CN100345969C - 对大肠杆菌o41的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O41(Escherichia coli O41)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O41中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15377个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O41的O-抗原基因簇中的寡糖单位处理基因(包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因)的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O41的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O41的方法。

Description

对大肠杆菌O41的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O41(Escherichia coli O41)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O41中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O41并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank etal(1987)“The function of antibody and complement in the lysis ofbacteria”.Rev Infect Dis 177：1750-1753.Pluschke G et al“Role of thecapsule and the O-antigen in resistance of O18：K1 Escherichia coli tocomplement-mediated king”.J Bacteriol 42：907-913]。大肠杆菌是一个种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]。

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O41的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O41的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。

本发明的另一个目的是提供了大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的基因：转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因；糖合成路径基因，包括gmd，fcl，gmm，manC，manB。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O41的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O41的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O41的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O41的O-抗原也是高度特异的。

本发明的还一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O41的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O41。

本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O41的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15377个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O41型的O-抗原特异的核苷酸，其中包括命名为wzx，orf2，orf3，wzy，orf5，orf6，gmd，fcl，gmm，manC，orf11，manB的12个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O41的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特异性的基因包括：转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO：1中的1114至2433碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ IDNO：1中的4649至5845碱基的核苷酸；所述的orf2基因是SEQ ID NO：1中的2433至3362碱基的核苷酸；orf3基因是SEQ ID NO：1中的3374至4630碱基的核苷酸；orf5基因是SEQ ID NO：1中的5842至6591碱基的核苷酸；orf6基因是SEQ ID NO：1中的6588至7445碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O41的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O41的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的1805至1822碱基的核苷酸和2393至2410碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的1510至1527碱基的核苷酸和2106至2123碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5012至5029碱基的核苷酸和5406至5389碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的5272至5289碱基的核苷酸和5645至5662碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O41型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。

前述的对大肠杆菌O41型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O41型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。

前述的对大肠杆菌O41型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。

前述的对大肠杆菌O41的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O41型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O41型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O41型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O41型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O41型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O41型的O-抗原的高度特异性；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O41，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O41的灵敏度。

前述的对大肠杆菌O41的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O41，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O41中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O41的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAAGAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCGCGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的ExpandLong Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库；反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3MNaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O41的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O41的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O41的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因设计引物；在每个基因内各设计两对引物，每对引物分布在相应基因内不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR，所有引物在大肠杆菌O41中得到阳性结果，在其他组中没有扩增到任何大小正确的带，也就是，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O41及其O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：将大肠杆菌O41的冻存菌液接种到有LB培养基的三角瓶中，30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时至饱和，取培养好的菌液稀释，取稀释菌液涂布LB琼脂平板，30℃至40℃，培养数小时计数，计算原液中活菌浓度；在5份重量均为20g的生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入LB培养基，过滤，过滤液于30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时；从培养好的菌液中取数ml于6,000g离心数分钟，去上清，加MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100℃沸水中煮数分钟，裂解液于12,000g离心数分钟，取上清做为PCR模板；用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的1805至1822碱基的核苷酸和2393至2410碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的1510至1527碱基的核苷酸和2106至2123碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的5012至5029碱基的核苷酸和5406至5389碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的5272至5289碱基的核苷酸和5645至5662碱基的核苷酸进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环；反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性；参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果；参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果；说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O41的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长15377个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，它包括命名为wzx，orf2，orf3，wzy，orf5，orf6，gmd，fcl，gmm，manC，orf11，manB的12个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O41的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括gmd，fcl，gmm，manC，manB。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因对大肠杆菌O41的O-抗原是特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O41的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基转移酶基因包括orf2、orf3、orf5、orf6基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源于大肠杆菌O41的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O41为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O41及它们的O-抗原是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O41的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O41中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的1114至2433碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的4649至5845碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O41都是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O41。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf2、orf3、orf5、orf6基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O41表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O41。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf5、orf6基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O41。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf2、orf3、orf5、orf6基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸混合物检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O41的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取。

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O41，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O41中的O-抗原基因簇

以大肠杆菌O41的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库。

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O41的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序。

从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到，最后获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析。

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O41的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1与Yersinia enterocolitica的O-抗原转运酶Wzx在426个氨基酸的序列中有32％的相同性，56％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法发现orf1有10个潜在的穿膜区，Wzx蛋白的氨基端有一个大约40个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf1是wzx基因，命名为wzx。Orf2与Geobacter sulfurreducens PCA的的糖基转移酶在274个氨基酸中有28％的相同性，52％的相似性，推测orf2也是一个糖基转移酶，将orf2暂命名为orf2。Orf3与Bacteroides thetaiotaomicron VPI-5482的糖基转移酶在416个氨基酸中有33％的相同性，54％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf3与糖基转移酶家族1的保守的功能域PF00534的Evalue为1.4×e^-27，推测orf3也是一个糖基转移酶，暂命名为orf3。Orf4与Drosophila simulans的O-抗原聚合酶在215个氨基酸的序列中有26％的相同性，47％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.et al(1984).Analysis of membrane and surface protein seque-nces withthe hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179：125-142]发现orf4有9个潜在的穿膜区，它与许多Wzy蛋白有相似的二级结构，有一个大的loop，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以确定orf4是wzy基因，命名为wzy。Orf5与Bacteroides fragilis的糖基转移酶在218个氨基酸中有31％的相同性，53％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf5与糖基转移酶家族2的保守的功能域PF00535的E value为2.1×e^-27，推测orf5也是一个糖基转移酶，暂命名为orf5。通过与GenBank中的基因比较没有找到与Orf6相似的序列，所以不能确定Orf6的功能，暂命名为Orf6。Orf7与Yersiniaenterocolitica的Gmd在271个氨基酸中有84％的相同性，93％的相似性，Gmd是一个GDP-mannose-4，6-dehydratase，高度的相同性表明orf7也是gmd基因，命名为gmd。Orf8与Yersinia pseudotuberculosis的GDP-L-fucosesynthetase在320个氨基酸中有76％的相同性，85％的相似性。GDP-L-fucosesynthetase由rmlC基因编码，较高的相同性表明葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶由fcl基因编码，高度的相同性表明orf8也是fcl基因，命名为fcl。Orf9与Salmonella typhimurium的GDP-mannose mannosyl hydrolase在148个氨基酸中有53％的相同性，68％的相似性。GDP-mannose mannosyl hydrolase由gmm基因编码，较高的相同性表明orf9也是gmm基因，命名为gmm。Orf10与Escherichia coli的GDP-mannose pyrophosphorylase在468个氨基酸中有81％的相同性，91％的相似性。GDP-mannose pyrophosphorylase由manC基因编码，较高的相同性表明orf10也是manC基因，命名为manC。Orf11内有一个终止密码子，推测它已经失去了功能，暂命名为orf11。Orf12与Shigella boydii的phosphomannomutase在473个氨基酸中有90％的相同性，94％的相似性。phosphomannomutase由manB基因编码，较高的相同性表明orf12也是manB基因，命名为manB。

实施例6：特异基因的筛选

针对大肠杆菌O41的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

在表1中列出了大肠杆菌O41的O抗原基因簇的转运酶基因、聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166种血清型的大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166种血清型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。

表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共13组。它们的来源都列于表中。

在第2组中含有大肠杆菌O41的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是不含有大肠杆菌O41的基因组DNA，作为阴性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性2分钟后，95℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第3组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O41及其O-抗原都是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O41中筛选到对大肠杆菌O41的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O41的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O41是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O41，并能鉴定它们的O-抗原。

