CN1453358A - 对大肠杆菌059的o-抗原特异的核苷酸 - Google Patents

对大肠杆菌059的o-抗原特异的核苷酸 Download PDF

Info

Publication number
CN1453358A
CN1453358A CN 03129935 CN03129935A CN1453358A CN 1453358 A CN1453358 A CN 1453358A CN 03129935 CN03129935 CN 03129935 CN 03129935 A CN03129935 A CN 03129935A CN 1453358 A CN1453358 A CN 1453358A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
nucleotide
antigen
bases
intestinal bacteria
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN 03129935
Other languages
English (en)
Other versions
CN1240835C (zh
Inventor
王磊
杨静华
冯露
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nankai University
Original Assignee
Nankai University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nankai University filed Critical Nankai University
Priority to CN 03129935 priority Critical patent/CN1240835C/zh
Publication of CN1453358A publication Critical patent/CN1453358A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1240835C publication Critical patent/CN1240835C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌059(Escherichia coli059)的O-抗原特异的核苷酸,它是大肠杆菌059中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列,如SEQ ID NO:1所示的分离的核苷酸,全长10450个碱基;或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基,同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸;还包括源于大肠杆菌059的O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸。本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌059的O-抗原都有高度的特异性。本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌059的方法。

Description

对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸
技术领域
本发明涉及大肠杆菌O59(Escherichia coli O59)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列,特别是涉及大肠杆菌O59中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸,可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O59并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
背景技术
大肠杆菌是引起人尿道感染和许多肠胃疾病如婴幼儿腹泻、旅行者腹泻等的最常见的原因之一。位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因,而O-抗原是脂多糖最外层结构,是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感,或者严重削弱病原体的毒力[Frank et al(1987)“The function of antibody and complement in thelysis of bacteria”.Rev Infect Dis 177:1750-1753.Pluschke Getal“Roleof the capsule and the O-antigen in resistance of O18:KlEscherichiacoli to complement-mediated king.J Bacteriol 42:907-913]。大肠杆菌是一个种,种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性,大肠杆菌有166种不同的O-抗原,O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves,P.R(1992)“Variation in antigens,niche specific selection andbacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett,100:509-516]。
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分,它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚:先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上,然后在内膜的内侧合成寡糖单位,O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧,而后通过聚合酶聚合成多糖,再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield,C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3:178-185;Schnaitman,C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews,57(3):655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列,形成一个基因簇[Reeves,P.R.,et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology,4:495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中,O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci:implicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity,11:6923-6930;Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters:gene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182:5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因:糖合成路径基因,糖基转移酶基因,寡糖单位处理基因,其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖;糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位;寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因,它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧,再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同,单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性,而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着,所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成,也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原,是大肠杆菌重要的致病因素之一,同时它又具有极强的多样性,这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定,是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清,而抗血清一般种类不全,数量不足,大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差,所以,现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年,Luk,J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk,J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A,B,C2,andD)”,J.Clin.Microbiol.31:2118-2123]。Luk,et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1,D1,A,B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年,Paton,A.W et.al用对E.coli coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34:1622-1627],但是后来的研究表明Paton,A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves,P.R.认为,这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves,P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 164:17-23],而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖,所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。
大肠杆菌O59中含有产shiga毒素的stx1基因和致病因子eae基因,大肠杆菌O59能与产毒素的大肠杆菌(Shigatoxin-producing Escherichiacoli,STEC)共同引起人的几种疾病[Terrance M.Arthur etal(2002)“Prevalence and characterization of Non-O157 shiga toxin-producingEscherichia coli on carcasses in commercia1 beef cattle processingplants”Applied and Environmental Microbiology Oct.4847-4852]。因此,及时而准确地检出大肠杆菌O59是重要的。
发明内容
本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O59的O-抗原基因簇中的核苷酸,是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。
本发明的一个目的是提供了大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的基因:聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因;糖基转移酶基因,包括orfl、orf3、orf4基因;糖合成路径基因,包括manB、manC基因。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸,它们分别源于大肠杆菌O59的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf1、orf3、orf4基因;源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因;它们是上述基因内的寡核苷酸,长度在10-20nt;它们对大肠杆菌O59的O-抗原是特异的;尤其是表1中列出的寡核苷酸,它们对大肠杆菌O59的O-抗原是高度特异的,而且这些寡核苷酸还可重新组合,组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O59的O-抗原也是高度特异的。
本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应,或者作为探针用于杂交反应,或者用于制造基因芯片或微阵列,从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O59的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O59。
本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列,也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,其是如SEQID NO:1所示的分离的核苷酸,全长10450个碱基;或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基,同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,其由6个基因组成,都位于galF基因和gnd基因之间。前述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,所述的基因包括:聚合酶基因,包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因;糖基转移酶基因,包括orf1、orf3、orf4基因;其中所述的wzy基因是SEQ ID NO:1中的2552至3721碱基的核苷酸;orf1基因是SEQ ID NO:1中的1354至2565碱基的核苷酸;orf3基因是SEQ ID NO:1中的3705至4781碱基的核苷酸;orf4基因是SEQ ID NO:1中的4919至5962碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,其源于所述的wzy基因或糖基转移酶基因orf1、orf3、orf4基因;或糖合成路径基因中的寡核苷酸;以及它们的混合或它们的重组。
源于orf1基因的寡核苷酸对是:
SEQ ID NO:1中的1701至1720碱基的核苷酸和2221至2239碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的1396至1414碱基的核苷酸和2354至2372碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的1969至1987碱基的核苷酸和2410至2429碱基的核苷酸;
源于wzy基因的寡核苷酸对是:
SEQ ID NO:1中的2857至2875碱基的核苷酸和3607至3625碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的2676至2694碱基的核苷酸和3379至3397碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的2925至2943碱基的核苷酸和3687至3707碱基的核苷酸;
源于orf3基因的寡核苷酸对是:
SEQ ID NO:1中的4165至4283碱基的核苷酸和4694至4712碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的3914至3933碱基的核苷酸和4535至4552碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的3714至3733碱基的核苷酸和4478至4497碱基的核苷酸;
源于orf4基因的寡核苷酸对是:
SEQ ID NO:1中的4967至4985碱基的核苷酸和5758至5776碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的5120至5139碱基的核苷酸和5518至5536碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的5253至5271碱基的核苷酸和5896至5914碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
前述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸的重组分子,而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O59的O-抗原,并成为细菌疫苗。
前述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸的应用,其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列,可用这些方法检测人体和环境中的细菌。
前述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸的分离方法,其特征在于,包括下述步骤:
(1)基因组的提取:在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O5 9,离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10u l0.4M EDTA重悬细胞,37℃温育20分钟,然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS,50℃温育2小时,再加入3ul 10mg/ml的RNase,65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物,取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次,取上清液,再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚,上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA,用玻璃丝卷出DNA并用70%乙醇洗DNA,最后将DNA重悬于30ul TE中,基因组DNA通过0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测;
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O59中的O-抗原基因簇:以大肠杆菌O59的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇;首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGGATC AAA GAA AT-3’),再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇,PCR反应程序如下:在94℃预变性2分钟,然后94℃变性10秒,60℃退火30秒,68℃延伸15分钟,这样进行30个循环;最后,在68℃继续延伸7分钟,得到PCR产物,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性;合并6管long PCR产物,并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物;
(3)构建O-抗原基因簇文库:用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物,0.9ul 0.1M MnCl2,1u1 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI,反应在室温中进行;酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间,而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应;合并4管同样的反应体系,用等体积的酚抽提一次,用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次,再用等体积的乙醚抽提一次后,用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗沉淀,最后重悬于18ul水中;随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP,1mMdGTP,1mMdTTP,10mMdATP),1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶,11℃反应30分钟,将酶切产物补成平端,75℃终止反应后,加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul,70℃反应20分钟,使DNA的3′端加dA尾,此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时,总体积为90ul,其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶;最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物,再用70%乙醇洗沉淀,干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5□细胞,取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后,转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击,电压为2.5千伏,时间为5.0毫秒-6.0毫秒,电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏,然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养,次日得到蓝白菌落,将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养,同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小,得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O59的O-抗原基因簇文库;
(4)对文库中的克隆测序:从文库中挑选插入片段在700bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI 377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序,使序列达到80%的覆盖率,再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20%的序列,从而获得O-抗原基因簇的所有序列;
(5)核苷酸序列的拼接及分析:用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列,从而得到大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列,序列的质量主要由两个方面来保证:1)对大肠杆菌O59的基因组作6个Long PCR反应,然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基,保证3个以上高质量的覆盖率;在得到大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的核苷酸序列后,用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information,NCBI)的orffinder发现基因,找到9个开放的阅读框,用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因,再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释,用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对,最后得到大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的结构;
(6)特异基因的筛选:针对大肠杆菌O59的O-抗原基因簇中的orf1、wzy、orf3、orf4基因设计引物;在每个基因内各设计了三对引物,每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性;用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR,所有引物都在大肠杆菌O59中得到阳性结果,在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带,也就是说,在大多数组中没有得到任何PCR产物带,虽然在少数组中得到PCR产物带,但其大小不符合预期大小,所以orf1、wzy、orf3、orf4基因对大肠杆菌O59及其O-抗原都是高度特异的。
也就是,本发明的第一个方面,提供了大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列,它的全序列如SEQ ID NO:1所示,全长10450个碱基;或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基,同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的结构,如表3所述,它的6个基因都位于galF基因和gnd基因之间,它的wzx基因在galF基因和gnd基因之外。
本发明的第二个方面,提供了大肠杆菌O59的O-抗原基因簇中的基因,即聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因);糖基转移酶基因,包括orf1、orf3、orf4;细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因,包括manB、manC基因;它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在图2中。本发明尤其涉及到糖基转移酶基因和聚合酶基因,因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的,对细菌的O-抗原并不是很特异的,而本发明涉及到的糖基转移酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O59的O-抗原是高度特异的。本发明的第三个方面,提供了源于大肠杆菌O59的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因,包括orf1、orf3、orf4基因的寡核苷酸,它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是,优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对,在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小,这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O59为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物,而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说,以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物,虽然在有些菌中得到了PCR产物带,但其大小不符合预期大小,这是由于引物结合到基因组的别的位置造成,这种问题可通过用基因内的其它引物做PCR来避免。所以,可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O59及它们的O-抗原是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤:1)基因组的提取;2)PCR扩增大肠杆菌O59中的O-抗原基因簇;3)O-抗原基因簇文库的构建;4)对文库中的克隆测序;5)核苷酸序列的拼接及分析,最终获得O-抗原基因簇的结构;6)特异基因的筛选。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开,对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所述,“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码聚合酶基因内的一段核苷酸分子,它们在长度上可改变,一般在10到20个核苷酸范围内改变。更确切的说这些寡核苷酸是orf1基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO:1的1354至2565碱基),wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO:1的2552至3721碱基),orf3基因(核苷酸位置是从SEQID NO:1的3705至4781碱基),orf4基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO:1的4919至5962碱基)。源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O59都是高度特异的。
此外,有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原,从而产生新的细菌类型,新的突变株。在这种环境中,需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此,本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物,它们源于糖基转移酶基因;源于聚合酶基因,包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因;也源于糖合成路径基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的,从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说,这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸与源于糖合成路径基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面,本发明涉及寡核苷酸的鉴定,它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法,这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交,这些基因是:(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码聚合酶的基因,包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交,这些细菌是大肠杆菌O59。可用PCR方法检测,更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测,或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明者考虑到以下情况:当单个的特异的寡核苷酸检测无效时,寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码聚合酶的基因,包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的,这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O59表达的。
另一方面,本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法,这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交,这些基因是:(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码聚合酶的基因,包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O59。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品,也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测,或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交,但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上,另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此,当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时,至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交,或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时,此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸,在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因,这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的,这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面,本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交,这些基因是:(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码聚合酶的基因,包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交,这些细菌是大肠杆菌O59。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品,也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应,或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说,以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时,其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外,当两个寡核苷酸都能杂交上时,它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即,当交叉反应出现问题时,可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原,而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性,本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的全长序列,而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子,通过插入表达可产生表达大肠杆菌O59的O-抗原,并成为有用的疫苗。
