CN1442424A - 对大肠杆菌o172型的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O172型(Escherichiacoli O172)的O－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O172型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长12850个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O172型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O172型的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O172型的方法。

Description

对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O172型(Escherichia coli O172)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O172型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O172型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and  J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测志大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation ofan outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification ofthe Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3，orf4，orf5，orf9基因。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf3，orf4，orf5，orf9基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因、源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O172型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O172型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O172型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O172型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O172型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长12850个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其由10个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3、orf4、orf5、orf9基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的1120至2388碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的2381至3556碱基的核苷酸；orf3是SEQ IDNO：1中的3553至4335碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO：1中的4335至5423碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO：1中的5420至6499碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1中的9795至11003碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf3、orf4、orf5、orf9基因；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的1166至1182碱基的核苷酸和1854至1870碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的1415至1434碱基的核苷酸和2286至2303碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的1157至1174碱基的核苷酸和1934至1951碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ IDNO：1中的2610至2627碱基的核苷酸和3452至3470碱基的核苷酸；SEQ IDNO：1中的2711至2728碱基的核苷酸和3460至3477碱基的核苷酸；SEQ IDNO：1中的2742至2759碱基的核苷酸和3480至3496碱基的核苷酸；源于orf3基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的3660至3677碱基的核苷酸和4255至4274碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的3728至3745碱基的核苷酸和4296至4313碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的3752至3769碱基的核苷酸和4308至4325碱基的核苷酸；源于orf4基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的4391至4410碱基的核苷酸和5211至5228碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4463至4470碱基的核苷酸和5271至5289碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4515至4530碱基的核苷酸和5396至5418碱基的核苷酸；源于orf5基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5435至5452碱基的核苷酸和5992至6009碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5687至5704碱基的核苷酸和6230至6247碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5724至5741碱基的核苷酸和6319至6336碱基的核苷酸；源于orf9基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的9825至9842碱基的核苷酸和10687至10704碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10001至10017碱基的核苷酸和10682至10699碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10201至10218碱基的核苷酸和10954至10971碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O172型的O-抗原，并成为细菌疫苗。

前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。

前述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O172型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O172型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O172型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ngPCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5 a细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨卞青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率，剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O172型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O172型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到10个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对痢大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf3、orf4、orf5、orf9基因设计引物；在每个基因内各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除源自orf9的的三对在O12、O25、O26中得到大小正确的带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf3、orf4、orf5基因对大肠杆菌O172型的O-抗原都是高度特异的。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长12850个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由10个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf3、orf4、orf5、orf9基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括gne基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O172型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf3、orf4、orf5、orf9基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物在以大肠杆菌O172型为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而除源自orf9的三对在O12、O25、O26中得到大小正确的带外，在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物。所以，可以确定除源自orf9的的三对这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O172型的O-抗原是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O172型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的1120至2388碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的2381至3556碱基的核苷酸)；orf3基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的3553至4335碱基的核苷酸)；orf4基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的4335至5423碱基的核苷酸)；orf5基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的5420至6499碱基的核苷酸)；orf9基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的9795至11003碱基的核苷酸)；源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O172型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O172型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O172型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O172型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O172型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O172型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O172型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O172型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O172型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCTGGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long TemplatePCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5干伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇文库。实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率。剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O172型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O172型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到10个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1编码的蛋白含有11个潜在跨膜片段，而且与许多Wzx蛋白相似，例如，和Y.pseudotuberculosis的Wzx在224个氨基酸中有25％的相同性，47％的相似性，所以可以确定orf1是wzx基因，命名为wzx。orf2含有9个潜在跨膜片段，它的内膜的拓扑结构具有众所周知的O-抗原聚合酶(Wzy)的典型特征。此外，它与S.enterica subsp.Enterica serovarVellore编码O-抗原聚合酶的Wzy在164个氨基酸中有26％的相同性，45％的相似性，说明它们之间有一定的同源性，所以命名orf2为wzy基因。orf3通过blast比较，与E.ictaluri的糖基转移酶在255个氨基酸中有25％的相同性，50％的相似性，说明它们之间有高度的同源性，可以推测orf3也为糖基转移酶基因，暂命名为orf3。orf4通过blast比较，与B.subtilis的糖基转移酶在121个氨基酸中26％的相同性，48％的相似性，说明它们之间有高度的同源性，可以推测orf4也为糖基转移酶基因，暂命名为orf4。orf5与E.coli的糖基转移酶基因在339个氨基酸中有27％的相同性，48％的相似性，所以推测orf5是一个糖基转移酶基因，暂命名为orf5。orf9与P.aeruginose的糖基转移酶基因在218个氨基酸中有27％的相同性，46％的相似性，所以推测orf9是一个糖基转移酶基因，暂命名为orf10。实施例6：特异基因的筛选：

针对大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf3、orf4、orr5、orf9基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

表1列出了大肠杆菌O172型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O172型的0抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物#101(-TTC ATC CTAAAC TCC TTA TT)和#102(-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG)，然后从166株大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共27组，它们的来源都列于表中。

在第24组中含有大肠杆菌O172型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在94℃预变性2分钟后，94℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy、orf3、orf4、orf5基因，每个基因都有三对引物被检测，每对引物除了在第24组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy、orf3、orf4、orf5基因对大肠杆菌O172型及其O-抗原是高度特异的。orf9的三对引物在O12、O25、O26中得到大小正确的带外，在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。