实施例7：引物灵敏度的检测。

购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O41的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ IDNO：1中的1805至1822碱基的核苷酸和2393至2410碱基的核苷酸，SEQ IDNO：1中的1510至1527碱基的核苷酸和2106至2123碱基的核苷酸，SEQ IDNO：1中的5012至5029碱基的核苷酸和5406至5389碱基的核苷酸，SEQ IDNO：1中的5272至5289碱基的核苷酸和5645至5662碱基的核苷酸进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O41的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O41的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

根据本发明的对大肠杆菌O41型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表3是大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的结构，共由12个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O41的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大肠杆菌O41的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

               SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)

<110>天津生物芯片有限责任公司

<120>对大肠杆菌O41的O-抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O41的O-抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>15377

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc atgcgtccaa gaacgcggtc     60

gaaaaccact tcgatacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaaatgcg cgttaagcgc    120

cagctgctgg cggaagtaca atctatttgc ccacctggtg tgaccattat gaacgtgcgt    180

cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttgtgcg ccagacctgc cattggcgac    240

aacccatttg tagtggtgct accagacgtt gttatcgacg acgccagcgc tgacccgctg    300

cgctacaacc ttgctgccat gattgcgcgt ttcaacgaaa cgggccgcag ccaggttctg    360

gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgag tactccgtca tccagacgaa agaaccgcta    420

gatcgtgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag    480

accctggatt cagacattat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgcaga tatttggccg    540

gaacttgaac gcactcagcc aggtgcatgg ggacgtattc agctgactga tgccattgcc    600

gaactggcga aaaaacagtc tgttgatgcc atgctgatga caggtgacag ctatgactgc    660

ggtaaaaaaa tgggttatat gcaggcattt gtgaagtatg gactacgcaa cctgaaagaa    720

ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg    780

atgtaacggt tgataaggaa attataacgg cagtgaagat tcgtggcgaa agtaatttgt    840

tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag    900

gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt    960

agcgtttgaa tttttcgggt ttagcgcgag taggtaacgc tcgtaacatc gtagacatgc   1020

atgcagtgct ctggtagctg ttaagccagg ggcggtagcg tgtgaaatat taatcaataa   1080

gaaaaacaga cgaataattt ggcctgaaat tttatgcata ttaaattaaa taaaaatata   1140

tcagaagtat tatctttctc ttccattgaa aaaatagcta aaaatagtgg gtggctatta   1200

atggaaagat gtactagatt aacactaggt ttattagtta gtacatggat cgctcgttat   1260

ttggggccgg atcagtacgg agttttgtct tatgtaatag catttatcgc gttcttccaa   1320

gctatccttc ctttaggaat ggatggtata atagtccgag atatctcaaa aaatgagaaa   1380

gactctggtg ctatacttgg aactataatt attacacgat tcacacttgg attaatatta   1440

tggtttgcaa tcataatttt aacgactatt atatactcac taaaaagtga atatacatta   1500

ttaagtgcca taatcggagc atcacttata tttcaagccg cagacacaat agatttgtgg   1560

ttccaaagtc aaagtcaaag taaaagaaca gtagtggcaa agttgcttgc ttacatatct   1620

gtaaatttac ttaagatagg aatgcttatt tttaaatgcc ccctatatgc ttttgcaatt   1680

gcaacactcc ttgaatttat cttttcttcc attgggctaa tcattgcttt tacgcgtttt   1740

cgtccaactg ttaaattggc cttttcatct ttaattatca agaaattttt aggtgagtca   1800

tggccatttc ttattagtag tatcgcaata ataatttata tgcgaattga ccaaatgttt   1860

atcaagtact atttgcctct aaatgatttg ggaatatact cagcaatgtt accacttgct   1920

acgctttggt catttattcc tatgactcta agcatcagtg tatctccttt tcttactaaa   1980

gcaaaaatgg aaagcgaaga aaaatatcag aaaatattgt gttttacatt caagttattt   2040

tcaatgttag gatggttaat ttgtattcca gtgtgtgtct tttctgatta tatagtttct   2100

ctactttatg gtccgcaata tcaaacaggt gctgtagtct tatcaatatt aatattcact   2160

aacttattta tataccaagg ggtggcgcag tcattatgga ttattaatga gcgaaaaggg   2220

aaattaagtt tattgaaaac aatattaggc gcaattgtat gtatagttgc taatttaata   2280

ttaattccga aatatggcat tattggtgca gctatatcag cagtattggc gcagtttaca   2340

tcagctataa tggcaaatat tgtaatggca ccaagaatat taatattaca gatacaaagc   2400

ctgttgttta taccgttgag aaaggttaat taatggaatc taaagtaagt gtgtatgctc   2460

ctgtaatcct atttgtttat gctagatatg aacatacaaa aaaaacaatt gaagcgttag   2520

cagataatta ttatgcaact gagacggaac ttatcattta ttctgattat tggcatgatg   2580

aaaatgataa agaaaatgtt aataaagtca gaaggtatat taaaagtata aaaggattta   2640

aatcaattac aataattgag agggagacta attatggctt ggcaaaaaat attatcgagg   2700

gagtgacaga tgtctgtaac aagtacgaac gagtgattat tttagaagat gacttgttaa   2760

catcgagatt ttttttaaag tacatgaatc acgcattgga aaaatatgag ttaaatgaag   2820

aagtatggca tataagcggt tggaattatc caattgattt taactccaat aaagcctcat   2880

ttttatggag agtgatgaac tgttgggggt gggcgacgtg gtcaaaccga tggcgttatt   2940

ttgaaaaaaa accttcacaa ataataagtg aatgggatgc tgaaaaaatc aaagcattca   3000

atttagatgg ttatcatgat ttttttgaac aaataataat gaattatgaa ggcagaaaaa   3060

atacctgggc aattttttgg tatgccacaa tatttattaa taatggtctg tgtttaaacc   3120

cgataaacac atatgtcaaa aatataggat atgatggctc aggtcaaaac tgtggtgtta   3180

aagatattta taagagtaag gtgtcacaat tttatattga ttcgtttcct gacatactgg   3240

aagagaatga attggccgtt aaagaaataa aaaaattttt caaaaaacaa gagccttctg   3300

tttttagaaa aatcgcaaga gaaatccgaa actacttaat gacattatgc aaaataaaat   3360

gaactggtaa gttatgaaaa tcctaatatt atcacactct gacatctctg gtggggcatc   3420

aatagcagct tatagactcc acaccgcatt gctgaaaaat aatatttatt ctagaatgat   3480

ggtaagggta aagaagactg atgactttac agttattggt cctaaaggga gcgttcaaaa   3540

aattttgaat aaaatccgct caccgcttgg taattgtatc aatggattat taaaaacaaa   3600

aaaaacaggt tttataagcg gaaattggat gccatctgga tgggcggaaa aaattaataa   3660

aatggatatt gatattgttc atcttcattg ggttggggca gaaacattat caattgagga   3720

tattggtaga ataaataaac cagttatttg gactttgcat gatatgtggc cattttgcgg   3780

gattgaacat tatgccccag atcttttaga aagtagatgg cgtaataatt atgaaaatca   3840

ttcattctct tcatttattg atttagattt cattgtatgg aaaagaaaaa aaaattcatg   3900

gaataataat attagtattg tttctccaag tacttggtta tacgattgtg caaaacatag   3960

cagtttattt gaaaataata aacatgttct aattccaaat gcacttgatc tttcagtttt   4020

taagccatta gataagagtt attgtcgaga gattttaaat atagacaatg ataagaaaat   4080

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atcaagacaa gataatttgc cacaaactgc tacagaagca caagcttgtg gttgccctgt   4380

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agctaaacca tacgattttg tagatttagc tagggggata ttatgggttc taaataataa   4500

agatgtggaa attaatctaa gcagtaatgc agtacataaa gctcataaaa tctggtcaga   4560

agatcaagta gtttctgaat atatagctct ataccaaaat attattaatg agaaaactcg   4620

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tacactacat cctttaattt ctttagtact tctgtcacta ataaacattt tcacgcgtct   4800

