CN1261575C - 对大肠杆菌o39的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O39(Escherichia coli O39)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O39中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长17095个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O39的O-抗原基因簇中的寡糖单位处理基因(包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因)的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O39的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O39的方法。

Description

对大肠杆菌O39的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O39(Escherichia coli O39)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O39中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O39并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank et al(1987)“The function of antibody and complement in the lysis of bacteria”.RevInfect Dis 177：1750-1753.Pluschke G et al“Role of the capsule andthe O-antigen in resistance of O18：K1Escherichia coli tocomplement-meduiated king”.J Bacteriol 42：907-913]。大肠杆菌是一个种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]。

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica majors erogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiologicalinvestigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused bydry fermented sausage contaminated with Shiga-like toxin producingEscherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.and Reeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111”.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O39的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O39的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。

本发明的一个目的是提供了大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的基因：转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf9、orf11、orf12基因；糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlC、rmlA、manB，manC、vioA，vioB，它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O39的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因，包括orf8、orf9、orf11、orf12基因。它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O39的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O39的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O39的O-抗原也是高度特异的。

本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O39的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O39。

本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O39的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQID NO：1所示的分离的核苷酸，全长17095个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O39型的O-抗原特异的核苷酸，其中包括命名为rmlBrmlD，rmlA，rmlC，vioA，vioB，wzx，orf8，orf9，wzy，orf11，orf12，manB，manC的14个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O39的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括：转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf9、orf11、orf12基因。其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO：1中的4675至6234碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO：1中的7110至8147碱基的核苷酸；所述的orf6基因是SEQ ID NO：1中的6234至7100碱基的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO：1中的8147至8974碱基的核苷酸；orf9基因是SEQ ID NO：1中的8976至9728碱基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO：1中的9725至10837碱基的核苷酸；orf11基因是SEQ ID NO：1中的10849至12459碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O39的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O39的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的6313至6330碱基的核苷酸和7001至7018碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的6794至6811碱基的核苷酸和7443至7460碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQID NO：1中的10155至10173碱基的核苷酸和10866至10883碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的10227至10244碱基的核苷酸和10626至10643碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O39型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。

前述的对大肠杆菌O39型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O39型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。

前述的对大肠杆菌O39型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌。

前述的对大肠杆菌O39的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O39型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O39型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O39型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O39型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O39型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O39型的O-抗原的高度特异性；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O39，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O39的灵敏度。

前述的对大肠杆菌O39的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O39，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O39中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O39的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAAGAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAGTCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库；反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10³的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O39的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O39的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到14个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O39的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因设计引物；在每个基因内各设计两对引物，每对引物分布在相应基因内不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR，所有引物在大肠杆菌O39中得到阳性结果，在其他组中没有扩增到任何大小正确的带，也就是，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O39及其O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：将大肠杆菌O39的冻存菌液接种到有LB培养基的三角瓶中，30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时至饱和，取培养好的菌液稀释，取稀释菌液涂布LB琼脂平板，30℃至40℃，培养数小时计数，计算原液中活菌浓度；在5份重量均为20g的生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入LB培养基，过滤，过滤液于30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时；从培养好的菌液中取数ml于6,000g离心数分钟，去上清，加MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100℃沸水中煮数分钟，裂解液于12,000g离心数分钟，取上清做为PCR模板；用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的6313至6330碱基的核苷酸和7001至7018碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的6794至6811碱基的核苷酸和7443至7460碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的10155至10173碱基的核苷酸和10866至10883碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的10227至10244碱基的核苷酸和10626至10643碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环；反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性；参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果；参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果；说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O39的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长17095个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，它包括命名为rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，vioA，vioB，wzx，orf8，orf9，wzy，orf11，orf12，manB，manC的14个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O39的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf8、orf9、orf11、orf12基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括rm1B、rmlD、rmlC、rmlA。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因对大肠杆菌O39的O-抗原是特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O39的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基转移酶基因包括orf8、orf9、orf11、orf12基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源于大肠杆菌O39的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O39为模板进行的PGR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O39及它们的O-抗原是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O39的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O39中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的6289至7767碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的9760至11007碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O39都是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf8、orf9、orf11、orf12基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf8、orf9、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O39。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf8、orf9、orf11、orf12基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊细菌O-抗原是由大肠杆菌O39表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf8、orf9、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O39。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因包括orf8、orf9、orf11、orf12基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf8、orf9、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O39。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf8、orf9、orf11、orf12基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O39的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取。

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O39，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O39中的O-抗原基因簇

以大肠杆菌O39的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库。

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10³的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O39的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序。

从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到，最后获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析。

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O39的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到14个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1与Shigella boydii的dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱氢酶在361个氨基酸中有97％的相同性，98％的相似性。dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱氢酶由rmlB基因编码，高度的相同性表明orf1也是rmlB基因，命名为rmlB。Orf2与Shigella boydii的dTDP-D-葡萄糖-4-鼠李糖还原酶在299个氨基酸中有94％的相同性，97％的相似性。dTDP-D-葡萄糖-4-鼠李糖还原酶由rmlD基因编码，高度的相同性表明orf2也是rmlD基因，命名为rmlD。Orf3与Shigellaboydii的葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶在292个氨基酸中有98％的相同性，98％的相似性。葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶由rmlA基因编码，高度的相同性表明orf3也是rmlA基因，命名为rmlA。Orf4与Escherichia coli的dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3，5-变位酶在173个氨基酸中有72％的相同性，85％的相似性。dTDP-D-葡萄糖4，6-脱氢酶由rmlC基因编码，较高的相同性表明orf4也是rmlC基因，命名为rmlC。这四个基因共同合成鼠李糖。说明在大肠杆菌O39的O-抗原中有鼠李糖。Orf5与Escherichia coli的dTDP-4-amino-4，6-dideoxy-D-glucose aminotransferase在363个氨基酸中有67％的相同性，77％的相似性，dTDP-4-amino-4，6-dideoxy-D-glucoseaminotransferase由vioA基因编码，高度的相同性表明orf5也是vioA基因，命名为vioA。Orf6与Escherichia coli的dTDP-viosamine N-acetylase在192个氨基酸中有55％的相同性，73％的相似性，dTDP-viosamine N-acetylase由vioB基因编码，高度的相同性表明orf6也是vioB基因，命名为vioB。Orf7与Escherichia coli的的O-抗原转运酶Wzx在461个氨基酸的序列中有25％的相同性，50％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法发现orf7有14个潜在的穿膜区，Wzx蛋白的氨基端有一个大约40个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf7是wzx基因，命名为wzx。Orf8与Geobacter sulfurreducens PCA的糖基转移酶在286个氨基酸中有25％的相同性，50％的相似性，推测orf8也是一个糖基转移酶，将orf8暂命名为orf8。Orf10与Escherichia coli的O-抗原聚合酶在407个氨基酸的序列中有26％的相同性，47％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis ofmembrane and surface protein sequences with the hydrophobic momentplot.J.Mol.Biol.179：125-142]发现orf7有9个潜在的穿膜区，它与许多Wzy蛋白有相似的二级结构，有一个大的loop，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以确定orf9是wzy基因，命名为wzy。Orf9与Brucella melitensis16M的糖基转移酶在307个氨基酸中有30％的相同性，51％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf9与糖基转移酶家族1的保守的功能域PF00534的Evalue为4.6×e^-11，推测orf9也是一个糖基转移酶，暂命名为orf9。Orf11与Salmonella typhimurium LT2的糖基转移酶在236个氨基酸中有27％的相同性，44％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf11与糖基转移酶家族1的保守的功能域PF00534的Evalue为0.00047，因此推测orf11也是一个糖基转移酶，暂命名为orf11。Orf12与Vibriovulnificus的糖基转移酶在243个氨基酸的序列中有44％的相同性，64％的相似性。在genbank中寻找保守的功能域，发现orf12与糖基转移酶家族的保守的功能域PF00535的Evalue为0.0021，推测orf12也是一个糖基转移酶，暂命名为orf12。Orf13与Escherichia coli的GDP-mannose pyrophosphorylase在476个氨基酸中有99％的相同性，100％的相似性，GDP-mannose pyrophosphorylase由manC基因编码，高度的相同性表明orf13也是manC基因，命名为manC。Orf14与Escherichia coli的Phosphomannomutase在459个氨基酸中有99％的相同性，99％的相似性，Phosphomannomutase由manB基因编码，高度的相同性表明orf14也是manB基因，命名为manB。

实施例6：特异基因的筛选。

针对大肠杆菌O39的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

在表1中列出了大肠杆菌O39的O抗原基因簇的转运酶基因、聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166种血清型的大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166种血清型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。

表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共13组。它们的来源都列于表中。

在第12组中含有大肠杆菌O39的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是不含有大肠杆菌O39的基因组DNA，作为阴性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性2分钟后，95℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ul PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第12组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O39及其O-抗原都是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O39中筛选到对大肠杆菌O39的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O39的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O39是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O39，并能鉴定它们的O-抗原。

实施例7：引物灵敏度的检测。

购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O39的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的6313至6330碱基的核苷酸和7001至7018碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的6794至6811碱基的核苷酸和7443至7460碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的10155至10173碱基的核苷酸和10866至10883碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的10227至10244碱基的核苷酸和10626至10643碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O39的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O39的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

根据本发明的对大肠杆菌O39型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表3是大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的结构，共由14个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O39的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大肠杆菌O39的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

              SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>对大肠秆菌O39的O-抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O39的O-抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>17095