最后，通过PCR从大肠杆菌O172型中筛选到对大肠杆菌O172型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy和三个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O172型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O172型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O172型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的结构，共由10个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。序列列表<110>南开大学<120>对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸<130>对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>12850<212>DNA<213>Escherichia coli<400>1attgtggctg cagggaatca aagaaatcct cctggtaact cacgcgtcca agaacgcggt     60cgaaaaccac ttcgacacct cttatgaatt agaatctctc cttgaacagc gcgtgaagcg    120tcagctgctg gcggaagtgc agtccatctg tccgccgggc gtgaccatta tgaacgtgcg    180tcagggcgaa cctttaggtt tgggccactc cattttatgt gcacgacccg ccattggtga    240caacccattt gtcgtggtgc tgccagacgt tgtgatcgat gacgccagcg ccgacccgct    300gcgctacaac cttgctgcca tgattgcgcg cttcaacgaa acgggtcgta gccaggtgct    360ggcaaaacgt atgccgggcg atctctctga atactccgtc attcagacca aagagccgct    420ggaccgtgaa ggcaaagtca gccgcattgt tgaatttatc gaaaaaccgg atcagccgca    480gacgctggac tcagacatca tggccgttgg tcgctatgtg ctttctgcag atatttggcc    540ggaacttgaa cgcactcagc ctggtgcatg ggggcgtatt cagctgactg atgccatcgc    600tgaactggcg aaaaaacagt ccgttgacgc catgctgatg actggagaca gctacgactg    660tggtaaaaaa atgggctata tgcaagcgtt cgtgaagtat gggctgcgca acctgaaaga    720aggggcgaag ttccgtaaag gcattgagaa gctgttaagc gaataatgaa aatctgaccg    780gatgtaacgg ttgataagaa aattataacg gcagtgaaga ttcgtggcga aagtaatttg    840ttgcgaatat tcctgccgtt gttttatata aacaatcaga ataacaacga gttagcaata    900ggattttagt caaagttttc caggattttc cttgtttcca gagcggattg gtaagacaat    960tagcgtttga atttttcggg tttagcgcga gtgggtaacg ctcgtcacat cgtaggcatg   1020catgcagtgc tctggtagct gtaaagccag gggcggtagc gtacctttta tatagagctt   1080acaattgtga ataataaaac gaatgagcta ataggtggaa tgttattcaa agggttatac   1140atctttataa cctcactgaa cgccctgttg atggttaaaa tactatcacc gaaagatctg   1200ggggtgtggt atgtttttat gactcttcaa actttaatat ttacacttaa taatgcgata   1260atacctaaca ttgctcggca atatacattg ggtagcctca gtaaagaatt aaactttaat   1320tgttatattt ttcatcgctc aactcaaaag acatttatat atcttatatt attgatatta   1380atcatatgtg caattgcaac atttacatat ttgagctctg ttttagcgat cttggaatca   1440caaaataaaa tagtcttagt ttcttggctt ataatcgtat tctctttgtg tttggaagtt   1500tattattctt catatgactg tgcttttaat gggatgggca aatttaaaaa tgtaaataaa   1560attaatttta tatcgcgggc atgtttgttt ttgataagta ttggcatgat agcatatgat   1620attgatggta gaaatgcatt attatatttt tgcattggtt attttattag taatttaata   1680aaaagatttt ttatatacag gctatttata tccaattatc ataatctatg ttttaatagt   1740gaatctgata ctgaatcttt ttataaaaaa aatgaaaaaa taatactcaa tttgtcatgt   1800atgtccttta tatcatcaat tggcgggatg ttaattgtga gaggtgggat gcttattcta   1860ccttattatg tatctatcga agaagttggt aaatatggtc taacttatca attgtttgag   1920attgctttta atttgctatt cactgcgtca gcaataaaaa cgcctagttg gatttttttg   1980tataaagaaa ataagtgtga gctaaaaaaa tcatatttaa aaataaaata tgtaagttta   2040attgtgatgg caataggggg gggggtgatc agtttttatg gggggcagat actgtcactg   2100tttggactgc atgcaacatt attaactaca aatttgtgtt tacttctgac attaattttt   2160attttacaat tgaatcatag tatatcaggg cagttgttaa ctattcagaa taaaatacct   2220tatgcatatg cttctcttta tacaggaatt ggggttgttt tactgtcgat gatttttata   2280ccgataacag gattcaaggg agcattggtt gcgattttta tttcccaatt agcatataat   2340aactggaaat ggccgttaga ggctaggaag aaaataataa atgtataata tgagcgttaa   2400taaaaaaatc acaaagatgt ttgtcttttg tgagttttta tgtggattgt atattttatt   2460ttatggtgaa tatgtctctg actatctcaa tgttgaaaca aatgttaagc atatttacat   2520aatatgtttt cttatttgta tcgtattttt tcattatttg tttttatata gttggtgtat   2580attaagtgtt ttgtttttcc gcaaaagcaa actaacaaca tcagtaaata ttaattctat   2640atttttgttg ttagttataa tatactttat ttttcttctc aaaaccggaa gtggaaaagt   2700atatgcggac ggcggtagca taggtgaatt aagtagtttt gataagttgt tatttttccc   2760aataataatt cttaaactta attttctaat atacatatat gcagcgggtt gtaaaaaaaa   2820ggataatata tattatcttg tgctatttat atttttaatt tgtgaacttt atagaggtgt   2880ttcattttca atattactga tcgctctaat tgaaattgag aaaataaaaa ggtgttttag   2940gattaaatgt ttgttaatat cactgcctct ttttgtctta tttgttaata tagtatataa   3000tattaaattt atggtaaggt taggggagca ttatgattat cttgatatat tccaaacctt   3060aataatgtta cttggtaggt taagtataat ttcaaatgtt ttgtataatt atgagcatta   3120ttactcagtt agcaactttg tagaaggttt tggttatagt gcgataaatg agtttttaga   3180aaaattgacg ccaatgccgt cattatttgg aataactgaa aaaacgacag aaatagggaa   3240gttgatattt tatcattcat atggaagatg ggatagtgca attgcaatct ctgtgttagg   3300tatattaagt attgtgcctg gacaactatt agagatatgt gcaattttaa ttattagttt   3360tgtttttatt caattaatta taaatatgct tgacaatact gagcagcaaa atacggttgc   3420atttttcttc attatattaa ctctttatca ggggttttgg gggttgctgg ctaattatgt   3480ctatgcgcta ttcatttatt taattattat agcatcttgt aatttaatga tgtctaaaag   3540taaaggacgg ttatgaataa tctagaaatt cgagtgttgt ctttgcctga cgcgtatgcg   3600cgaaggacga aatttcagga aagattttct ttagtctcca aattgaaatt tcaatttttc   3660gatggcgtgt atgggaagaa tattccagac gagattttga aaagtatata tgatgataaa   3720aaggctaagt tgaagattaa ccgaagtatg acagtaggtg aaattggggc aacatattca   3780cattacttaa tatataaaga cgcatatgaa aaaaaacttg attatctaat tgtactcgag   3840gatgactctt ttgtagatga aaattttgat gatgtaatta ataggttact tgtaaaaata   3900acaccagatg atgatgctat tatatttata caaaagcata cc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引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物	反向引物	PCR产物的长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								Wzx	O-抗原转运酶	1120-2388	1166-1182	1854-1870	705bp	0*	50
			1415-1434	2286-2303	889bp	0*	51
											1157-1174	1934-1951	7956p	0*	50
Wzy	O-抗原聚合酶	2381-3556	2610-2627	3452-3470	861bp	0*	50
											2711-2728	3460-3477	767bp	0*	50
			2742-2759	3480-3496	755bp	0*	50
								orf3	糖基转移酶	3553-4335	3660-3677	4255-4274	615bp	0*	51
			3728-3745	4296-4313	586bp	0*	51
											3752-3769	4308-4325	574bp	0*	45
orf4	糖基转移酶	4335-5423	4391-4410	5211-5228	838bp	0*	50
											4463-4470	5271-5289	827bp	0*	52
			4515-4530	5396-5418	904bp	0*	53
								orf5	糖基转移酶	5420-6499	5435-5452	5992-6009	613bp	0*	50
			5687-5704	6230-6247	561bp	0*	50
											5724-5741	6319-6336	613bp	0*	51
orf9	糖基转移酶	9795-11003	9825-9842	10687-10704	880bp	0**	50
											10001-10017	10682-10699	699bp	0**	51
			10201-10218	10954-10971	771bp	0**	51