具体实施方式:
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件。实施例1:基因组的提取。
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O59,离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞,37℃温育20分钟,然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS,50℃温育2小时,再加入3ul 10mg/ml的RNase,65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物,取上清液,再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次,取上清液,再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA,用玻璃丝卷出DNA并用70%乙醇洗DNA,最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测。实施例2:通过PCR扩增大肠杆菌O59中的O-抗原基因簇
以大肠杆菌O59的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT-3’),再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇,PCR反应程序如下:在94℃预变性2分钟;然后94℃变性10秒,60℃退火30秒,68℃延伸15分钟,这样进行30个循环;最后,在68℃继续延伸7分钟,得到PCR产物,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物,并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。实施例3:构建O-抗原基因簇文库。
首先是连接产物的获得:
用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物,0.9ul 0.1M MnCl2,1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI,反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间,而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系,用等体积的酚抽提一次,用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次,再用等体积的乙醚抽提一次后,用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗沉淀,最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP,1mMdGTP,1mMdTTP,10mMdATP),1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶,11℃反应30分钟,将酶切产物补成平端,75℃终止反应后,加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul,70℃反应20分钟,使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时,总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pHS.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物,再用70%乙醇洗沉淀,干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备:
参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中,180rpm培养10小时后,取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中,37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右,然后冰浴冷却20分钟,于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清液,用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体,于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体,于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10%的甘油悬浮细胞,4℃ 6000rpm离心10分钟,弃上清液,最后沉淀用1ml冰预冷的10%的甘油悬浮细胞,即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管,-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞:
取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后,转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击,电压为2.5千伏,时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养,次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养,同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小,得到白色克隆群构成了大肠杆菌O59的O-抗原基因簇文库。实施例4:对文库中的克隆测序。
从文库中挑选插入片段在700bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序,使序列达到80%的覆盖率。剩余20%的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到,最后获得O-抗原基因簇的所有序列。实施例5:核苷酸序列的拼接及分析。
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列,从而得到大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证:1)对大肠杆菌O59的基因组作6个Long PCR反应,然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基,保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的核苷酸序列后,用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation,NCBI)的orffinder发现基因,找到6个开放的阅读框,用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因,再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释,用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对,最后得到大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的结构,如表3所示。
通过检索和比较,发现orf1与Pseudomonas syringae pv.tomato str.DC3000的糖基转移酶在362个氨基酸序列中有32%的相同性,50%的相似性。这个糖基转移酶属于糖基转移酶家族1(pfam00534,Glycos_transf_1),而且和Agrobacterium tumefaciens的糖基转移酶在403个氨基酸中有25%的相同性,51%的相似性,所以可以确定orf1也是一个糖基转移酶基因,命名为orf1。orf2与Shewanella oneidensis MR-1的脂多糖生物合成中的wzy基因编码的O-抗原聚合酶在303个氨基酸中有20%的相同性,有45%的相似性,与Yersinia pseudotuberculosis的O-抗原聚合酶在280个氨基酸中有20%的相同性,45%的相似性,另外orf2经算法得知它带有10个跨膜片段的蛋白,它的内膜的拓扑结构具有众所周知的O-抗原聚合酶的典型特征,所以orf2命名为wzy基因。orf3与Brucella suis 1330的WbkA在349个氨基酸序列中有37%的相同性,55%的相似性,WbkA是一个甘露糖基转移酶。orf3也与Leptospira interrogans serovar lai str的mtfA基因编码的甘露糖基转移酶A在336个氨基酸序列中有32%的相同性,48%的相似性。此外,它与其他菌的甘露糖基转移酶也表现出较高的相同性和相似性。所以,可以确定orf3是一个糖基转移酶基因,命名为orf3。 orf4与Escherichia coliO6:K5:H1的一个糖基转移酶在347个氨基酸序列中有41%的相同性,59%的相似性。另外orf4与Clostridium acetobutylicum ATCC 824的糖基转移酶基因在333个氨基酸序列中有29%的相同性,50%的相似性,所以认为orf4是一个糖塞转移酶基因,命名为orf4。orf5与Escherichia coli O157:H7的ManC在468个氨基酸序列中有65%的相同性,79%的相似性,与其他菌的ManC的氨基酸序列也表现出高度的相同性和相似性,所以orf5被命名为manC。orf6与Shigella boydii 5的ManB在471个氨基酸序列中有92%的相同性,97%的相似性。因此orf6被命名为manB。在大肠杆菌O59的O-抗原基因簇里没有发现WZX基因,WZX基因不在galF与gnd之间,还需进一步研究。实施例6:特异基因的筛选
针对大肠杆菌O59的O-抗原基因簇中的wzy、orf1、orf3、orf4基因设计引物,这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
在表1中列出了大肠杆菌O59的O抗原基因簇的糖基转移酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内,我们各设计了三对引物,每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO:1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR,得到了相应的PCR产物,其大小也列于表中。
mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因,所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′),然后从166株大肠杆菌中提取基因组,方法如前所述。用这对引物从166株大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源,为了检测的方便,我们将它们每8-10个菌分为一组,总共27组,它们的来源都列于表中。
在第9组中含有大肠杆菌O59的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板,用表1中的每对引物按如下条件做PCR:在94℃预变性2分钟后,94℃变性15秒,退火温度因引物的不同而不同(参照表1),退火时间是50秒,72℃延伸2分钟,这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟,反应体系是25ul。反应完毕后,取10ulPCR产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzy、orf1、orf3、orf4基因,每个基因都有三对引物被检测,每对引物除了在第9组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外,在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。也就是说,在大多数组中没有得到任何PCR产物带,虽然在少数组中得到PCR产物带,但其大小不符合预期大小,所以wzy、orf1、orf3、orf4基因对大肠杆菌O59及其O-抗原都是高度特异的。
最后,通过PCR从大肠杆菌O59中筛选到对大肠杆菌O59的O-抗原高度特异的基因:wzy和三个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O59的O-抗原是特异的,尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O59是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O59,并能鉴定它们的O-抗原。
表3是大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的结构表,在表中列出了大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的结构,共由6个基因组成,每个基因用方框表示,并在方框内写入基因的名称,数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因,它们不属于O-抗原基因簇,我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O59的O-抗原基因簇中的基因的位置表,在表中列出了大肠杆菌O59的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置,在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个:ATG和GTG。
序列列表
                   SEQUENCE LISTING<110>  南开大学<120>  对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸<160>  1<170>  PatentIn version 3.1<210>  1<211>  10450<212>  DNA<213>  Escherichia coli<400>  1attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc     60gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgagcagcg cgtgaagcgt    120caactactgg cggaagtaca gtccatttgc ccgccgggag tgaccattat gaacgtgcgt    180cagggcgaac ctttaggttt gggccactcc attttatgtg cacgacccgc cattggtgac    240aacccatttg tcgtggtgct gccagacgtt gtgatcgatg acgccagcgc cgacccgctg    300cgctacaacc ttgcggccat gattgcgcgc ttcaacgaaa cgggccgcag ccaggtgctg    360gcaaaacgta tgccaggtga cctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agagccgctg    420gaccgcgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaattcatcg aaaaaccgga tcagccgcaa    480acgctggact cagatattat ggccgtgggc cgttatgtgc tttctgccga tatttggccg    540gaacttgaac gcactcagcc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgctattgcc    600gaactggcga aaaaacagtc tgttgatgca atgctgatga ctggtgacag ttacgactgc    660ggcaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttt gtgaagtatg gactacgcaa cctgaaagaa    720ggggcgaagt tccgcaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg    780atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaagat tcgtggcgaa agtaatttgt    840tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag    900gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agctgattgg taagacaatt    960agcgtttgaa tttatgaggg ctttgcgggg ttagatgcag agttcgtgac atccattgag   1020aatctacgca gtgcactggt agctgttaag ccaggggcgg tagcgtgggt gaaacgttta   1080ataatgagat ataagttatg attatttcta aacttagccg gcataaaatt gcttgtgctg   1140agtcagagtt agaacttgta aattatagta tataaattaa actgtgaaat attattgcgg   1200taatcttacc aaaaagctgt atgaatttac cataaaacaa atattgattg tgttcttggt   1260tttttattaa gcagatcaat agttgttatc tattgccttg ttgggtaata aggcatctat   1320aaatcttgat ggttaatatt taagtcccaa taaatgaaaa ttttgattgt aaatactttt   1380ttttatccaa atgaaattgg tggtgctgag