagcaa tatatagtaa    480

tagtgtaaat gatataagaa aaatcatcac aaatgctgtt acagtattat tgattatcgc    540

gacatcaatc aatttattat tctatgctgc cactccttta gttagttgga atagaatttt    600

gaatctgagt gaaaaaattg actcacattc tatagagcat gctttatttg tatttgtttt    660

ttgctttagt ttaaatgtgc tattttctat agtacagaaa atacagttgg catatcaatt    720

ggggtttata gcaagtatat ggcaaatatt aggtagtgta ttttcacttg gattgctgtt    780

tctgtttatt aacttgaagc ttgaaatggc ttggttggt tttttcaatag ctggtatacc    840

tgctatattt caactattaa actatttgca cttttctctc gtaatttgta aaactggctt    900

tttcaagata agttttataa aaatagcaga aatgaaatca ctattaagta ctggtgtgtt    960

attttttgca ttacagattt ccatggtgtg cacttataca tccgataata tcatcttaaa   1020

tacgattatt ggagcggaag ctgtaactga atatagcgtt catgtgcgat tgtttagtgt   1080

aattccgatc cttatgggga tggtgttaat tccattatgg ccagcatact catcagcaag   1140

gataaagaaa gatataaaat ggattcggga tgtttggaat aaaagcatta tgatggcatt   1200

gttagtttca gtatttatag gtggaagtat tattcttttt ttacctgata tttttgatct   1260

ctggctgaaa aataaaatac aacctacata taccctagct tatatgcttt ttgtatggaa   1320

actttttgaa tctgtaggct tagcaataag ctgttttctt aacgggatgg atttaattaa   1380

acagcaagca ttcattgcag tggtaactgc ggtagttgct atctctttga agatattgtt   1440

tgtatatcaa ataggaatta ctggagtgct tcttggaacg ctgattccct ttgttttatt   1500

gacttttata ccaacattat ttatatcatt gggctttttg agaaaaggaa tgtgctaatg   1560

aaaaagttta tttcaagatt gctctataat ccttacaaaa agataaaaaa agactctcga   1620

attgaattta attctgggat tttggataaa aatttccgtg tgcattttta ctgtagcgaa   1680

agtcgtgcta aggcatatat cggaaataat tgcatcctaa aaaatgagat tatatttgag   1740

agagagtgtg gtgtcgtcac tattggtgat aatacattca ttaacaaaaa cacgaagatt   1800

ataagtgtta atagaattag tataggaagt aatgttacca tatcttatgg tgtaataata    1860

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ttagagactc gagatccaaa taatgatata gaaaataaaa attgggattg tgttaaaagt    1980

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gttactatag gtgagggcgc ggttgttgct gcaagagcgg tagttacaaa agatgttccg    2100

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tgtagttcga aaatttggag aaacggtggt ttcagaaatt tattttaaat tgatagatta    7740

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tactcctcta atctcgattg atctcataat tagaaacgat aaaggagagg cgctgctggg    9960

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atgctgctat tgattccctc aagccatacc tcgataaagg tgacattatc attgatggtg    14400

gtaatacctt cttccaggac accattcgtc gtaatcgtga gctttctgcc gaaggtttta    14460

acttcattgg taccggtgtt tccggcggtg aagaaggtgc gctgaaaggt ccttccatta    14520

tgcctggtgg gcagaaagaa gcctatgaac ttgttgcgcc gatcctgacc aaaatcgccg    14580

cagtggctga agacggtgag ccatgcgtta cctatattgg tgccgatggt gcaggtcact    14640

atgtgaagat ggttcacaac ggtattgaat acggtgatat gcaactgatt gctgaagcct    14700

attctctgct taaaggtggc ctgaacctca ccaacgaaga actggcgcag acctttaccg    14760

agtggaataa cggtgaactg agcagctacc tgatcgacat caccaaagat atcttcacca    14820

aaaaagatga agacggtaac tacctggttg atgtgatcct ggatgaagcg gctaacaaag    14880

gtacgggtaa atggaccagc cagagtgcgc tggatctcgg cgaaccgctg tcgctgatta    14940

ccgagtctgt atttgcacgt tatatctctt ctctgaaaga tcagcgtgt tgccgcatcta    15000

aagttctctc tggcccgcaa gcacagccag ctggcgacaa ggctgagttc atcgaaaaag    15060

ttcgtcgtgc gctgtatctg ggcaaaatcg tatcttacgc ccagggcttc tctcagctgc    15120

gtgctgcgtc tgaagagtac aactgggatc tgaactacgg cgaaatcgcg aaaattttcc    15180

gtgctggctg catcatccgt gcgcagttcc tgcagaaaat caccgatgct tatgccgaaa    15240

atccgcagat cgctaacctg ctgctggctc cgtacttcaa gcaaattgcc gatgactacc    15300

agcaggcgct gcgtgatgtc gttgcttatg cagtacagaa cggtatcccg gttccgacct    15360

tcgctgctgc ggttgcctat tacgatagct accgtgccgc tgttctgcct gcgaacctaa    15420

tccaggccca gcgcgactaa                                                15440

表1大肠杆菌O84型的O-抗原基因簇中寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物	反向引物	PCR产物的长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								wzx	转运酶	164-1558	558-577	1334-1353	796bp	0*	55
			431-449	1057-1076	647bp	0*	55
								wzy	聚合酶	4226-5377	4723-4742	5258-5276	554bp	0*	51
			4472-4491	5007-5026	555bp	0*	55

