CN1234859C - 对大肠杆菌o61的0－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O61(Escherichia coli O61)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O61中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO:1所示的分离的核苷酸，全长15461个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的寡糖单位处理基因(包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因)的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O61的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O61的方法。

Description

对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O61(Escherichia coli O61)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O61中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O61并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank etal(1987)“The function of ant ibody and complement in the lysis ofbacteria”.Rev Infect Dis 177：1750-1753.Pluschke Getal“Role of thecapsule and the O-antigen in resistance of O18：K1Escherichia coli tocomplement-mediated king”.J Bacteriol 42：907-913]。大肠杆菌是一个种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]。

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implicationfor Escherichia coli and Shigella rela tionships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli 0111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coliO111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。

本发明的另一个目的是提供了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的基因：转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因；糖合成路径基因，包括orf1、orf2、nnaA、nnaB、wckD、orf7、nnaC、orf9。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O61的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O61的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O61的O-抗原也是高度特异的。

本发明的还一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O61的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O61。

本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15461个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其包括命名为off1，orf2，nnaA，nnaB，wckD，orf6，orf7，nnaC，orf9，orf10，wzx，orf12，wzy，orf14的14个基因组成，它们都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特异性的基因包括：转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。其中所述的转运酶基因是SEQ IDNO：1中的9915至11141碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO：1中的12068至13225碱基的核苷酸；所述的orf6基因是SEQ ID NO：1中的5878至6936碱基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO：1中的9368至9922碱基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO：1中的11122至12075碱基的核苷酸；orf14是SEQ ID NO：1中的13246至13962碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O61的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的10333至10350碱基的核苷酸和10869至10886碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的10020至10037碱基的核苷酸和10980至10997碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的12267至12284碱基的核苷酸和12870至12887碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的12536至12553碱基的核苷酸和12874至12891碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O61型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。

前述的对大肠杆菌O61型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O61型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。

前述的对大肠杆菌O61型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。

前述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O61型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O61型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O61型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O61型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O61型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O61型的O-抗原的高度特异性；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O61，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O61的灵敏度。

前述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O61，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O61中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O61的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAAGAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCGCGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的ExpandLong Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，6O℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾，此混合物经等体积氯仿：异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O61的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到14个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在大肠杆菌O61中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O61及其O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O61的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μl上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的10333至10350碱基的核苷酸和10869至10886碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的10020至10037碱基的核苷酸和10980至10997碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的12267至12284碱基的核苷酸和12870至12887碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的12536至12553碱基的核苷酸和12874至12891碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O61的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长15461个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，它其包括命名为orf1，orf2，nnaA，nnaB，wckD，orf6，orf7，nnaC，orf9，orf10，wzx，orf12，wzy，orf14的14个基因组成都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括orf1、orf2、nnaA、nnaB、wckD、orf7、nnaC、orf9基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因对大肠杆菌O61的O-抗原是特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基转移酶基因包括orf6、orf10、orf12、orf14基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源于大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O61为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物。所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O61及它们的O-抗原是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸的分离和鉴定方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O61中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的9915至11141碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的12068至13225碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O61都是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O61。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf2、orf4、orf7、orf9基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O61表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O61。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf10、orf12、orf14基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O61。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf6、orf10、orf12、orf14基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O61的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取。

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O61，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O61中的O-抗原基因簇

以大肠杆菌O61的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR严物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库。

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿：异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序。

从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到，最后获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析。