ttttcatgta aggtattagc agaagctctt   1440gcggaacggg ggcatgatgt gtctgtttta tctacaacaa atggggaatc aagacaaact   1500aggttaggta aattgaagtt gtattattta aaattaagta atgtgttctg gcatggtaaa   1560tcaaaaaaac aaggagcaat aaaagggatt atatggcatg ctatggattc atttaacccg   1620attatgttct ttaaattatt aaaattattt aaagaaatca ggcctgatgt tatacataca   1680aataatatag ttggctttag ttgctcatta tggtttgctg ctttagtttt aaatattcct   1740gttgtccaca cgttacgtga ttattattta aaatgttatc gttcatgcat gcggaaaaat   1800aataaaaatt gtgattctca atgtgttgca tgtaagttat taacaacacc aagaaaaatt   1860atttcatcga atgtaaatgc tgttattggc aatagccagt atatgattaa ctctcatttg   1920aaaaataatt atttttcaaa tacaccgatg aaaaaagtaa tatttaatgc atggaaccca   1980tcaacagacc ttcaaaaaca tcaaaattta ctttggcaac gagtagaaca tgcacgattc   2040ggttttattg gaagaatcac agaggaaaaa ggaattgaac tattgttaag gtcgttcaaa   2100aatataaaga accaaccttt tagcaataaa atcagcttaa tagttgcggg ggaaggagat   2160gacaattata taaagaaatt atctgatgaa tattcagata cagatggcat attattcgtt   2220gggaaagtag aacccgaaga tttctataag cggattgatt ttactattgt tccgtcttta   2280tgggaagagc cattagcaag agttgttttt gagtcatttt tcttttcatt gcctgttttg   2340acaacagctc gaggaggaaa tgccgaagtt gtgaagcatg ggcagaatgg gtttattttc   2400tccgaaacag tagagtcttt gtcggcaaca atgcagatgg cactgaatgt aaattatatt   2460gagatgtcta aggctgcttt ttatagtcga ttaaaattta cgaatgaaaa tctggtttca   2520tcctatgaaa atatatatcg aagaataaaa catgaagaaa agtgaatttc aagcagaaaa   2580actaataatt ttgttttatt ttataataaa tctttgcacc tttataatta ttacatcgtc   2640atcgatatat ataggtgatc cagcgggtga atattatact gtgccgcttg atatagctat   2700aatattattt attagtaata ctgctatata ttatctttta tacttgatct atcgttgttg   2760tgtatcacat attgcattcc acaatgaagt tatcataaaa agaattgaaa ctttattgtt   2820tttaggtgtt acaattgcat tattaggctt tttttggatt gattatggac gagctgaata   2880tcaaagtaca tctccatttg gttttgtctt taggttaata ccttattccg tcatttggct   2940tctctatgtt tcaattaatt caaaatggaa tgcaaaaagt atattcctta ttgtttacta   3000tgttgccgct aaaataataa tgggatggag tggtatatta ttagcactct tctgggtttt   3060gtttataaaa tattacaatg cgaagaaacg tagtttttta tttatgtgta tgtgcatgac   3120tctgctagtc atattgtatt tttcggctcc tatagtttat tatttgaaat attacataag   3180atatgctggt cagtttgaat ttaattatcc tgtgctatta tcgaagctta cggcaagatt   3240atctactatt cagaatgtgt tgtatattta tcaaaatact aatgtattca caaacttata   3300taataagtat ttatttgatg gtttttattt tatcgaacca ataacatcta tcttgcctag   3360agctctttta ggtataagtg caactaactt tgaaactata tatgtaaaca tcgtaactgg   3420agagttcaac ccaggtgtca tattttattt gggattgttt ggtaaactat tagcttactt   3480taatacaggg atatataatt ttggcaactt tttcattgta acctttgttc ttcttggggg   3540gctatttata ttactcaaat taaactttaa aaaagcagcc aaccctttta ttttttatac   3600aatcatacaa tttgctctta gtggctcgat agaggaacta tcatatacac tatacggtat   3660ttgtcttgtt ttaatatttt gtaaaatacg gtttggtatt cataatgaaa ataggtattg   3720attcaactgc acttgtaaaa aatagaactg gagtaggtaa ttatatatat tcaattttaa   3780acgaattagt taaaaataca gaacatcaat ttattttata ttctaacaaa gaaatatttt   3840atcctgattt gccaaatgtt agaaaagtta ttcattcatc gacttataaa gggccagtat   3900ggcaaaatac aagtttgatt tattccctct tcaaagatag acctgatgtt ttttgggggg   3960ggaatgggta tttaccaatg ttagttccga agaaaacaaa gctgatttta acagttcatg   4020atcttgtata taaatatgct ggtcgtacaa tgcctaccat cagtagatta tctcgtaggt   4080tttttcagcc attatctgta aataaagctg atgcaatagt tgcagtcagt catgcaactg   4140cagatgaggt atataaagaa tatggtgtcc gacctgattg tgtggtccat cctcagatat   4200ctccgttatt ttcattacaa gaaaaatcta acttagcgaa aattaaagaa aaataccagc   4260ttaatgagta tatattgaca attggaaccc ttgaaccacg aaaaaatatg gtggctttaa   4320tccaggcata tctaaacgta gtatcattgg gttataaatt acctgtactg gcaattgctg   4380gaggtaaagg ctggatgcag ggagagttag ataaattagt agagaagggg gtggcaaaag   4440gtattatcag aaaattaggt tatgtatctg atccggattt agcggttctt tattcaggag   4500ctcaactttt tgttttagca tctatttatg aaggttttgg tatgccgatt ctggaggctc   4560aagccagcgg gtgtcctgtg cttatatcca gaataaaatc tatgatagag gccgcaggtg   4620atatttgctg tacttttgag ccagatatac agtctattga gaactctctt ataaatctat   4680caaaagggaa tcagcctctt atttgtcggc taccatatac tattgaaaat aaaattgata   4740ttgcagctaa aaaatatgaa aaattgatga ggttatcttg aagaaaatat tggtaattac   4800cccaagattt ccatatccag tgatcggagg agatagatta cgtatttatg aaatatgtaa   4860agagctgtct cgtaaatact cattgactct ggttagtttg tgtgagtcga atgaagaaat   4920gacatatcct atccctgatg atggtgttta tacatcagta tatagatgtc atcatccacg   4980aatcatatcg tatttttcat gcttactagc actgcctact aacataccac tgcaagttgc   5040ttattactat tctcccaaat ttaaaaaaat aattaataag ttagttcctg aacatgattt   5100attattacct catttaattc gtgttgctgg gtatgtaaaa aaaaactcaa ctcctaaaat   5160attagaaatg actgatgcta tttctatgaa ttatgagaga gtatgtaaat taaaaaatag   5220tacaggaatt aaaggtctta tatataaaat tgagcgtaac cgtctaaatc aatatgaaaa   5280atcaatagca aaatactttg atcagacaat ttttgtatct caacatgata agaactacct   5340ttttagaaat ttaccagact tatatcataa gtcattagtt tgtacaaatg gagttgatgt   5400tgctaacttt aaaaatacat tgtttaaaag aagctacaaa cttattttta ttggcaacat   5460gttttctgtt caaaattttg atgcggcttt ttggttttgt gaatctgtat tacctatact   5520tcgtcaatat ggaccattta cctttcatgt tataggtaaa atatcgttag aaaactcaaa   5580aaaactttca gcatatgagg gggttttcgt tactggggct gtagataatg ttatggacta   5640tgcaaataat tctttggcgg gcatatgttc agtaagatta gctgcgggtg tacagaataa   5700aattttagag tacatggcta tgggaatacc ggcaataaca acatcgattg gtttggaggg   5760gttattcgct gttgacggcg aaagtatagt tgtggctaat acacctcatg agtttgtatc   5820aacaatattg aaattgttta atgatccaag ttttggaaaa accatttcaa aaaatggatt   5880aggttatgtt caacaaaatc attcgtggtc tgagaaatta caacccctaa ttcaagtaat   5940taataattta atcgaagagt agtttatgtc tagtataatt cctgttatta tggctggcgg   6000ttctggtagt cgtttatggc ctctttcgcg cgaacttcgt ccaaagcaat tccttaagct   6060tgatggtgag ctaacaatgc tgcaagcgac tatcaatcgt ttaaaaaatt tcgttacgac   6120gcaaccattg gttatttgta atgaagatca ccgattttta gttgctgaac agttacgtta   6180tttaggtaaa cttgaaaata atatcatctt agagccattt ggacgtaata ctgcgccagc   6240aatagctttg gctgcattca cagctttaca gagctcttct cttaaggaag atcctatatt   6300gttagtatta gcggcagatc atgttatccg agatgaagag tcatttaaaa gatcagttca   6360acaagcagtt ccttatgcta aatctggaaa acttgttact tttggcattg tacctaccca   6420tgcggaaacc ggatatggat atatacaacg aggaaaggaa ttaaatgatg cttattcagt   6480taaacaattt gtcgaaaagc ccgagcttga aaccgcacaa caatatttta atagcggaga   6540atattattgg aatagtggta tgttcttgtt tcgtgctagc cgctatcttg atgaactggc   6600attattccga ccagatattt atactgcttg tggtaaagca ataggggcta ttgacccaga   6660tcatgacttt gttcgtattg ataaagatgc attcaattct tgtccaagtg attctattga   6720ttatgctgta atggaaaaaa cttcagatgc agtagtcgtt ccgatggatg ctggttggtc   6780tgatgttgga tcttggctat cgttatggga gctttcaaaa aaagattcta tggggaattc   6840atttcatggt gatgtgattc aacatagtag taaaaataat tttgttttta cagagagctg   6900tttggttagt ttggttggtg ttgaaaaact tgtagtcgta caaacaaaag atgcaatatt   6960agttgctgat cagaataaag ttcaagatgt aaaaaatata gttgagaaac taaaaaatag   7020ctgccgtaca gaacatcgta tacaccggga agtttttcgc ccttggggaa agcatgattt   7080aattgacgat ggagatgtat atcgagtcaa aaggataagt gttaaaccgg gtgagaggct   7140ttcattgcaa atgcatcatc atagagctga acactggata gttgtatctg gtatagctaa   7200agttacgaat ggtgacaata tatatctttt aaaagaaaat gaatcaacat tcataccttc   7260aggtacgatt catgccttag aaaatccagg agaaataatg ctggagctta ttgaggtgca   7320atcgggagta tgcttggatg aaaatgatat tatccgttta taaggtcact tataattgaa   7380gttaaagagt ttctattaaa ataggctatt tggagctttg acagttgttt agtatttaat   7440cgcaaaaatg atatctttat ttataatgtt aaaggtagtg tcctatgact aagtataata   7500gttcttcatt aatagccaat agtaatgtga attttggtac tagtggtgct cgtggattag   7560tcgttgattt tactcacaat gtttgtgctg cttttactca tgcatttctt tcggttatcg   7620aaaaacactt taagtttgac acagtggctg tagcaataga taacagacct agtagtttta   7680atatagcaca agcatgtgtt ttcgctataa aacagcatgg atatggcatc gaatatcatg   7740gtgtcattcc gactcctgca ttagctcatt attcgatgca gaaaaatatt ccctgtataa   7800tggtcactgg gagtcatata ccttttgatc gtaatggttt aaaattctac cgaccagatg   7860gtgaaatcac aaaagaggat gagctcgcaa ttgtaaatag tgaatataca ttttctcctg   7920taggtgtatt acctcatctt gaaacaagct ctcaaggtgc ggactgctac ttggaacgtt   7980atgtttctct tttttattct gatattttaa aggggaaaag aataggggta tatgaacatt   8040ctagtgcggg gcgcgattta tatgcttctc tttttaatca attgggtgca gaggtcattt   8100ccctaggcag aagtgatgag ttcgttccga ttgatacgga agcagtaagt gatgaagatc   8160gtgtacttgc aagagagtgg tctaaaaaat ataatcttga tgctattttc tcaacagatg   8220gcgatggtga tcgtccttta gttgccgatg aaaatggtga atggttaaga ggcgatattc   8280tgggactact tactgctatt gaacttaata tcaaggcgtt ggctattcca gtgagttgta   8340atacagcaat tgaagagtct