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc atgcgtccaa gaacgcggtc      60

gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaacagcg cgtaaagcgc     120

caactgcttg cggaagtgca gtccatctgt ccaccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt     180

cagggcgaac ctttaggttt gggtcactcc attttatgtg cacgacccgc cattggtgac     240

aacccatttg tcgtggtgct gccagacgtt gttatcgatg acgccagtgc cgacccgctg     300

cgctacaacc ttgcagccat gattgcgcgc ttcaacgaaa cgggccgtag ccaggtgctg     360

gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agagccgctg     420

gaccgcgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag     480

acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgcaga tatttggccg     540

gaacttgaac gcactcagcc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccatcgct     600

gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgcc atgctgatga caggtgacag ctacgactgc     660

ggtaaaaaaa tgggttatat gcaggcgttt gtgaagtatg gactacgcaa cctgaaagaa     720

ggagcgaagt tccgcaaagg cattgagaaa ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccga     780

atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaagat tcgtggcgaa agtaattgtt     840

gcgaattttc ctgccgttgt tttatataaa caatcagaat aacaacgagt tagcaatagg     900

attttagtca aagttttcca ggattttcct tgtttccaga gcggattggt aagacaatta     960

gcgtttaaat ttttcgggtt tagcgcgagt gggtaacgct cgctacatcg taggcatgca    1020

tgcagtgctc tggtagctgt aaagccaggg gcggtagcgt gcattaatac ctctattaat    1080

caaactgaga gccgcttatt tcacagcatg ctctgaagta atatggaata ataaagtgaa    1140

gatacttgtt actggtggcg caggatttat tggttctgct gtagttcgtc acattataaa    1200

taatactcag gatagtgttg ttaatgtcga taaattaacg tacgccggaa acctggaatc    1260

acttgctgat gtttctgact ctgaacgcta tgtttttgaa catgcggata tttgcgatgc    1320

tgctgcaatg gcgcggattt ttgctcagca tcagccggat gcagtgatgc acctggctgc    1380

tgaaagccat gtggatcgtt caattacagg ccctgcggca tttattgaaa ccaatattgt    1440

tggtacttat gtccttttgg aagcggctcg caattactgg tctgctcttg atggcgacaa    1500

gaaaaatagc ttccgttttc atcatatttc tactgacgaa gtctatggtg atttgcctca    1560

tcctgacgaa gtaaataata aagaacaatt acccctcttt actgagacga cagcttacgc    1620

gccaagtagc ccatattctg cttcgaaagc atcaagcgat catttagtcc gcgcttggaa    1680

acgtacctat ggtttaccga ccattgtgac taattgctct aacaattatg gtccttatca    1740

tttcccggaa aaattgattc cattggttat tctgaatgct ctggaaggta aaggattacc    1800

tatttatggt aaaggggatc aaattcgcga ctggctgtat gttgaagatc atgcgcgtgc    1860

gttatatacc gtcgtaaccg aaggtaaagc gggtgaaact tataacattg gtggacacaa    1920

cgaaaagaaa aacatcgatg tagtgctcac tatttgtgat ttgtcggatg agattgtacc    1980

gaaagagaaa tcttaccgcg agcaaattac ttatgttgcc gatcgcccgg gacacgatcg    2040

ccgttatgcg attgatgcag agaagattag ccgcgaattg ggctggaaac cgcaggaaac    2100

gtttgagagc gggattcgta aaacggtgga atggtacctg gctaatgcaa aatgggtcga    2160

gaatgtgaaa agtggtgcct atcaatcgtg gattgaacag aactatgagg gccgccagta    2220

atgaatattc tccttttcgg caaaacaggg caggtaggtt gggaactaca gcgtgctctg    2280

gcacctttgg gtaatttgat tgctcttgat gttcactcca ctgattattg tggtgatttt    2340

agtaatcctg aaggtgtggc tgaaaccgtc aaaaaaattc gccctgatgt aattgttaat    2400

gctgcggctc ataccgcagt agataaggct gagtcagaac ccgaatttgc acaattactc    2460

aatgcgacca gcgttgaatc aattgccaaa gcggctaatg aagttggggc ctgggtaatt    2520

cattactcaa ctgactacgt atttccggga accggtgaaa taccatggct ggagacggat    2580

gcaaccgcac cgctaaatgt ttacggtgaa accaagttag ccggagaaaa agcgttacag    2640

gaacattgcg cgaagcatct tattttccgt accagctggg tatacgcagg taaaggaaac    2700

aattttgcca agacaatgtt acgtctggca aaagagcgcg aagaattagc tgttattaat    2760

gatcagtttg gtgcaccaac aggtgctgaa ctgctggctg attgtacggc acatgcaatt    2820

cgtatggcac tgaataaacc agaagtcgca ggcttgtacc atctggtagc cactggtacc    2880

acaacctggc acgattatgc tgtgctggtt tttgaagagg cacgaaaagc aggtattccc    2940

cttgcactca acaagctcaa ggcagtacca acaacagcct atcctacacc agctcgtcgt    3000

ccacataact ctcgccttaa tacagaaaaa tttcagcaaa attttgcgct tgttttgcct    3060

gactggcaag ttggcgtgaa acgcatgctc aacgaattat taacgactac agcaatttaa    3120

tagtttttgc atcttgttcg tgatgatgga gcaagatgaa ttaaaaggaa tgatgaaatg    3180

aaaacgccta aaggtattat tttagcgggt ggctctggta ctcgtcttta tcctgtgact    3240

atggctgtca gtaaacagct attacctatt tatgataagc cgatgatcta ttacccgctc    3300

tctacactga tgttggcggg tattcgcgat attctgatta tcagtacgcc acaggatact    3360

cctcgttttc aacaactgct gggtgacggt agccagtggg ggctaaatct tcagtacaaa    3420

gtgcaaccga ctccagatgg gcttgcgcag gcgtttatta tcggtgaaga gtttatcggt    3480

ggtgatgatt gtgctttggt tctaggtgat aatatctttt acggtcacga tctgccgaag    3540

ttaatggata ccgctgttaa caaagaaagt ggtgcaacgg tatttgccta tcacgttaat    3600

gatcctgaac gctatggtgt cgttgagttt gataaaaacg gtacggcaat aagcctggaa    3660

gaaaaaccgc tacaaccaaa aagtaattat gcggtaaccg ggctttattt ctatgataac    3720

gacgttgtcg aaatggcgaa aaaccttaag ccttctgccc gtggtgaact ggaaattacc    3780

gatattaacc gtatttatat ggaacagggg cgtttatccg ttgccatgat ggggcgtggt    3840

tatgcatggc tggatacggg gacacatcag agtcttattg aagcaagcaa cttcattgcc    3900

accattgaag agcgccaggg actaaaggtt tcctgcccag aagaaattgc ttaccgtaaa    3960

gggtttattg atgcagagca ggtgaaagca ttagctgagc cgctgaaaaa aaatgcttat    4020

ggccagtatc tgctgaaaat gattaaaggt tattaataaa atgaacgtaa ttaaaacaga    4080

aattccagat gtactgattt ttgaaccgaa agtttttagt gatgagcgtg gtttcttttt    4140

cgagagcttt aaccagaaga tttttgagga agctgtaggc cgcaaagttg aatttgttca    4200

agataaccat tcgaagtcca ggaaaggtgt tttacgcgga ttgcattatc agttagaacc    4260

ttatgcgcaa ggaaaattgg tacgctgcgt tgttggtgag gtttttgatg ttgcggttga    4320

tattcgtaaa tcatcaccta cttttggcaa gtgggttggg gtgaatttat ctgctgagaa    4380

taagcgccag ttgtggatcc ctgaaggatt tgcgcatgga tttttaacct taaaagataa    4440

tactgaaata ttgtacaaga ctacaagtta ttattcacct gagtatgaaa gatctatcat    4500

atggaatgat gaagatcttg taattaagtg gcctaatgac ccttgtgtca tctcccataa    4560

agatagtttg gcacaatcat ttgctattat tagaaattaa tgaggaatat atgagtaaga    4620

agattccagt tacacaacca tttcttcctg agttatcgga gtttatacca ttcctagaga    4680

aaatatggga aaataaatgg ttgacaaata atggtccatt tcaccaacaa cttgaaagag    4740

aattatgtga atttcttaac gttaaacata tatctttatt tacaaatgcg acaattgctc    4800

ttgtaacagc acttcaagcc ctaagagtga aaggtgaagt gattacaact ccatattcat    4860

ttgttgcaac ctcacattct atattatgga acaatcttac gccagtattt gtcgatatta    4920

aagaaggggg atttaatatt gatcctaaaa aaatagaaga ggccataact ccaaatacaa    4980

cagctattat gcctgttcat tgttatggtt atccatgcga agtcaatgaa attcaaagga    5040

ttgctgataa ttatggacta aaagtaatat acgatgcagc tcatgctttt gggattaatt    5100

atggggatga aagtatttta aattttggcg atctttcaat tttaagcttt catgcaacaa    5160

aagtttttaa cacatttgag gggggggcga taatatgtcc tgatctaaaa acaaaagaga    5220

gaatagatag attgaaaaat tttgggtttg tagatgagtt aacagtgact gcagctggaa    5280

taaatgggaa aatgagcgag gtaaattcag cgtttggatt actccagctt aaatatataa    5340

atgaagcaat cggaaaaaga agtagaattg attcacaata cagaaatgat cttagtaata    5400

ttgaagaaat cataattcct gctaaaagta ctgagagcaa tagtaatttt tcgtacttcc    5460

caattttagt ccaatcagaa tctggtttca gtagagatgg actgtatgat catcttaaag    5520

aaaatggaat actctcgaga aaatattttt acccactaat tagtaatatg ccgatgtata    5580

agagaaacga atcttctctt gtagataatt tgaaaaatgc aaatgaaaca gcatctaaag    5640

tattatgttt acccatatat gcatccatga atagagacga atatgtctat ataatttcca    5700

aagtgaagga gtatttttca tgagttattt aacaagagat gagattgaaa attttggatt    5760

taataaaata ggtagaaatg tattaatatc agataaaacc tcgatataca atccacaaaa    5820

aatatcaatc ggtgataatg ttaggattga cgatttttgt attttgtcag caggtgatgg    5880

tggtatagaa attggaaatt atgtgcatat tgcatcatat tcgtccttaa tagggaagga    5940

aaaaattaaa ttaggagatt atagcggtct atcttcgcgt gtttctattt attccagtag    6000

tgatgattat tctggacttt ggatgactaa tccaacggtt ccatctacgt ttaccaatgt    6060

tgtttcaaaa cctgtaattc ttgagaagca tgttattgta ggctgtggag cagttatctt    6120