^*只在大肠杆菌O84型中得到正确的一条带

表2  166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

                                                                                   

组号                 该组中含有的菌株                                                    来源

1、野生型大肠杆菌    O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，O19ab，  IMVS^a

                     O20，O21，O22，O23，O24

2、野生型大肠杆菌    O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，         IMVS^a

                     O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43

3、野生型大肠杆菌    O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，         IMVS^a

                     O57，O58，O60，O61，O62，O53

4、野生型大肠杆菌    O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，             IMVS^a

                     O79，O80，O81，O82，O83，O68

5、野生型大肠杆菌    O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，                  IMVS^a

                     O101，O102，O1 03，O104，O105，O106，O97

6、野生型大肠杆菌    O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，                IMVS^a

                     O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117

7、野生型大肠杆菌    O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，              IMVS^a

                     O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140

8、野生型大肠杆菌    O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，              IMVS^a

                     O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153                       b

9、野生型大肠杆菌    O168，O169，O170，O171，O172，O173，                                 c

     痢疾志贺氏菌    D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13               d

10、鲍氏志贺氏菌     B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，       d

                     B16，B17，B18

11、福氏志贺氏菌     F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，           d

                     DS，DR

12、野生型大肠杆菌   O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，     IMVS^a

                     O124，O162，O167，O121，O127，O149，O119

13、第5组菌株加上大肠杆菌标准菌株O84                                                     IMVS^a

                                                                            

^*为了检测的方便，我们将每13-19个菌分为一组，总共12组

a.  Institute of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australia

b.  Statens Serum Insti tut，Copenhagen，Denmark

c.  O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.  中国预防医学科学院流行病学研究所

表3大肠杆菌O84型O-抗原基因结构

                                                                              

Escherichia coli O84 O antigen genc cluster

orf#  wzx  orf2 orf3  orf4  wzy  orf6  orf7  gmd  fcl  gmm mQnC  orf12  manB  gnd

G+C％31.3  34.3  33.7  31.9  25.9  29.3  32.3  41.0  40.0  37.7  41.4  33.5  38.0  50.6

contcnt

表4大肠杆菌O84型O-抗原基因簇基因位置

                                                                                   