aataaatttg caagtataca acgaacgaaa ataggttctc   8400cttatgtaat tgcagcattt gcagatcttg ctaagcaatt tgattcagtc gctggttttg   8460aagctaatgg tggttttctc cttgcctccg atttacaaat taatgacaag gaattaaaat   8520cgttgcctac acgagatgct gtgttaccag cattaatgct cttaatagct tctcgcaata   8580gtactatttc tcaactgatt aataatcttc ctcagcgatt cacttggtca gatagagtta   8640aaaacttccc ttcagattca agtcaacaaa ttataaagaa tgccatatcg tcacccaata   8700atttctttaa tagtttaggt tatgaatcat tatcctgttc ctctattgat gaaacggatg   8760gtgcaagatt tactttaaat aatggtgata ttatacatct ccgtccttcc ggtaatgctc   8820cagaactccg ttgttatgct gaggccagtg atgaaaatca ggctaagcaa tatgttacga  8880atgtgctggg aaatattacc tctttgattt cttgatgtta taggtttatc tacgcttata  8940tgtgtgcgta ggtttgatta cacgtagatg ctggtataca gaattgaaga acggtatttg  9000ttgcattaat gaaattcagc actacacaca ttcgtgcaac ttgagataac atctcaatca  9060tattcaagtc gcgcatacat cgcggtgaac accccctgac aggagtaaac aatgtcaaag  9120caacagatcg gcgtcgtcgg tatggcagtg atggggcgca accttgcgct caacatcgaa  9180agccgtggtt ataccgtctc tattttcaac cgttcccgtg agaaaacgga agaagtgatt  9240gccgaaaatc caggcaagaa actggttcct tactatacgg tgaaagagtt tgttgaatct  9300ctggaaacgc ctcgtcgcat cctgttaatg gtgaaagcag gtgcaggcac ggatgctgct  9360attgattccc tcaagccata cctcgataaa ggtgacatca ttattgatgg tggtaatacc  9420ttcttccagg acaccattcg tcgtaaccgt gagctttctg ccgaaggttt taacttcatc  9480ggtaccggtg tttccggcgg tgaagaaggt gcgctgaaag gtccttccat tatgcctggt  9540gggcagaaag aagcctatga actggttgca ccgatcctga ccaaaatcgc cgcagtggct  9600gaagactgtg agccatgcgt tacctatatt ggtgccgatg gtgcaggtca ctatgtgaag  9660atggttcaca acggtattga atacggcgat atgcagctga ttgctgaagc ctattctctg  9720cttaaaggtg gcttgaacct ttccaacgaa gaactggcgc agacctttac cgagtggaat  9780aacggtgaac tgagcagcta cctgattgac atcactaaag acatcttcac taaaaaagat  9840gaagacggta actacctggt tgatgtgatt ctggatgaag cggctaacaa aggtaccggt  9900aaatggacca gccagagcgc gctggatctc ggcgaaccgc tgtcgctgat taccgagtct  9960gtgtttgcac gttatatctc ttctctgaaa gatcagcgtg ttgccgcatc taaagttctc  10020tctggcccgc aagcacagcc agcaggcgac aaagctgagt ttatcgagaa agttcgccgt  10080gcgctgtatc tgggcaaaat cgtttcttac gctcagggct tctctcagct acgcgccgcg  10140tcggaagatt acaattggga tctgaactac ggcgaaatcg cgaagatttt ccgtgctggt  10200tgcatcatcc gtgcgcagtt cctgcagaaa atcaccgatg cgtatgccga aaatcccaaa  10260atcgctaacc tgctgttggc tccgtacttt aagcaaatcg ccgacgacta ccagcaggca  10320ctgcgtgatg tcgtcgctta tgcagtgcaa aacggtattc cggttccaac cttctctacg  10380gcggttgcct attacgatag ctaccgtgcc gcggtgctgc ctgcgaacct aattcaggct  10440cagcgcgact                                                         10450表1大肠杆菌O59的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和wzy基因及其中的引物及PCR数据
基因 功能 基因的碱基位置 正向引物 反向引物 PCR产物长度 产生正确大小电泳带的组数 PCR的退火温度(℃)
Orf1 糖基转移酶 1354-2565 #277(1701-1720) #278(2221-2239) 539bp 0 60
#279(1396-1414) #280(2354-2372) 977bp 0 55
#281(1969-1987) #282(2410-2429) 461bp 0 58
wzy 聚合酶 2552-3721 #283(2857-2875) #284(3607-3625)   769bp   0*   60
#285(2676-2694) #286(3379-3397)   522bp   0   55
#287(2925-2943) #288(3687-3707)   783bp   0   55
Orf3 糖基转移酶 3705-4781 #289(4165-4283) #290(4694-4712)   548bp   0   60
#291(3914-3933) #292(4535-4552)   639bp   0   55
#293(3714-3733) #294(4478-4497)   784bp   0   58
Orf4 糖基转移酶 4919-5962 #295(4967-4985) #296(5758-5776)   810bp   0   60
#297(5120-5139) #298(5518-5536)   417bp   0   60
#299(5253-5271) #300(5896-5914)   662bp   0   55
*在一组中产生一条错误大小的带
表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源
组号             该组中含有的菌株                                            来源
1     野生型大肠杆菌O1,O2,O3,O4,O10,O16,O18,O39                       IMVSa
2     野生型大肠杆菌O40,O41,O48,O49,O71,O73,O88,O100                  IMVS
3     野生型大肠杆菌O102,O109,O119,O120,O121,O125,O126,O137           IMVS
4     野生型大肠杆菌O138,O139,O149,O7,O5,O6,O11,O12                   IMVS
5     野生型大肠杆菌O13,O14,O15,O17,O19ab,O20,O21,O22                 IMVS
6     野生型大肠杆菌O23,O24,O25,O26,O27,O28,O29,O30                   IMVS
7     野生型大肠杆菌O32,O33,O34,O35,O36,O37,O38,O42                   IMVS
8     野生型大肠杆菌O43,O44,O45,O46,O50,O51,O52,O53                   IMVS
9     野生型大肠杆菌O54,O55,O56,O57,O58,O59,O60,O61                   IMVS
10    野生型大肠杆菌O62,O63,O64,O65,O66,O68,O69,O70                   IMVS
11    野生型大肠杆菌O74,O75,O76,O77,O78,O79,O80,O81                   IMVS
12    野生型大肠杆菌O82,O83,O84,O85,O86,O87,O89,O90                   IMVS
13    野生型大肠杆菌O91,O92,O95,O96,O97,O98,O99,O101                  IMVS
14    野生型大肠杆菌O112,O162,O113,O114,O115,O116,O117,O118           IMVS
15    野生型大肠杆菌O123,O165,O166,O167,O168,O169,O170,O171           See b
16    野生型大肠杆菌O172,O173,O127,O128,O129,O130,O131,O132,         See c
17    野生型大肠杆菌O133,O134,O135,O136,O140,O141,O142,O143           IMVS
18    野生型大肠杆菌O144,O145,O146,O147,O148,O150,O151,O152           IMVS
19    野生型大肠杆菌O153,O154,O155,O156,O157,O158,O159,O164           IMVS
20    野生型大肠杆菌O160,O161,O1 63,O8,O9,O124,O111                    IMVS
21    野生型大肠杆菌O103,O104,O105,O106,O107,O108,O110                 IMVS
22    鲍氏志贺氏菌血清型B4,B5,B6,B8,B9,B11,B12,B14                    See d
23    鲍氏志贺氏菌血清型B1,B3,B7,B8,B10,B13,B15,B16,B17,B18         See d
24    痢疾志贺氏菌血清型D1,D2,D3,D4,D5,D6,D7,D8                       See d
25    痢疾志贺氏菌血清D9,D10,D11,D12,D13                                 See d
26    弗氏志贺氏菌F6a,F1a,F1b,F2a,F2b,F3,F4a,F4b,F5(v:7)F5(v:4)    See d
27    宋内氏志贺氏菌D5,DR                                                   See d
 a.   Institude of Medical and Veterinary Science,Anelaide,Australia
 b.   O123 from IMVS;the rest from Statens Serum Institut,Copenhagen,Denmark
 c.   172 and173 from Statens Serum Institut,Copenhagen,Denmark,the rest from IMVS
 d.   中国预防医学科学院流行病学研究所
表3是大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的结构表表3是大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的结构表
表4是大肠杆菌O59的O-抗原基因簇中的基因的位置表ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC      60GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT     120CAACTACTGG CGGAAGTACA GTCCATTTGC CCGCCGGGAG TGACCATTAT GAACGTGCGT     180CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT GGGCCACTCC ATTTTATGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC     240AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGATG ACGCCAGCGC CGACCCGCTG     300CGCTACAACC TTGCGGCCAT GATTGCGCGC TTCAACGAAA CGGGCCGCAG CCAGGTGCTG     360GCAAAACGTA TGCCAGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TTCAGACCAA AGAGCCGCTG     420GACCGCGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTCATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAA     480ACGCTGGACT CAGATATTAT GGCCGTGGGC CGTTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG     540GAACTTGAAC GCACTCAGCC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCTATTGCC     600GAACTGGCGA AAAAACAGTC TGTTGATGCA ATGCTGATGA CTGGTGACAG TTACGACTGC     660GGCAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GACTACGCAA CCTGAAAGAA     720GGGGCGAAGT TCCGCAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG     780ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT     840TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG     900GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCTGATTGG TAAGACAATT     960AGCGTTTGAA TTTATGAGGG CTTTGCGGGG TTAGATGCAG AGTTCGTGAC ATCCATTGAG    1020AATCTACGCA GTGCACTGGT AGCTGTTAAG CCAGGGGCGG TAGCGTGGGT GAAACGTTTA    1080ATAATGAGAT ATAAGTTATG ATTATTTCTA AACTTAGCCG GCATAAAATT GCTTGTGCTG    1140AGTCAGAGTT AGAACTTGTA AATTATAGTA TATAAATTAA ACTGTGAAAT ATTATTGCGG    1200TAATCTTACC AAAAAGCTGT ATGAATTTAC CATAAAACAA ATATTGATTG TGTTCTTGGT    1260TTTTTATTAA GCAGATCAAT AGTTGTTATC TATTGCCTTG TTGGGTAATA AGGCATCTAT    1320
                      orf1基因的起始密码子AAATCTTGAT GGTTAATATT TAAGTCCCAA TAAATGAAAA TTTTGATTGT AAATACTTTT    1380TTTTATCCAA ATGAAATTGG TGGTGCTGAG TTTTCATGTA AGGTATTAGC AGAAGCTCTT    1440GCGGAACGGG GGCATGATGT GTCTGTTTTA TCTACAACAA ATGGGGAATC AAGACAAACT    1500AGGTTAGGTA AATTGAAGTT GTATTATTTA AAATTAAGTA ATGTGTTCTG GCATGGTAAA    1560TCAAAAAAAC AAGGAGCAAT AAAAGGGATT ATATGGCATG CTATGGATTC ATTTAACCCG    1620ATTATGTTCT TTAAATTATT AAAATTATTT AAAGAAATCA GGCCTGATGT TATACATACA    1680AATAATATAG TTGGCTTTAG TTGCTCATTA TGGTTTGCTG CTTTAGTTTT AAATATTCCT    1740GTTGTCCACA CGTTACGTGA TTATTATTTA AAATGTTATC GTTCATGCAT GCGGAAAAAT    1800AATAAAAATT GTGATTCTCA ATGTGTTGCA TGTAAGTTAT TAACAACACC AAGAAAAATT    1860ATTTCATCGA ATGTAAATGC TGTTATTGGC AATAGCCAGT ATATGATTAA CTCTCATTTG    1920AAAAATAATT ATTTTTCAAA TACACCGATG AAAAAAGTAA TATTTAATGC ATGGAACCCA    1980TCAACAGACC TTCAAAAACA TCAAAATTTA CTTTGGCAAC GAGTAGAACA TGCACGATTC    2040GGTTTTATTG GAAGAATCAC AGAGGAAAAA GGAATTGAAC TATTGTTAAG GTCGTTCAAA    2100AATATAAAGA ACCAACCTTT TAGCAATAAA ATCAGCTTAA TAGTTGCGGG GGAAGGAGAT    2160GACAATTATA TAAAGAAATT ATCTGATGAA TATTCAGATA CAGATGGCAT ATTATTCGTT    2220GGGAAAGTAG AACCCGAAGA TTTCTATAAG CGGATTGATT TTACTATTGT TCCGTCTTTA    2280TGGGAAGAGC CATTAGCAAG AGTTGTTTTT GAGTCATTTT TCTTTTCATT GCCTGTTTTG    2340ACAACAGCTC GAGGAGGAAA TGCCGAAGTT GTGAAGCATG GGCAGAATGG GTTTATTTTC    2400TCCGAAACAG TAGAGTCTTT GTCGGCAACA ATGCAGATGG CACTGAATGT AAATTATATT    2460GAGATGTCTA AGGCTGCTTT TTATAGTCGA TTAAAATTTA CGAATGAAAA TCTGGTTTCA    2520