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O61的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for Biot echnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到14个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1与Vibrio vulnificus CMCP6的变位酶在396个氨基酸中有86％的相同性，91％的相似性；高度的相同性表明orf1也是一个编码变位酶的基因，暂命名为orf1。Orf2与Vibrio parahaemolyticus的氨基转移酶在380个氨基酸中有73％的相同性，86％的相似性，高度的相同性表明orf2也是一个编码氨基转移酶的基因，暂命名为orf2。orf3与Vibrio parahaemolyticus的NeuC在386个氨基酸中有77％的相同性，88％的相似性，高度的相同性表明orf3也一个编码NeuC的基因，它是变位酶，将orf3命名为nnaA。Orf4与Vibrio parahaemolyticus的NeuB在357个氨基酸中有77％的相同性，84％的相似性，高度的相同性表明orf4也是一个编码NeuB的基因，将orf4命名为nnaB。Orf5与Vibrio parahaemolyticus的NeuD在195个氨基酸中有45％的相同性，67％的相似性，较高的相同性表明orf5也编码一个NeuD，因此将orf5命名为wckD。orf6与Vibrioparahaemolyticus的dNTP-转移酶在351个氨基酸中有68％的相同性，84％的相似性，较高的相同性表明orf6也编码一个dNTP-转移酶，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf6与核苷酸转移酶PF00483的E值为3.3×e^-30，因此将orf6暂命名为orf6。Orf7与Pseudomonas aeruginosa的氧化还原酶在336个氨基酸中有35％的相同性，59％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现Orf7与氧化还原酶家族PF01408的E值为4×e^-05，因此将orf7暂命名为orf7。orf8与Pseudomonas aeruginosa的NeuA在223个氨基酸中有55％的相同性，70％的相似性，较高的相同性表明orf8也是一个编码NeuA的基因，命名为nnaC。Orf9与VIbrio parahaemolyticus的脱氢酶在253个氨基酸中有64％的相同性，80％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现Orf9与脱氢酶家族PF00106的E值为2.8×e^-08，将orf9暂命名为orf9。Orf10与Methanosarcina acetivorans C2A的乙酰基转移酶在174个氨基酸中有32％的相同性，54％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现Orf10与细菌的己肽转移酶PF00132的E值为6.3×e^-11，将orf10暂命名为orf10。Orf11与Versinia enterocolitica type O8的O-抗原转运酶在398个氨基酸的序列中有24％的相同性，44％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwa rz，E.etal(1984).Analysis ofmembrane and surface protein sequences with the hydrophobic momentplot.J.Mol.Biol.179：125-142]发现orf11有12个潜在的穿膜区，它与许多Wzx蛋白相似，而且在Wzx蛋白的氨基端有一个大约40个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf11是wzx基因，命名为wzx。Orf12与Bacillussubtilis的糖磷酸转移酶在206个氨基酸中有26％的相同性，43％的相似性，将Orf12暂命名为Orf12。blast比较表明orf13与许多Wzy蛋白相似，例如，和Escherichia coli O157：H7在304个氨基酸中有26％的相同性，44％相似性。另外通过Eisenberg算法得知orf13有10个潜在的穿膜区，与其他的O-抗原聚合酶有相似的二级结构，有一个大的loop，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以确定orf13是wzy基因，命名为wzy。在genbank中寻找保守的功能域，发现orf14与糖基转移酶家族PF00535的糖基转移酶相似，E值为1.3×e^-39，通过进行blast比较发现，orf14与Escherichia coli的糖基转移酶在242个氨基酸中分别有48％的相同性，69％的相似性，说明它们之间有较高的同源性，因此推测orf14也是一个糖基转移酶基因，暂命名为orf14。

实施例6：特异基因的筛选

针对大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

在表1中列出了大肠杆菌O61的O抗原基因簇的转运酶基因、聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166种血清型的大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166种血清型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。

表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共13组。它们的来源都列于表中。

在第3组中含有大肠杆菌O61的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是不含有大肠杆菌O61的基因组DNA，作为阴性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性2分钟后，95℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ul PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第3组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O61及其O-抗原都是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O61中筛选到对大肠杆菌O61的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O61的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O61是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O61，并能鉴定它们的O-抗原。

实施例7：引物灵敏度的检测。

购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O61的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的10333至10350碱基的核苷酸和10869至10886碱基的核苷酸，SEQ IDNO：1中的10020至10037碱基的核苷酸和10980至10997碱基的核苷酸，SEQID NO：1中的12267至12284碱基的核苷酸和12870至12887碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的12536至12553碱基的核苷酸和12874至12891碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O61的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O61的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

根据本发明的对大肠杆菌O61型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表3是大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构，共由14个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

                 SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>对大肠杆菌O61的O-抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>Patent In version 3.1