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atatctgatt gagtttaatg agcgtagtgg tgatgatact tttcgatata tcccatttat   4920

aaaaaatata gcaacatttt catttgataa agcattaact gcagaatctg atatattcag   4980

cattgagcca ttaagtcgag catattggtg gttgctatca gttttaggag ttaatatcaa   5040

tgtgatatta ttgcttcaag tcttttgttg gacaacttgt ttgatggttt tagctataaa   5100

aataagtgaa agatatgcaa tgattattct atgcataggc atttgctttt tttcatatac   5160

aattccatac actttctttc atttatttag gcaggcatgg ggactatcat tctttattct   5220

atatttgtgc aattgggata agccgggtag atttgcattt attctattag ccggattgag   5280

tcatttgatg tttattccat tattgatttt tatggaaata tcaagaaaag ggatattaat   5340

attaacatct aaatattttc cgttattggc tgctatcttc ctgattgcat tatatttaac   5400

atataatgca ttgctaacaa aaattggaat gtattctgaa ggtgaaaaca taaactattc   5460

accatttaaa tctttaattt attctctctt tttcttttct ttactgatgc tttataacaa   5520

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attgctatca ccgcttgtta ttatgtttct taccattact aaaagcagat ttcttttatt   5700

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tatatatcag ttcacaatga ggggttatct tgatttttat aatgtaatgg atgcgttgta   5820

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ttgagttgtt tattggtgta tgcgtaactt acgatgattt taataaatat aagctacaac   6660

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ttattcaaag tgaacgttgt tcttttgatt atcgttactc atatccaacg gattggatcg   6780

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tgctttttaa aaaaaaatca tttcaaattt tatataatag attaaaaggt tttattggag   7440

tataatatga aaaaagcatt aattacaggc attactggtc aagatggttc ctacttggca   7500

gaattccttc ttgataaagg gtatgaagtg catggcatta aacgtcgtgc atcttcgttt   7560

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cttcattatg gtgacttaac agattcatca aacttaatac gtctcatcaa agaaatccaa   7680

ccagacgaag tttataacct tggcgctcag tctcatgtgg ctgtttcatt cgaatcacct   7740

gaatatactg ctgatgtgga tgcgatgggg actttacgtc tgctggaagc gattcgtatt   7800

tgtgggctag agaaaaaaac acgtttctat caggcatcaa cttctgaact ctttggctta   7860

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aaattatgtg aatcttataa ccggcaatat ggccgtgatt atcgcagtgt aatgcctact    9060

aatctttatg gcataaatga taattttcat cctgaaaact ctcatgttat tccggcactc    9120

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ttgatctcat aattagaaac gataaaggag aggcgctgct tgggcagcgc ctgaatcgcc    9660

cagcacaaaa ttattggttt gtgcctggag ggcgaattta taaggatgag tcattcgagg    9720

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tatttcttgg ggtgtatgaa catttctaca atgataattt ttctgaagca gaattttcta    9840

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cggtccagca taattcctac aagtggtttg atgtagtaac gttgcttaat agcactatag    9960

ttcatcaata taccaaaaat tattttatac caaggtaata gatatgctac ttcccgttgt   10020

catggccggt ggttctggta ccagattatg gcctctttca cgtacacttt atccgaaaca   10080

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ctttttaatt ccgatatttt gaaaggaaaa aaaataggga tatatgaaca ttctagtgca  12720

ggacgagatt tatatgctcc tctttttaat caattgggcg ctgaggtcat ttcccttggc  12780

agaagtgatg aattcgtccc tattgacact gaagcagtaa gtgatgaaga tcgtatactt  12840

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attgaacaat ctaacaaatt tgcaagtgta caacggacga aaataggctc tccttatgtg  13080

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ggtggttttc tgcttgcctc cgatttacaa ataaatggca aggaattaaa ttcattacct  13200

acacgagatg ctgtgttacc agcattaatg ctcttaatag cttcacgcaa cagtaccatc  13260

tctcaactgg ttaataatct tccacagcga ttcacttggt cagatagggt taaagatgtc  13320

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aatagcttag gatatgaatc attatcctgt tccgctattg atgaaacgga tggtgcaaga  13440

tttactttaa ataatggtga tattatacac ctccgtcctt ccggtaatgc cccagaactc  13500

cgttgttatg ctgaagccag taatgaaaat caggctaagc aatatgttac gaaagtcctt  13560

ggaaacatta cctctttgat ttcttgaatt ataaaaaatg ccatattgtc acccaataat  13620

ttctttaata gcttaggata tgaatcatta tcctgttccg ctattgatga aacggatggt  13680

gcaagattta ctttaaataa tggtgatatt atacacctcc gtccttccgg taatgcccca  13740

gaactccgtt gttatgctga agccagtaat gaaaatcagg ctaagcaata tgttacgaaa  13800

gtccttggaa acattacctc tttgatttct tgatgttata gatttatcta cgtttatatg  13860

cgtgcgtagg tttggttaca agtagatgcc gatataaagg aagattaacg atattcgttg  13920

tattagtact acacacattc gtgcaacttg agataacatc tcaatcatat tcaagtcgcg  13980

catacatcgc gctgaacacc ccctgacagg agtaaacaat gtcaaagcaa cagatcggcg  14040

tcgtcggtat ggcagtgatg gggcgcaacc ttgcgctgaa catcgaaagc cgtggttata  14100

ccgtctctat tttcaaccgt tcccgtgaaa aaacggaaga agtgattgcc gagaacccag  14160

gcaagaaact ggttccttac tacacggtga aagagtttgt tgaatctctg gaaacgcctc  14220

gtcgcatcct gttaatggtg aaagcaggtg caggcacgga tgctgctatt gattccctga  14280

aaccatacct cgataaaggt gacatcatca ttgatggtgg taataccttc ttccaggaca  14340

ccattcgtcg taaccgtgag ctttctgcag aaggctttaa cttcatcggt accggtgttt  14400

ccggtggtga agaaggcgcg ctgaaaggtc cttcaatcat gcctggcggc cagaaagaag  14460

cctatgaact ggttgccccg atcctgacta aaatcgccgc tgtggccgaa gatggcgaac  14520

cgtgcgtaac ctatattggt gccgatggcg caggccatta tgtgaagatg gttcacaacg  14580

gtattgaata cggagatatg caactcattg ctgaagccta ttctctgctt aaaggtggcc  14640

tgaacctctc caatgaagaa ctggcgcaga cctttaccga gtggaataac ggtgaactga  14700

gcagctacct aatcgacatt accaaagaca tcttcactaa aaaagatgaa gacggtaact  14760

acctggttga tgtgattctg gatgaagcgg ctaacaaagg taccggtaaa tggaccagcc  14820

agagcgcgct ggatctcggt gaaccgctgt cgctgattac cgagtctgtg tttgctcgtt  14880

atatctcttc tctgaaagag cagcgcgttg ccgcgtctaa agttctctct ggcccgaaag  14940

cacagccagc aggcgacaag actgaattca tcgaaaaagt tcgtcgtgcg ctgtatctgg  15000

gcaaaatcgt ttcttacgct cagggcttct ctcagctgcg tgctgcgtct gaagagtaca  15060

actgggatct gaattacggc gaaatcgcga agattttccg tgctggttgc atcatccgtg  15120

cgcagttcct gcagaaaatc actgatgcat atgccgaaaa tccgcagatc gctaacctgc  15180

tgctggctcc gtactttaaa caaatcgccg gtgactacca gcaggcgctg cgcgatgtcg  15240

tcgcttatgc agtacagaac ggtatcccgg ttccgacctt cgccgctgcg gttgcctatt  15300

acgacagcta ccgtgctgca gtactgcctg cgaacttgat ccaggcacag cgcgactatg  15360

acgattgtag ctgcaga                                                 15377

表1大肠杆菌O41的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物位置	反向引物位置	PCR产物长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								wzxwzy	O-抗原转运酶0-抗原聚合酶	1114-24334649-5845	1805-18221510-15275012-50295272-5289	2393-24102106-21235406-53895645-5662	605bp613bp377bp390bp	0000	60585860