accgggagta cttatccaag aaggtgctgc aattgcagca ctttcacttg ttaaaaaatc    6180

gtgtgagcct ttttatatct atcatggtaa ccctgcaaaa aaaatttttg cgagaaaaaa    6240

agtaataaag aatcttgaga gaaaccttga agaatttgat aatttaaaat gtcaaaaata    6300

actaagaata tattcgcaaa ttatttaggg gtggtgatta ccaccgctct ttctttttta    6360

gttgtaccat tttatttaaa gatattaggt aaggattcct ttggtttaat aggaatagca    6420

tcgcttattc agggctgggt aatgttgtta aattcaggat tagcgcctgt aactggacga    6480

gaagcagcaa aagcctatgc tataggtaat tcttggcgtg aagctgcaat atttttcaga    6540

acagttgatg ttttcttaat atcattgtca ttaattgttt ttgtaatttt ttatatttca    6600

agaggttggt tatcaaatgt ctggatagaa agctcatcat taaattcctc tactataagt    6660

ttggcattat gtcttcttat tgcaatgacg tcaattcgac ttttaacaag tattacgaga    6720

ggcatattgg ctaacataga taggcaaata tggttaaata ataatttaat tatatttagc    6780

ttacttagat ttgctgctag tattccattg ctatatgcct acccgggcat aaactatctt    6840

tttatatggt ggctatttgt atcactactt gaatatttta gtattcagta taaaacatgg    6900

tcaataatac cagttaaaat taattttttt atttttgatt ttttaagtat aaaaaaacgc    6960

tggaaaatga tagtagcatt ggcatcaact agtttgatat gggtgctgat aacaaatacg    7020

gacaaattga ttctgtctac atatctctcg cttgagagtt acggttttta tagcattgca    7080

acattacttt caagtagtat tatcatatta gcccaaccta ttgcacaagc atttcagcca    7140

aagatgactt cagcttttac tcacggaggt attgaaaatg ctgaaatgat cttaagggaa     7200

gcaactaaat ggatcgttta tctcatttat cctatcgttg ttattctgtg tttatatcca     7260

aatcaaatta tatttgtttg gacaggagat agtgatgcaa tgcagcaggc tggtgatttt     7320

ctcattgggt acacaatagg aaatatattt attgcccttg gttcaatact atatgctttt     7380

caagtctcaa tcggtatagt taggaaacat ctacagggga atataatctt gtgtgtttgc     7440

tatctcccac taataccatt tattgtaacc aaatatggag cgataggtat atctatatta     7500

tgggcgattg tgaattttat atattttgtt ttatggaact tacatttgtt aaaaaaaatc     7560

acaaaaacac tttaccctca gtgggttctt attgaaacat tgcttccatt aataatgtta     7620

tttttaataa tgacatttgt caggtatttt ttcgttctag acggacagta ttcaagattt     7680

attctatttt tgttgctctg tttattaact tgcgtggcct ttgtaatcaa ccttttaaat     7740

atgaagttat taaaatatag gaactaatgg ctatgacaaa atatgcacca attaccgttt     7800

atacgtataa tcgttatgat cattttacta aaacaattga ggcactgcgt aataattatt     7860

tagccgaaaa ctctattcta tatgtggtct cagatgctgc tgctaatgaa aaagatgaaa     7920

atttagtaaa aaaaatccga gactattcaa aaaaaatatc aggatttaaa tcggttgaat     7980

taatttttag aaaggaaaat ttaggtcctc ttcaaagcat ttatggtgcc gagcgtgaaa     8040

ttattgatag tcacggaaga ataatatcaa tggaagatga taatattaca tcaagaaatt     8100

ttttaaactt tatgaatcaa ggacttgaac gctttgaata tgagcagtca gtttattcaa     8160

tttgtggcta ttgcccagca gttaaacgct ctactaaaga gcttggtgat atttggttgt     8220

atccttggaa tatatcttgg ggatatgcta cttggaaaca aaaatacgat cttctaaatc     8280

cacttattaa taattatgaa caattaaaga cagaggggat tttaagaaga gttaatagaa     8340

tgggggggtt atatattaca gactctctaa aaagagatta tatgaagaca gcatatttcc     8400

ccgatgcaat attatgctgt aatatgacta agttagatat ggtttccgtt atcccttcca     8460

tttcgaaagt ttttaacatt ggaaatgatg gttcggggaa tagtaaaggt gctaatacta     8520

ataaatacga tgttctgctg gatgaaggag ctaaaactat atttgatttc aatatcacaa     8580

aacaatcact ttccgctgaa atgactaaag aagttgcaag attttataat gggagactag     8640

tgacaagact agcaagaaaa attggcatat atgatcgtct tttatcatta aaacaaaatt     8700

atggataata aattatggct ttattgataa tttcacctag tctaataaat ggcgggcacg     8760

aatttcagag tattgagttt ataaacgaac tatataaaac gagaaaatca atttttgtta     8820

gttgtgcaaa tagttttttt tacgaaaata ttaatatttc agaagaagat aaagaaatat     8880

ttgaatatcc tcaaggcggg attattgatt tattctgcag ttttaatagg gtgaaaaaac     8940

atctcaaaac acatatccat ggcgtaaccg atgttttaat ttgtggagga acaatagaag     9000

taattatttt ttattcacat ataataaaat ctattgataa aaaaattagg gtaattggtt     9060

atgtaccaat ggtagttgat aaaaaaattc tcaggccagt gttaggtacc agtgcaaaat     9120

tatgtattaa aattttatgt ggtaaagttg atgaaataat cacaattaac aagattcaat     9180

catatttgtt taatgttttt tataataaaa aaacacttgt attacctaat aagctgaaaa     9240

aaattagttg tgttacaagt gattatggct ttcgactaat atattgtgga aggctagata     9300

atgttcagaa aaacataata gaactaatct ttatgcttga taggataaat aatcctgtta     9360

aagaatttat tatcatcggt gatggccccg atttccaaaa aatattagag ataagtaata     9420

agacaaggaa tattaaagtt aaaattattg gatgggctag tgaggaggat ataaattcga     9480

ttcttggaat aaatgatatt ttgatcatga attctagatg ggagggggaa cctcttgtta     9540

ttagagaatt tattgatagg aaccttcctg tcatttcacg tgatataccc ggagttcgtg     9600

gtgttacttt aagaaaatat agatataata atgaaaatga acttgaggaa attttaaata     9660

atcatgttgg gagatttgaa gtaaaaaaac aaataaaaga agaaaatatt atgaggatgc     9720

gttctagggt aattgctatt attacaggta ggatatgaaa tgtttctctt taagaaacct     9780

aaatttatat ttttattact tttcattata tcaaacattt actcatgttt atattttatt     9840

aacaccgggc atttgttagg agaagtttct gactttaatt tcaaaagtga agaaacatct     9900

atttatataa atttgcttat tatatttttt tatctttttt tcttggtcgt tatttttagg     9960

tttttttcta aaatacatgt aaattcttta ttggataacg attgcagaat aaaatggtgt    10020

aaagcagagt ttttctgggg gaagttatta ataataattc agattttgtt tattttttat    10080

ttttgcttaa caaacacatt tggcgcaaat agcgttaata gagatggtgg cataatatca    10140

gctttatggg ttgtattatc accagacaat ctttttttta tctattacag catatttagg    10200

aaaagtagat atgctaaata taatttattg ctcgcgattc tttctaatat attgagggga    10260

tggagcggaa tactgatttt tattgttttt atcgaattat gttatagata tcgggaggga    10320

aaattaaaaa taaggcttct ctcgaagatt tgtgggataa tgttcctact gtatcctgtg    10380

atattggctg ttaagtatgg cattcgtgat tcatttttga ctaacagcaa tttttgggaa    10440

agttttgaca gatcttggtt atatgtattt aacaataatg gtgtgttagg atacatcaat    10500

ggtcttttgt ttggaattga acaatttttt agtagaatac aacttttttc gaatgcagtt    10560

gttgtttatt ctttgaaaca tgaattagcc aattttgtta tcaccaataa agtaacgagt    10620

tattggcaag agggtattta tggtattatc tggaatagga tatttgattt accaacgagt    10680

tataacttgg gcgaagtatt ggcaaatttc attgatccac aaagtatcat aggaagctgg    10740

aattctaacc caacattttt atcttggctg tttattgatc catttcagat aggaatctat    10800

ctattattta caattgcgct ttgttttata actatgtttt tagtaaaaaa aataacatcg    10860

tcaactttgt cgctagatat gctctggtat atgtggctga tccttattat gcccggttgg    10920

tttgcttcat taatattatt tcttaatact ttaataattt tttatgttat tacatttata    10980

aaattaaacg taacaataga gaggtagttg tagtggggaa aatagttata aatctttggc    11040

atataaaaaa tactaatggc ttattttatt atgccttgga ttatattgat catattgctg    11100

cagaaaaaat aattttatta aatgttaact ttccaaattc tgaagctatt gaacgactga    11160

gtggaaataa tgaaatatta aagctgagtt tgttaaacta tgtcatgttt atgtttaaat    11220

gttttatcga acataattta atttttactc ctagctctca tcccattcct tttataaaaa    11280

aacagttagt tattgtgcat gacatgtatc cttttcatgg ctttaaaggg aacctaaaaa    11340

aaatattgtt ctgtatttct gcgaaaatat ctcgatgtaa aattggttat ataaatagat    11400

ctcaagtttt acctgcatta ctcaacttgg gaattaatcc caggcaactt gtatttgctc    11460

caaacaaatt tcctgattta ttctcaaatc ctttaaatag aattccatat gataagaaaa    11520

aaattattgt ggggctagtg ggtacagatt cagataaaaa gaactaccat gaacttttaa    11580

gctcaattcg tcataggaaa ttgcatggac agtttaatct catgatctat gggcatgaga    11640

ctccttactt caaacgcgta aatagtgact ttcctgatct aaatatttca ttagtaaaaa    11700

gtgatgaaac gtcattaaga gattttttaa ctaatattaa tatattaata tctatatgta    11760

gaacagaagg atttggcaga cctattgcta cagcgcttgt taatggggtt ccatgcttct    11820

taatcaactg tcctgttttt agagaatttt tttcaaatag tgccaatgtt tatccaacga    11880

ctgatgaact tattaatgcc atcctcgaaa taaaagatat tccgataaac aaagccttca    11940

ttataccaac tgatgttaaa gaagcatttt tcagcatcat agatatgata aataacggat    12000

aaaaatatgc tttatattgc tattgtatct catgggcatt ttgagattat taatgaactc    12060

aattgcattt caaagttatc tgctttagac gatgttcaga taatagtaaa agataatgtg    12120

ggagagataa aacttaaaga atattgtaaa aaatataata tcatgtattt tgatgataaa    12180

aagggattag gctttggtgc gaataataat tttattttta ataaaatatg tcatgatgct    12240

aatgataatg actacttttt agtaatgaat ccagatgtat ttattgaatg tgatgaatta    12300