<210>1

<211>15461

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

attcagctga ctgatgctat tgccgaactg gcgaaaaaac agtccgttga cgccatgctg      60

atgaccggcg acagctacga ctgcggtaaa aaaatgggct atatgcaggc gttcgtgaag     120

tatggactac gcaacctcaa agaaggggcg aagttccgta aaggtattga gaagctgtta     180

agcgaataat gaaaatctga ccgaatgtaa cggttgataa gaaaattata acggcggtga     240

agattcgtgg cgaaagtaat ttgttgcgaa tattcctgcc gttattttat ataaacaatc     300

agaataacaa cgagttagca ataggatttt agtcaaagtt ttccaggatt ttccttgttt     360

ccatagctga ttggtaagac aattagtgtt tgaatttttc aggtttagcg cgagtgtgta     420

acgctcgtca catcgtaggc atgtacgcag tgctctggta gctataaagc caggggcggt     480

agcgtgtgca aatctgagtt aaggcagcga ttgtgggggc tataggtatg tatagctgct     540

cgttctgtag atatgcttga accagagcag cttctgactc aggcatgtcg tcgcaataat     600

atttaatcaa cgggatcgta aaatgggtaa tattctccaa cttattggac gcaataaagc     660

attattcggt gatgatgtat ctgaaaatga agaagaatta caaagaattg tcgctacatc     720

ccgttttttg gttctgggcg gtgcaggctc tatcgggcag gctgttacaa aagagatatt     780

taaacgtaat cctcaaaagc tccatgttgt cgatattagt gaaaataata tggttgagct     840

ggtacgagat atacgtagct ctttcggtta tattgatggg gatttccaaa cctttgctct     900

ggatattggt tcggttgagt atgacgcatt tatcaaagct gatggaaaat acgattatgt     960

cctgaatttg tcagcgctta agcatgttcg cagtgaaaaa gatccgttta ctttaatgcg    1020

tatgattgaa gtaaacatcc ttaatacaga gaaaactatt caacaatcta ttgcagccgg    1080

tgttaagaaa tttttctgtg tttctaccga taaagccgca aaccctgtga atatgatggg    1140

ggcttccaag cgtattatgg aaatgttcct gatgcgcaag agcgaagaga tcgctatttc    1200

tactgctcgt tttgcaaatg tagcattttc agatggctca ctgcttcatg gttttaatca    1260

gcgactgcag aaacaacagc caattgtggc tcctcacgat atcaagcgct attttgtgac    1320

tccacaggaa tctggtgagt tgtgtttgat gtcctgtatc ttcggcgaga atcgtgacat    1380

ctttttcccc aaattaaatg aggcactgca tcttatctcc tttgccgata tcgcagtttt    1440

gtatttgaaa cagcgtggct acgaacctca tctctgtgag acggaagatg aggctcgtgt    1500

gttggcgaaa actttgccag cgcagggaaa gtggccatgc cttttcacat ccagcgacac    1560

cactggtgaa aaagatttcg aggaattttt taccgacaaa gaggtgcttg atatgaagcg    1620

ctttattaat ctcggcatta tcaagaatga tccactttac gatcccatgc ttttagacca    1680

ttttaaagaa aaaattgagc acatgagggc gtcgctggag tggagtaaaa aagacattgt    1740

aaaactgttt tttgaaatga ttccagattt tgggcataaa gaaacaggta aatatcttga    1800

cagtaaaatg taagtaggcc tcctcgtatg aatatcaatt caattatcga atttgtccga    1860

gacgtataca aaacgaatga gtttattcct ttgcatgcgc cagtttttga tggcaatgaa    1920

aaaaaatatg tattagatac acttgaaagc accttcgttt caagcgtagg caaatatgtc    1980

gatgactttg ggcgcaagat ggaggcttat actggaacgg cgagagctgt tgcgacagta    2040

aatggtactg cggcattaag tgctgcgctg tatctggctg gggtgaagcg cggcgactta    2100

gtggttaccc aagcgctgac ttttgttgca acctgtaatg ccctttatca tttgggggct    2160

gaacctgtat ttatagatgt ctcgcctgtc agtctcggtc tttgccctgt tgcgctggat    2220

agctggcttt ctgaaaatac cgagctgact gagcatgggt gccagcatcg tacaacacat    2280

cagattgttc gcgctgtggt gccaatgcac acttttggtc atcctgttga aatggatgaa    2340

cttattgcgg tctgcaagaa gtggcgaatt gttctggtag aagatgcggc agaaagcttg    2400

ggttcctttt ataaggggct gcatactggt acgcttggtg agtatggggc tctgagtttt    2460

aatggaaata agattatcac tactggtggt ggtggtatgg ttttttgtcg cgcgtctgag    2520

gaaggtgtgc gagcgaagca tgtcaccaca accgccaagg ttccacatcc atatgagttt    2580

taccacgatg agcctggttt taactaccgt atgcccaacc tgaatgctgc tctgggatgt    2640

ggacaaatgg aacgattgga tatgttttta aagcaaaaac gcacgcttgc ccagcgttat    2700

caaacattct tcgaagggtc tgagtttaaa ttcgttaaag aacctcaata tgctcagtct    2760

aattactggc ttaatgccgt aatctgtgaa aacttggatt cacgtgacgc tattttggca    2820

caaatgaatg aagcaaaagt gatgacacgc ccgatatgga aactgatgca ccgcttacca    2880

atgtttgagc acgcaatgcg ggatgatctt aaaaactctg agcaaattga ggctcgcttg    2940

gtcaacttgc ctagctctcc tgtggaataa gtgcgatgac aacaacaaca cgcaaggtcg    3000

cagtttttac cggaactcga gcagaatatg gattactcta ttggttaatg aaggacatcc    3060