表2166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号	该组中含有的菌株	来源
			1、野生型大肠杆菌2、野生型大肠杆菌3、野生型大肠杆菌4、野生型大肠杆菌	O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，O19ab，O20，O21，O22，O23，O24O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，O57，O58，O60，O61，O62，O53O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81，O82，O83，O68	IMVSaIMVSaIMVSaIMVSa

5、野生型大肠杆菌6、野生型大肠杆菌7、野生型大肠杆菌8、野生型大肠杆菌9、野生型大肠杆菌痢疾志贺氏菌10、鲍氏志贺氏菌11、福氏志贺氏菌12、野生型大肠杆菌13、野生型大肠杆菌

O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O41，O137，O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153O168，O169，O170，O171，O172，O173，D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B17，B18F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，DS，DRO3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119去除大肠杆菌O41的第2组菌

IMVSaIMVSaIMVSaIMVSabcdddIMVSa

为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阴性对照

a.Institude of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3是大肠杆菌O41的O-抗原基因簇的结构表

galF       wzx   orf2   orf3     wzy   orf5  orf6    gmd   fcl   gmm   manC   orf11   manB        gnd

                 1kb＿＿＿＿

表4是大肠杆菌O41的O-抗原基因簇中的基因的位置表

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ATGCGTCCAA GAACGCGGTC     60

GAAAACCACT TCGATACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAAATGCG CGTTAAGCGC    120

CAGCTGCTGG CGGAAGTACA ATCTATTTGC CCACCTGGTG TGACCATTAT GAACGTGCGT    180

CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTGTGCG CCAGACCTGC CATTGGCGAC    240

AACCCATTTG TAGTGGTGCT ACCAGACGTT GTTATCGACG ACGCCAGCGC TGACCCGCTG    300

CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGT TTCAACGAAA CGGGCCGCAG CCAGGTTCTG    360

GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAG TACTCCGTCA TCCAGACGAA AGAACCGCTA    420

GATCGTGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG    480

ACCCTGGATT CAGACATTAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCAGA TATTTGGCCG    540

GAACTTGAAC GCACTCAGCC AGGTGCATGG GGACGTATTC AGCTGACTGA TGCCATTGCC    600

GAACTGGCGA AAAAACAGTC TGTTGATGCC ATGCTGATGA CAGGTGACAG CTATGACTGC    660

GGTAAAAAAA TGGGTTATAT GCAGGCATTT GTGAAGTATG GACTACGCAA CCTGAAAGAA    720

GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG    780

ATGTAACGGT TGATAAGGAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT    840

TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG    900

GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT    960

AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TTAGCGCGAG TAGGTAACGC TCGTAACATC GTAGACATGC   1020

ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TTAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGTGAAATAT TAATCAATAA   1080