ttgaaattta aaaaaaatat agatactaat gattattctt gtgtgaccat aaatttatat    12360

aaagattatt gttataaaca atttgacaac gcaataagaa aattccccac tttattaact    12420

ttcattaagt catttttatt tggaattaat gatagtatag aggataaatt atcttttgat    12480

aaaatacaag aaatcgagtg gtgtgctggc tcttttatcg catttgatat taaaacatat    12540

cgatcattgg gaggatttga tgaaaaatat tttatgtatt gtgaggatat agatctttgc    12600

tggcgtgtga aatatatcat aaataaaaaa atatattgtc tgtctgatat taaagccatt    12660

catcttgctc gttttaataa ccggaaaatg ctttccaagc atttcttttg gcacgttaaa    12720

agtataatga tttttttatc aaaaacttat atgtcaaaat attttagagg gcaatcaaat    12780

ggctaaatat aatataaacc cagttatact gtgtggaggg aatggtactc gattatggcc    12840

actttcacgg ggtttatatc ctaagcagtt tctgaatctt gatgatacat catcaatgct    12900

agagaaaaca attaatagat tagaaggttt ggatgtttcc cttcccttgg taatatgtaa    12960

tgagcaacat cgttttatcg tagcggaaca actgcgaacc ttaaagaaat taaatagaaa    13020

tattcttctg gagccaattg gtaaaaatac ggcaccagct ctagctcttg ctgctcttta    13080

taatatcaac tttaatagta atagtttgct tttagttctt gctgcagatc atgttataaa    13140

cgataaccaa agttttgtaa cttcaattaa aaaagctata ccctatgcta ttgagggtaa    13200

actagttacc tttggtattg aacctacaaa accagaaact ggatatggat atataaaaaa    13260

gggaaatgaa tgttcctcta tagctattgg tgatggttat catgttgaac gttttgtgga    13320

gaagccgaat ttctcaagtg catgtgatta cattagttct ggtgaatatc tatggaatag    13380

tggcatgttt ttatttgagc ctcataaata cttatcagaa ttgaggaaat atcagcctga    13440

tatttacaat gcctgtgtcg atgcatttaa atatgatcta atcgataacg acttcattcg    13500

cgttgatcca ctatcatttt cccaaagtcc tagcttatca gttgattatg cagtaatgga    13560

aaagacatca gatgcagttg tagtacctat gaatgctgaa tggagcgatg ttggttcttg    13620

ggctgcatta tgggaaataa gcaacaaaga tgatgatggt aatgttttgc atggagatgt    13680

aattagtttg tcgaccaaga atagttacat atactcagaa tctgagttgg taacaactat    13740

tggcattgaa aatttggcta tggttcagac aaaagatgct attttggttt cgaatcttgc    13800

atctactcaa gatgtaaaaa aattagttga gatattgcag ttaaatggtc gtactgagca    13860

ttatgttcac caagaaagat ataggccttg ggggaaatca gatacaatag atacggggga    13920

ttcttatcaa gttaaaatgc taacaataat gccacgtgaa aatttatcaa tgcaggtaca    13980

ttacaaacgc gccgagcatt gggttgtact ttctggttgt gctaggatag tcattgatgg    14040

ttttgaaagt attttaaatg aaaatgagtc tgtgcatatt cctgtaggtg taaaacatta    14100

tttagaaaat attggtaata cgcctctcag aattattgag atacgttctg gttcttattt    14160

agaagaagat gatattatca ggttttctga aatgatgga  tatgtttaac ttatgcccaa    14220

aaatagagta ataactagtt ttaaagccta tgatattcgc ggaaaactag gcgaagaact    14280

gaatgaagat atcgcctggc gcattggtcg cgcctatggc gaatttctca aaccgaaaac    14340

tattgtgtta ggcggtgatg tccgcctcac cagcgaaacc ttaaaactgg cgctggcgag    14400

aggtttacag gatgcgggcg tcgatgtgct ggatatcggc atgtccggca ccgaagaggt    14460

ctatttcgcc acgttccatc tcggcgtgga tggcggcatt gaagttactg tcagccataa    14520

tccgatggat tataacggca tgaagctggt gcgcgagggg gcccgcccga tcagcgggga    14580

taccggactg cgcgacgtcc agcgtctggc tgaagccaac gactttcctc ccgtcgatga    14640

aaccaaacgc ggtcgctatc agcaaatcaa cctgcgtgac gcttacgttg atcacctgtt    14700

cggttatatc aacgtcaaaa acctcacgcc gctcaagctg gtgattaact ccgggaacgg    14760

cgcagcgggt ccggtggtgg acgccattga agcccgcttt aaagccctcg gcgcacccgt    14820

ggaattaatc aaagtgcaca acacgccgga cggcaatttc cccaacggta ttcctaaccc    14880

gctactgccg gaatgtcgcg acgacacccg caatgcggtc atcaaacacg gcgcggatat    14940

gggcattgcc tttgatggcg attttgaccg ctgcttcctg tttgacgaaa aagggcagtt    15000

tatcgagggc tactacattg tcggtttgct ggcagaagcg ttcctcgaaa aaaatcccgg    15060

cgcgaagatc atccacgatc cacgtctctc ctggaatacc gttgatgtgg tgactgccgc    15120

aggcggcacg ccggtgatgt cgaaaaccgg acacgccttt attaaagaac ggatgcgcaa    15180

ggaagacgcc atctacggtg gcgaaatgag cgcccaccat tacttccgtg atttcgctta    15240

ctgcgacagc ggcatgatcc cgtggctgct ggtggccgaa ctggtgtgtc tgaaaggaaa    15300

aacgctgggc gaactggtgc gcgaccggat ggcagcgttt ccggcaagcg gtgagatcaa    15360

cagcaaactg gcgcaacccg ttgaggcgat taaccgcgtc gaacagcact ttagccgcga    15420

ggcgctggcg gtggatcgca ccgatggcat cagcatgacc tttgccgact ggcgctttaa    15480

cctgcgctcc tccaacaccg aaccggtggt gcgcctgaat gtggaatcgc gcggtgatgt    15540

gccgctgatg aaagaaaaga caaaacttat ccttgagtta ctgaataagt aattgagtaa    15600

attcatataa ataggtttta aaagacagaa aagatgagat attcagtgtg gtatagcaaa    15660

ggtaatgcta ttcaccatct ctatgagtga gttaacatct ataccacatt taagccgcac    15720

actcggcggt gaccaccccc tgacaggagt aaacaatgtc aaagcaacag atcggcgtag    15780

tcggtatggc agtgatgggg cgcaaccttg cgctcaacat cgaaagccgt ggttataccg    15840

tctctatttt caaccgttcc cgtgaaaaga cggaagaagt gattgccgaa aatccaggca    15900

agaagctggt tccttactat acggtgaaag agtttgttga atctctggaa acgcctcgtc    15960

gcatcctgtt aatggtgaaa gcaggtgctg gcacggatgc tgctattgat tccctcaagc    16020

catacctcga taaaggtgac atcatcattg atggtggtaa taccttcttc caggacacca    16080

ttcgccgtaa ccgtgagctt tctgccgaag gctttaactt catcggtacc ggtgtttccg    16140

gtggtgaaga gggcgcgttg aaaggtcctt ccattatgcc tggtggccag aaagaagcct    16200

atgaactggt tgctccgatc ctgaccaaaa tcgccgccgt tgctgaagat ggcaaaccgt    16260

gcgttaccta tattggtgcc gatggcgcgg gtcactatgt aaaaatggtt cacaacggta    16320

ttgaatacgg tgatatgcaa ctgattgctg aagcctattc tctcctgaaa ggcggcctga  16380

atctctctaa cgaagaactg gcgcagacct ttaccgagtg gaataacggt gaactgagca  16440

gctacctgat cgacatcacc aaagatatct tcactaaaaa agatgaagac ggtaagtacc  16500

tggttgatgt gatcctggat gaagcggcta acaaaggtac cggtaaatgg accagccaga  1b560

gcgcgctgga tctcggcgaa ccgctgtcgc tgattaccga gtctgtgttt gcacgttata  16620

tctcttctct gaaagagcag cgtgttgccg catctaaagt tctctctggc ccgcaagcgc  16680

agccagctgg cgacaaaggt gagttcatcg aaaaagttcg tcgtgctctg tatctgggca  16740

aaatcgtttc ttacgctcag ggcttctctc agctgcgtgc ggcgtctgaa gagtacaact  16800

gggatctgaa ctacggcgaa atcgcgaaaa ttttccgtgc tggctgcatc atccgtgcgc  16860

agttcctgca gaaaatcacc gatgcttatg ccgaaaatcc gcagatcgct aacctgctgc  16920

tggctccgta cttcaagcaa attgccgatg actaccagca ggcgctgcgt gatgtcgttg  16980

cttatgcagt acagaacggt atcccggttc cgaccttcgc ggctgcggtt gcctattatg  17040

acagctaccg cgccgcagtt ctgcctgcga acaattgtgc aggcacagcg gacta       17095

表1大肠杆菌O39的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物位置	反向引物位置	PCR产物长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								wzx	O-抗原转运酶	6289-7767	6313-63306794-6811	7001-70187443-7460	706bp667bp	00	5353
wzy	O-抗原聚合酶	9760-11007	10155-1017310227-10244	10866-1088310626-10643	729bp417bp	00	5353

表2  166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号	该组中含有的菌株	采源
			1、野生型大肠杆菌	O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，O19ab，O20，O21，O22，O23，O24	IMVSa
2、野生型大肠秆菌	O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43	IMVSa
			3、野生型大肠杆菌	O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，O57，O58，O60，O61，O62，O53	IMVSa
4、野生型大肠杆菌	O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81，O82，O83，O68	IMVSa
			5、野生型大肠杆菌	O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，	IMVSa
6、野生型大肠杆菌	O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117	IMVSa
			7、野生型大肠秆菌	O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O51，O137，O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140	IMVSa
8、野生型大肠杆菌	O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153	IMVSab
			9、野生型大肠杆菌痢疾志贺氏菌	O168，O169，O170，O171，O172，O173，D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13	cd
10、鲍氏志贺氏菌	B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B17，B18	d
			11、福氏志贺氏菌	F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，DS，DR	d
12、野生型大肠秆菌	O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119	IMVSa
			13、野生型大肠秆菌	去除大肠秆菌O39的第12组菌

为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阴性对照

a.Institude of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3是大肠杆菌O39的O-抗原基因簇的结构表

               E.cili O39 O antigen gene cluster

#orf galF rmlB rmlD rmlA rmlC vioA vioB wzx orf8 orf9 wzy orf11 orf12 manC manB gnd