agagcgacga ggagctgcaa ctgcaactgc tcgtcagtgg tatgcacctt tcccctgaat    3120

ttggcagtac atggcaacag atcgagcagg atggtttttc aattgatgag aaaattgaaa    3180

ttttgctctc ctctgattct ccggtcggta tagcaaaaag catggggttg ggggttctgg    3240

ggtttgctga tgcattatcc cggctgaaac ctgatgtttt ggtcattctt ggcgatcgtt    3300

ttgaagctct tgcggcggcg caaaccgcga tgattcttcg tattcctgtt ttccatctac    3360

atggcggtga aattactgaa ggtgcctacg atgatgctat taggcacgcc atcacgaaat    3420

tgagttattt acacggtact tccacggaag aatataaaaa ccgtgtcgtt cagttgggtg    3480

aaaatccggc tcgtgttact aatgtgggtg ctattgggtt agagcatctg aagcgtagca    3540

agtttatgac ggtcgaagag ttatcaacat cattgaattt ttcgctaaaa aagccgtatg    3600

tagttgtcac atatcatccg gttactttag gtgatgagcc tgctgaggcg agctttacag    3660

cattgctgga cgcgcttgat aaatttcccg agcttcaggt tatcctgacc tacccgaatg    3720

cggatgatgg cggcagaaaa attattcctt tacttgaagc ttatgctgct aaatcacctg    3780

aacgcgtcaa agctatcccg tcacttggac agatgcgtta tctaagtgcg gttaaatatg    3840

cttcagcggt ggtgggaaac tcttccagcg gcataattga ggtgcctgct ctcgacgttc    3900

ctacggtaaa tattggcgtg cgtcaaaaag ggcgtattgc cgcgcaaagc gtactcaatt    3960

gtgatgctac aacggaatct atcactgctg cactaacgag tgcgatttcg cgaagttaca    4020

taagggaagg agaaaaaata tccaatcctt atgggcaagg gaatgcgagt gctaagatca    4080

ttgagatgat caaatccatg aattttgtac cgagcaagac attctacgac attaagtgaa    4140

attgtatgac gcttattatt gctgaagccg gtgttaacca caacggcgac gaaaaactgg    4200

cttttaaact tgttgatgct gctcataaag caggtgctga tatcgtcaaa tttcagacgt    4260

tcaaggcgaa aaacttggta acagctgaag cagtacaggc ggactatcag gttgcgaaca    4320

ctaagaagca agaatcacag ttagaaatgc taagtcggtt ggagctttca tgggaagctc    4380

accacaagct ggttagttat tgtaataaac ttggtatcga attcctttca accgcctttg    4440

attccgagag cttggatttt cttgttaatg agcttggcgt caaaaggcta aagttacctt    4500

caggtgaatt gactaacgcg cctttggtac ttgagcatgc gcgcactggt tgcgacatta    4560

ttgtctcaac gggaatggcg acattggctg agattgaggc cgcgttgggt gttattgctt    4620

tcggatatac agcgcctgaa gaggcagtgc cgagtattga agcttttcag cgtgcgtact    4680

cgtctgaggt tggtcaaaaa gcgcttaagg aaaaggttat cgttcttcat tgcactacgg    4740

aatatcctgc gccagtggaa gagattaatc tacgtgctat ggatacgttg cgtcaggcgt    4800

ttggattacc tgtggggtat tccgatcaca gtgaagggat aatgattcct gtggccgctg    4860

ttgcacgtgg tgcggttgtg atcgaaaaac acttcacact tgataaaaac atggaaggac    4920

cggaccacaa agcatcgctg gagcccgttg aactggaggc aatgattgcc gctattcatc    4980

agatagaaaa agcgctaggg aatagcatta aagcgcctac tgtgtcagaa atcaaaaaca    5040

agagtgttgc gcgaaaaagc ctagttgctg caaaaactat tatagcgggg gaaagcttca    5100

catccgataa tctggcaata aagcgccctg gtacaggtat gtctccttat ttatattgga    5160

atttaataaa tgaagtttct gaaaatgatt atttaccggg ggagttgatt agtgaatgat    5220

aatcttcaga gaaaaccact tgttattatt ggtgggggag ggcacgctag cgtaattgtt    5280

gatattttga aaagacagaa gcgagagatt gttgctatta ttagccctga tgatatcact    5340

cagcgaaagg tatattcagg aattgatgtt ttttcgaatg ataatgaaat ctttcgtttc    5400

caaccaaagg atattcgctt aattaatgga attggtgcct taccagactc ggaagttagg    5460

tataaagtta atttgtactt tgaaaaaatg ggctattgtt ttgaaacaat tgtagctgat    5520

aacgcatatg tgtcaccctt tgcctttttg gaagaaggag tacagatatt tcctggtgcc    5580

ataattcaac cagggacaca tattggtgcc catactatta ttaatacccg tgtagtcatt    5640

gagcatgatg tatctctcgg tgcatataac gcaatctctc ctggggctat aatatgtggg    5700

cagtgtaaaa ctgaagagcg tgtattcatt ggtgcaggtg caattgttat tcagaatatt    5760

gaaatcggat caagagccac aatcatggcg aacgcactgg tagcagaaaa tatacatccc    5820

caacaaaaag tttatgcttc acgcggtata gtcagataat gtttcagaag gtatataatg    5880

aatcagcaat ggaaaaatgt attaatctca ccagatagct cgatacttga agcactcgaa    5940

attatcaata acgaagcatt aagagttgcg ctggtagtta atgagaataa cacgttatta    6000

ggagtcatta ccgatggtga tattcgaaga ggaattttga aaaacctgcc tctgactgca    6060

gaagtacacc aggttatgaa taaaaaaccc gtaacggcaa gtccagttct ttccaaaaaa    6120

gaactcaata atctgatgtc atcgcatggg atactgtcta taccaatagt cgataagggt    6180