             orf2基因的起始密码子orf1基因的终止密码子TCCTATGAAA ATATATATCG AAGAATAAAA CATGAAGAAA AGTGAATTTC AAGCAGAAAA    2580ACTAATAATT TTGTTTTATT TTATAATAAA TCTTTGCACC TTTATAATTA TTACATCGTC    2640ATCGATATAT ATAGGTGATC CAGCGGGTGA ATATTATACT GTGCCGCTTG ATATAGCTAT    2700AATATTATTT ATTAGTAATA CTGCTATATA TTATCTTTTA TACTTGATCT ATCGTTGTTG    2760TGTATCACAT ATTGCATTCC ACAATGAAGT TATCATAAAA AGAATTGAAA CTTTATTGTT    2820TTTAGGTGTT ACAATTGCAT TATTAGGCTT TTTTTGGATT GATTATGGAC GAGCTGAATA    2880TCAAAGTACA TCTCCATTTG GTTTTGTCTT TAGGTTAATA CCTTATTCCG TCATTTGGCT    2940TCTCTATGTT TCAATTAATT CAAAATGGAA TGCAAAAAGT ATATTCCTTA TTGTTTACTA    3000TGTTGCCGCT AAAATAATAA TGGGATGGAG TGGTATATTA TTAGCACTCT TCTGGGTTTT    3060GTTTATAAAA TATTACAATG CGAAGAAACG TAGTTTTTTA TTTATGTGTA TGTGCATGAC    3120TCTGCTAGTC ATATTGTATT TTTCGGCTCC TATAGTTTAT TATTTGAAAT ATTACATAAG    3180ATATGCTGGT CAGTTTGAAT TTAATTATCC TGTGCTATTA TCGAAGCTTA CGGCAAGATT    3240ATCTACTATT CAGAATGTGT TGTATATTTA TCAAAATACT AATGTATTCA CAAACTTATA    3300TAATAAGTAT TTATTTGATG GTTTTTATTT TATCGAACCA ATAACATCTA TCTTGCCTAG    3360AGCTCTTTTA GGTATAAGTG CAACTAACTT TGAAACTATA TATGTAAACA TCGTAACTGG    3420AGAGTTCAAC CCAGGTGTCA TATTTTATTT GGGATTGTTT GGTAAACTAT TAGCTTACTT    3480TAATACAGGG ATATATAATT TTGGCAACTT TTTCATTGTA ACCTTTGTTC TTCTTGGGGG    3540GCTATTTATA TTACTCAAAT TAAACTTTAA AAAAGCAGCC AACCCTTTTA TTTTTTATAC    3600AATCATACAA TTTGCTCTTA GTGGCTCGAT AGAGGAACTA TCATATACAC TATACGGTAT    3660
                            orf3基因的起始密码子  orf2基因的终止密码子TTGTCTTGTT TTAATATTTT GTAAAATACG GTTTGGTATT CATAATGAAA ATAGGTATTG    3720ATTCAACTGC ACTTGTAAAA AATAGAACTG GAGTAGGTAA TTATATATAT TCAATTTTAA    3780ACGAATTAGT TAAAAATACA GAACATCAAT TTATTTTATA TTCTAACAAA GAAATATTTT    3840ATCCTGATTT GCCAAATGTT AGAAAAGTTA TTCATTCATC GACTTATAAA GGGCCAGTAT    3900GGCAAAATAC AAGTTTGATT TATTCCCTCT TCAAAGATAG ACCTGATGTT TTTTGGGGGG    3960GGAATGGGTA TTTACCAATG TTAGTTCCGA AGAAAACAAA GCTGATTTTA ACAGTTCATG    4020ATCTTGTATA TAAATATGCT GGTCGTACAA TGCCTACCAT CAGTAGATTA TCTCGTAGGT    4080TTTTTCAGCC ATTATCTGTA AATAAAGCTG ATGCAATAGT TGCAGTCAGT CATGCAACTG    4140CAGATGAGGT ATATAAAGAA TATGGTGTCC GACCTGATTG TGTGGTCCAT CCTCAGATAT    4200CTCCGTTATT TTCATTACAA GAAAAATCTA ACTTAGCGAA AATTAAAGAA AAATACCAGC    4260TTAATGAGTA TATATTGACA ATTGGAACCC TTGAACCACG AAAAAATATG GTGGCTTTAA    4320TCCAGGCATA TCTAAACGTA GTATCATTGG GTTATAAATT ACCTGTACTG GCAATTGCTG    4380GAGGTAAAGG CTGGATGCAG GGAGAGTTAG ATAAATTAGT AGAGAAGGGG GTGGCAAAAG    4440GTATTATCAG AAAATTAGGT TATGTATCTG ATCCGGATTT AGCGGTTCTT TATTCAGGAG    4500CTCAACTTTT TGTTTTAGCA TCTATTTATG AAGGTTTTGG TATGCCGATT CTGGAGGCTC    4560AAGCCAGCGG GTGTCCTGTG CTTATATCCA GAATAAAATC TATGATAGAG GCCGCAGGTG    4620ATATTTGCTG TACTTTTGAG CCAGATATAC AGTCTATTGA GAACTCTCTT ATAAATCTAT    4680CAAAAGGGAA TCAGCCTCTT ATTTGTCGGC TACCATATAC TATTGAAAAT AAAATTGATA    4740
                             orf3基因的终止密码子TTGCAGCTAA AAAATATGAA AAATTGATGA GGTTATCT TG AAGAAAATAT TGGTAATTAC    4800CCCAAGATTT CCATATCCAG TGATCGGAGG AGATAGATTA CGTATTTATG AAATATGTAA    4860
                                               orf4基因的起始密码子AGAGCTGTCT CGTAAATACT CATTGACTCT GGTTAGTTTG TGTGAGTCGA ATGAAGAA AT  4920GACATATCCT ATCCCTGATG ATGGTGTTTA TACATCAGTA TATAGATGTC ATCATCCACG    4980AATCATATCG TATTTTTCAT GCTTACTAGC ACTGCCTACT AACATACCAC TGCAAGTTGC    5040TTATTACTAT TCTCCCAAAT TTAAAAAAAT AATTAATAAG TTAGTTCCTG AACATGATTT    5100ATTATTACCT CATTTAATTC GTGTTGCTGG GTATGTAAAA AAAAACTCAA CTCCTAAAAT    5160ATTAGAAATG ACTGATGCTA TTTCTATGAA TTATGAGAGA GTATGTAAAT TAAAAAATAG    5220TACAGGAATT AAAGGTCTTA TATATAAAAT TGAGCGTAAC CGTCTAAATC AATATGAAAA    5280ATCAATAGCA AAATACTTTG ATCAGACAAT TTTTGTATCT CAACATGATA AGAACTACCT    5340TTTTAGAAAT TTACCAGACT TATATCATAA GTCATTAGTT TGTACAAATG GAGTTGATGT    5400TGCTAACTTT AAAAATACAT TGTTTAAAAG AAGCTACAAA CTTATTTTTA TTGGCAACAT    5460GTTTTCTGTT CAAAATTTTG ATGCGGCTTT TTGGTTTTGT GAATCTGTAT TACCTATACT    5520TCGTCAATAT GGACCATTTA CCTTTCATGT TATAGGTAAA ATATCGTTAG AAAACTCAAA    5580AAAACTTTCA GCATATGAGG GGGTTTTCGT TACTGGGGCT GTAGATAATG TTATGGACTA    5640TGCAAATAAT TCTTTGGCGG GCATATGTTC AGTAAGATTA GCTGCGGGTG TACAGAATAA    5700AATTTTAGAG TACATGGCTA TGGGAATACC GGCAATAACA ACATCGATTG GTTTGGAGGG    5760GTTATTCGCT GTTGACGGCG AAAGTATAGT TGTGGCTAAT ACACCTCATG AGTTTGTATC    5820AACAATATTG AAATTGTTTA ATGATCCAAG TTTTGGAAAA ACCATTTCAA AAAATGGATT    5880AGGTTATGTT CAACAAAATC ATTCGTGGTC TGAGAAATTA CAACCCCTAA TTCAAGTAAT    5940
  orf4基因的终止密码子  orf5基因的起始密码子TAATAATTTA ATCGAAGAG T AGTTT ATGTC TAGTATAATT CCTGTTATTA TGGCTGGCGG    6000TTCTGGTAGT CGTTTATGGC CTCTTTCGCG CGAACTTCGT CCAAAGCAAT TCCTTAAGCT    6060TGATGGTGAG CTAACAATGC TGCAAGCGAC TATCAATCGT TTAAAAAATT TCGTTACGAC    6120GCAACCATTG GTTATTTGTA ATGAAGATCA CCGATTTTTA GTTGCTGAAC AGTTACGTTA    6180TTTAGGTAAA CTTGAAAATA ATATCATCTT AGAGCCATTT GGACGTAATA CTGCGCCAGC    6240AATAGCTTTG GCTGCATTCA CAGCTTTACA GAGCTCTTCT CTTAAGGAAG ATCCTATATT    6300GTTAGTATTA GCGGCAGATC ATGTTATCCG AGATGAAGAG TCATTTAAAA GATCAGTTCA    6360ACAAGCAGTT CCTTATGCTA AATCTGGAAA ACTTGTTACT TTTGGCATTG TACCTACCCA    6420TGCGGAAACC GGATATGGAT ATATACAACG AGGAAAGGAA TTAAATGATG CTTATTCAGT    6480TAAACAATTT GTCGAAAAGC CCGAGCTTGA AACCGCACAA CAATATTTTA ATAGCGGAGA    6540ATATTATTGG AATAGTGGTA TGTTCTTGTT TCGTGCTAGC CGCTATCTTG ATGAACTGGC    6600ATTATTCCGA CCAGATATTT ATACTGCTTG TGGTAAAGCA ATAGGGGCTA TTGACCCAGA    6660TCATGACTTT GTTCGTATTG ATAAAGATGC ATTCAATTCT TGTCCAAGTG ATTCTATTGA    6720TTATGCTGTA ATGGAAAAAA CTTCAGATGC AGTAGTCGTT CCGATGGATG CTGGTTGGTC    6780TGATGTTGGA TCTTGGCTAT CGTTATGGGA GCTTTCAAAA AAAGATTCTA TGGGGAATTC    6840ATTTCATGGT GATGTGATTC AACATAGTAG TAAAAATAAT TTTGTTTTTA CAGAGAGCTG    6900TTTGGTTAGT TTGGTTGGTG TTGAAAAACT TGTAGTCGTA CAAACAAAAG ATGCAATATT    6960AGTTGCTGAT CAGAATAAAG TTCAAGATGT AAAAAATATA GTTGAGAAAC TAAAAAATAG    7020CTGCCGTACA GAACATCGTA TACACCGGGA AGTTTTTCGC CCTTGGGGAA AGCATGATTT    7080AATTGACGAT GGAGATGTAT ATCGAGTCAA AAGGATAAGT GTTAAACCGG GTGAGAGGCT    7140TTCATTGCAA ATGCATCATC ATAGAGCTGA ACACTGGATA GTTGTATCTG GTATAGCTAA    7200AGTTACGAAT GGTGACAATA TATATCTTTT AAAAGAAAAT GAATCAACAT TCATACCTTC    7260AGGTACGATT CATGCCTTAG AAAATCCAGG AGAAATAATG CTGGAGCTTA TTGAGGTGCA    7320
                       orf5基因的终止密码子ATCGGGAGTA TGCTTGGATG AAAATGATAT TATCCGTTTA  TAAGGTCACT TATAATTGAA    7380GTTAAAGAGT TTCTATTAAA ATAGGCTATT TGGAGCTTTG ACAGTTGTTT AGTATTTAAT    7440
                               orf6基因的起始密码子CGCAAAAATG ATATCTTTAT TTATAATGTT AAAGGTAGTG TCCT ATGACT AAGTATAATA    7500GTTCTTCATT AATAGCCAAT AGTAATGTGA ATTTTGGTAC TAGTGGTGCT CGTGGATTAG    7560TCGTTGATTT TACTCACAAT GTTTGTGCTG CTTTTACTCA TGCATTTCTT TCGGTTATCG    7620AAAAACACTT TAAGTTTGAC ACAGTGGCTG TAGCAATAGA TAACAGACCT AGTAGTTTTA    7680ATATAGCACA AGCATGTGTT TTCGCTATAA AACAGCATGG ATATGGCATC GAATATCATG    7740GTGTCATTCC GACTCCTGCA TTAGCTCATT ATTCGATGCA GAAAAATATT CCCTGTATAA    7800TGGTCACTGG GAGTCATATA CCTTTTGATC GTAATGGTTT AAAATTCTAC CGACCAGATG    7860GTGAAATCAC AAAAGAGGAT GAGCTCGCAA TTGTAAATAG TGAATATACA TTTTCTCCTG    7920TAGGTGTATT ACCTCATCTT GAAACAAGCT CTCAAGGTGC GGACTGCTAC TTGGAACGTT    7980ATGTTTCTCT TTTTTATTCT GATATTTTAA AGGGGAAAAG AATAGGGGTA TATGAACATT    8040CTAGTGCGGG GCGCGATTTA TATGCTTCTC TTTTTAATCA ATTGGGTGCA GAGGTCATTT    8100CCCTAGGCAG AAGTGATGAG TTCGTTCCGA TTGATACGGA AGCAGTAAGT GATGAAGATC    8160GTGTACTTGC AAGAGAGTGG TCTAAAAAAT ATAATCTTGA TGCTATTTTC TCAACAGATG    8220GCGATGGTGA TCGTCCTTTA GTTGCCGATG AAAATGGTGA ATGGTTAAGA GGCGATATTC    8280TGGGACTACT TACTGCTATT GAACTTAATA TCAAGGCGTT GGCTATTCCA GTGAGTTGTA    8340ATACAGCAAT TGAAGAGTCT AATAAATTTG CAAGTATACA ACGAACGAAA ATAGGTTCTC    8400CTTATGTAAT TGCAGCATTT GCAGATCTTG CTAAGCAATT TGATTCAGTC GCTGGTTTTG    8460AAGCTAATGG TGGTTTTCTC CTTGCCTCCG ATTTACAAAT TAATGACAAG GAATTAAAAT    8520CGTTGCCTAC ACGAGATGCT GTGTTACCAG CATTAATGCT CTTAATAGCT TCTCGCAATA    8580GTACTATTTC TCAACTGATT AATAATCTTC CTCAGCGATT CACTTGGTCA GATAGAGTTA    8640AAAACTTCCC TTCAGATTCA AGTCAACAAA TTATAAAGAA TGCCATATCG TCACCCAATA    8700ATTTCTTTAA TAGTTTAGGT TATGAATCAT TATCCTGTTC CTCTATTGAT GAAACGGATG    8760GTGCAAGATT TACTTTAAAT AATGGTGATA TTATACATCT CCGTCCTTCC GGTAATGCTC    8820CAGAACTCCG TTGTTATGCT GAGGCCAGTG ATGAAAATCA GGCTAAGCAA TATGTTACGA    8880