G+C％     43.9 45.6 44.0 37.0 32.341.031.4  31.6 28.2 28.5 30.0 25.8  34.9 55.0

content

表4是大肠杆菌O39的O-抗原基因簇中的基因的位置表

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ATGCGTCCAA GAACGCGGTC      60

GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAACAGCG CGTAAAGCGC     120

CAACTGCTTG CGGAAGTGCA GTCCATCTGT CCACCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT     180

CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT GGGTCACTCC ATTTTATGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC     240

AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTTATCGATG ACGCCAGTGC CGACCCGCTG     300

CGCTACAACC TTGCAGCCAT GATTGCGCGC TTCAACGAAA CGGGCCGTAG CCAGGTGCTG     360

GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TTCAGACCAA AGAGCCGCTG     420

GACCGCGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG     480

ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCAGA TATTTGGCCG     540

GAACTTGAAC GCACTCAGCC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCCATCGCT     600

GAACTGGCGA AAAAACAGTC CGTTGATGCC ATGCTGATGA CAGGTGACAG CTACGACTGC     660

GGTAAAAAAA TGGGTTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GACTACGCAA CCTGAAAGAA     720

GGAGCGAAGT TCCGCAAAGG CATTGAGAAA CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGA     780

ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTGTT     840

GCGAATTTTC CTGCCGTTGT TTTATATAAA CAATCAGAAT AACAACGAGT TAGCAATAGG     900

ATTTTAGTCA AAGTTTTCCA GGATTTTCCT TGTTTCCAGA GCGGATTGGT AAGACAATTA     960

GCGTTTAAAT TTTTCGGGTT TAGCGCGAGT GGGTAACGCT CGCTACATCG TAGGCATGCA    1020

TGCAGTGCTC TGGTAGCTGT AAAGCCAGGG GCGGTAGCGT GCATTAATAC CTCTATTAAT    1080

                                                          Orf1的起始

CAAACTGAGA GCCGCTTATT TCACAGCATG CTCTGAAGTA ATATGGAATA ATAAA GTGAA  1140

GATACTTGTT ACTGGTGGCG CAGGATTTAT TGGTTCTGCT GTAGTTCGTC ACATTATAAA    1200

TAATACTCAG GATAGTGTTG TTAATGTCGA TAAATTAACG TACGCCGGAA ACCTGGAATC    1260

ACTTGCTGAT GTTTCTGACT CTGAACGCTA TGTTTTTGAA CATGCGGATA TTTGCGATGC    1320

TGCTGCAATG GCGCGGATTT TTGCTCAGCA TCAGCCGGAT GCAGTGATGC ACCTGGCTGC    1380

TGAAAGCCAT GTGGATCGTT CAATTACAGG CCCTGCGGCA TTTATTGAAA CCAATATTGT    1440

TGGTACTTAT GTCCTTTTGG AAGCGGCTCG CAATTACTGG TCTGCTCTTG ATGGCGACAA    1500

GAAAAATAGC TTCCGTTTTC ATCATATTTC TACTGACGAA GTCTATGGTG ATTTGCCTCA    1560

TCCTGACGAA GTAAATAATA AAGAACAATT ACCCCTCTTT ACTGAGACGA CAGCTTACGC    1620

GCCAAGTAGC CCATATTCTG CTTCGAAAGC ATCAAGCGAT CATTTAGTCC GCGCTTGGAA    1680

ACGTACCTAT GGTTTACCGA CCATTGTGAC TAATTGCTCT AACAATTATG GTCCTTATCA    1740

TTTCCCGGAA AAATTGATTC CATTGGTTAT TCTGAATGCT CTGGAAGGTA AAGGATTACC    1800

TATTTATGGT AAAGGGGATC AAATTCGCGA CTGGCTGTAT GTTGAAGATC ATGCGCGTGC    1860

GTTATATACC GTCGTAACCG AAGGTAAAGC GGGTGAAACT TATAACATTG GTGGACACAA    1920

CGAAAAGAAA AACATCGATG TAGTGCTCAC TATTTGTGAT TTGTCGGATG AGATTGTACC    1980

GAAAGAGAAA TCTTACCGCG AGCAAATTAC TTATGTTGCC GATCGCCCGG GACACGATCG    2040

CCGTTATGCG ATTGATGCAG AGAAGATTAG CCGCGAATTG GGCTGGAAAC CGCAGGAAAC    2100

GTTTGAGAGC GGGATTCGTA AAACGGTGGA ATGGTACCTG GCTAATGCAA AATGGGTCGA    2160

GAATGTGAAA AGTGGTGCCT ATCAATCGTG GATTGAACAG AACTATGAGG GCCGCCAG TA  2220

                                                               Orf1的终止

Orf2的起始

ATGAATATTC TCCTTTTCGG CAAAACAGGG CAGGTAGGTT GGGAACTACA GCGTGCTCTG  2280

GCACCTTTGG GTAATTTGAT TGCTCTTGAT GTTCACTCCA CTGATTATTG TGGTGATTTT    2340

AGTAATCCTG AAGGTGTGGC TGAAACCGTC AAAAAAATTC GCCCTGATGT AATTGTTAAT    2400

GCTGCGGCTC ATACCGCAGT AGATAAGGCT GAGTCAGAAC CCGAATTTGC ACAATTACTC    2460

AATGCGACCA GCGTTGAATC AATTGCCAAA GCGGCTAATG AAGTTGGGGC CTGGGTAATT    2520

CATTACTCAA CTGACTACGT ATTTCCGGGA ACCGGTGAAA TACCATGGCT GGAGACGGAT    2580

GCAACCGCAC CGCTAAATGT TTACGGTGAA ACCAAGTTAG CCGGAGAAAA AGCGTTACAG    2640

GAACATTGCG CGAAGCATCT TATTTTCCGT ACCAGCTGGG TATACGCAGG TAAAGGAAAC    2700

AATTTTGCCA AGACAATGTT ACGTCTGGCA AAAGAGCGCG AAGAATTAGC TGTTATTAAT    2760

GATCAGTTTG GTGCACCAAC AGGTGCTGAA CTGCTGGCTG ATTGTACGGC ACATGCAATT    2820

CGTATGGCAC TGAATAAACC AGAAGTCGCA GGCTTGTACC ATCTGGTAGC CACTGGTACC    2880

ACAACCTGGC ACGATTATGC TGTGCTGGTT TTTGAAGAGG CACGAAAAGC AGGTATTCCC    2940

CTTGCACTCA ACAAGCTCAA GGCAGTACCA ACAACAGCCT ATCCTACACC AGCTCGTCGT    3000

CCACATAACT CTCGCCTTAA TACAGAAAAA TTTCAGCAAA ATTTTGCGCT TGTTTTGCCT    3060

                                                         Orf2的终止

GACTGGCAAG TTGGCGTGAA ACGCATGCTC AACGAATTAT TAACGACTAC AGCAATT TAA  3120

                                                        Orf3的起始

TAGTTTTTGC ATCTTGTTCG TGATGATGGA GCAAGATGAA TTAAAAGGAA TGATGAA ATG  3180

AAAACGCCTA AAGGTATTAT TTTAGCGGGT GGCTCTGGTA CTCGTCTTTA TCCTGTGACT    3240

ATGGCTGTCA GTAAACAGCT ATTACCTATT TATGATAAGC CGATGATCTA TTACCCGCTC    3300

TCTACACTGA TGTTGGCGGG TATTCGCGAT ATTCTGATTA TCAGTACGCC ACAGGATACT    3360

CCTCGTTTTC AACAACTGCT GGGTGACGGT AGCCAGTGGG GGCTAAATCT TCAGTACAAA    3420

GTGCAACCGA CTCCAGATGG GCTTGCGCAG GCGTTTATTA TCGGTGAAGA GTTTATCGGT    3480

GGTGATGATT GTGCTTTGGT TCTAGGTGAT AATATCTTTT ACGGTCACGA TCTGCCGAAG    3540

TTAATGGATA CCGCTGTTAA CAAAGAAAGT GGTGCAACGG TATTTGCCTA TCACGTTAAT    3600

GATCCTGAAC GCTATGGTGT CGTTGAGTTT GATAAAAACG GTACGGCAAT AAGCCTGGAA    3660

GAAAAACCGC TACAACCAAA AAGTAATTAT GCGGTAACCG GGCTTTATTT CTATGATAAC    3720

GACGTTGTCG AAATGGCGAA AAACCTTAAG CCTTCTGCCC GTGGTGAACT GGAAATTACC    3780

GATATTAACC GTATTTATAT GGAACAGGGG CGTTTATCCG TTGCCATGAT GGGGCGTGGT    3840

TATGCATGGC TGGATACGGG GACACATCAG AGTCTTATTG AAGCAAGCAA CTTCATTGCC    3900

ACCATTGAAG AGCGCCAGGG ACTAAAGGTT TCCTGCCCAG AAGAAATTGC TTACCGTAAA    3960

GGGTTTATTG ATGCAGAGCA GGTGAAAGCA TTAGCTGAGC CGCTGAAAAA AAATGCTTAT    4020

                                   Orf3的终止Orf4的起始

GGCCAGTATC TGCTGAAAAT GATTAAAGGT TAT TAATAAA  ATGAACGTAA TTAAAACAGA4080

AATTCCAGAT GTACTGATTT TTGAACCGAA AGTTTTTAGT GATGAGCGTG GTTTCTTTTT    4140

CGAGAGCTTT AACCAGAAGA TTTTTGAGGA AGCTGTAGGC CGCAAAGTTG AATTTGTTCA    4200