aaactattaa agaaattatt ggtagctgta agccaagggc ggtagcgtgg aaaaattaaa     60

atgaaactct ttgtaaaaat aaaaagctgt ggatgtcgga atagtaaaag tataaattat    120

                                             orf1的起始

catggttcta tattgagctt tataactcaa caatgagata tgt atgctgt caaaaataaa    180

aaatgtgata gatcggatag ttattatatt taaaccaata gcggcagatt tgacacagaa    240

agaaaaagat gaagttatta gattacgtgg agtttatctg actgctatca tatctttgtt    300

gtcaaagatt atttctatga tatctatatt tataactatt ccagcaatat taaattactt    360

aggtgaggaa ttgttcggga tttggatgac attaagttcc attattgcga tgttgacttt    420

tgcagatatg gggattggga atggagttgt aaataaatta tcaaaagcaa tatatagtaa    480

tagtgtaaat gatataagaa aaatcatcac aaatgctgtt acagtattat tgattatcgc    540

gacatcaatc aatttattat tctatgctgc cactccttta gttagttgga atagaatttt    600

gaatctgagt gaaaaaattg actcacattc tatagagcat gctttatttg tatttgtttt    660

ttgctttagt ttaaatgtgc tattttctat agtacagaaa atacagttgg catatcaatt    720

ggggtttata gcaagtatat ggcaaatatt aggtagtgta ttttcacttg gattgctgtt    780

tctgtttatt aacttgaagc ttgaaatggc ttggttggtt ttttcaatag ctggtatacc    840

tgctatattt caactattaa actatttgca cttttctctc gtaatttgta aaactggctt    900

tttcaagata agttttataa aaatagcaga aatgaaatca ctattaagta ctggtgtgtt    960

attttttgca ttacagattt ccatggtgtg cacttataca tccgataata tcatcttaaa   1020

tacgattatt ggagcggaag ctgtaactga atatagcgtt catgtgcgat tgtttagtgt   1080

aattccgatc cttatgggga tggtgttaat tccattatgg ccagcatact catcagcaag   1140

gataaagaaa gatataaaat ggattcggga tgtttggaat aaaagcatta tgatggcatt   1200

gttagtttca gtatttatag gtggaagtat tattcttttt ttacctgata tttttgatct   1260

ctggctgaaa aataaaatac aacctacata taccctagct tatatgcttt ttgtatggaa   1320

actttttgaa tctgtaggct tagcaataag ctgttttctt aacgggatgg atttaattaa   1380

acagcaagca ttcattgcag tggtaactgc ggtagttgct atctctttga agatattgtt   1440

tgtatatcaa ataggaatta ctggagtgct tcttggaacg ctgattccct ttgttttatt   1500

                                                   orf1的终止orf2的起始

gacttttata ccaacattat ttatatcatt gggctttttg agaaaaggaa tgtgc taatg   1560

aaaaagttta tttcaagatt gctctataat ccttacaaaa agataaaaaa agactctcga   1620

attgaattta attctgggat tttggataaa aatttccgtg tgcattttta ctgtagcgaa   1680

agtcgtgcta aggcatatat cggaaataat tgcatcctaa aaaatgagat tatatttgag   1740

agagagtgtg gtgtcgtcac tattggtgat aatacattca ttaacaaaaa cacgaagatt   1800

ataagtgtta atagaattag tataggaagt aatgttacca tatcttatgg tgtaataata   1860

tatgaccatg attcacactc gctagattat cgggaaaggc aaaaggatat tctgaaaata   1920

ttagagactc gagatccaaa taatgatata gaaaataaaa attgggattg tgttaaaagt   1980

ttaccagtaa ttataggtga taacgtttgg ataggttttc aagctgcgat actaaaaggt   2040

gttactatag gtgagggcgc ggttgttgct gcaagagcgg tagttacaaa agatgttccg   2100

gcgtggtctg tcgtggcagg caatccagcg aaggttgtga aagaaatacc aagagatatg   2160

    orf2的终止              orf3的起始

aggaag taag ttgaaaaata taactata at gattttgggg gcaggtggat tcattggttc   2220

tcatctgtgt aattcatgta tacaaaatgg agctacagtt tatgcacttg ggcgtaactt   2280

agataatgtg aagatcaaaa accagaggtt tataaaatta agttcaaatg aaatcactga   2340

aaagacatta tttgatgttg cacaaccaga ttatgtgtat tttttaatgg gcgcggcatc   2400

tgtagcaaaa tctatagaag ctccattata tgactttaac cagagtttac ccccactatt   2460

ggtgattttg gaaaaattac gaaaagaatg gatagggacg cgcctcattt ttatctcaag   2520

tgctgcagta tatggtgaaa atgcgagtga aagaacaagt gtaagtagtt tacctatgcc    2580

tttatcccct tatggattaa ataagaaaat ctcagaaacg tatgtgcaat attatatgaa    2640

acactatgat attagtgcga aaataataag acctttttct gtctatgggc ctggtttaaa    2700

gaagcaactt atttgggatg tattgaataa aataaaagat aagcagcatc attattttgg    2760