                              orf1的起始

GAAAAACAGA CGAATAATTT GGCCTGAAAT TTT ATGCATA TTAAATTAAA TAAAAATATA 1140

TCAGAAGTAT TATCTTTCTC TTCCATTGAA AAAATAGCTA AAAATAGTGG GTGGCTATTA   1200

ATGGAAAGAT GTACTAGATT AACACTAGGT TTATTAGTTA GTACATGGAT CGCTCGTTAT   1260

TTGGGGCCGG ATCAGTACGG AGTTTTGTCT TATGTAATAG CATTTATCGC GTTCTTCCAA   1320

GCTATCCTTC CTTTAGGAAT GGATGGTATA ATAGTCCGAG ATATCTCAAA AAATGAGAAA   1380

GACTCTGGTG CTATACTTGG AACTATAATT ATTACACGAT TCACACTTGG ATTAATATTA   1440

TGGTTTGCAA TCATAATTTT AACGACTATT ATATACTCAC TAAAAAGTGA ATATACATTA   1500

TTAAGTGCCA TAATCGGAGC ATCACTTATA TTTCAAGCCG CAGACACAAT AGATTTGTGG   1560

TTCCAAAGTC AAAGTCAAAG TAAAAGAACA GTAGTGGCAA AGTTGCTTGC TTACATATCT   1620

GTAAATTTAC TTAAGATAGG AATGCTTATT TTTAAATGCC CCCTATATGC TTTTGCAATT   1680

GCAACACTCC TTGAATTTAT CTTTTCTTCC ATTGGGCTAA TCATTGCTTT TACGCGTTTT   1740

CGTCCAACTG TTAAATTGGC CTTTTCATCT TTAATTATCA AGAAATTTTT AGGTGAGTCA   1800

TGGCCATTTC TTATTAGTAG TATCGCAATA ATAATTTATA TGCGAATTGA CCAAATGTTT   1860

ATCAAGTACT ATTTGCCTCT AAATGATTTG GGAATATACT CAGCAATGTT ACCACTTGCT   1920

ACGCTTTGGT CATTTATTCC TATGACTCTA AGCATCAGTG TATCTCCTTT TCTTACTAAA   1980

GCAAAAATGG AAAGCGAAGA AAAATATCAG AAAATATTGT GTTTTACATT CAAGTTATTT   2040

TCAATGTTAG GATGGTTAAT TTGTATTCCA GTGTGTGTCT TTTCTGATTA TATAGTTTCT   2100

CTACTTTATG GTCCGCAATA TCAAACAGGT GCTGTAGTCT TATCAATATT AATATTCACT   2160

AACTTATTTA TATACCAAGG GGTGGCGCAG TCATTATGGA TTATTAATGA GCGAAAAGGG   2220

AAATTAAGTT TATTGAAAAC AATATTAGGC GCAATTGTAT GTATAGTTGC TAATTTAATA   2280

TTAATTCCGA AATATGGCAT TATTGGTGCA GCTATATCAG CAGTATTGGC GCAGTTTACA   2340

TCAGCTATAA TGGCAAATAT TGTAATGGCA CCAAGAATAT TAATATTACA GATACAAAGC   2400

                         orf1的终止orf2的起始

CTGTTGTTTA TACCGTTGAG AAAGGTTAAT  TAATGGAATC TAAAGTAAGT GTGTATGCTC 2460

CTGTAATCCT ATTTGTTTAT GCTAGATATG AACATACAAA AAAAACAATT GAAGCGTTAG   2520

CAGATAATTA TTATGCAACT GAGACGGAAC TTATCATTTA TTCTGATTAT TGGCATGATG   2580

AAAATGATAA AGAAAATGTT AATAAAGTCA GAAGGTATAT TAAAAGTATA AAAGGATTTA   2640

AATCAATTAC AATAATTGAG AGGGAGACTA ATTATGGCTT GGCAAAAAAT ATTATCGAGG   2700

GAGTGACAGA TGTCTGTAAC AAGTACGAAC GAGTGATTAT TTTAGAAGAT GACTTGTTAA   2760

CATCGAGATT TTTTTTAAAG TACATGAATC ACGCATTGGA AAAATATGAG TTAAATGAAG   2820

AAGTATGGCA TATAAGCGGT TGGAATTATC CAATTGATTT TAACTCCAAT AAAGCCTCAT   2880

TTTTATGGAG AGTGATGAAC TGTTGGGGGT GGGCGACGTG GTCAAACCGA TGGCGTTATT   2940

TTGAAAAAAA ACCTTCACAA ATAATAAGTG AATGGGATGC TGAAAAAATC AAAGCATTCA   3000

ATTTAGATGG TTATCATGAT TTTTTTGAAC AAATAATAAT GAATTATGAA GGCAGAAAAA   3060

ATACCTGGGC AATTTTTTGG TATGCCACAA TATTTATTAA TAATGGTCTG TGTTTAAACC   3120

CGATAAACAC ATATGTCAAA AATATAGGAT ATGATGGCTC AGGTCAAAAC TGTGGTGTTA   3180

AAGATATTTA TAAGAGTAAG GTGTCACAAT TTTATATTGA TTCGTTTCCT GACATACTGG   3240

AAGAGAATGA ATTGGCCGTT AAAGAAATAA AAAAATTTTT CAAAAAACAA GAGCCTTCTG   3300

TTTTTAGAAA AATCGCAAGA GAAATCCGAA ACTACTTAAT GACATTATGC AAAATAAAAT   3360

orf1的终止 orf3的起始

GAACTGGTAA GTT ATGAAAA TCCTAATATT ATCACACTCT GACATCTCTG GTGGGGCATC3420

AATAGCAGCT TATAGACTCC ACACCGCATT GCTGAAAAAT AATATTTATT CTAGAATGAT   3480

GGTAAGGGTA AAGAAGACTG ATGACTTTAC AGTTATTGGT CCTAAAGGGA GCGTTCAAAA   3540

AATTTTGAAT AAAATCCGCT CACCGCTTGG TAATTGTATC AATGGATTAT TAAAAACAAA   3600

AAAAACAGGT TTTATAAGCG GAAATTGGAT GCCATCTGGA TGGGCGGAAA AAATTAATAA   3660

AATGGATATT GATATTGTTC ATCTTCATTG GGTTGGGGCA GAAACATTAT CAATTGAGGA   3720

TATTGGTAGA ATAAATAAAC CAGTTATTTG GACTTTGCAT GATATGTGGC CATTTTGCGG   3780

GATTGAACAT TATGCCCCAG ATCTTTTAGA AAGTAGATGG CGTAATAATT ATGAAAATCA   3840

TTCATTCTCT TCATTTATTG ATTTAGATTT CATTGTATGG AAAAGAAAAA AAAATTCATG   3900

GAATAATAAT ATTAGTATTG TTTCTCCAAG TACTTGGTTA TACGATTGTG CAAAACATAG   3960

CAGTTTATTT GAAAATAATA AACATGTTCT AATTCCAAAT GCACTTGATC TTTCAGTTTT   4020

TAAGCCATTA GATAAGAGTT ATTGTCGAGA GATTTTAAAT ATAGACAATG ATAAGAAAAT   4080

AATTCTTTTT GGTGCGTTTG GCGGAGGAAC TGACAAGCGC AAAGGGTATG ATTTGTTAGT   4140

TAAAGCATTA GAATTAATCG CTAAGGACAG TAACACCTTC AAAATTCAAT GCTTAGTCTT   4200

TGGACAAAGT ACGCCAGAAG AAAAAATTGA TCTTCCCATC GATATAAAAT GGTTAGGCCA   4260

TATATATGAT AATACAACAT TATCTTTAAT TTATAACTCA GCGAATGTAA TGGTTGTTCC   4320

ATCAAGACAA GATAATTTGC CACAAACTGC TACAGAAGCA CAAGCTTGTG GTTGCCCTGT   4380

CGTGGCATTT GATTGCACTG GATTTCCAGA TATAATCACA CACAAGGAAA CAGGGTATCT   4440

AGCTAAACCA TACGATTTTG TAGATTTAGC TAGGGGGATA TTATGGGTTC TAAATAATAA   4500

AGATGTGGAA ATTAATCTAA GCAGTAATGC AGTACATAAA GCTCATAAAA TCTGGTCAGA   4560

AGATCAAGTA GTTTCTGAAT ATATAGCTCT ATACCAAAAT ATTATTAATG AGAAAACTCG    4620

  Orf3的终止             orf4的起始

GAATGTT TAA TTATAGGGCG GATTAC ATGT GAGTAAACTT AAATCCAAGT ATATAAGAAA4680

TAACTATGCC AGACCTGGTA ATGATATAGT TGCTTCTATA ATTTCATTAT GCGTGATTAT    4740

TACACTACAT CCTTTAATTT CTTTAGTACT TCTGTCACTA ATAAACATTT TCACGCGTCT    4800

AAGTAATAAG ATATGCTATC TTTACTGCTT AGTATATTCA ATACTTATTG TAAATAGAGA    4860

ATATCTGATT GAGTTTAATG AGCGTAGTGG TGATGATACT TTTCGATATA TCCCATTTAT    4920