atcattgtgg ggctggagac tattacaagc atcgctgcaa cggaaaaata tgataatcct    6240

gtttttatta tggccggagg gtttggtact cgtttgagac cactcactga taattgccct    6300

aaaccaatgc ttaaagtagg tgataaacct attttagaga cagtggtaag aagctttgtt    6360

aaagcagggt ttagtaattt atatatatca acccattttc tgccagatat gattcatcag    6420

cacttcggtg atggtgatgc gtttaatgca aaaatcacct atatacatga agaaactccc    6480

ttaggtacgg gaggagcgct gggattgctt cctgactcct tatcagattc tttgccactc    6540

attatgatca atggtgatgt gcttaccaat attgattttg agcggttact atcatttcat    6600

aataataaca atgcggatgc tacaatctgc gtaagaaaat atgactacca gatcccatat    6660

ggtgttataa caggtaatgg taataaaata gtcagtatgg ttgaaaagcc agtacatcat    6720

ttctttgtta atgcaggaat ctatgttgtt tctcccgata tttttaaatc agtacccaaa    6780

aaccatcgaa ttgatatgcc gacgttactc gaacaattta tgagtaagaa taaagagata    6840

ctaatgttcc cgattcatga gtattggctt gatatagggc gaatagatga ttttaatcgg    6900

gcacaggccg atattcattc tttagggctg gattaaaaat gaaaaaggtc gctgtaatcg    6960

ggctgggaaa tatcgcaaca agacatcgcc acaatcttaa aaaacttttt ccaggaatta    7020

ttgttttttc tatgtcttca agtgagcgag tgctatccga gttagtgagt gactgtgatg    7080

gtcacttagc taatgtagat gctatcatac aagagcaagt cgattttgta attgtagcat    7140

caccagcaac ttaccattta cggcatagtg aaaaactttt ggcagcagga attccctact    7200

ttttattgaa aaaccctgtt acagcttcgt ttgatgacgc taagaagtta catgaaatag    7260

ctgaaagaca cgcaactccg gtggctatag gatattgttt acgctatttg ccttctgcaa    7320

aaataattaa aaaaataatt gaggataaat ttattggcag tatttacaat gtcaatattg    7380

agattggtca atatctgccg gattggagac cgtcaaaatc atatcgtgaa agtgtatcag    7440

caagtaaagt tttgggtggc ggagcgctac tcgaattaag tcatgagctg gattatgcgc    7500

aatggctatt tggtgaactg aaacttgtga attcagtgct acggacttcg tcagaacttg    7560

aaatggatgt cgaatcttta gctgatatta tagtgataaa ttccgccggt tcgcttatta    7620

atatccatct tgatttcctt caaaagaaac catggcgaca atgtcatatt attggcagta    7680

agggacgaat tgtctgggat cttatccgca atgaaatcat tcatcatact cgacagagta    7740

ccgatattat ctttagtgat cctggctggg ataaaaatgg tatgtataca gatatgctgc    7800

tcgacttcat tgcggaaata tccgggagtg ataacaactg tgtgacattg gagtcatcaa    7860

taaatattgt tagcttaatt gataagataa aagaaacaag tcaatgcctt ggagaagttc    7920

aatgaaaata aacgctttta tatttgcacg tgggggatca aaaggattac ctggtaaaaa    7980

tattaaacct ctagcaggca aacctctcct gcaatactct attgagactg ccaaacagag    8040

tccttcgatt tcctctatat atgtttcaac cgacgatgat gatattgctc tcgttgcaga    8100

aaattgtggt gctactgtta ttcgtagacc ggcggagctt gccggagata ctagtccaga     8160

atggttggca tggcgtcacg caattgagtg ggttcagaag gaagtggggg atttcgatgg     8220

ctttgtaagt ttaccgacta caagcccttt gcgaagtgtc gatgatgtcg aatgtgctat     8280

tgctaaaaga gtcgagtctg gtgctgacat atgcatttca gtcactccgg cgagcagaag     8340

tccttatttt aatatggtaa aatttcacga aagtggttat gtgaggcttg tcaatgaacc     8400

ggaagggaaa gtgctcagac ggcaggattc accagacgta tttgatatta ctactgttgt     8460

gtacgcgaca acgccaaaat ttgttttgaa taattatggg ctattctcag gcaaagttgc     8520

aagcattatt gttcctaaag aacgtgccgt tgatatagat gatatttttg atttttacat     8580

ggcggaaatt ttacttaagg aattgaatcg tggctaatat acttaaaggg aaaaaaatcc     8640

ttattgctgg tgccggtgga ttgctaggca ctcatcttgt taaaaaagtc atagatgaag     8700

gtggttatgt tattgccggt gattttgact tagtgtcaac acagaacaaa ttaaatgagc     8760

tgggtatcac aactggatat gaattacatc aacttgatgt aacaagtctt gaatctgttc     8820

aggaaatact agccattgca cctgatctgg atggtgctat taatacgact tatcctcgaa     8880

ataaaactta tggtgcccac ttttacgatg taacgctgga aagtttcaac gaaaatcttt     8940

cgttgcatct tggaagttca tttcttttct cacaacagtg tgcagcatat ttcaaaaaaa     9000

atcagcgttc attttcactt gtaaatattt cttctattta tggtgtcgtg gcaccaaaat     9060

tcgaaatata cgaaaatact aaaatgacga tgcctgttga atatgcggca ataaaatcgg     9120

cattgttaca tttaaacaaa tatattgtag cttatgttag agatagtcga tttagagtta     9180

atgctgtaag ccctggcggt atttttgatc atcaaccaga tgctttttta gaagcatata     9240

aaaaagaaac taatggtgca gggatgcttg gtgttacaga aatgcttgga agtattgtat     9300