tagcggtaat gaaatgcgtg attggatata tattgatgat tttattgctg ttttgtttaa    2820

ttatgttagt aattatgctt tgatgagtga cctgataaat gtaggtacag gtattccaat    2880

aaaggttaaa aatgttattg aacaattgta cacattgacc gatacatttg aaattccctc    2940

gtttagtgat ggtggtaagg aaggcgatcc aaagcacttg gtaagtaatt atgaggagca    3000

agatttttta agagaacttt taaaaacgcc tcttgaattg ggattgagaa atacagttga    3060

                      orf4的起始orf3的终止

ttggtttaaa aaccaggagg aaca atgt ta aaagtcggta ttcctgtatt gttcagtgag    3120

cagcattgga tgggagggat caactacttt agaagtctaa tttctgcttt ttcacttgtt    3180

gaacaaaatg atattgaact tataattttt tgtgaaaaag atggattgtt caatacaacc    3240

aaacttaata atgttcgaca ggtaattatt cctgagcttc ttcctagaaa attgtctaaa    3300

cgtataataa ataaagttta tggagtgaat tttgaattat acaaagctat taaaaatgaa    3360

agtgttgaca ttttatctca tacccagata aataaacggt tagcttgcaa aaccatgtgg    3420

tggaagcccg attttcaaga gaaatactat cctgagtttt ttaatgagaa agatttattt    3480

ctacgaaatc agtctgtagt taataatgct ttacgtggat atctgctgtt tagtagtaat    3540

gatgcaaaaa acgatttttt taagttctat aatactttgc caacgcaaaa tattaatgtg    3600

cttcaattcg ttccagaaat tgaaataagc agttcacaag atgaaaatga tagaataata    3660

gcagtaaaag aaaaatatgg aattagtgga gattattttt ttttaccaaa ccaattctgg    3720

aaacataaaa accatgaatt agtgataaag gccattatta caggagatat acctgctaaa    3780

gtcgtggcaa ctggggcatc taatgattat cgtggaggga ggcatataga attaatcaat    3840

caattactta aacaagattc tgctaaaaaa ttcaagttat tagggttagt tgatagggat    3900

gatgttaatc ttttgatgaa aggtgctata gccgtaatca acccatctcg gtttgagggg    3960

tggagtacga cggtcgaaga ggcaaaatat ttaggtaaaa gattaatatt atctgatata    4020

ccagtacacc atgaacaaaa tcctcctgat tcattatatg tatcatgtga tgatgtatca    4080

ggaatgattt ctgctatgcg caagataata gatgaatatg atacagagaa ggaaatattt    4140

cgtgcaaaga aggctgctga gcaatataag tttaaaagaa aggaatttgg tctctcatac    4200

                   orf4的终止orf5的起始

tataatatct taaagtcact a taat atggc catctatata tttataagca tttcatgttt    4260

aatatcatat gttttgtcga ataatgataa gaattcattg agtccaagat tcctgttaat    4320

aatactaact ttatttacgg ggttatctta tacaaatgga tgggattggt acggttatct    4380

tgacttctat aataacattc aaaatgaagg ggtaagtgca atatatgagt ataatatata    4440

tggcattgag tatttatatt taatatattt gtatattgtt ggcctaagtg gaggaagttt    4500

tagcttattc atattattga atgcaataat aataaatttt ctcatttata gtttttgcaa    4560

acgagcttat gttaattata gcttgttcat gtttattttt atagctgcat catatttgag    4620

gttggaatta agtactatac gtcaaggatt ggccgttgtt atagttatat attcatattc    4680

gcttttatta aactcaaaaa taaatttatc cttattgttt atatttctgg ctatttgctt    4740

tcatagaagc gctgctatag tattattatt ctttccgttt gtttattata atagtgcaag    4800

aaatattcat tactttattg tcatacttac tataccattt gttattcttt cgggggaatt    4860

aaatgttgta tctataaaaa tattgaatgc ttttaattca tcattattaa atgcatatat    4920

atcgaagctt ataatttatt tgtcattaaa caaacaagca attattaacc cacaagctat    4980

ggcattatta gtcttttatt ttatttgtat cagggtttgt gatgttaaaa acaaaaaaca    5040

aattatattt ttaaatataa ttgcttgtca ggttataatt tctttttatt ttatattttt    5100

aacacaattg attattatgc gtctggttta ttattttcaa gttggatgga tatgttgggt    5160

aataatatta tacaaggagt atttccgacc taaatggtta tgttttttcc ttatatgtct    5220

tctgtttatt accaagtcaa tattaaattt tagatatgag caagatagag cggttttttt    5280

tccatattat aatgtaatat cttcatactt ggatgataat tatgggagaa gtagatcttt    5340

                                off5的终止orf6的起始

tatattgaat aaagcagatg agctttttaa ggag taaa at gtcaaagaaa attaagtata    5400

ttataaattt tgcaatgtca ctttttatat taccattttt ctatatagaa aaaaagataa    5460