^*只在大肠杆菌O172型中得到正确的一条带

^**在O12、O25、O26中得到大小正确的带

表2  166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号               该组中含有的菌株                                    来源

1    野生型大肠杆菌O1，O2，O3，O4，O10，O16，O18，O39                  IMVS^a

2    野生型大肠杆菌O40，O41，O48，O49，O71，O73，O88，O100             IMVS

3    野生型大肠杆菌O102，O109，O119，O120，O121，O125，O126，O137      IMVS4     野生型大肠杆菌O138，O139，O149，O7，O5，O6，O11，O12                   IMVS5     野生型大肠杆菌O13，O14，O15，O17，O19ab，O20，O21，O22                 IMVS6     野生型大肠杆菌O23，O24，O25，O26，O27，O28，O29，O30                   IMVS7     野生型大肠杆菌O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O42                   IMVS8     野生型大肠杆菌O43，O44，O45，O46，O50，O51，O52，O53                   IMVS9     野生型大肠杆菌O54，O55，O56，O57，O58，O59，O60，O61                   IMVS10    野生型大肠杆菌O62，O63，O64，O65，O66，O68，O69，O70                   IMVS11    野生型大肠杆菌O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81                   IMVS12    野生型大肠杆菌O82，O83，O84，O85，O86，O87，O89，O90                   IMVS13    野生型大肠杆菌O91，O92，O95，O96，O97，O98，O99，O101                  IMVS14    野生型大肠杆菌O112，O162，O113，O114，O115，O116，O117，O118           IMVS15    野生型大肠杆菌O123，O165，O166，O167，O168，O169，O170，O171           See b16    野生型大肠杆菌O172，O173，O127，O128，O129，O130，O131，O132，         See c17    野生型大肠杆菌O133，O134，O135，O136，O140，O141，O142，O143           IMVS18    野生型大肠杆菌O144，O145，O146，O147，O148，O150，O151，O152           IMVS19    野生型大肠杆菌O153，0154，O155，O156，O157，O158，O159，               IMVS20    野生型大肠杆菌O160，O161，O163，O8，O9，O124，O111                     IMVS21    野生型大肠杆菌O103，O104，O105，O106，O107，O108，O110                 IMVS22    鲍氏志贺氏菌血清型B4，B5，B6，B8，B9，B11，B12，B14                    See d23    鲍氏志贺氏菌血清型B1，B3，B7，B8，B10，B13，B15，B16，B17，B18         See d24    痢疾志贺氏菌血清型D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8                       See d25    痢疾志贺氏菌血清D9，D10，D11，D12，D13                                 See d26    弗氏志贺氏菌F6a，F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：7)F5(v：4)    See d27    宋内氏志贺氏菌D5，DR                                                   See da.   Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australiab.   O123 from IMVS；the rest from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmarkc.   172 and 173 from Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，the rest from IMVSd.   中国预防医学科学院流行病学研究所表3大肠杆菌O172型O抗原基因结构图

表4大肠杆菌O172型O抗原基因簇基因位置

 1 ATTGTGGCTG CAGGGAATCA AAGAAATCCT CCTGGTAACT CACGCGTCCA AGAACGCGGT

61 CGAAAACCAC TTCGACACCT CTTATGAATT AGAATCTCTC CTTGAACAGC GCGTGAAGCG121 TCAGCTGCTG GCGGAAGTGC AGTCCATCTG TCCGCCGGGC GTGACCATTA TGAACGTGCG181 TCAGGGCGAA CCTTTAGGTT TGGGCCACTC CATTTTATGT GCACGACCCG CCATTGGTGA241 CAACCCATTT GTCGTGGTGC TGCCAGACGT TGTGATCGAT GACGCCAGCG CCGACCCGCT301 GCGCTACAAC CTTGCTGCCA TGATTGCGCG CTTCAACGAA ACGGGTCGTA GCCAGGTGCT361 GGCAAAACGT ATGCCGGGCG ATCTCTCTGA ATACTCCGTC ATTCAGACCA AAGAGCCGCT421 GGACCGTGAA GGCAAAGTCA GCCGCATTGT TGAATTTATC GAAAAACCGG ATCAGCCGCA481 GACGCTGGAC TCAGACATCA TGGCCGTTGG TCGCTATGTG CTTTCTGCAG ATATTTGGCC541  GGAACTTGAA CGCACTCAGC CTGGTGCATG GGGGCGTATT CAGCTGACTG ATGCCATCGC601  TGAACTGGCG AAAAAACAGT CCGTTGACGC CATGCTGATG ACTGGAGACA GCTACGACTG661  TGGTAAAAAA ATGGGCTATA TGCAAGCGTT CGTGAAGTAT GGGCTGCGCA ACCTGAAAGA721  AGGGGCGAAG TTCCGTAAAG GCATTGAGAA GCTGTTAAGC GAATAATGAA AATCTGACCG781  GATGTAACGG TTGATAAGAA AATTATAACG GCAGTGAAGA TTCGTGGCGA AAGTAATTTG841  TTGCGAATAT TCCTGCCGTT GTTTTATATA AACAATCAGA ATAACAACGA GTTAGCAATA901  GGATTTTAGT CAAAGTTTTC CAGGATTTTC CTTGTTTCCA GAGCGGATTG GTAAGACAAT961  TAGCGTTTGA ATTTTTCGGG TTTAGCGCGA GTGGGTAACG CTCGTCACAT CGTAGGCATG1021 CATGCAGTGC TCTGGTAGCT GTAAAGCCAG GGGCGGTAGC GTACCTTTTA TATAGAGCTT