ttttgctttc tgatgcgtca aaatatgtaa cgggacaaaa tattattgtt gatgacggct     9360

tttcattatg atttctttta taaaaaaaat aaaattttgg attgtgtgca acaggttagg     9420

acctgatata ccacttagtc acttattatt atattcacgt cgcttggggc gtatgatttg     9480

taaacggaaa ttcaaaagtt ttggcaataa ctcttctttt cggccttttg catatgctat     9540

tgaaacacaa aagattgcta tcggtgataa tgttgttatc aggcctggta caatgttatt     9600

tgcttcacca tatggtgaag aaaaaaaact tcatatcctt attgaagatg atgttttaat     9660

tggttcttct gtacatattt atgtatccaa ccataagttt tttgatataa cattacctat     9720

ctctaagcaa ggtcattcag tggtgaaacc tgttattctg aaaaaaggtt gttggattgg     9780

tgctaatgta accattttac ctggagtggt agtcggtgaa aattcggttg ttggtgcaaa     9840

tagtgtagtt acgaaaagta tctctccttt tacagttgtt gcaggaaacc cagccaaaat     9900

tataaagaaa ttaaatgagt gaatataaaa gaatttttca gtatttagca tttgacctta     9960

caaataaggt tttaccattc gtagttccat actttattgc ttcctatttg agttcagtag    10020

agttagggta ttatacaact aaacagcttt tatttttact gttctttaat atcataagta    10080

tggggggagg cgcaaaatta ctagtctcta tctcaaagaa agatggagag gagaaaaaaa    10140

tctcatccat tttattaaaa atgttttgtt ttaatgcctg tgttatttta tttttttatg    10200

tattacttcc ttttttcatt gttagtgaaa atgtaattaa agattatata ccattggtaa    10260

tatgctcttt attttattct attatacagc tgcaattgtc gatttataga ggatataata    10320

gaataaatgc ttacgggatg ttaaatctaa gcctctcagt ttgtgtttgt atcgtgatat    10380

tcagttatat attatatttc aaaacgcaac tagggttatg gtattggcta attataccat    10440

atgcactttt ttctattaaa tttttgaaata ttatctgac agagcgagta ttatcatctg    10500

ctgttttact tgatacatta aaattttgtt tttatcaatt tcctcatgtg ctaagttcgt    10560

ggtgtcgttt aggtattgat aggctatttt tggctaatat attcgctatg tcattggttg    10620

gatactactc aatgatgctt cagtttggtt tgattgttag cgcagtactt cagtcattga    10680

ataattatta ttccccttat ctcttcagag ttctctcaga aagacaatcg tataaaaaac    10740

tgtctctatt tagtaaaaat aataaagctg ctcgttcatc gtttctgttt tttgtagcct    10800

cttttgttat cgttatagtg gtgaatattt ttgcatatgt cgttgttcat tattttttac    10860

ccagcgagta ttctccatat tactatctgg taccattggt tacttttgcc tatggattgc    10920

aaggatgcta ctttgcagtt gttaattata tttatttttg ggggaagact cagtatctta    10980

atatcccatc gatattatca tgcttatttc aggtggtaat tggctacttc tttatcttac    11040

atttctctct attgggagca tcattaagtt tattaatgtc ttggagtttg caactgctat    11100

ttacattagg gggggtgatg tatgttgcaa aaaacaaata aaaagggatt tcaattggct    11160

ttagttgagt ccttactgca actaaaaact ttagatagtt attctggaaa taataaaaat    11220

aacattcatc tttttgttcg actaaatggt gagcagaaaa atgaggagga gatactcaat    11280

tttattaaac caagagcatg tcattattct tcagttcaat ttgtaagcat tcgacgaaat    11340

gataagttct ctttactctt taatattctg aaattaagat tatttctttt ttgtaaacga    11400

aaggtaattt tgatcattgg tgatccacgc gctctgtgga tgaatatgat atcatcgttt    11460

aaaaatgttc atgatgtaat atacttagag gatggaatgt caacagtcct cttttatcag    11520

acctttaaac ctaagtaccc acataaacat tataaactgg ttacacgcct gaaactggat    11580

ggtaatgcct ttctgtctct tattcctttg gaagtaaaaa agaatacggt tatgcggatc    11640

gacaatgatg tggctttgtt catcggtatg ccgatgattg aaaataacgc gttgagtaaa    11700

aagaaatatt tatcttatct gcataaaatt attatgtctt tgaagaatat gaagataaca    11760

aagttttatt atgctcccca tagatatgaa aatgaaaata atttttattt atatgagaat    11820

ttgggttttc atatgttaga tacagattgt gctattgaag attatctcaa cagcaagaac    11880

attatcccgg cggtgtatgc tagtttttat tcaacagcct tattacagat agatacttta    11940

ttttatggag ttagtgttat ttgttatgta attaatgttg aagagttgaa ttatgacttt    12000

cgtaatccag cattatatgc atatgaatat tataacaaaa ctccctctat tataaaggtt    12060

gatttgcatg attgaatttt tattgttcat attatgtagc tttatcttat atcaggtttt    12120

ttatgttact aaggaattta agagtaatct tttcttaatc atgtgggggt atacttttct    12180

attcgtaact cccgttatat acatttttta tggtggtgag aaatatcgtg tctttagtga    12240

tgaaagtgca ttaacatttt atttgttggg ttgtctctcc gctgcgttta taattttaat    12300

gcttctgttc aaggtttcac ttaaccgaat aaaaatatgt aaaatcaatt tatttatctc    12360