            orf6基因的终止密码子ATGTGCTGGG AAATATTACC TCTT TGATTT CTTGATGTTA TAGGTTTATC TACGCTTATA    8940TGTGTGCGTA GGTTTGATTA CACGTAGATG CTGGTATACA GAATTGAAGA ACGGTATTTG    9000TTGCATTAAT GAAATTCAGC ACTACACACA TTCGTGCAAC TTGAGATAAC ATCTCAATCA    9060TATTCAAGTC GCGCATACAT CGCGGTGAAC ACCCCCTGAC AGGAGTAAAC AATGTCAAAG    9120CAACAGATCG GCGTCGTCGG TATGGCAGTG ATGGGGCGCA ACCTTGCGCT CAACATCGAA    9180AGCCGTGGTT ATACCGTCTC TATTTTCAAC CGTTCCCGTG AGAAAACGGA AGAAGTGATT    9240GCCGAAAATC CAGGCAAGAA ACTGGTTCCT TACTATACGG TGAAAGAGTT TGTTGAATCT    9300CTGGAAACGC CTCGTCGCAT CCTGTTAATG GTGAAAGCAG GTGCAGGCAC GGATGCTGCT    9360ATTGATTCCC TCAAGCCATA CCTCGATAAA GGTGACATCA TTATTGATGG TGGTAATACC    9420TTCTTCCAGG ACACCATTCG TCGTAACCGT GAGCTTTCTG CCGAAGGTTT TAACTTCATC    9480GGTACCGGTG TTTCCGGCGG TGAAGAAGGT GCGCTGAAAG GTCCTTCCAT TATGCCTGGT    9540GGGCAGAAAG AAGCCTATGA ACTGGTTGCA CCGATCCTGA CCAAAATCGC CGCAGTGGCT    9600GAAGACTGTG AGCCATGCGT TACCTATATT GGTGCCGATG GTGCAGGTCA CTATGTGAAG    9660ATGGTTCACA ACGGTATTGA ATACGGCGAT ATGCAGCTGA TTGCTGAAGC CTATTCTCTG    9720CTTAAAGGTG GCTTGAACCT TTCCAACGAA GAACTGGCGC AGACCTTTAC CGAGTGGAAT    9780AACGGTGAAC TGAGCAGCTA CCTGATTGAC ATCACTAAAG ACATCTTCAC TAAAAAAGAT    9840GAAGACGGTA ACTACCTGGT TGATGTGATT CTGGATGAAG CGGCTAACAA AGGTACCGGT    9900AAATGGACCA GCCAGAGCGC GCTGGATCTC GGCGAACCGC TGTCGCTGAT TACCGAGTCT    9960GTGTTTGCAC GTTATATCTC TTCTCTGAAA GATCAGCGTG TTGCCGCATC TAAAGTTCTC    10020TCTGGCCCGC AAGCACAGCC AGCAGGCGAC AAAGCTGAGT TTATCGAGAA AGTTCGCCGT    10080GCGCTGTATC TGGGCAAAAT CGTTTCTTAC GCTCAGGGCT TCTCTCAGCT ACGCGCCGCG    10140TCGGAAGATT ACAATTGGGA TCTGAACTAC GGCGAAATCG CGAAGATTTT CCGTGCTGGT    10200TGCATCATCC GTGCGCAGTT CCTGCAGAAA ATCACCGATG CGTATGCCGA AAATCCCAAA    10260ATCGCTAACC TGCTGTTGGC TCCGTACTTT AAGCAAATCG CCGACGACTA CCAGCAGGCA    10320CTGCGTGATG TCGTCGCTTA TGCAGTGCAA AACGGTATTC CGGTTCCAAC CTTCTCTACG    10380GCGGTTGCCT ATTACGATAG CTACCGTGCC GCGGTGCTGC CTGCGAACCT AATTCAGGCT    10440CAGCGCGACT                                                           10450
以上仅是本发明较佳实施例,并非对本发明作任何限制,凡依本发明技术实质对以上实施例作修改、等同变化与修饰,均属本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1、一种对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,其是如SEQ ID NO:1所示的分离的核苷酸,全长10450个碱基;或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基,同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸。
2、按照权利要求1所述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,其由6个基因组成,都位于galF基因和gnd基因之间。
3、按照权利要求2所述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,所述的基因包括:聚合酶基因,其包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因;糖基转移酶基因,其包括orf1、orf3、orf4基因;其中所述的聚合酶基因是SEQ ID NO:1中的2552至3721碱基的核苷酸;orf1基因是SEQ ID NO:1中的1354至2565碱基的核苷酸;orf3基因是SEQ ID NO:1中的3705至4781碱基的核苷酸;orf4基因是SEQ ID NO:1中的4919至5962碱基的核苷酸。
4、按照权利要求1或2所述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,其源于所述的wzy基因或糖基转移酶基因即orf1、orf3、orf4基因;或糖合成路径基因中的寡核苷酸;以及它们的混合或它们的重组。
5、按照权利要求4所述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸,其特征在于,所述的源于orf1基因的寡核苷酸对是:
SEQ ID NO:1中的1701至1720碱基的核苷酸和2221至2239碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的1396至1414碱基的核苷酸和2354至2372碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的1969至1987碱基的核苷酸和2410至2429碱基的核苷酸;
源于wzy基因的寡核苷酸对是:
SEQ ID NO:1中的2857至2875碱基的核苷酸和3607至3625碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的2676至2694碱基的核苷酸和3379至3397碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的2925至2943碱基的核苷酸和3687至3707碱基的核苷酸;
源于orf3基因的寡核苷酸对是:
SEQ ID NO:1中的4165至4283碱基的核苷酸和4694至4712碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的3914至3933碱基的核苷酸和4535至4552碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的3714至3733碱基的核苷酸和4478至4497碱基的核苷酸;
源于orf4基因的寡核苷酸对是:
SEQ ID NO:1中的4967至4985碱基的核苷酸和5758至5776碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的5120至5139碱基的核苷酸和5518至5536碱基的核苷酸,
SEQ ID NO:1中的5253至5271碱基的核苷酸和5896至5914碱基的核苷酸。
6、权利要求1所述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。
7、权利要求1所述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸的重组分子,而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O59的O-抗原,并成为细菌疫苗。
8、权利要求1所述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸的应用,其特征在于,它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列,检测人体和环境中的细菌。
9、权利要求1所述的对大肠杆菌O59的O-抗原特异的核苷酸的分离方法,其特征在于,包括下述步骤:
(1)基因组的提取:在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O59,离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞,37℃温育20分钟,然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10%SDS,50℃温育2小时,再加入3ul 10mg/ml的RNase,65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物,取上清液,再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提两次,取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚,上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA,用玻璃丝卷出DNA并用70%乙醇洗DNA,最后将DNA重悬于30ul TE中,基因组DNA通过0.4%的琼脂糖凝胶电泳检测;
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O59中的O-抗原基因簇:以大肠杆菌O59的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇;首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGGATC AAA GAA AT-3’),再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C-3’)。用Boehr inger Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇,PCR反应程序如下:在94℃预变性2分钟,然后94℃变性10秒,60℃退火30秒,68℃延伸15分钟,这样进行30个循环;最后,在68℃继续延伸7分钟,得到PCR产物,用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性;合并6管long PCR产物,并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物;
(3)构建O-抗原基因簇文库:用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库;反应体系是300ng PCR纯化产物,0.9ul 0.1MMnCl2,1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI,反应在室温中进行;酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间,而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应;合并4管同样的反应体系,用等体积的酚抽提一次,用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次,再用等体积的乙醚抽提一次后,用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗沉淀,最后重悬于18ul水中;随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP,1mMdGTP,1mMdTTP,10mMdATP),1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶,11℃反应30分钟,将酶切产物补成平端,75℃终止反应后,加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul,70℃反应20分钟,使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时,总体积为90ul,其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶;最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物,再用70%乙醇洗沉淀,干燥后溶于30ul水中得到连接产物;用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5□细胞,取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后,转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击,电压为2.5千伏,时间为5.0毫秒-6.0毫秒,电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏,然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养,次日得到蓝白菌落,将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养,同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小,得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O59的O-抗原基因簇文库;
(4)对文库中的克隆测序:从文库中挑选插入片段在700bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI 377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序,使序列达到80%的覆盖率,再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20%的序列,从而获得O-抗原基因簇的所有序列。
(5)核苷酸序列的拼接及分析:用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列,从而得到大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列,序列的质量主要由两个方面来保证:1)对大肠杆菌O59的基因组作6个Long PCR反应,然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基,保证3个以上高质量的覆盖率;在得到大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的核苷酸序列后,用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information,NCBI)的orffinder发现基因,找到9个开放的阅读框,用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因,再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释,用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对,最后得到大肠杆菌O59的O-抗原基因簇的结构;
(6)特异基因筛选:针对大肠杆菌O59的O-抗原基因簇中orf1、wzy、orf3、orf4基因设计引物;在每个基因内各设计三对引物,每对引物分布在相应基因内不同地方以确保其特异性;用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR,所有引物在大肠杆菌O59中得到阳性结果,在其他组中没有扩增到任何大小正确的带,也就是,在大多数组中没有得到任何PCR产物带,虽在少数组中得到PCR产物带,但其大小不符合预期大小,所以orf1、wzy、orf3、orf4基因对大肠杆菌O59及其O-抗原都是高度特异的。
CN 03129935 2003-05-27 2003-05-27 对大肠杆菌059的o-抗原特异的核苷酸 Expired - Fee Related CN1240835C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 03129935 CN1240835C (zh) 2003-05-27 2003-05-27 对大肠杆菌059的o-抗原特异的核苷酸