                               SD    orf1的起始1141 ATCTTTATAA CCTCACTGAA CGCCCTGTTG ATGGTTAAAA TACTATCACC GAAAGATCTG1201 GGGGTGTGGT ATGTTTTTAT GACTCTTCAA ACTTTAATAT TTACACTTAA TAATGCGATA1261 ATACCTAACA TTGCTCGGCA ATATACATTG GGTAGCCTCA GTAAAGAATT AAACTTTAAT1321 TGTTATATTT TTCATCGCTC AACTCAAAAG ACATTTATAT ATCTTATATT ATTGATATTA1381 ATCATATGTG CAATTGCAAC ATTTACATAT TTGAGCTCTG TTTTAGCGAT CTTGGAATCA1441 CAAAATAAAA TAGTCTTAGT TTCTTGGCTT ATAATCGTAT TCTCTTTGTG TTTGGAAGTT1501 TATTATTCTT CATATGACTG TGCTTTTAAT GGGATGGGCA AATTTAAAAA TGTAAATAAA1561 ATTAATTTTA TATCGCGGGC ATGTTTGTTT TTGATAAGTA TTGGCATGAT  AGCATATGAT1621 ATTGATGGTA GAAATGCATT ATTATATTTT TGCATTGGTT ATTTTATTAG TAATTTAATA1681 AAAAGATTTT TTATATACAG GCTATTTATA TCCAATTATC ATAATCTATG TTTTAATAGT1741 GAATCTGATA CTGAATCTTT TTATAAAAAA AATGAAAAAA TAATACTCAA TTTGTCATGT1801 ATGTCCTTTA TATCATCAAT TGGCGGGATG TTAATTGTGA GAGGTGGGAT GCTTATTCTA1861 CCTTATTATG TATCTATCGA AGAAGTTGGT AAATATGGTC TAACTTATCA ATTGTTTGAG1921 ATTGCTTTTA ATTTGCTATT CACTGCGTCA GCAATAAAAA CGCCTAGTTG GATTTTTTTG1981 TATAAAGAAA ATAAGTGTGA GCTAAAAAAA TCATATTTAA AAATAAAATA TGTAAGTTTA2041 ATTGTGATGG CAATAGGGGG GGGGGTGATC AGTTTTTATG GGGGGCAGAT ACTGTCACTG2101 TTTGGACTGC ATGCAACATT ATTAACTACA AATTTGTGTT TACTTCTGAC ATTAATTTTT2161 ATTTTACAAT TGAATCATAG TATATCAGGG CAGTTGTTAA CTATTCAGAA TAAAATACCT2221 TATGCATATG CTTCTCTTTA TACAGGAATT GGGGTTGTTT TACTGTCGAT GATTTTTATA2281 CCGATAACAG GATTCAAGGG AGCATTGGTT GCGATTTTTA TTTCCCAATT AGCATATAAT

                    SD            orf2的起始，orf1的终止2401 TAAAAAAATC ACAAAGATGT TTGTCTTTTG TGAGTTTTTA TGTGGATTGT ATATTTTATT2461 TTATGGTGAA TATGTCTCTG ACTATCTCAA TGTTGAAACA AATGTTAAGC ATATTTACAT2521 AATATGTTTT CTTATTTGTA TCGTATTTTT TCATTATTTG TTTTTATATA GTTGGTGTAT2581 ATTAAGTGTT TTGTTTTTCC GCAAAAGCAA ACTAACAACA TCAGTAAATA TTAATTCTAT2641 ATTTTTGTTG TTAGTTATAA TATACTTTAT TTTTCTTCTC AAAACCGGAA GTGGAAAAGT2701 ATATGCGGAC GGCGGTAGCA TAGGTGAATT AAGTAGTTTT GATAAGTTGT TATTTTTCCC2761 AATAATAATT CTTAAACTTA ATTTTCTAAT ATACATATAT GCAGCGGGTT GTAAAAAAAA2821 GGATAATATA TATTATCTTG TGCTATTTAT ATTTTTAATT TGTGAACTTT ATAGAGGTGT2881 TTCATTTTCA ATATTACTGA TCGCTCTAAT TGAAATTGAG AAAATAAAAA GGTGTTTTAG2941 GATTAAATGT TTGTTAATAT CACTGCCTCT TTTTGTCTTA TTTGTTAATA TAGTATATAA3001 TATTAAATTT ATGGTAAGGT TAGGGGAGCA TTATGATTAT CTTGATATAT TCCAAACCTT3061 AATAATGTTA CTTGGTAGGT TAAGTATAAT TTCAAATGTT TTGTATAATT ATGAGCATTT3121 TTACTCAGTT AGCAACTTTG TAGAAGGTTT TGGTTATAGT GCGATAAATG AGTTTTTAGA3181 AAAATTGACG CCAATGCCGT CATTATTTGG AATAACTGAA AAAACGACAG AAATAGGGAA3241 GTTGATATTT TATCATTCAT ATGGAAGATG GGATAGTGCA ATTGCAATCT CTGTGTTAGG3301 TATATTAAGT ATTGTGCCTG GACAACTATT AGAGATATGT GCAATTTTAA TTATTAGTTT3361 TGTTTTTATT CAATTAATTA TAAATATGCT TGACAATACT GAGCAGCAAA ATACGGTTGC3421 ATTTTTCTTC ATTATATTAA CTCTTTATCA GGGGTTTTGG GGGTTGCTGG CTAATTATGT3481 CTATGCGCTA TTCATTTATT TAATTATTAT AGCATCTTGT AATTTAATGA TGTCTAAAAG