AAAAAATATA GCAACATTTT CATTTGATAA AGCATTAACT GCAGAATCTG ATATATTCAG    4980

CATTGAGCCA TTAAGTCGAG CATATTGGTG GTTGCTATCA GTTTTAGGAG TTAATATCAA    5040

TGTGATATTA TTGCTTCAAG TCTTTTGTTG GACAACTTGT TTGATGGTTT TAGCTATAAA    5100

AATAAGTGAA AGATATGCAA TGATTATTCT ATGCATAGGC ATTTGCTTTT TTTCATATAC    5160

AATTCCATAC ACTTTCTTTC ATTTATTTAG GCAGGCATGG GGACTATCAT TCTTTATTCT    5220

ATATTTGTGC AATTGGGATA AGCCGGGTAG ATTTGCATTT ATTCTATTAG CCGGATTGAG    5280

TCATTTGATG TTTATTCCAT TATTGATTTT TATGGAAATA TCAAGAAAAG GGATATTAAT    5340

ATTAACATCT AAATATTTTC CGTTATTGGC TGCTATCTTC CTGATTGCAT TATATTTAAC    5400

ATATAATGCA TTGCTAACAA AAATTGGAAT GTATTCTGAA GGTGAAAACA TAAACTATTC    5460

ACCATTTAAA TCTTTAATTT ATTCTCTCTT TTTCTTTTCT TTACTGATGC TTTATAACAA    5520

ATATGAGGAA AAAATATTTC ATCTTTCGAA TATTAAATTC AATATAAGTC TCACATTAAT    5580

TTCCTTTTAT TTGTTTGGTC TTTATATTCC GTTAGCAGAT ATTGTTAATC GATATATTTT    5640

ATTGCTATCA CCGCTTGTTA TTATGTTTCT TACCATTACT AAAAGCAGAT TTCTTTTATT    5700

GTTATTTTTG TTAGCTGCAT TAATTAAATT GTCGATCCAT TTGTTCGATG TAGATGGTAA    5760

TATATATCAG TTCACAATGA GGGGTTATCT TGATTTTTAT AATGTAATGG ATGCGTTGTA    5820

                    Orf5的起始Orf4的终止

TTTTTATTTA GAGAGAAAAA T ATGAAACCA TTAATAACCG TGATAACGGT TGTCTACAAC  5880

GATAGTAAAG GTTTAACAAA AACTATAAAT TCACTCAAGC TACAAACTAA TTTAACAAAT    5940

GTTGAGTTTA TTGTTGTAGA TGGCAACTCG AGTGATTCGA CAATTGAAAT AATAAAAAGT    6000

TCTAAAGTTA TAACAAAGTA TATCATTGAA GATGATCATG GTATATATGA TGCCATGAAT    6060

AAAGGAATTG ATTTGGCTAC AGGTAATTGG ATACTATTTT TGAATGCAGG AGATGTTTTC    6120

TATAATGATG ATGTTTTACG TAAATTAAAT GATACTATAA TGAATCTTCA CGAGAGCATT    6180

AATTTTATTT ATAGTGATTA TCTTTCTGGT GGGGTTATTT ATAAGCAGTT CCTTAGTTTA    6240

GATTTTTTAG CGTCACATAT GATTAATCAT CAAAATATTG TTTATAAGAC TGAACTTCTC    6300

AAAGATAAAG GGTATAGCAC AAAATATAAA TTTTGCTCAG ATTATAAACA CATATTGGAT    6360

AATTATTTTA TTATTAATCC TTATAAGACT GGCTATATTA TAGCAGCATT CGATAATACA    6420

GGAGTTAGTT CACAGGTTGT TAATAAGTAT AAAATGTGGT TGGAGAGATT AAATGCTGTG    6480

TGGTCATCAA AATTATCACT GCAAGCAAAG ATAAAATTAA GTAAA GAGG TTGGGTAGCC    6540

                                            Orf6的起始Orf5的终止

TTACCTTATC AATTCATAAG ATTTGTCATC ATAAAAATGA GAATGCT ATG AATTATAATG  6600

TTGAGTTGTT TATTGGTGTA TGCGTAACTT ACGATGATTT TAATAAATAT AAGCTACAAC    6660

TTCTTTCTTC TTTAAAAAAT CTATATAACT CATTTGCTGG GGATTGTAGT GTTTATATTG    6720

TTATTCAAAG TGAACGTTGT TCTTTTGATT ATCGTTACTC ATATCCAACG GATTGGATCG    6780

AATTTTATGA AACAGATTAT TTTGGAATAT CAAATGCAAG AAACTTATGC ATAGAAGCTT    6840

GTTTAAGAAA AAATGCGAAA TTTATTATCT TTCATGATGC ATCAATTTAT TGGACAAAGT    6900

CTGCAGCAGA GTTTATTCAC AGGTTTAGAA ATAACATCGA GACACCGCGA ATCAACCTCT    6960

TGTTTGATAA AAACTACCAT ATGCAACATG AATTTAATCA TCCTTTAGAC ATTCAAAATA    7020

TTCGTATAGA AAAATGCAAT CCAATTTATA ACTCATATGT TGGTGGTTTT CTATTTAGAG    7080

TTAGTAAAAT AAAGGAATTA AGATTTCATC TTGGCTTTGG TCCGGGTAAA TACACGAAAT    7140

GTAAAAGTGG TGAGGATGTT TTATTTTTAT TCGAGTATTT TGAACGACAG AATATTACCC    7200

TCTACCCTAT AAATAGAAAA ATTGCAGTTA TACATCCACC AAGGCCATCT GATTATTCAA    7260

AGCATTTGTT ATATGCATAT GGTCAAGGGG CATTATTTAG ATTTTTAGTT CATAAATATA    7320

AACGAATGAG TCTATTTTAT GATTTGATAC TTTTTTTTGG GAATGCACTT GTTAGATGTT    7380

TGCTTTTTAA AAAAAAATCA TTTCAAATTT TATATAATAG ATTAAAAGGT TTTATTGGAG    7440

Orf6的终止Orf7的起始

TA TAAT ATGA AAAAAGCATT AATTACAGGC ATTACTGGTC AAGATGGTTC CTACTTGGCA7500

GAATTCCTTC TTGATAAAGG GTATGAAGTG CATGGCATTA AACGTCGTGC ATCTTCGTTT    7560

AACACAGAAC GTGTTGATCA TATTTATCAA GATCGCCACA ACCAAAATCC AAATTTCTTT    7620

CTTCATTATG GTGACTTAAC AGATTCATCA AACTTAATAC GTCTCATCAA AGAAATCCAA    7680

CCAGACGAAG TTTATAACCT TGGCGCTCAG TCTCATGTGG CTGTTTCATT CGAATCACCT    7740

GAATATACTG CTGATGTGGA TGCGATGGGG ACTTTACGTC TGCTGGAAGC GATTCGTATT    7800

TGTGGGCTAG AGAAAAAAAC ACGTTTCTAT CAGGCATCAA CTTCTGAACT CTTTGGCTTA    7860

GTTCAGGAAA TCCCACAGCG AGAAACAACA CCATTCTACC CTCGTTCGCC TTATGCTGTT     7920

GCGAAGATGT ATGCATACTG GATTACTGTA AACTATCGTG AATCCTATGG AATGTACGCC     7980

TGTAACGGTA TTCTTTTCAA CCATGAATCC CCGCGTCGTG GTGAAACATT CGTAACACGT     8040

AAAATCACGC GTGCTATTGC AAATATTTCG CAGGGAATCG AAAAATGTCT CTATCTTGGC     8100

AATATGGATT CACTGCGCGA CTGGGGACAT GCGAAAGATT ACGTGCGTAT GCGGTGGATG     8160

ATGTTGCAAC AAGATCACCC AGAGGATTTT GTAATTGCAA CAGGCAAACA AATTTCCGTA     8220

CGTGAATTTG TTCGTATGTC AGCTAAAGAA GTAGGCCTGG AGTTAGAATT CTCCGGACAA     8280

GGTGTTGATG AAATAGCAAC TGTTGTGAAT AAAACATCTG ACTGTGCTAT TGGTGTTAGT     8340

ATTGGGGATG TAATCGTTCG TGTTGATCCG CGTTATTTCC GTCCTGCAGA AGTTGAAACT     8400

CTTCTTGGTG ATCCAGCAAA AGCCAAAAAA GTATTGGGTT GGGAACCAGA GATTACAGTT     8460

GAAGAGATGT GTGCAGAAAT GGTTGCCAGT GATCTGGCGA AAGCAAAACA GCATGCACTT     8520

                                          Orf7的终止Orf8的起始

CTGAAAAGCC ATGGTTACGA TGTTGCAGTT TCTCTGGAGC GG TAAGGT AT GACAAAGAAA 8580

CGTATCTACG TTGCTGGTCA CCGAGGTATG GTTGGCTCTG CTATTTGCCG TCAATTATCA     8640