tcggaaaaaa aatttggtta tgtggcgcag gaaatggcta ttatgaaaat aacatagcta    5520

gcattcatga ttatattttg aagagtttac ctttagctaa aaataaaatt ttttttgtaa    5580

caacaaatcg ggaactttta agcggtgagg tagccttccc tgtacttatt agagggcatt    5640

taaaaactta tgcgttgagt attttagctg attatttaat ctttgatact tgtaactcag    5700

atattgctcc tggaattcac cggtatcttt ctgctttgaa ggtaaatgtt aatcatggct    5760

ttgaaggctt aaagaagctt cctgaagact attatgcgaa aattgatgct gacatccatt    5820

gtgcttcttc aatgagagag aaatatatta aggtatttga atgtggagca gcgaatgaga    5880

aagtatttat tacaggttat cctagatttg atcgaatcgt ttcacgtgaa aacagtcatg    5940

tgaaaaaaat tcttttcttt ccaacatgga gatcatggtt ggagagtcta agcaatgatg    6000

agttaaataa ttccacgtat gtcagatcta tttatgattt tctatacagt gagagactca    6060

aagaatattt gagtgaaaat aacattataa tgtattataa gccacatcat aaaattagcc    6120

atttgaaatt agatttatct tcttgtaaaa atattatttt gctaaaagat tatgatgatc    6180

ttacacatta tatatgtgaa tcagatttgc ttattacaga ttattcaagc gttgcgtggg    6240

atttccttta ctctaataga gaagtaattt tctatatatt tgatattgat gaatatatat    6300

taaaacaagg tttatactat gatgtcagaa cttccttaag aaattatggc ggcacacctg    6360

atgaaattat taatctcctt aaaaaagaac gtaaggaagt tgatttaaat ttatcaagta    6420

tggcagggga attttttgag tatcgagata ataaaaattc tgagcgaatt ctaaaattaa    6480

           orf7的起始off6的终止

tctgtgaata taagat atga aagtaaaaat aatttcttat tctttatcca aaggcggagc    6540

ggcaaaagca gcaaaaaatt ttttacatct tgcttcgaaa aacaaaaaat atgaagcaga    6600

gatgataagt gtatcaggta ttataaaaaa tggtgtttta tttaaatcat caaaattatc    6660

agtgttttgg cattactcaa aaatgttagt aagccgggta ctcacttatt ttattttaaa    6720

tgataaaagt ataaaatatt cattgaatat ttttgactct aattatgttt taaaacatat    6780

cagagtggaa gatgggcaaa gggaagttat ccatattaat tgggtgaata atgataccct    6840

atctttattt tcattaagta aattatttga aaataaaaga aaaagaataa tattaacgtt    6900

acatgatgaa tggttttatt gtgcgtcaga gcactatgct aaatataatt cattatgtta    6960

tgtaacagga tatgatgata gcaattttat taatagctat atttttgaat taaaaaagag    7020

aataaatttt gagaatgtcg taattaccgt tccatcatat tggttgtatg agcgagcaaa    7080

gaaaagttat ttgttaagta attgtgatat atatatattg cctaattata tcgatactaa    7140

tatttttaca gagttaaagg acattcgttc aaaacgttat agaatacttg atgttcctga    7200

ggatgctttt attattggat ttggtgctgt tagtggcggt gccaacccct tgaaggggtt    7260

tgatctcttg gtttctgcct tggatgaagt attaagtaaa ataaatgaca aagctagaat    7320

tgtaatggtg acgttcggtg ctaacgatat agataaacgt gtaacatcac tgggatgcca    7380

cattataaat atgggagtta tctctaacag ccataatatg gctgagattt ataattattt    7440

ggatgtcatg attgttcctt cacgcgttga atcctttggg caagtagctg ctgaaagttt    7500

agcttgtaaa accccggtta ttgcatttga ttattcagga attaaagata ttgttactca    7560

tcaacggagt ggtttattag ctgaaccatt ttctgttgat tcactcgcac taaatataaa    7620

ttcatttatg aatatgacgg agaaagagag atatgtatat ggtgaaaatg gtcgcgatga    7680

tgtagttcga aaatttggag aaacggtggt ttcagaaatt tattttaaat tgatagatta    7740

                orf8的起始  orf7的终止

tgttagagga gatgaat atg aaaaa taaag tagctctaat tactggtgtt accggtcaag    7800

atggttctta cttggcagaa tttcttcttg aaaagggtta tgaagtgcac ggtataaaac    7860

gccgagcatc ttcttttaat actgaacgtg tagatcatat ctatcaggat cgtcataatg    7920

aaaacccaga tttcatactt cattatggtg acttaacgga ctcatcaaac ctgatacgct    7980

tgattaaaga aatccaacca gatgaagttt ataaccttgg agcacaatct catgtagcag    8040

tttcatttga atcacctgaa tatactgctg atgtagatgc tatggggact ttacgtctgc    8100

cggaagcgat ccgtatttgt ggactagaga aaaagacgcg tttctatcag gcatcaactt    8160

ctgaactctt cggcttagtc caagaaattc cgcagcgaga aactacaccg ttctatcctc    8220