 SD  orf3的起始，orf2的终止3601 CGAAGGACGA AATTTCAGGA AAGATTTTCT TTAGTCTCCA AATTGAAATT TCAATTTTTC3661 GATGGCGTGT ATGGGAAGAA TATTCCAGAC GAGATTTTGA AAAGTATATA TGATGATAAA3721 AAGGCTAAGT TGAAGATTAA CCGAAGTATG ACAGTAGGTG AAATTGGGGC AACATATTCA3781 CATTACTTAA TATATAAAGA CGCATATGAA AAAAAACTTG ATTATCTAAT TGTACTCGAG3841 GATGACTCTT TTGTAGATGA AAATTTTGAT GATGTAATTA ATAGGTTACT TGTAAAAATA3901 ACACCAGATG ATGATGCTAT TATATTTATA CAAAAGCATA CCCTTGACTC TAAAGTGATT3961 TTTAGTCGAA AAAAAGATAT ATTGAAAAAC GGTTTTGAGT TGGTAAAAAT GTTAGGAAGT4021 TCACAATATT TTGTTGGGTC ATATGGCTAT ATTCTAACTA AAAAATCAAT TAACAAAATA4081 ATACAGAACT ATTTGCCAAT ATATTGTGTT TGCGACCATT GGTTCTTTAT TAAAAAAGAT4141 AGTAAGATAG AGTCATTTTA TTGTGTGAGC CCAAGTTTAG TATATACTAA TGATGAAGAT4201 ATTAGACTGG TTGATAGTTT TATCAATGAA GAAAGGAAAA ATGTTCTGAA AAATCGAGGT

                                                 SD4321 AAGGATTGGG AA TAGTGTTT TATATTTGTA AGGTAATCAC CGTTTTAATC AAGGTTATAA

        orf3的终止；orf4的起始4381 TTTCATTCTT GGTGTTTCCA TTGTGTAAGC CATTTAGTAA TAAAAATAAA AAAGTGGTTG4441 TAATAGGAAC TCGAAATGGA AATCAAGGTA ATGATAATGG TGAGGTTTTT TATTCATATT4501 TAAATGACAA TAATGACAAT GACGATCTTC TGGTTTATTT AATACGGAGA AGTAAGAATA4561 AGGAGAAATA TAAAAATATC CTAATAAAAA ACTCCATCAG AGCTAACATT AAGATTTTAA4621 GTGCGGACAT ATTATATATA ACACATTCAG AATCAGATTT AATTGACTTC TGGTGGCGAT4681 TCGTTACTTA TAAAAAAATA GTTTTTATTC AGCATGGTGT TATAGGAATA AAAAGACTTC4741 CTGAGTACGA AAAGAAAAAA TTCTCTCTTT TTGTTTCAAG CAACAATTAT GAATATGAGA4801 TTTTGATTAA ATATTATAAT ATATGTAGCG AAAGAATAGT TAAATCAGGA ATACCTAGGT4861 TTGATAATTA TACTATATTG AACGAAGCCC CACAGAAAAT AAAAAAATGC CTAGTCATGT4921 TTACATGGCG AAAATTTTAT AAAGATGAAC AATCAATCAG ATTGAAGCGT GTTATTAGTA4981 CAATAATTAG AAATGAGCCT TCAATAAAGA TATACGTTGC ATCGCACGAA TTATCTGATT5041 ATTCACTGTC AGAATTTGAA TTTTATAATA TCAATTATGT GGAATCAATA GGTATACAGA5101 ATGCAATTAA AGAGTGTGAT CTATTAATAA CTGATTTTTC AAGTATTGCT TGGGATTTTT5161 TATATCAAAA TAAATTGATT TGCTTTATAC AAACTGATTA TTTAGAATAT GTTTTCAATG5221 AGGGTGTCTA TTTCCATTGT GATGATTTTT TTGGTTATAT TATCAGGGAT CTAAGTGATA5281 TTAATGATGC CTTTATTTCG GAAATTTTAA GAGTTAATAA GTTAAATAAT CAAGAATTCT5341 TAAAAAGATA CCCTTTTTAT ATAAACTATA AGAAAAAGCA CTCTGAGTTA TTATTTCTAG

    SD          orf5的起始，orf4的终止5461 CGCTCTTTCG CTTTTAAATG ATTTGCTGGA ATATGCGAAT GATGATATTG ATAATGAATA5521 TACTGTTTGC GTTAATGAAA AATTAAATAA CGAAGTGTCT GTTTACAATA ATTTGACATT5581 TTTATTTGTT GATACTAAAG CTTGGCATAA AAGGGTTTAT TTTGACTTTA TAGGGTTTAA5641 AAAAAACTTT GATAATAAAG ATTATTGCTT GGTAATAAAT TTGCAAAATA TACCAGTTCG5701 GACACAATTA AAACAAATAT TGTACTTGCA TCAGCCTTTG CCTTTTTCGG ATATTAAGTT5761 AAAATTTTTG GAGAAGCGTA ATAGAAAATT GATATTCTAT AATAACTTAT ATGGATTAAT5821 AATAAAATTT AATTCATGTT TTATTGATCA TTGCTTAGTG CAAACTGAGT GGATGAGAAA5881 AGCTGTTATT GATAAACTAA ACCTGTCTGA GAAAAAAATA AGTATAATTA GACCAGTAAT5941 AGATATTGAT TTGAACAAAA TTTTAAAAAA TGAAAATGAA AATGAAAATA CATTCATCTA6001 TCCCGCAGCA TCTTATAGTT ATAAAAATCA TATAATATTG GTTGAATCAT TAAATATGAT6061 TGGTGTGGAT TTTTTGTTTC AGAATAAGAT AACTGTTATA TTTACATTAG ATCGTGATGA6121 AAATTCGAAG TTGTTTGATC GGATAAAAAA ATATAATCTT CAAGAGATTA TTAAATTTAC6181 AGGAAATATC CCAAGATATG ATGTTTTAAA TTACATTTAT AATGCTAAAG CCTTACTGTT6241 TCCATCAAGA CTAGAAACAT TTGGTATACC ATTGATAGAA GCTGTAAAAT TTAATTCTAA6301 CATAATTGTA AGTGATCTAC CTTATGCGCA CGACGTATTG GATGGTTATG AAAATGTCAA6361 ATACTGTAAT CCTGATTCTC CAGAGGATTG GTCTGAAGCA ATCAAATTTG CTATCAATCT6421 AAAAGAGAAT AAATTAAATC AGGGCTTTGA ATTAAATTCA GGGTGGAGAG AGTTGAGTTC