AGATAACCAT TCGAAGTCCA GGAAAGGTGT TTTACGCGGA TTGCATTATC AGTTAGAACC    4260

TTATGCGCAA GGAAAATTGG TACGCTGCGT TGTTGGTGAG GTTTTTGATG TTGCGGTTGA    4320

TATTCGTAAA TCATCACCTA CTTTTGGCAA GTGGGTTGGG GTGAATTTAT CTGCTGAGAA    4380

TAAGCGCCAG TTGTGGATCC CTGAAGGATT TGCGCATGGA TTTTTAACCT TAAAAGATAA    4440

TACTGAAATA TTGTACAAGA CTACAAGTTA TTATTCACCT GAGTATGAAA GATCTATCAT    4500

ATGGAATGAT GAAGATCTTG TAATTAAGTG GCCTAATGAC CCTTGTGTCA TCTCCCATAA    4560

                                        Orf4的终止  Orf5的起始

AGATAGTTTG GCACAATCAT TTGCTATTAT TAGAAAT TAA TGAGGAATAT  ATGAGTAAGA4620

AGATTCCAGT TACACAACCA TTTCTTCCTG AGTTATCGGA GTTTATACCA TTCCTAGAGA    4680

AAATATGGGA AAATAAATGG TTGACAAATA ATGGTCCATT TCACCAACAA CTTGAAAGAG    4740

AATTATGTGA ATTTCTTAAC GTTAAACATA TATCTTTATT TACAAATGCG ACAATTGCTC    4800

TTGTAACAGC ACTTCAAGCC CTAAGAGTGA AAGGTGAAGT GATTACAACT CCATATTCAT    4860

TTGTTGCAAC CTCACATTCT ATATTATGGA ACAATCTTAC GCCAGTATTT GTCGATATTA    4920

AAGAAGGGGG ATTTAATATT GATCCTAAAA AAATAGAAGA GGCCATAACT CCAAATACAA    4980

CAGCTATTAT GCCTGTTCAT TGTTATGGTT ATCCATGCGA AGTCAATGAA ATTCAAAGGA    5040

TTGCTGATAA TTATGGACTA AAAGTAATAT ACGATGCAGC TCATGCTTTT GGGATTAATT    5100

ATGGGGATGA AAGTATTTTA AATTTTGGCG ATCTTTCAAT TTTAAGCTTT CATGCAACAA    5160

AAGTTTTTAA CACATTTGAG GGGGGGGCGA TAATATGTCC TGATCTAAAA ACAAAAGAGA    5220

GAATAGATAG ATTGAAAAAT TTTGGGTTTG TAGATGAGTT AACAGTGACT GCAGCTGGAA    5280

TAAATGGGAA AATGAGCGAG GTAAATTCAG CGTTTGGATT ACTCCAGCTT AAATATATAA    5340

ATGAAGCAAT CGGAAAAAGA AGTAGAATTG ATTCACAATA CAGAAATGAT CTTAGTAATA    5400

TTGAAGAAAT CATAATTCCT GCTAAAAGTA CTGAGAGCAA TAGTAATTTT TCGTACTTCC    5460

CAATTTTAGT CCAATCAGAA TCTGGTTTCA GTAGAGATGG ACTGTATGAT CATCTTAAAG    5520

AAAATGGAAT ACTCTCGAGA AAATATTTTT ACCCACTAAT TAGTAATATG CCGATGTATA    5580

AGAGAAACGA ATCTTCTCTT GTAGATAATT TGAAAAATGC AAATGAAACA GCATCTAAAG    5640

TATTATGTTT ACCCATATAT GCATCCATGA ATAGAGACGA ATATGTCTAT ATAATTTCCA    5700

               Orf6的起始Orf5的终止

AAGTGAAGGA GTATTTTTC A TGAGTTATTT AACAAGAGAT GAGATTGAAA ATTTTGGATT  5760

TAATAAAATA GGTAGAAATG TATTAATATC AGATAAAACC TCGATATACA ATCCACAAAA    5820

AATATCAATC GGTGATAATG TTAGGATTGA CGATTTTTGT ATTTTGTCAG CAGGTGATGG    5880

TGGTATAGAA ATTGGAAATT ATGTGCATAT TGCATCATAT TCGTCCTTAA TAGGGAAGGA    5940

AAAAATTAAA TTAGGAGATT ATAGCGGTCT ATCTTCGCGT GTTTCTATTT ATTCCAGTAG    6000

TGATGATTAT TCTGGACTTT GGATGACTAA TCCAACGGTT CCATCTACGT TTACCAATGT    6060

TGTTTCAAAA CCTGTAATTC TTGAGAAGCA TGTTATTGTA GGCTGTGGAG CAGTTATCTT    6120

ACCGGGAGTA CTTATCCAAG AAGGTGCTGC AATTGCAGCA CTTTCACTTG TTAAAAAATC    6180

GTGTGAGCCT TTTTATATCT ATCATGGTAA CCCTGCAAAA AAAATTTTTG CGAGAAAAAA    6240

                                                Orf7的起始Orf6的终止

AGTAATAAAG AATCTTGAGA GAAACCTTGA AGAATTTGAT AATTTAAA AT GTCAAAAATA  6300

ACTAAGAATA TATTCGCAAA TTATTTAGGG GTGGTGATTA CCACCGCTCT TTCTTTTTTA    6360

GTTGTACCAT TTTATTTAAA GATATTAGGT AAGGATTCCT TTGGTTTAAT AGGAATAGCA    6420

TCGCTTATTC AGGGCTGGGT AATGTTGTTA AATTCAGGAT TAGCGCCTGT AACTGGACGA    6480

GAAGCAGCAA AAGCCTATGC TATAGGTAAT TCTTGGCGTG AAGCTGCAAT ATTTTTCAGA    6540

ACAGTTGATG TTTTCTTAAT ATCATTGTCA TTAATTGTTT TTGTAATTTT TTATATTTCA    6600

AGAGGTTGGT TATCAAATGT CTGGATAGAA AGCTCATCAT TAAATTCCTC TACTATAAGT    6660

TTGGCATTAT GTCTTCTTAT TGCAATGACG TCAATTCGAC TTTTAACAAG TATTACGAGA    6720

GGCATATTGG CTAACATAGA TAGGCAAATA TGGTTAAATA ATAATTTAAT TATATTTAGC    6780

TTACTTAGAT TTGCTGCTAG TATTCCATTG CTATATGCCT ACCCGGGCAT AAACTATCTT    6840

TTTATATGGT GGCTATTTGT ATCACTACTT GAATATTTTA GTATTCAGTA TAAAACATGG    6900

TCAATAATAC CAGTTAAAAT TAATTTTTTT ATTTTTGATT TTTTAAGTAT AAAAAAACGC    6960

TGGAAAATGA TAGTAGCATT GGCATCAACT AGTTTGATAT GGGTGCTGAT AACAAATACG    7020

GACAAATTGA TTCTGTCTAC ATATCTCTCG CTTGAGAGTT ACGGTTTTTA TAGCATTGCA    7080

ACATTACTTT CAAGTAGTAT TATCATATTA GCCCAACCTA TTGCACAAGC ATTTCAGCCA    7140

AAGATGACTT CAGCTTTTAC TCACGGAGGT ATTGAAAATG CTGAAATGAT CTTAAGGGAA    7200

GCAACTAAAT GGATCGTTTA TCTCATTTAT CCTATCGTTG TTATTCTGTG TTTATATCCA    7260

AATCAAATTA TATTTGTTTG GACAGGAGAT AGTGATGCAA TGCAGCAGGC TGGTGATTTT    7320

CTCATTGGGT ACACAATAGG AAATATATTT ATTGCCCTTG GTTCAATACT ATATGCTTTT    7380

CAAGTCTCAA TCGGTATAGT TAGGAAACAT CTACAGGGGA ATATAATCTT GTGTGTTTGC    7440

TATCTCCCAC TAATACCATT TATTGTAACC AAATATGGAG CGATAGGTAT ATCTATATTA    7500

TGGGCGATTG TGAATTTTAT ATATTTTGTT TTATGGAACT TACATTTGTT AAAAAAAATC    7560

ACAAAAACAC TTTACCCTCA GTGGGTTCTT ATTGAAACAT TGCTTCCATT AATAATGTTA    7620

TTTTTAATAA TGACATTTGT CAGGTATTTT TTCGTTCTAG ACGGACAGTA TTCAAGATTT    7680

ATTCTATTTT TGTTGCTCTG TTTATTAACT TGCGTGGCCT TTGTAATCAA CCTTTTAAAT    7740

                      Orf7的终止Orf8的起始

ATGAAGTTAT TAAAATATAG GAAC TAATGG CTATGACAAA ATATGCACCA ATTACCGTTT  7800

ATACGTATAA TCGTTATGAT CATTTTACTA AAACAATTGA GGCACTGCGT AATAATTATT    7860

TAGCCGAAAA CTCTATTCTA TATGTGGTCT CAGATGCTGC TGCTAATGAA AAAGATGAAA    7920

ATTTAGTAAA AAAAATCCGA GACTATTCAA AAAAAATATC AGGATTTAAA TCGGTTGAAT    7980

TAATTTTTAG AAAGGAAAAT TTAGGTCCTC TTCAAAGCAT TTATGGTGCC GAGCGTGAAA    8040

TTATTGATAG TCACGGAAGA ATAATATCAA TGGAAGATGA TAATATTACA TCAAGAAATT    8100

TTTTAAACTT TATGAATCAA GGACTTGAAC GCTTTGAATA TGAGCAGTCA GTTTATTCAA    8160

TTTGTGGCTA TTGCCCAGCA GTTAAACGCT CTACTAAAGA GCTTGGTGAT ATTTGGTTGT    8220

ATCCTTGGAA TATATCTTGG GGATATGCTA CTTGGAAACA AAAATACGAT CTTCTAAATC    8280

CACTTATTAA TAATTATGAA CAATTAAAGA CAGAGGGGAT TTTAAGAAGA GTTAATAGAA    8340

TGGGGGGGTT ATATATTACA GACTCTCTAA AAAGAGATTA TATGAAGACA GCATATTTCC    8400

CCGATGCAAT ATTATGCTGT AATATGACTA AGTTAGATAT GGTTTCCGTT ATCCCTTCCA    8460

TTTCGAAAGT TTTTAACATT GGAAATGATG GTTCGGGGAA TAGTAAAGGT GCTAATACTA    8520

ATAAATACGA TGTTCTGCTG GATGAAGGAG CTAAAACTAT ATTTGATTTC AATATCACAA    8580

AACAATCACT TTCCGCTGAA ATGACTAAAG AAGTTGCAAG ATTTTATAAT GGGAGACTAG    8640

TGACAAGACT AGCAAGAAAA ATTGGCATAT ATGATCGTCT TTTATCATTA AAACAAAATT    8700

     Orf8的终止Orf9的起始

ATGGA TAATA AATT ATGGCT TTATTGATAA TTTCACCTAG TCTAATAAAT GGCGGGCACG8760