gttcgcctta tgctgttgct aagatgtatg catactggat tactataaac tatcgtgaat    8280

cttatggtat gtatgcctgt aacggtatct tgttcaacca cgaatctcca cgtcgtggcg    8340

aaacatttgt tacacgtaaa attactcgtg caattgctaa tgtttcgcaa ggaatcgaaa    8400

aatgtctcta tcttggtaac atggactcat tgcgtgactg gggacatgct aaagattatg    8460

tccgtatgca gtggatgatg cttcaacaag aacgcccgga agattttgta atcgctactg    8520

gtaaacaaat ttctgtacgt gaatttgtcc gaatggcggc taaagaagtt ggcttggaac    8580

ttcagttctc tggtaaaggt attgatgaaa tagctactgt tgtaaacaaa acatctgact    8640

gtgctattgg cgtaaatgtt ggggatgtaa ttgttcgtgt tgatccacgc tatttccgcc    8700

ctgcggaagt tgaaacactt cttggtgatc caagtaaagc taaaaaatta ttgggttggg    8760

aaccagaaat tactgttgaa gaaatgtgtg cggaaatggt tgccagtgat ctggcggaag    8820

                                                              orf8的终止

caaaacagca tgcactactg aaaagccatg gttacgatgt tgcagtttct ctggagcgg t    8880

    orf9的起始

aaggt atgac aaaaaaacgt atctacgttg ctggtcaccg aggtatggtt ggctctgcta    8940

tttgccgtca attatcacag cgtgatgata tcgaattagt ggtcaaaaca cacaaagaac    9000

tcgatctaac cgtacagaag gatgttgatg cattttttga gcaagagaaa attgatcagg    9060

tttatcttgc tgcggctaaa gttggtggca tttatgccaa caatacattt ccggcagaat    9120

tcatctatca gaatctcatg attgagagta atattattca ttcagctcac aaggccggaa    9180

ttcaaaaatt acttttttta ggctcaagct gtatttatcc taaattcgca gagcagccga    9240

tgaacgagtc agcgctttta atgggcatac ttgagccaac taatgaacca tacgcaatag    9300

ctaaaattgc gggcataaaa ttatgtgaat cttataaccg ccaatatggc cgtgattatc    9360

gcagtgtaat gcctactaat ctttatggca taaatgataa tttccatcct gaaaactctc    9420

atgttattcc ggcactcatg cgtagattcc atgaagcaaa agagagtggt gcgccagagg    9480

ttattgtctg gggaaccgga acaccgatgc gtgagttttt atatgttgat gatatggctg    9540

ccgcatccgt ccatgtaatg gagcttgacg aagcaattta tcaacaaaat acacagccta    9600

tgttatccca tattaatgtt ggtacgggtg tagattgttc tatacgtgaa atggctgaaa    9660

caatggcctc tgtggtgggt tatcaaggta aaattgtttt tgattttact aaacctgatg    9720

gcactccgcg taaacttatg gacgttaccc ggctcaaaaa cttgggctgg caatatcgct    9780

ataatttaca tgaaggctta tcattaactt ataaatggtt tattgggaat attaattctt    9840

     orf9的终止orf10的起始

ttcgggga ta gtt atgaaca agagattgga acgtgagcta tttaaaacaa tagttgagca    9900

tactcctcta atctcgattg atctcataat tagaaacgat aaaggagagg cgctgctggg    9960

gcagcgcctg aatcgcccag cacaaaatta ttggtttgtg ccaggagggc gaatttataa   10020

ggatgagtca ttcgagattg catttaagcg gataacactt gaagagttgg gcgttcaaat   10080

tagtcttaat gatgccttat ttcttggggt gtatgaacat ttttacaatg ataatttttt   10140

tgaagcagaa ttttctacac gctatatagt gcatggatat gaaatccaac ttaaacctca   10200

gcaacttcac ctaccaacgg tccagcataa ttcctacaag tggtttgatg tagtaacgtt   10260

                                                        orf10的终止

gcttaatagc actatagttc atcaatatac caaaaactat tttataccaa gg taatagat   10320

orf11的起始

atgctacttc ccgttgtcat ggccggtggt tctggtacca gattatggcc tctttcacgt  10380

acactttatc cgaaacaatt tctgtcttta aatagtcgtt taaccatgtt gcaagagaca  10440

ttgcggcggc ttgataaggt cgaacataaa cctgctttgg tcatttgtaa cgaatcacat  10500

cgctttatcg ttgctgaaca attgcgtaaa gagagtttaa agcatagcgg tattttgctt  10560

gagcctgttg gtcgtaatac tgcgcctgct gtagcacttg cagcacttca ggctatggta  10620

actggagacg atcctattct tttggttctt gctgctgatc atgaaatcca ggatgaggat  10680

aatttcattg ctgcaattct cgctgcaaag aattttgcag agcagggtaa gcttgttacg  10740

tttggtatta ttccaacatc cccagagact ggctatggtt acattaagtc aggtgaatct  10800

ctggatggac aaggttacaa agttgcggct tttgttgaaa aaccagatct tcacgtagct  10860

cagcggtaca tatcagatgg cggttatctt tggaatagcg ggatgtttat gttcagagca  10920