          orf5的终止                SD     orf6的起始6541 GTTTTATTAA TAACCGGTGG GACTGGTTCT TTTGGAAATG CTGTATTGCG GCGATTTCTT6601 GACACAGATA TTAAAGAAAT TCGTGTTTTT TCGCGTGATG AAAAGAAACA AGATGATATG6661 CGAAAAAAAT ACAATAATGA TAAATTGAAA TTCTATATTG GTGATGTCAG AGATTATAGA6721 AGTATTTTAA ATGCTACACG AGGTGTTGAT TATATTTATC ATGCAGCTGC ATTAAAACAA6781 GTTCCTTCGT GTGAATTCCA TCCTATGGAG GCAGTTAAGA CCAACGTGTT AGGTACTGAG6841 AATGTGTTGG AGGCTGCAAT TTCTAATGGA GTTAAACGAG TAGTTTGTTT GAGTACTGAT6901 AAAGCCGTGT ACCCCATTAA TGTAATGGGG ATTTCCAAAG CAATGATGGA AAAAGTAATT6961 GTAGCGAAAT CGCGTAATTT GGATAGTTCT AAAACTGTCA TTTGTGGAAC TCGCTATGGC7021 AACGTTATGG CATCGCGTGG CTCAGTTATT CCTCTGTTTG TGGATTTGAT TAAAGCAGGA7081 AAACCGCTAA CAGTGACGAA CCCTGATATG ACAAGGTTTA TGATGACGCT TGAAGATGCG7141 GTAGACCTAG TTCTTTATGC ATTTGAACAT GGTAATAATG GCGATATTTT CGTACAAAAA7201 GCACCAGCAG CTACCATTGA AACTTTAGCA ATTGCACTCA AGGAACTATT GGGTGCTAAT7261 GAACATCCGG TCAAAATTAT AGGTACCAGA CACGGCGAAA AATTATATGA GGCGTTATTG7321 AGTCGTGAAG AGATGATCGC AGCAATCGAT ATGGGAGAAT ATTACTGTGT TCCGCCAGAC7381 TTGCGTGACC TTAACTATAG TAAATATGTT GAGCATGGTG ATTGTCGAAT TTCAGAAATT7441 GAAGACTATA ATTCACACAA TACAGTAAGG CTGGATGTTA AAGGAATGAA GGAATTATTG

                                                     SD      orf6的终止7561 T ATGAAAATA CTAATTACTG GTTCTAAAGG TTTTATTGCT CGTAATTTAA TCTATCGCCTorf7的起始7621 GCAGGAAGCA GGCTTTAAAG ATTTAATTAC GATCGACCGT GAATCACCTT TGCAAGAGTT7681 AGAACAGGGA CTCAAAATTG CTGATTTTAT TTATCATCTT GCTGGTGTAA ATAGGCCAAA7741 GGAAGAACAT GAGTTTCAGG AGGGAAATAC TGATCTTACA AAATTAATTG TTGACTATCT7801 GCTTTGTAAT GCAAAAAAGA CTCCTATTAT GCTTAGTTCC TCCATTCAGG CTGAATGTGA7861 TAACGCGTAT GGAAAAAGCA AGGCATCGGC GGAAAAAATC ATTCAACATT ATGGTCATGT7921 TAGTGGCGCA GAATATTATA TCTATCGATT ACCAAATGTG TTCGGTAAGT GGTGTCGACC7981 AAATTACAAC TCCTTTGTTG CAACTTTTTG TCATAGGATA GCAAACGATC AAGATATTAT8041 CATTCATGAC CCGACAGCAG AGGTCGAGCT TGTTTATATT GATGATTTTT GTACTGATGC8101 TATCAACTTA TTAAATAACA AGTACGCGTC AGGTTTTAAA AATATAAAGC CGACGTATTC8161 AATAACAGTG GGTGAGGTAG CAAATCTAAT TTATAAATTT AAAGAAAGTA GACATACTCT8221 TATTACGGAA AATGTTGGTC AGGGTTTTTC ACGAGCGTTA TATTCAACTT GGCTTAGTTA8281 CTTGCAACCA GAGCAGTTCG TGTATGCAGT GCCTTCCTAT AGTGATGAAA GAGGAGTGTT8341 CTGCGAGGTC TTAAAAACCC ATTCCTCTGG ACAATTTTCA TTTTTTACCG CACTTCCAGG8401 AGTAACGCGT GGAGGGCACT ATCATCATAC AAAGAATGAA AAATTTATCG TTATTCGTGG8461 AACAGCATGT TTTAGGTTTA AAAATGTTTT AACAGGAGAA CGATATGAGA TTAATGTTGC8521 GTCAGATGAA TATAAAATTG TAGAAACTGT GCCAGGTTGG TCCCATGATA TTACTAATAC8581 CGGTCATGAT GAATTAATCG TAATGTTGTG GGCGAATGAA ATATTTAATC GTGATCAACC