AATTTCAGAG TATTGAGTTT ATAAACGAAC TATATAAAAC GAGAAAATCA ATTTTTGTTA    8820

GTTGTGCAAA TAGTTTTTTT TACGAAAATA TTAATATTTC AGAAGAAGAT AAAGAAATAT    8880

TTGAATATCC TCAAGGCGGG ATTATTGATT TATTCTGCAG TTTTAATAGG GTGAAAAAAC    8940

ATCTCAAAAC ACATATCCAT GGCGTAACCG ATGTTTTAAT TTGTGGAGGA ACAATAGAAG    9000

TAATTATTTT TTATTCACAT ATAATAAAAT CTATTGATAA AAAAATTAGG GTAATTGGTT    9060

ATGTACCAAT GGTAGTTGAT AAAAAAATTC TCAGGCCAGT GTTAGGTACC AGTGCAAAAT    9120

TATGTATTAA AATTTTATGT GGTAAAGTTG ATGAAATAAT CACAATTAAC AAGATTCAAT    9180

CATATTTGTT TAATGTTTTT TATAATAAAA AAACACTTGT ATTACCTAAT AAGCTGAAAA    9240

AAATTAGTTG TGTTACAAGT GATTATGGCT TTCGACTAAT ATATTGTGGA AGGCTAGATA    9300

ATGTTCAGAA AAACATAATA GAACTAATCT TTATGCTTGA TAGGATAAAT AATCCTGTTA    9360

AAGAATTTAT TATCATCGGT GATGGCCCCG ATTTCCAAAA AATATTAGAG ATAAGTAATA    9420

AGACAAGGAA TATTAAAGTT AAAATTATTG GATGGGCTAG TGAGGAGGAT ATAAATTCGA    9480

TTCTTGGAAT AAATGATATT TTGATCATGA ATTCTAGATG GGAGGGGGAA CCTCTTGTTA    9540

TTAGAGAATT TATTGATAGG AACCTTCCTG TCATTTCACG TGATATACCC GGAGTTCGTG     9600

GTGTTACTTT AAGAAAATAT AGATATAATA ATGAAAATGA ACTTGAGGAA ATTTTAAATA     9660

ATCATGTTGG GAGATTTGAA GTAAAAAAAC AAATAAAAGA AGAAAATATT ATGAGGATGC     9720

                                 Orf9的终止Orf10的起始

GTTCTAGGGT AATTGCTATT ATTACAGGTA GGATA TGAA A TGTTTCTCTT TAAGAAACCT 9780

AAATTTATAT TTTTATTACT TTTCATTATA TCAAACATTT ACTCATGTTT ATATTTTATT     9840

AACACCGGGC ATTTGTTAGG AGAAGTTTCT GACTTTAATT TCAAAAGTGA AGAAACATCT     9900

ATTTATATAA ATTTGCTTAT TATATTTTTT TATCTTTTTT TCTTGGTCGT TATTTTTAGG     9960

TTTTTTTCTA AAATACATGT AAATTCTTTA TTGGATAACG ATTGCAGAAT AAAATGGTGT    10020

AAAGCAGAGT TTTTCTGGGG GAAGTTATTA ATAATAATTC AGATTTTGTT TATTTTTTAT    10080

TTTTGCTTAA CAAACACATT TGGCGCAAAT AGCGTTAATA GAGATGGTGG CATAATATCA    10140

GCTTTATGGG TTGTATTATC ACCAGACAAT CTTTTTTTTA TCTATTACAG CATATTTAGG    10200

AAAAGTAGAT ATGCTAAATA TAATTTATTG CTCGCGATTC TTTCTAATAT ATTGAGGGGA    10260

TGGAGCGGAA TACTGATTTT TATTGTTTTT ATCGAATTAT GTTATAGATA TCGGGAGGGA    10320

AAATTAAAAA TAAGGCTTCT CTCGAAGATT TGTGGGATAA TGTTCCTACT GTATCCTGTG    10380

ATATTGGCTG TTAAGTATGG CATTCGTGAT TCATTTTTGA CTAACAGCAA TTTTTGGGAA    10440

AGTTTTGACA GATCTTGGTT ATATGTATTT AACAATAATG GTGTGTTAGG ATACATCAAT    10500

GGTCTTTTGT TTGGAATTGA ACAATTTTTT AGTAGAATAC AACTTTTTTC GAATGCAGTT    10560

GTTGTTTATT CTTTGAAACA TGAATTAGCC AATTTTGTTA TCACCAATAA AGTAACGAGT    10620

TATTGGCAAG AGGGTATTTA TGGTATTATC TGGAATAGGA TATTTGATTT ACCAACGAGT    10680

TATAACTTGG GCGAAGTATT GGCAAATTTC ATTGATCCAC AAAGTATCAT AGGAAGCTGG    10740

AATTCTAACC CAACATTTTT ATCTTGGCTG TTTATTGATC CATTTCAGAT AGGAATCTAT    10800

CTATTATTTA CAATTGCGCT TTGTTTTATA ACTATGTTTT TAGTAAAAAA AATAACATCG    10860

TCAACTTTGT CGCTAGATAT GCTCTGGTAT ATGTGGCTGA TCCTTATTAT GCCCGGTTGG    10920

TTTGCTTCAT TAATATTATT TCTTAATACT TTAATAATTT TTTATGTTAT TACATTTATA    10980

                         Orf10的终止Orf11的起始

AAATTAAACG TAACAATAGA GAGG TAGTTG TA GTGGGGAA AATAGTTATA AATCTTTGGC11040

ATATAAAAAA TACTAATGGC TTATTTTATT ATGCCTTGGA TTATATTGAT CATATTGCTG    11100

CAGAAAAAAT AATTTTATTA AATGTTAACT TTCCAAATTC TGAAGCTATT GAACGACTGA    11160

GTGGAAATAA TGAAATATTA AAGCTGAGTT TGTTAAACTA TGTCATGTTT ATGTTTAAAT    11220

GTTTTATCGA ACATAATTTA ATTTTTACTC CTAGCTCTCA TCCCATTCCT TTTATAAAAA    11280

AACAGTTAGT TATTGTGCAT GACATGTATC CTTTTCATGG CTTTAAAGGG AACCTAAAAA    11340

AAATATTGTT CTGTATTTCT GCGAAAATAT CTCGATGTAA AATTGGTTAT ATAAATAGAT    11400

CTCAAGTTTT ACCTGCATTA CTCAACTTGG GAATTAATCC CAGGCAACTT GTATTTGCTC    11460

CAAACAAATT TCCTGATTTA TTCTCAAATC CTTTAAATAG AATTCCATAT GATAAGAAAA    11520

AAATTATTGT GGGGCTAGTG GGTACAGATT CAGATAAAAA GAACTACCAT GAACTTTTAA    11580

GCTCAATTCG TCATAGGAAA TTGCATGGAC AGTTTAATCT CATGATCTAT GGGCATGAGA    11640

CTCCTTACTT CAAACGCGTA AATAGTGACT TTCCTGATCT AAATATTTCA TTAGTAAAAA    11700

GTGATGAAAC GTCATTAAGA GATTTTTTAA CTAATATTAA TATATTAATA TCTATATGTA    11760

GAACAGAAGG ATTTGGCAGA CCTATTGCTA CAGCGCTTGT TAATGGGGTT CCATGCTTCT    11820

TAATCAACTG TCCTGTTTTT AGAGAATTTT TTTCAAATAG TGCCAATGTT TATCCAACGA    11880

CTGATGAACT TATTAATGCC ATCCTCGAAA TAAAAGATAT TCCGATAAAC AAAGCCTTCA    11940

TTATACCAAC TGATGTTAAA GAAGCATTTT TCAGCATCAT AGATATGATA AATAACGGAT    12000

Orf11的终止Orf12的起始

AAAAAT ATGC TTTATATTGC TATTGTATCT CATGGGCATT TTGAGATTAT  TAATGAACTC12060

AATTGCATTT CAAAGTTATC TGCTTTAGAC GATGTTCAGA TAATAGTAAA AGATAATGTG    12120

GGAGAGATAA AACTTAAAGA ATATTGTAAA AAATATAATA TCATGTATTT TGATGATAAA    12180

AAGGGATTAG GCTTTGGTGC GAATAATAAT TTTATTTTTA ATAAAATATG TCATGATGCT    12240

AATGATAATG ACTACTTTTT AGTAATGAAT CCAGATGTAT TTATTGAATG TGATGAATTA    12300

TTGAAATTTA AAAAAAATAT AGATACTAAT GATTATTCTT GTGTGACCAT AAATTTATAT    12360

AAAGATTATT GTTATAAACA ATTTGACAAC GCAATAAGAA AATTCCCCAC TTTATTAACT    12420

TTCATTAAGT CATTTTTATT TGGAATTAAT GATAGTATAG AGGATAAATT ATCTTTTGAT    12480

AAAATACAAG AAATCGAGTG GTGTGCTGGC TCTTTTATCG CATTTGATAT TAAAACATAT    12540

CGATCATTGG GAGGATTTGA TGAAAAATAT TTTATGTATT GTGAGGATAT AGATCTTTGC    12600

TGGCGTGTGA AATATATCAT AAATAAAAAA ATATATTGTC TGTCTGATAT TAAAGCCATT    12660

CATCTTGCTC GTTTTAATAA CCGGAAAATG CTTTCCAAGC ATTTCTTTTG GCACGTTAAA    12720

                                                       Orf13的起始

AGTATAATGA TTTTTTTATC AAAAACTTAT ATGTCAAAAT ATTTTAGAGG GCAATCAA AT  12780

   Orf12的终止

GGC TAAATAT AATATAAACC CAGTTATACT GTGTGGAGGG AATGGTACTC GATTATGGCC 12840

ACTTTCACGG GGTTTATATC CTAAGCAGTT TCTGAATCTT GATGATACAT CATCAATGCT    12900

AGAGAAAACA ATTAATAGAT TAGAAGGTTT GGATGTTTCC CTTCCCTTGG TAATATGTAA    12960

TGAGCAACAT CGTTTTATCG TAGCGGAACA ACTGCGAACC TTAAAGAAAT TAAATAGAAA    13020

TATTCTTCTG GAGCCAATTG GTAAAAATAC GGCACCAGCT CTAGCTCTTG CTGCTCTTTA    13080

TAATATCAAC TTTAATAGTA ATAGTTTGCT TTTAGTTCTT GCTGCAGATC ATGTTATAAA    13140

CGATAACCAA AGTTTTGTAA CTTCAATTAA AAAAGCTATA CCCTATGCTA TTGAGGGTAA    13200

ACTAGTTACC TTTGGTATTG AACCTACAAA ACCAGAAACT GGATATGGAT ATATAAAAAA    13260