tctgtattta tcgatgaact gaaaaaattc cgaccagata ttttagccag ttgccaacgc  10980

tccttgtcct cttcgataca agatttagat tttatccgtc tggatagtgc ttcattttct  11040

tgctgtcctg aagagtctat tgactatgca gttatggaaa aaacagccga agctgtcgtc  11100

gttccattaa atgcacaatg gagtgatgtt gggtcatggt ctgcattgtg ggaaataagt  11160

tcaaaagatc aaagcggtaa tgccattcgt ggtgatgtat tggttgaaga tgctacagat  11220

agttatcttt attcgcagca tagacttatt ggtgccgtgg gcgtaaagga tttgattgtt  11280

gttgaaacga aagatgccgt attagttgct cataaagata aagttcagca agttaaaaac  11340

atcgtcgctc aacttaaaaa gaataatcgc acagaatatt tacagcatcg ggaaatattt  11400

cggccttggg gcagtcatga tactatagct gaagggccgc gctttcaagt gaaacatgtg  11460

attgtattgc ctggtcacat taccgctaag cagattcatt accatcgtac tgaacattgg  11520

attgttgtct cggggacagc taaagttcat cttgaagata agacttacct tgtttctgaa  11580

aatgaatcaa catatatacc tgttggtgtt ccacatgcca ttgaaaatcc tggcaagatc  11640

ccgcttgaaa taattgaggt tagatcagga gtctacctgg aagaggatga tgttataaga  11700

                   orf11的终止orf12的起始

gtttcttctt ctggagtagg atac taatgc gaatttctat tatcacagcc acttataata  11760

gtgaaaaaac tctccttgat acattacttt ctctagaaaa acaaacgcat ccagatatcg  11820

aatatatagt tgtagatgga gcatcgaaag ataatacaat taagctgatc aagaggaatt  11880

gtacaaaagt ttcaaaaatc atttgcgaac ccgataaggg catttatgat gctctgaata  11940

aaggtattca agtagcttcg ggtgatgtta ttggcttttt acattctgat gatttactag  12000

cttatgatga tgctattgca gatatagcaa aaacatttga aagtacaggg tgtgatgcta  12060

tttatggcga tttggagtat gttgcccaaa atgatacgac taaacgtatt agattatgga  12120

aaagtggttc atttagtcgc ttcaagatga aagtgggttg gatgccacca cacccatcat  12180

tttatatgaa acgcgaatgt tatagtcagt ttggtagttt ttctttagat tatcgaatat  12240

ctgctgatta tgactcatta ttacgatata ttttaaaaca acgtatttcg atagcatatt  12300

taccaaaagt cttagtgaag atgcgtgttg gtggaattag caatcgttca gtatcttcaa  12360

tggtcaagaa gtcaatggaa gacattcgta ttatgaaaca gaatggtatt atctggccac  12420

                                                    orf12的终止orf13的起始

ttgctttagc gtataaaaat atatccaaac ttcctcaatt tattaaaaag taatcat cat   12480

gttaaatgtt aaaaaaatca ttaacgatag taatattgcg ttcggtacta gtggtgctcg  12540

cggtttagtg atcgattttt cccatgatgt ttgtgctgcg ttcactcatg cgtttctttc  12600

tgttattgat gacaaataca attttaataa agttgcctta gccattgata accgtccaag  12660

tagttacgaa attgctcagg catgcgcgta tgctataaaa caacatggat tcgaggttga  12720

atatcatggt gtaattccga ctcctgcatt agctcattat tcgatgcaga aaaacattcc  12780

ctgcataatg gtcacaggga gtcatatccc tttcgatcgt aatggcttaa aattctacag  12840

acctgatggt gaaatcacta aagaggatga gctcgcaatt ataaatagtg agtatacatt  12900

ttcgcctgta ggtgtattac ctcatcttga aacaagcact caaggtgcag actactacct  12960

cgagcgttat gtttctcttt ttaatcccga gattttaaag gggaaaagaa taggggtata  13020

tgaacattct agtgcgggac gcgatttata tgctcctctt tttaatcaaa tgggtgcaga  13080

ggtcatttcc ctcggtagga gtgatgagtt cgttccgatt gatacggaag cagtaagcga  13140

tgaagatcgt atacttgcaa gagagtggtc taaaaaatat aatcttgatg ctattttctc  13200

aacagatggc gatggtgatc gtcctttagt tgccgatgaa aatggtgaat ggttaagagg  13260

cgatattctg ggactactta ctgctattga acttaatatc aaggcgttgg ctattccagt  13320

gagttgtaat acagcaattg aagagtctaa taaatttgca agtatacaac gaacgaaaat  13380

aggttctcct tatgtaattg cagcatttgc agatcttgct aagcaatttg attcagtcgc  13440

tggttttgaa gctaatggtg gttttctcct tgcctctgat ttacaaatta atggcaagga  13500

attaaaatcg ttacctacac gagatgctgt gttaccagca ttaatgctct taatagcttc  13560

tcgcaatagt actatttctc aactgattaa taatcttcct cagcgattca cttggtcaga  13620

tagagttaaa aacttccctt cagattcaag tcaacaaatt ataaaaaatg ccatatcgtc  13680

acccaataat ttctttaata gtttaggtta tgaatcatta tcctgttccg ctattgatga  13740