CTGCGTGATG ATATCGAATT AGTGGTCAAA ACACACAAAG AACTCGATCT AACCGTACAG     8700

AAAGATGTTG ATGCATTTTT TGAGCAAGAG AAAATTGATC AGGTTTATCT TGCTGCGGCT     8760

AAAGTTGGTG GTATTTATGC CAACAATACA TTTCCGGCAG AATTCATCTA TCAGAATCTC     8820

ATGATTGAGA GCAATATTAT TCATTCAGCT CACAAGGCCG GAATTCAAAA ATTACTTTTT     8880

TTAGGCTCAA GCTGTATTTA TCCTAAGTTT GCAGAGCAGC CGATGAACGA GTCTGAACTT     8940

TTAACGGGCA TACTTGAGCC AACTAATGAG CCATACGCAA TTGCTAAAAT TGCGGGTATA     9000

AAATTATGTG AATCTTATAA CCGGCAATAT GGCCGTGATT ATCGCAGTGT AATGCCTACT     9060

AATCTTTATG GCATAAATGA TAATTTTCAT CCTGAAAACT CTCATGTTAT TCCGGCACTC     9120

ATGCGTAGAT TCCATGAAGC AAAAGAGAGT GGTGCACCAG AGGTTGTTGT TTGGGGAACC     9180

GGAACACCGA TGCGTGAGTT TTTATATGTT GATGATATGG CTGCCGCATC TGTTCATGTA     9240

ATGGAACTTG ATGAAGCAAT TTATCAACAA AATACTCAGC CTATGTTATC TCATATTAAT     9300

GTTGGTACGG GTGTGGATTG TTCTATACGT GAAATGGCTG AAACAATGGC CTCTGTGGTG     9360

GGTTATCAAG GTAAAATTGT TTTTGATGCT ACCAAACCTG ATGGCACTCC GCGTAAACTT     9420

ATGGACGTTA CCCGGCTCAA AAACCTGGGC TGGCAATATC GCTATAATTT GCATGAAGGC     9480

                                                  Orf8的终止Orf9的起始

TTATCATTAA CATATAAATG GTTTATTGAG AATATTAATT CTTTTCGGGG A TAGTT ATGA 9540

ACAAGAGATT GGAATGTGAG TTATTTAAAA CAATAGTTGA GCATACTCCT CTAATCTCGA     9600

TTGATCTCAT AATTAGAAAC GATAAAGGAG AGGCGCTGCT TGGGCAGCGC CTGAATCGCC     9660

CAGCACAAAA TTATTGGTTT GTGCCTGGAG GGCGAATTTA TAAGGATGAG TCATTCGAGG     9720

TTGCATTTAA TCGGATAACA TTTGAAGAGT TGGGCGTTCA AATTAGTCTT AATGACGCCT     9780

TATTTCTTGG GGTGTATGAA CATTTCTACA ATGATAATTT TTCTGAAGCA GAATTTTCTA     9840

CACACTATGT AGTGCATGGA TATGAAATCC AACTTAATCC TCAGCAACTT CACCTACCAA     9900

CGGTCCAGCA TAATTCCTAC AAGTGGTTTG ATGTAGTAAC GTTGCTTAAT AGCACTATAG     9960

                                   Orf9的终止Orf10的起始

TTCATCAATA TACCAAAAAT TATTTTATAC CAAGG TAATA GAT ATGCTAC TTCCCGTTGT10020

CATGGCCGGT GGTTCTGGTA CCAGATTATG GCCTCTTTCA CGTACACTTT ATCCGAAACA    10080

ATTTCTGTCT TTAAATAGTC GTTTAACCAT GTTGCAAGAG ACATTGCGGC GGCTTGACAA    10140

GGTCGAACAT AAACCCGCTT TGGTCATTTG TAACGAATCA CATCGCTTTA TCGTTGCTGA    10200

ACAATTGCGT AAAGAGGGTT TAAAGCATAG CGGTATTTTG CTTGAGCCTG TTGGTCGTAA    10260

TACTGCGCCT GCTGTAGCAC TCGCAGCACT TCAGGCTATG GTAACTGGAG ATGACCCTAT    10320

TCTGTTGGTT CTTGCTGCAG ATCATGAAAT CCAGGATGAG GATAATTTCA TTGCTGCAGT    10380

TCTTGCTGCC AAGAATTTTG CAGAGCAGGG TAAGCTTGTT ACATTTGGTA TTGTTCCAAC    10440

ATCCCCAGAG ACTGGCTATG GTTACATTAA GTCAGGTGAA TCTCTGGATG AACAAGGTTA    10500

TAAAGTTGCA GCTTTTGTTG AAAAACCAGA TCTTCACGTG GCTCAGCGGT ACATATCAGA    10560

AGGCGGTTAT CTTTGGAATA GTGGGATGTT TATGTTCAGA GCGTCTGTAT TTATCGATGA    10620

ACTGAAAAAA TTCCGACCAG ATATTTTAGC CAGTTGCCAA CGCTCCCTGT CCTCTTCGAT    10680

ACAAGATTTA GATTTTATCC GCCTGGATAA CGCTTCATTT TCTTGCTGTC CTGAAGAGTC    10740

TATTGACTAT GCCGTTATGG AAAAAACAGC CGAAGCTGTC GTCGTTCCAT TAAATGCGCA    10800

ATGGAGTGAT GTCGGGTCAT GGTCTGCATT GTGGGAAATA AGTTCAAAAG ACCAAAGCGG    10860

CAATGCCATT CGTGGTGATG TATTGGTTGA AGATGCTACA GATAGTTATC TTTATTCGCA    10920

GCATAGACTT ATTGGTGCCG TGGGCGTAAA GGATTTGGTT GTTGTTGAAA CGAAAGATGC    10980

AGTATTAGTT GCTCATAAAG ATAAAGTTCA GCAAGTTAAA AATATCGTCG CTCAACTAAA    11040

AAAGAATAAT CGAACAGAAT ATTTACAGCA TCGGGAAATT TATCGACCTT GGGGCAGTCA    11100

TGATACTATA GCTGAAGGGG AACGATTCCA GGTAAAGCAT GTGATTGTAT TACCTGGACA    11160

TATTACTGCT AAACAGATCC ATTACCATCG CACTGAGCAT TGGGTAGTTG TATCGGGGAC    11220

AGCTAAAGTT CATCTTGAGG ATAAGACTTA CCTTGTCTCT GAAAATGAAT CAACATATAT    11280

ACCTGTTGGT GTTCCACATG CTATTGAAAA TCCTGGCAAG ATCCCGCTCG AAATAATTGA    11340

GGTTAGATCG GGAGTCTATC TGGAAGAGGA TGATGTTATA AGAGTGTTCT TCTCTGGAGT    11400

    Orf10的终止Orf11的起始

CGGATAC TAA  TGAGAATTTC GATTATTACA GCCACTTATA ATAGTGAAAA AACCCTCCTT11460

GATACATTAC TTTCTCTAGA AAAGCAAACA CATCCAGATA TCGAATATAT AGTTATAGAT    11520

GGAGCATCAA AAGATAATAC AATCAAACTA ATCAAAAGTA ATTGTACAAG AGTTTCAAAA    11580

ATCATTTGCG AACCCGATAA TGGCATTTAT GATGCGCTAA ATAAAGGAAT TCAAGCCGCT    11640

TCGGGTGATG TCATTGGTTT TTTACATTCT GATGACTTAC TTGCTTATGA TGATGTTATT    11700

GCAGATATAG CAAAAACATT TGAAAGTTCA GGATGTGATG CTGTTTATGG CGATTTGGAG    11760

TATGTTGCCC AAAATGATAC GACTAAACGT ATTAGATTAT GGAAAAGTGG CTCATTCAGT    11820

CGTTTGAAGA TGAAACTGGG TTGGATGCCG CCACACCCAT CATTTTATAT GAAACGTGAT    11880

                                                Orf11的终止

TGTTATGGTC AGTTTGGTTG TTTTTCATTA GATATATCGA ATATCTGC TG ATTATGATTC  11940

ATTGTTACGT TATATTTTAA AACAACGCAT TTCAATAGCG TATTTACCGC AAGTATTAGT    12000

GAAGATGCGT GTTGGTGGAA TTAGCAATCG TTCATTATCT TCCATGGTCA ACAAGTCGAT    12060

GGAGGATATT CGTGTTATGA AACAGAATGG TATTTTCTGG CCAATAGCTT TAGCGTATAA    12120

                                        Orf12的起始

AAATCTATCC AAACTTCCTC AATTCATTAA AAAGTAATTA TC ATGTTAAA TGCTAAAAAA  12180

ATCATTACCG ATAGCAATAT TGCTTTCGGA ACTAGTGGGG CGCGTGGTCT CGTTGTCGAT    12240

TTTACCCATG ATGTTTGTGC TGCGTTCACT CATGCGTTTC TTTCTGTTAT TGATGATAAA    12300