cgattttata ttaaaaatta tattttcttt ctgtataatg tttgttgttc tttatattct    12420

attttattgg agggagtggc ctttttttga ttttgtctcg ggagatatct cagaccgtcc    12480

ggatattgta aaaggaacct ttcaaggttt ttttatctat tctttattta cgagcataat    12540

aatccccggg atatattttc atttaaaaga taaaaaagga aaattgttta atttactttt    12600

ctttattttt gtttgtttta gtatggtggt aagtggtaat aaaggtgttt ttctatattt    12660

tattattttt aatgtgttat ttgaatggaa aaagatacgt ctaagtacgt attt9attat    12720

tatcgtaggt ctgatggcta tctatgcctt aattcgtctg ccatttatag gtgacaattt    12780

ttctttatca tatctaattg aatcgatatc tgagaggatt tttttaacgc aagggatggc    12840

tatgccagcc gttatcgagt tagcaaagtc aaccgatgtg acaatgatga actctaatga    12900

tctaaaatac acacttttta atttcgttta tggctatagc cccggttcga tgcctctttt    12960

ttatacagct gaattatatg tcaggtatgg ttggttaatg atgtctttca tatctgtaat    13020

aatttcgctt gtatttggat ttggtgcatt tgttattaat aagacaaagg attctgccat    13080

tagatgggtt tattatatct ctttatatgc actaataatg ggaggggtag gaagtgctaa    13140

tcttttcttt tttattgtgg caattttatg gtggttatta ttaactctca gtaatggaac    13200

aattacaagt aggagtggca agtgattgca gaagtatcaa taattatgcc gatgtacaat    13260

gctgaacatt atgtcagagc gtcaatttgt tcaattttaa atcagacgtt taaaaatttt    13320

ttattatata ttattgacga ctgctctacg gattcatcaa agcagattgc tgaatctttt    13380

aacgacccgc gaataatcat tatttcgaat gctatcaatg ttggagttgc tcgaactcgt    13440

aataaaggaa tagagcttgc gcagacgaaa tatatcgcat tttgtgatag tgatgatatc    13500

tggcatgagc aaaaactgga aaaacaaatc tcactacttg atagtgggaa atataatgtt    13560

gttggaagtt tttactcaac ttttaaggat ggaaagtttg aaagtgcaaa gttaatatct    13620

gcgcctgaac ttgtttgtta tcgtgatatg cttaaatcta attggattgg taatcttact  13680

ggcatttata atgcttatgt tttaggtaag gtttttcaac aagaaattgg tcatgaagat  13740

tatgtaatgt ggttgaaact tattgaaaaa agtcgagttg cttacattat tcaagaacct  13800

ttggcttatt ataggattag gtcctcatct ctttcttcga ataaaatgaa agcttgcttg  13860

tggcagtgga gaatttatcg gaaaatgctt cattttaata tttttagaac ttcttgttat  13920

atgttctttt atattattgc tgcattaaat aaaagacggt aattatttaa tgcacatatt  13980

ttataagtga gtaaatttta caattactgg gttaatttaa ggggtggaat atttctgtta  14040

ttgtttatgt ttttaatata gaatcgatgt aaattaaaac ctcacaggtc gtgtggagac  14100

cgcatctgac aggagtaaac aatgtcaaag caacagatcg gcgtcgtcgg tatggcagag  14160

atggggcgca accttgcgct caacatcgaa agccgtggtt ataccgtctc tattttcaac  14220

cgttcccgtg aaaagacgga agaagtgatt gccgaaaatc caggcaagaa actggttcct  14280

tactatacgg tgaaagagtt tgttgaatct ctggaaacgc ctcgtcgcat cctgttaatg  14340

gtgaaagcag gtgcaggcac ggatgctgct attgattccc tcaagccata cctcgataaa  14400

ggtgacatca tcattgatgg tggtaacacc ttcttccagg acaccattcg tcgtaaccgt  14460

gagctttctg cagaaggctt taactttatc ggtaccggtg tttccggtgg tgaagaaggc  14520

gcgctgaaag gtccttccat tatgcctggt gggcagaaag aagcctatga actggttgcg  14580

ccgatcctga ccaaaatcgc cgcagtggct gaagacggtg agccatgcgt tacctatatt  14640

ggtgccgatg gtgcaggtca ctatgtgaag atggttcaca acggtattga atacggtgat  14700

atgcaactga ttgctgaagc ctattctctg cttaaaggtg gtctgaacct ctccaacgaa  14760

gaactggcgc agacctttac cgagtggaat aacggtgaac tgagcagcta cctgattgac  14820

atcactaaag acatcttcac taaaaaagat gaagacggta actacctggt tgatgtgatt  14880

ctggatgaag cagctaacaa aggtaccggt aaatggacca gccagagcgc gctggatctc  14940

ggtgaaccgc tgtcgctgat taccgagtct gtgtttgcac gttatatctc ttctctgaaa  15000

gatcagcgtg ttgccgcatc taaagttctc tctggcccgc aagcacagcc agcaggcgac  15060

aaggctgagt tcatcgaaaa agttcgccgt gcgctgtatc tgggcaaaat cgtttcttac  15120

gctcagggct tctctcagct acgcgccgcg tctgaagagt acaactggga tctgaactac  15180

ggtgaaatcg cgaagatttt ccgtgctggc tgcatcatcc gtgcgcagtt cctgcagaaa  15240

atcaccgatg catatgccga aaatccgcag atcgctaacc tgatgctggc tccgtacttc  15300

aagcaaatcg ccgatgacta ccagcaggcg ctgcgcgatg tcgtcgctta cgcggtacag  15360

aacggtatcc cggttccgac cttcgccgct gcggttgcct attatgacag ctaccgcgcc  15420

gctgttctgc ctgcgaacct gatccaggcc cagcgcgact a                      15461