         SD      orf8的起始，orf7的终止8701 CGTCCAGAAA TTATTCGACT TTCGCGTGTC CTTGCAAAAT TAGATGAATA TTGTGACCAC8761 CTTATTGTTC ATACTGGACA AAACTACGAT TATGAATTGA ATGAAGTTTT TTTCAAAGAT8821 TTGGGTGTTC GCAAACCTGA TTATTTTCTT AATGCCGCAG GTAAAAATGC AGCAGAGACT8881 ATTGGACAAG TTATTATTAA AGTTGATGAG GTCCTTGAAC AGGAAAAACC AGAAGCCATG8941 TTAGTTCTTG GTGATACTAA CTCCTGTATT TCAGCAATAC CAGCAAAGCG TCGAAGAATT9001 CCGATCTTCC ATATGGAGGC TGGGAATCGT TGTTTTGACC AACGCGTACC GGAAGAAACT9061 AACAGAAAAA TAGTTGACCA TACCGCTGAT ATCAATATGA CATATAGTGA TATCGCGCGT9121 GAATATCTTC TGGCTGAAGG TGTACCAGCC GATAGAATTA TTAAAACTGG TAGCCCAATG9181 TTTGAAGTAC TCACGCATTA TATGCCGCAG ATTGATGGTT CCGATGTACT TTCTCGCCTG9241 AATTTAACAC CTGGGAATTT CTTTGTGGTA AGTGCCCACA GAGAAGAAAA TGTTGATACC9301  CCTAAACAGC TTGCGAAACT GGCGAATATA CTTAATACCG TAGCTGAAAA ATATGATGTC9361  CCGGTAGTCG TTTCTACTCA TCCTCGCACT CGTAACCGCA TCAACGAAAA CGGTATTCAA9421  TTCCATAAAA ATATCTTGCT TCTTAAGCCA TTAGGATTTC ACGATTACAA CCATCTGCAA9481  AAAAATGCGC GTGCTGTTTT ATCGGATAGT GGGACTATTA CAGAAGAGTC CTCCATTATG9541  AACTTCCCTG CACTCAATAT ACGAGAAGCG CACGAACGCC CGGAAGGCTT CGAAGAAGGG9601  GCAGTAATGA TGGTCGGCCT TGAATCTGAG CGCGTTTTAC AGGCATTAGA AATTATCGCA9661  ACACAGCCTC GTGGAGAAGT ACGCTTACTC CGTCAGGTCA GTGACTATAG CATGCCAAAT9721  GTTTCAGATA AAGTTGTGCG TATTATCCAT TCATACACTG ACTACGTTAA ACGGGTTGTC

SD         orf8的终止，orf9的起始9841  GTGTTGGGGC TAAAATGTTT CATGAGTTAG GCCTTGAATT GCTGAGCAGA GGCCATGATG9901  TAACTGTAAT TACGCCTGAC ATCACATTAC AAGTAATCTA TTCTGTTAGT ATGATTGATG9961  GTATAAAGGT TTGGCGTTTC AAAAGTGGCC CTTTAAAGGA TGTAGGTAAG GCTAAACGTG10021 CCATAAATGA AACTCTTTTA TCTTTTCGTG CATGGCGCGC ATTTAAGCAC CTCATTCAGC10081 ATGATACATT TGATGGTATT GTTTATTATT CCCCCTCTAT TTTTTGGGGA GACTTGGTTA10141 AAAAAATAAA ACAGCGATGC CAGTGCCCAA GCTATCTGGT CCTGAGGGAT ATGTTTCCAC10201 AGTGGGTTAT TGATGCAGGT ATGTTGAAAG CCGGTTCACC AATTGAAAAA TATTTCAGGT10261 ATTTTGAAAA AAAATCATAT CAGCAGGCTG ACCGGATAGG GTTAATGTCT GATAAGAATC10321 TTGAGATATT TCGTCAGGCC AATAAAAATT ATCCGTGTGA AGTTTTACGT AATTGGGCCT10381 CAATGACTCC TGTGTCTGCC AGCGATGATT ATCATTCACT TCGTCAAAAA TACGATCTAA10441 AAGATAAAGT TATTTTTTTC TATGGCGGAA ATATTGGGCA TGCTCAAGAT ATGGCAAACT10501 TAATGCGCCT TGCGCGTGAT ATGATGCGTT ATCATGATGC TCATTTCCTG TTTATAGGGC10561 AGGGTGATGA AGTTGACCTG ATAAAATCTC TTGCTGTAGA ATGGAATTTA ACTAATTTCA10621 TTCATCTACC TTCAGTGACC CAAGAAGAGT TCAAATTAAT TTTATCTGAA GTTGATGTCG10681 GCCTATTCTC CCTTTCATCT CGCCATTCTT CACATAATTT CCCCGGGAAA TTACTCGGGT10741 ATATGGTTCA TTCAATCCCG ATTCTTGGGA GTGTGAATGA CGGCAATGAT TTGATGGATA10801 TAATTAACAA GCACAGGGCC GGTTTTATTC ATGTTAATGG TGAAGATGAT AAACTGTTTG10861 AATCTGCACA ATTGCTTCTT AGTGATTCAG TTTTAAGAAA ACAGTTAGGT CAGAACGCTA10921 ATGTGTTGTT AAAGTCTCAA TTTTCGGTTG AATCGGCGGC ACATACTATC GAAGTCCGAC

SD          orf10的起始    orf9的终止11041 AGTAAATTCT GAACGTTTGC GCGCTCATTA TTTATTGCAC GCATCTCATC AGGAGAAAGT11101 TCAACGTTTA CTTATTGCAT TTGTACGCGA CAGCTATGTT GAACCCCATT GGCATGAGTT11161 ACCGCATCAG TGGGAAATGT TTGTCGTCAT GCAAGGGCAA TTAGAAGTTT GTTTGTATGA11221 GCAAAATGGT GAGATCCAAA AAAAGTTTGT TGTTGGAGAC GGTACGGGAA TAAGCGTCGT11281 GGAATTTTCC CCAGGAGATA TACATAGTGT CAAATGCCTG TCACCAAAAG CCCTTATGTT11341 AGAGATAAAG GAGGGGCCAT TTGACCCACT GAAAGCTAAG GTTTTTTCTA AGTGGTTATA11401 GGGCGATACA TCACCGTTTA TTCTTCTATC TTATTCTATA CATGCTGGGT TACCATCTTAorfl0的终止