TACAATCTTA ATAAAGTTGC CTTAGCAATT GATAACCGGC CAAGCAGTTA CGAAATTGCT    12360

CAGGCATGCG CCTTAGCTAT CAAACAACAT GGGTTCACTG TCGAATATCA TGGTGTAATT    12420

CCTACTCCTG CATTAGCTCA TTATTCTATG CAGAAAAACA TTCCCTGTAT AATGGTCACT    12480

GGGAGCCATA TACCTTTTGA TCGTAATGGT TTGAAATTCT ACAGACCAGA TGGCGAAATC    12540

ACAAAAGAGG ATGAACTAGC AATAGTAAAT AGTGAATATG TCTTTTCTCC TGTAGATGTA    12600

TTACCTCATC TTGAACTAAG CACTCAAGGA GCGGATTGCT ATCTTAAACG TTATGTTTCT    12660

CTTTTTAATT CCGATATTTT GAAAGGAAAA AAAATAGGGA TATATGAACA TTCTAGTGCA    12720

GGACGAGATT TATATGCTCC TCTTTTTAAT CAATTGGGCG CTGAGGTCAT TTCCCTTGGC    12780

AGAAGTGATG AATTCGTCCC TATTGACACT GAAGCAGTAA GTGATGAAGA TCGTATACTT    12840

GCAAGAGAGT GGTCTAAAAA ATATAATCTT GATGCTATTT TCTCTACAGA TGGCGATGGT    12900

GATCGTCCCT TAGTTGCCGA TGAAAATGGT GAATGGCTAA GAGGCGATAT TCTGGGATTA    12960

CTTACTGCTA TTGAACTTAA TATCAAGGCG TTGGCTATTC CAGTCAGTTG TAATACTGCA    13020

ATTGAACAAT CTAACAAATT TGCAAGTGTA CAACGGACGA AAATAGGCTC TCCTTATGTG    13080

ATTGCAGCGT TTGCGGATCT TGCTAAGCAA TTTGATTCAG TCGCTGGTTT TGAAGCTAAT    13140

GGTGGTTTTC TGCTTGCCTC CGATTTACAA ATAAATGGCA AGGAATTAAA TTCATTACCT    13200

ACACGAGATG CTGTGTTACC AGCATTAATG CTCTTAATAG CTTCACGCAA CAGTACCATC    13260

TCTCAACTGG TTAATAATCT TCCACAGCGA TTCACTTGGT CAGATAGGGT TAAAGATGTC    13320

CCTTCAGAGT CAAGTCAACA TATTATAAAA AATGCCATAT TGTCACCCAA TAATTTCTTT    13380

AATAGCTTAG GATATGAATC ATTATCCTGT TCCGCTATTG ATGAAACGGA TGGTGCAAGA    13440

TTTACTTTAA ATAATGGTGA TATTATACAC CTCCGTCCTT CCGGTAATGC CCCAGAACTC    13500

CGTTGTTATG CTGAAGCCAG TAATGAAAAT CAGGCTAAGC AATATGTTAC GAAAGTCCTT    13560

                      Orf12的终止

GGAAACATTA CCTCTTTGAT TTCT TGAATT ATAAAAAATG CCATATTGTC ACCCAATAAT  13620

TTCTTTAATA GCTTAGGATA TGAATCATTA TCCTGTTCCG CTATTGATGA AACGGATGGT    13680

GCAAGATTTA CTTTAAATAA TGGTGATATT ATACACCTCC GTCCTTCCGG TAATGCCCCA    13740

GAACTCCGTT GTTATGCTGA AGCCAGTAAT GAAAATCAGG CTAAGCAATA TGTTACGAAA    13800

GTCCTTGGAA ACATTACCTC TTTGATTTCT TGATGTTATA GATTTATCTA CGTTTATATG    13860

CGTGCGTAGG TTTGGTTACA AGTAGATGCC GATATAAAGG AAGATTAACG ATATTCGTTG    13920

TATTAGTACT ACACACATTC GTGCAACTTG AGATAACATC TCAATCATAT TCAAGTCGCG    13980

CATACATCGC GCTGAACACC CCCTGACAGG AGTAAACAAT GTCAAAGCAA CAGATCGGCG    14040

TCGTCGGTAT GGCAGTGATG GGGCGCAACC TTGCGCTGAA CATCGAAAGC CGTGGTTATA    14100

CCGTCTCTAT TTTCAACCGT TCCCGTGAAA AAACGGAAGA AGTGATTGCC GAGAACCCAG    14160

GCAAGAAACT GGTTCCTTAC TACACGGTGA AAGAGTTTGT TGAATCTCTG GAAACGCCTC    14220

GTCGCATCCT GTTAATGGTG AAAGCAGGTG CAGGCACGGA TGCTGCTATT GATTCCCTGA    14280

AACCATACCT CGATAAAGGT GACATCATCA TTGATGGTGG TAATACCTTC TTCCAGGACA    14340

CCATTCGTCG TAACCGTGAG CTTTCTGCAG AAGGCTTTAA CTTCATCGGT ACCGGTGTTT    14400

CCGGTGGTGA AGAAGGCGCG CTGAAAGGTC CTTCAATCAT GCCTGGCGGC CAGAAAGAAG    14460

CCTATGAACT GGTTGCCCCG ATCCTGACTA AAATCGCCGC TGTGGCCGAA GATGGCGAAC    14520

CGTGCGTAAC CTATATTGGT GCCGATGGCG CAGGCCATTA TGTGAAGATG GTTCACAACG  14580

GTATTGAATA CGGAGATATG CAACTCATTG CTGAAGCCTA TTCTCTGCTT AAAGGTGGCC  14640

TGAACCTCTC CAATGAAGAA CTGGCGCAGA CCTTTACCGA GTGGAATAAC GGTGAACTGA  14700

GCAGCTACCT AATCGACATT ACCAAAGACA TCTTCACTAA AAAAGATGAA GACGGTAACT  14760

ACCTGGTTGA TGTGATTCTG GATGAAGCGG CTAACAAAGG TACCGGTAAA TGGACCAGCC  14820

AGAGCGCGCT GGATCTCGGT GAACCGCTGT CGCTGATTAC CGAGTCTGTG TTTGCTCGTT  14880

ATATCTCTTC TCTGAAAGAG CAGCGCGTTG CCGCGTCTAA AGTTCTCTCT GGCCCGAAAG  14940

CACAGCCAGC AGGCGACAAG ACTGAATTCA TCGAAAAAGT TCGTCGTGCG CTGTATCTGG  15000

GCAAAATCGT TTCTTACGCT CAGGGCTTCT CTCAGCTGCG TGCTGCGTCT GAAGAGTACA  15060

ACTGGGATCT GAATTACGGC GAAATCGCGA AGATTTTCCG TGCTGGTTGC ATCATCCGTG  15120

CGCAGTTCCT GCAGAAAATC ACTGATGCAT ATGCCGAAAA TCCGCAGATC GCTAACCTGC  15180

TGCTGGCTCC GTACTTTAAA CAAATCGCCG GTGACTACCA GCAGGCGCTG CGCGATGTCG  15240

TCGCTTATGC AGTACAGAAC GGTATCCCGG TTCCGACCTT CGCCGCTGCG GTTGCCTATT  15300

ACGACAGCTA CCGTGCTGCA GTACTGCCTG CGAACTTGAT CCAGGCACAG CGCGACTATG  15360

ACGATTGTAG CTGCAGA                                                 15377

以上仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡依本发明技术实质对以上实施例作修改、等同变化与修饰，均属本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1、一种对大肠杆菌O41的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于，其wzx序列为SEQ ID NO：1中的1114至2433碱基的核苷酸或wzy序列为SEQ IDNO：1中的4649至5845碱基的核苷酸或者具有上述序列插入、缺失或取代一个或多个核苷酸，但保持wzx、wzy核苷酸特异性检测大肠杆菌O41的O-抗原功能的寡核苷酸。

2、一种对大肠杆菌O41的O-抗原高度特异的寡核苷酸，其特征在于，其为源于wzx基因的寡核苷酸对：SEQ ID NO：1中的1805至1822碱基的核苷酸和2393至2410碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的1510至1527碱基的核苷酸和2106至2123碱基的核苷酸；或源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQID NO：1中的5012至5029碱基的核苷酸和5406至5389碱基的核苷酸，SEQID NO：1中的5272至5289碱基的核苷酸和5645至5662碱基的核苷酸。

3、权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O41型的O-抗原特异的寡核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原中的应用。

4、按照权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O41型的O-抗原特异的寡核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测体外及环境中的细菌。