aacggatggt gcaagattta ctttaaataa tggtgatatt atacatctcc gtccttccgg  13800

taatgctcca gaactccgtt gttatgctga ggccagtgat gaaaatcagg ctaagcaata  13860

                                           orf13的终止

tgttacgaat gtgctgggaa atattacctc tttgatttct  tgatgttata ggtttatcta  13920

cgcttatatg tgtgcgtagg tttgattaca cgtagatgcc ggtatacaga attgaagaac  13980

ggtatttgtt gcattaatga aattcagcac tacacacatt cgtgcaactt gagataacat  14040

ctcaatcata ttcaagtcgc gcatacatcg cggtgaacac cccctgacag gagtaaacaa  14100

tgtcaaagca acagatcggc gtcgtcggta tggcagtgat ggggcgcaac cttgcgctca  14160

acatcgaaag ccgtggttat accgtctcta ttttcaaccg ttcccgtgag aaaacggaag  14220

aagtgattgc cgaaaatcca ggcaagaaac tggttcctta ctatacggtg aaagaatttg  14280

ttgaatcttt ggaaacgcct cgtcgcatcc tgttaatggt gaaagcaggt gcaggcacgg  14340

atgctgctat tgattccctc aagccatacc tcgataaagg tgacattatc attgatggtg  14400

gtaatacctt cttccaggac accattcgtc gtaatcgtga gctttctgcc gaaggtttta  14460

acttcattgg taccggtgtt tccggcggtg aagaaggtgc gctgaaaggt ccttccatta  14520

tgcctggtgg gcagaaagaa gcctatgaac ttgttgcgcc gatcctgacc aaaatcgccg  14580

cagtggctga agacggtgag ccatgcgtta cctatattgg tgccgatggt gcaggtcact  14640

atgtgaagat ggttcacaac ggtattgaat acggtgatat gcaactgatt gctgaagcct  14700

attctctgct taaaggtggc ctgaacctca ccaacgaaga actggcgcag acctttaccg  14760

agtggaataa cggtgaactg agcagctacc tgatcgacat caccaaagat atcttcacca  14820

aaaaagatga agacggtaac tacctggttg atgtgatcct ggatgaagcg gctaacaaag  14880

gtacgggtaa atggaccagc cagagtgcgc tggatctcgg cgaaccgctg tcgctgatta  14940

ccgagtctgt atttgcacgt tatatctctt ctctgaaaga tcagcgtgtt gccgcatcta  15000

aagttctctc tggcccgcaa gcacagccag ctggcgacaa ggctgagttc atcgaaaaag  15060

ttcgtcgtgc gctgtatctg ggcaaaatcg tatcttacgc ccagggcttc tctcagctgc  15120

gtgctgcgtc tgaagagtac aactgggatc tgaactacgg cgaaatcgcg aaaattttcc  15180

gtgctggctg catcatccgt gcgcagttcc tgcagaaaat caccgatgct tatgccgaaa  15240

atccgcagat cgctaacctg ctgctggctc cgtacttcaa gcaaattgcc gatgactacc  15300

agcaggcgct gcgtgatgtc gttgcttatg cagtacagaa cggtatcccg gttccgacct  15360

tcgctgctgc ggttgcctat tacgatagct accgtgccgc tgttctgcct gcgaacctaa  15420

tccaggccca gcgcgactaa                                              15440

本发明的目的是寻找并应用该细菌的特异分子标识物(分子探针)，即特异核苷酸序列，因此本发明的技术方案具有独特性，其与常规研究方法的不同之处是，寻找到具有特异性的核苷酸序列，并通过可靠的实验数据确保分子标识物的特异性，即可利用本领域技术人员公知的成熟技术(如PCR或基因芯片等)，应用该标识物检测细菌的技术，使所有本领域技术人员都可以根据本发明提供的技术内容，很容易的实现本发明的目的并取得预期的使用效果。本发明中已经提供的实验数据，充分证明了该核苷酸序列的特异性，并可以应用于该细菌的检测，应用本发明的现代分子生物学细菌鉴定方法相对于传统的血清学免疫反应，具有快速、准确、低成本的优势。本发明测序并用生物信息学软件推测各个基因的功能，是为了寻找特异性核苷酸，细菌中有一些特定功能的基因是高度特异的，利用以上方法推测出这些特定功能的基因以及它们的位置，然后利用实验进行证明，将推测出的这些基因的功能，作为一种路标去更好更快的寻找到特异性核苷酸，这样，可以减少研究实验的盲目性，加快实验的进度，降低实验经费。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1、一种对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于，其为选自SEQ ID NO：1中的558至577碱基的寡核苷酸，SEQ IDNO：1中1334至1353碱基的寡核苷酸，SEQ ID NO：1中的431至449碱基的寡核苷酸，SEQ ID NO：1中1057至1076碱基的寡核苷酸，SEQID NO：1中的4723至4742碱基的寡核苷酸，5258至5276碱基的寡核苷酸，SEQ ID NO：1中的4472至4491碱基的寡核苷酸，或SEQ IDNO：1中5007至5026碱基的寡核苷酸。

2、一种对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的寡核苷酸对，其特征在于，其为选自SEQ ID NO：1中的558至577碱基的寡核苷酸和1334至1353碱基的寡核苷酸，SEQ ID NO：1中的431至449碱基的寡核苷酸和1057至1076碱基的寡核苷酸，SEQ ID NO：1中的4723至4742碱基的寡核苷酸和5258至5276碱基的寡核苷酸，或SEQ IDNO：1中的4472至4491碱基的寡核苷酸和5007至5026碱基的寡核苷酸。

3、权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的寡核苷酸或寡核苷酸对在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原中的应用。

4、权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O84型的O-抗原特异的寡核苷酸或寡核苷酸对的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。