GGGAAATGAA TGTTCCTCTA TAGCTATTGG TGATGGTTAT CATGTTGAAC GTTTTGTGGA    13320

GAAGCCGAAT TTCTCAAGTG CATGTGATTA CATTAGTTCT GGTGAATATC TATGGAATAG    13380

TGGCATGTTT TTATTTGAGC CTCATAAATA CTTATCAGAA TTGAGGAAAT ATCAGCCTGA    13440

TATTTACAAT GCCTGTGTCG ATGCATTTAA ATATGATCTA ATCGATAACG ACTTCATTCG    13500

CGTTGATCCA CTATCATTTT CCCAAAGTCC TAGCTTATCA GTTGATTATG CAGTAATGGA    13560

AAAGACATCA GATGCAGTTG TAGTACCTAT GAATGCTGAA TGGAGCGATG TTGGTTCTTG    13620

GGCTGCATTA TGGGAAATAA GCAACAAAGA TGATGATGGT AATGTTTTGC ATGGAGATGT    13680

AATTAGTTTG TCGACCAAGA ATAGTTACAT ATACTCAGAA TCTGAGTTGG TAACAACTAT    13740

TGGCATTGAA AATTTGGCTA TGGTTCAGAC AAAAGATGCT ATTTTGGTTT CGAATCTTGC    13800

ATCTACTCAA GATGTAAAAA AATTAGTTGA GATATTGCAG TTAAATGGTC GTACTGAGCA    13860

TTATGTTCAC CAAGAAAGAT ATAGGCCTTG GGGGAAATCA GATACAATAG ATACGGGGGA    13920

TTCTTATCAA GTTAAAATGC TAACAATAAT GCCACGTGAA AATTTATCAA TGCAGGTACA    13980

TTACAAACGC GCCGAGCATT GGGTTGTACT TTCTGGTTGT GCTAGGATAG TCATTGATGG    14040

TTTTGAAAGT ATTTTAAATG AAAATGAGTC TGTGCATATT CCTGTAGGTG TAAAACATTA    14100

TTTAGAAAAT ATTGGTAATA CGCCTCTCAG AATTATTGAG ATACGTTCTG GTTCTTATTT    14160

                                             Orf13的终止Orf14的起始

AGAAGAAGAT GATATTATCA GGTTTTCTGA CAATGATGGA TATGTT TAAC TT ATGCCCAA14220

AAATAGAGTA ATAACTAGTT TTAAAGCCTA TGATATTCGC GGAAAACTAG GCGAAGAACT    14280

GAATGAAGAT ATCGCCTGGC GCATTGGTCG CGCCTATGGC GAATTTCTCA AACCGAAAAC    14340

TATTGTGTTA GGCGGTGATG TCCGCCTCAC CAGCGAAACC TTAAAACTGG CGCTGGCGAG    14400

AGGTTTACAG GATGCGGGCG TCGATGTGCT GGATATCGGC ATGTCCGGCA CCGAAGAGGT    14460

CTATTTCGCC ACGTTCCATC TCGGCGTGGA TGGCGGCATT GAAGTTACTG TCAGCCATAA    14520

TCCGATGGAT TATAACGGCA TGAAGCTGGT GCGCGAGGGG GCCCGCCCGA TCAGCGGGGA    14580

TACCGGACTG CGCGACGTCC AGCGTCTGGC TGAAGCCAAC GACTTTCCTC CCGTCGATGA    14640

AACCAAACGC GGTCGCTATC AGCAAATCAA CCTGCGTGAC GCTTACGTTG ATCACCTGTT    14700

CGGTTATATC AACGTCAAAA ACCTCACGCC GCTCAAGCTG GTGATTAACT CCGGGAACGG    14760

CGCAGCGGGT CCGGTGGTGG ACGCCATTGA AGCCCGCTTT AAAGCCCTCG GCGCACCCGT    14820

GGAATTAATC AAAGTGCACA ACACGCCGGA CGGCAATTTC CCCAACGGTA TTCCTAACCC    14880

GCTACTGCCG GAATGTCGCG ACGACACCCG CAATGCGGTC ATCAAACACG GCGCGGATAT    14940

GGGCATTGCC TTTGATGGCG ATTTTGACCG CTGCTTCCTG TTTGACGAAA AAGGGCAGTT    15000

TATCGAGGGC TACTACATTG TCGGTTTGCT GGCAGAAGCG TTCCTCGAAA AAAATCCCGG    15060

CGCGAAGATC ATCCACGATC CACGTCTCTC CTGGAATACC GTTGATGTGG TGACTGCCGC    15120

AGGCGGCACG CCGGTGATGT CGAAAACCGG ACACGCCTTT ATTAAAGAAC GGATGCGCAA    15180

GGAAGACGCC ATCTACGGTG GCGAAATGAG CGCCCACCAT TACTTCCGTG ATTTCGCTTA    15240

CTGCGACAGC GGCATGATCC CGTGGCTGCT GGTGGCCGAA CTGGTGTGTC TGAAAGGAAA    15300

AACGCTGGGC GAACTGGTGC GCGACCGGAT GGCAGCGTTT CCGGCAAGCG GTGAGATCAA    15360

CAGCAAACTG GCGCAACCCG TTGAGGCGAT TAACCGCGTC GAACAGCACT TTAGCCGCGA    15420

GGCGCTGGCG GTGGATCGCA CCGATGGCAT CAGCATGACC TTTGCCGACT GGCGCTTTAA    15480

CCTGCGCTCC TCCAACACCG AACCGGTGGT GCGCCTGAAT GTGGAATCGC GCGGTGATGT    15540

                                                  Orf14的终止

GCCGCTGATG AAAGAAAAGA CAAAACTTAT CCTTGAGTTA CTGAATAAG T AATTGAGTAA  15600

ATTCATATAA ATAGGTTTTA AAAGACAGAA AAGATGAGAT ATTCAGTGTG GTATAGCAAA    15660

GGTAATGCTA TTCACCATCT CTATGAGTGA GTTAACATCT ATACCACATT TAAGCCGCAC    15720

ACTCGGCGGT GACCACCCCC TGACAGGAGT AAACAATGTC AAAGCAACAG ATCGGCGTAG    15780

TCGGTATGGC AGTGATGGGG CGCAACCTTG CGCTCAACAT CGAAAGCCGT GGTTATACCG    15840

TCTCTATTTT CAACCGTTCC CGTGAAAAGA CGGAAGAAGT GATTGCCGAA AATCCAGGCA    15900

AGAAGCTGGT TCCTTACTAT ACGGTGAAAG  CTTTGTTGA ATCTCTGGAA ACGCCTCGTC    15960

GCATCCTGTT AATGGTGAAA GCAGGTGCTG GCACGGATGC TGCTATTGAT TCCCTCAAGC    16020

CATACCTCGA TAAAGGTGAC ATCATCATTG ATGGTGGTAA TACCTTCTTC CAGGACACCA    16080

TTCGCCGTAA CCGTGAGCTT TCTGCCGAAG GCTTTAACTT CATCGGTACC GGTGTTTCCG    16140

GTGGTGAAGA GGGCGCGTTG AAAGGTCCTT CCATTATGCC TGGTGGCCAG AAAGAAGCCT    16200

ATGAACTGGT TGCTCCGATC CTGACCAAAA TCGCCGCCGT TGCTGAAGAT GGCAAACCGT    16260

GCGTTACCTA TATTGGTGCC GATGGCGCGG GTCACTATGT AAAAATGGTT CACAACGGTA    16320

TTGAATACGG TGATATGCAA CTGATTGCTG AAGCCTATTC TCTCCTGAAA GGCGGCCTGA    16380

ATCTCTCTAA CGAAGAACTG GCGCAGACCT TTACCGAGTG GAATAACGGT GAACTGAGCA    16440

GCTACCTGAT CGACATCACC AAAGATATCT TCACTAAAAA AGATGAAGAC GGTAAGTACC    16500

TGGTTGATGT GATCCTGGAT GAAGCGGCTA ACAAAGGTAC CGGTAAATGG ACCAGCCAGA    16560

GCGCGCTGGA TCTCGGCGAA CCGCTGTCGC TGATTACCGA GTCTGTGTTT GCACGTTATA    16620

TCTCTTCTCT GAAAGAGCAG CGTGTTGCCG CATCTAAAGT TCTCTCTGGC CCGCAAGCGC    16680

AGCCAGCTGG CGACAAAGGT GAGTTCATCG AAAAAGTTCG TCGTGCTCTG TATCTGGGCA    16740

AAATCGTTTC TTACGCTCAG GGCTTCTCTC AGCTGCGTGC GGCGTCTGAA GAGTACAACT    16800

GGGATCTGAA CTACGGCGAA ATCGCGAAAA TTTTCCGTGC TGGCTGCATC ATCCGTGCGC    16860

AGTTCCTGCA GAAAATCACC GATGCTTATG CCGAAAATCC GCAGATCGCT AACCTGCTGC    16920

TGGCTCCGTA CTTCAAGCAA ATTGCCGATG ACTACCAGCA GGCGCTGCGT GATGTCGTTG    16980

CTTATGCAGT ACAGAACGGT ATCCCGGTTC CGACCTTCGC GGCTGCGGTT GCCTATTATG    17040

ACAGCTACCG CGCCGCAGTT CTGCCTGCGA ACAATTGTGC AGGCACAGCG GACTA         17095

以上仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡依本发明技术实质对以上实施例作修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1、一种对大肠杆菌O39的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于，其wzx序列为SEQ ID NO：1中的6289至7767碱基的核苷酸或wzy序列为SEQ IDNO：1中的9760至11007碱基的核苷酸或者具有上述序列插入、缺失或取代一个或多个核苷酸，但保持wzx、wzy核苷酸特异性检测大肠杆菌O39的O-抗原功能的寡核苷酸。

2、一种对大肠杆菌O39的O-抗原高度特异的寡核苷酸，其特征在于，其为源于wzx基因的寡核苷酸对：SEQ ID NO：1中的6313至6330碱基的核苷酸和7001至7018碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的6794至6811碱基的核苷酸和7443至7460碱基的核苷酸；或源于wzy基因的寡核苷酸对：SEQ IDNO：1中的10155至10173碱基的核苷酸和10866至10883碱基的核苷酸，SEQID NO：1中的10227至10244碱基的核苷酸和10626至10643碱基的核苷酸。

3、权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O39型的O-抗原特异的寡核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原中的应用。

4、按照权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O39型的O-抗原特异的寡核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测体外及环境中的细菌。