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN 03129935 CN1240835C (zh) 2003-05-27 2003-05-27 对大肠杆菌059的o-抗原特异的核苷酸

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1453358A true CN1453358A (zh) 2003-11-05
CN1240835C CN1240835C (zh) 2006-02-08

Family

ID=29260427

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 03129935 Expired - Fee Related CN1240835C (zh) 2003-05-27 2003-05-27 对大肠杆菌059的o-抗原特异的核苷酸

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN1240835C (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100345969C (zh) * 2004-04-19 2007-10-31 天津生物芯片技术有限责任公司 对大肠杆菌o41的o-抗原特异的核苷酸
CN100345968C (zh) * 2004-04-19 2007-10-31 天津生物芯片技术有限责任公司 对大肠杆菌o15型的o-抗原特异的核苷酸

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100345969C (zh) * 2004-04-19 2007-10-31 天津生物芯片技术有限责任公司 对大肠杆菌o41的o-抗原特异的核苷酸
CN100345968C (zh) * 2004-04-19 2007-10-31 天津生物芯片技术有限责任公司 对大肠杆菌o15型的o-抗原特异的核苷酸

Also Published As

Publication number Publication date
CN1240835C (zh) 2006-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Restieri et al. Autotransporter-encoding sequences are phylogenetically distributed among Escherichia coli clinical isolates and reference strains
JP2008283895A (ja) 下痢原性大腸菌検出方法
L'Abée-Lund et al. The highly virulent 2006 Norwegian EHEC O103: H25 outbreak strain is related to the 2011 German O104: H4 outbreak strain
US20060194206A1 (en) Diagnostics of diarrheagenic escherichia coli (dec) and shigella spp
CN1942592A (zh) 淋病奈瑟氏球菌检测
CN1442423A (zh) 对大肠杆菌o107型的o-抗原特异的核苷酸
Hartleib et al. Prevalence of the new, SPI1-like, pathogenicity island ETT2 among Escherichia coli
CN1442421A (zh) 对大肠杆菌o150型的o-抗原特异的核苷酸
CN1453358A (zh) 对大肠杆菌059的o-抗原特异的核苷酸
CN1442422A (zh) 对痢疾志贺氏菌3型、大肠杆菌o124与o164的o-抗原特异的核苷酸
CN1442424A (zh) 对大肠杆菌o172型的o-抗原特异的核苷酸
CN1462801A (zh) 对大肠杆菌052的0-抗原特异的核苷酸
Kawahara et al. Francisellosis of Yesso scallops Mizuhopecten yessoensis in Japan is caused by a novel type of Francisella halioticida
CN1307305C (zh) 对大肠杆菌o76型的o-抗原特异的核苷酸序列
CN1451662A (zh) 对鲍氏志贺氏菌1型和大肠杆菌0149的o-抗原特异的核苷酸
CN1432576A (zh) 对痢疾志贺氏菌12型和大肠杆菌o152的o-抗原特异的核苷酸
CN1316020C (zh) 对大肠杆菌o74型的o-抗原特异的核苷酸
CN1429832A (zh) 鲍氏志贺氏菌7型的o-抗原特异的核苷酸
CN1438230A (zh) 对鲍氏志贺氏菌15型、痢疾志贺氏菌2型和大肠杆菌0112的o-抗原特异的核苷酸
CN1307308C (zh) 对大肠杆菌o85型的o-抗原特异的核苷酸
CN1451663A (zh) 对痢疾志贺氏菌7型和大肠杆菌0121的o-抗原特异的核苷酸
CN1439645A (zh) 对鲍氏志贺氏菌8型和大肠杆菌0143的o-抗原特异的核苷酸
CN1429833A (zh) 对痢疾志贺氏菌8型的o-抗原特异的核苷酸
KR100853263B1 (ko) 살모넬라균 및 캠필러박터균의 검출을 위한올리고뉴클레오티드 프라이머, 이를 포함하는 조기진단키트 및 이를 이용한 검출방법
CN1328384C (zh) 对大肠杆菌o177型的o-抗原特异的核苷酸

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20060208

Termination date: 20100527