11461 GCTTCTTCAA GCCGCACACC CGCAGCGAAC ACCCCTGACA GGAGTAAACA ATGTCAAAGC

11521 AACAGATCGG CGTCGTCGGT ATGGCAGTAA TGGGGCGCAA CCTTGCGCTC AACATCGAAA

11581 GCCGTGGTTA TACCGTCTCT ATTTTCAACC GTTCCCGTGA GAAGACGGAA GAAGTGATTG

11641 CCGAAAATCC GGGCAAGAAA CTGGTTCCTT ACTATACGGT GAAAGAGTTT GTTGAATCTC

11701 TGGAAACGCC TCGTCGCATC CTGTTAATGG TGAAAGCAGG TGCAGGCACG GATGCTGCTA

11761 TTGATTCTCT CAAGCCATAC CTCGATAAAG GCGACATCAT CATTGATGGT GGTAACACCT

11821 TCTTCCAGGA CACCATCCGT CGTAACCGTG AGCTTTCTGC AGAAGGCTTT AACTTCATCG

11881 GTACCGGTGT CTCCGGCGGT GAAGAAGGTG CGCTGAAAGG TCCTTCCATT ATGCCTGGTG

11941 GGCAGAAAGA AGCCTATGAA CTGGTTGCGC CGATCCTGAC CAAAATCGCC GCAGTGGCTG

12001 AAGATGGCGA ACCGTGCGTT ACCTATATTG GTGCCGATGG TGCAGGTCAT TATGTGAAGA

12061 TGGTTCACAA CGGTATTGAA TACGGTGATA TGCAGCTGAT TGCCGAAGCC TATTCTCTGC

12121 TAAAAGGTGG CCTGAACCTT ACCAACGAAG AACTGTCACA GACCTTTACC GAATGGAATA

12181 ACGGTGAACT GAGCAGCTAC CTGATCGACA TCACCAAAGA TATCTTCACC AAAAAAGATG

12241 AAGACGGTAA CTACCTGGTT GATGTGATTC TGGATGAAGC AGCAAACAAA GGTACGGGTA

12301 AATGGACCAG CCAGAGTGCG CTGGATCTCG GTGAACCGCT GTCGCTAATT ACCGAGTCTG

12361 TGTTTGCACG TTATGTCTCT TCTCTGAAAG ATCAGCGTGT TGCCGCATCT AAAGTTCTCT

12421 CTGGCCCGCA AGCGCAGCCA GCTGGCGACA AGGCTGAGTT CATCGAAAAA GTTCGTCGTG

12481 CGCTGTATCT GGGCAAAATC GTTTCTTACG CCCAGGGCTT CTCTCAGCTG CGTGCTGCGT

12541 CTGAAGAGTA CAACTGGGAT CTGAACTACG GCGAAATCGC GAAGATTTTC CGTGCTGGCT

12601 GCATCATCCG TGCGCAGTTC CTGCAGAAAA TCACCGATGC TTATGCCGAA AATCCACAGA

12661 TCACTAACCT GCTGCTGGCT CCGTACTTCA AGCAAATTGC CGATGACTAC CAGCAGGCGC

12721 TGCGCGATGT CGTCGCATAT GCAGTACAGA ACGGTATCCC GGTTCCGACC TTCGCCGCTG

12781 CGGTTGCCTA TTATGACAGC TACCGTGCCG CTGTTCTGCC TGCGAACCTG ATCCAGGCAC

12841 AGCGCGACTA

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1、一种对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长12850个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ IDNO：1的核苷酸。

2、按照权利要求1所述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是由10个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

3、按照权利要求2所述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf3、orf4、orf5、orf9基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的1120至2388碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的2381至3556碱基的核苷酸；orf3是SEQ ID NO：1中的3553至4335碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO：1中的4335至5423碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO：1中的5420至6499碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1中的9795至11003碱基的核苷酸。

4、按照权利要求1或2所述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，它是源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf3、orf4、orf5、orf9基因；以及它们的混合或它们的重组。

5、按照权利要求4所述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的1166至1182碱基的核苷酸和1854至1870碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的1415至1434碱基的核苷酸和2286至2303碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的1157至1174碱基的核苷酸和1934至1951碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的2610至2627碱基的核苷酸和3452至3470碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的2711至2728碱基的核苷酸和3460至3477碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的2742至2759碱基的核苷酸和3480至3496碱基的核苷酸；源于orf3基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的3660至3677碱基的核苷酸和4255至4274碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的3728至3745碱基的核苷酸和4296至4313碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的3752至3769碱基的核苷酸和4308至4325碱基的核苷酸；源于orf4基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的4391至4410碱基的核苷酸和5211至5228碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4463至4470碱基的核苷酸和5271至5289碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4515至4530碱基的核苷酸和5396至5418碱基的核苷酸；源于orf5基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5435至5452碱基的核苷酸和5992至6009碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5687至5704碱基的核苷酸和6230至6247碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5724至5741碱基的核苷酸和6319至6336碱基的核苷酸；源于orf9基因的寡核苷酸对是：SEQ IDNO：1中的9825至9842碱基的核苷酸和10687至10704碱基的核苷酸；SEQ IDNO：1中的10001至10017碱基的核苷酸和10682至10699碱基的核苷酸；SEQID NO：1中的10201至10218碱基的核苷酸和10954至10971碱基的核苷酸。

6、权利要求1所述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

7、权利要求1所述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O172型的O-抗原，并成为细菌疫苗。

8、按照权利要求1所述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。

9、权利要求1所述的对大肠杆菌O172型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O172型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟，之后加入3ul 20rng/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O172型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O172型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA AT-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ngPCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应，合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾，此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bi0-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5a细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨卞青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在700bp以上的120个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到90％的覆盖率，剩余10％的序列再通过将部分序列反向测序，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O172型的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O172型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到10个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因的筛选：针对痢大肠杆菌O172型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、orf3、orf4、orf5、orf9基因设计引物；在每个基因内各设计了三对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除源自orf9的的三对在O12、O25、O26中得到大小正确的带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，即在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PDR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy、orf3、orf4、orf5基因对大肠杆菌O172型的O-抗原都是高度特异的。