表1大肠杆菌O61的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物位置	反向引物位置	PCR产物长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								wzx	O-抗原转运酶	9915-11141	10333-1035010020-10037	10869-1088610980-10997	544bp978bp	00	6060
wzy	O-抗原聚合酶	12068-13225	12267-1228412536-12553	12870-1288712874-12891	621bp356bp	00	6060

表2166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号                   该组中含有的菌株                      来源

1、野生型大肠杆菌  O1，O2，O5，O7，08，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，    IMVS^a

                   O19ab，O20，O21，O22，O23，O24

2、野生型大肠杆菌  O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，    IMVS^a

                   O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43

3、野生型大肠杆菌  O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，    IMVS^a

                   O57，O58，O60，O61，O62，O53

4、野生型大肠杆菌  O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，        IMVS^a

                   O79，O80，O81，O82，O83，O68

5、野生型大肠杆菌  O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，        IMVS^a

                   O101，O102，O103，0104，O105，O106，O97，

6、野生型大肠杆菌  O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，           IMVS^a

                   O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117

7、野生型大肠杆菌  O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，         IMVS^a

                   O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140

8、野生型大肠杆菌  O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，         IMVS^a

                   O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153                 b

9、野生型大肠杆菌  O168，O169，O170，O171，O172，O173，                           c

   痢疾志贺氏菌    D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13         d

10、鲍氏志贺氏菌   B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， d

                   B16，B17，B18

11、福氏志贺氏菌   F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，     d

                   DS，DR

12、野生型大肠杆菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，IMVSa

                   O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119

13、野生型大肠杆菌 去除大肠杆菌061的第3组菌

为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阴性对照

a.Institude of Medical and Veterinary Science，Analaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自

于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3是大肠杆菌O61的O-抗原基因簇的结构表

      orf1   orf2   nnaA  nnaB    wckDorf6   orf7 nnaC orf9 orf10  wzx    orf12  wzy   orf14

1kh

表4是大肠杆菌O61的O-抗原基因簇中的基因的位置表

ATTCAGCTGA CTGATGCTAT TGCCGAACTG GCGAAAAAAC AGTCCGTTGA CGCCATGCTG    60

ATGACCGGCG ACAGCTACGA CTGCGGTAAA AAAATGGGCT ATATGCAGGC GTTCGTGAAG    120

TATGGACTAC GCAACCTCAA AGAAGGGGCG AAGTTCCGTA AAGGTATTGA GAAGCTGTTA    180

AGCGAATAAT GAAAATCTGA CCGAATGTAA CGGTTGATAA GAAAATTATA ACGGCGGTGA    240

AGATTCGTGG CGAAAGTAAT TTGTTGCGAA TATTCCTGCC GTTATTTTAT ATAAACAATC     300

AGAATAACAA CGAGTTAGCA ATAGGATTTT AGTCAAAGTT TTCCAGGATT TTCCTTGTTT     360

CCATAGCTGA TTGGTAAGAC AATTAGTGTT TGAATTTTTC AGGTTTAGCG CGAGTGTGTA     420

ACGCTCGTCA CATCGTAGGC ATGTACGCAG TGCTCTGGTA GCTATAAAGC CAGGGGCGGT     480

AGCGTGTGCA AATCTGAGTT AAGGCAGCGA TTGTGGGGGC TATAGGTATG TATAGCTGCT     540

CGTTCTGTAG ATATGCTTGA ACCAGAGCAG CTTCTGACTC AGGCATGTCG TCGCAATAAT     600

                    Orf1的起始

ATTTAATCAA CGGGATCGTA AA ATGGGTAA TATTCTCCAA CTTATTGGAC GCAATAAAGC   660

ATTATTCGGT GATGATGTAT CTGAAAATGA AGAAGAATTA CAAAGAATTG TCGCTACATC     720

CCGTTTTTTG GTTCTGGGCG GTGCAGGCTC TATCGGGCAG GCTGTTACAA AAGAGATATT     780

TAAACGTAAT CCTCAAAAGC TCCATGTTGT CGATATTAGT GAAAATAATA TGGTTGAGCT     840

GGTACGAGAT ATACGTAGCT CTTTCGGTTA TATTGATGGG GATTTCCAAA CCTTTGCTCT     900

GGATATTGGT TCGGTTGAGT ATGACGCATT TATCAAAGCT GATGGAAAAT ACGATTATGT     960

CCTGAATTTG TCAGCGCTTA AGCATGTTCG CAGTGAAAAA GATCCGTTTA CTTTAATGCG    1020

TATGATTGAA GTAAACATCC TTAATACAGA GAAAACTATT CAACAATCTA TTGCAGCCGG    1080

TGTTAAGAAA TTTTTCTGTG TTTCTACCGA TAAAGCCGCA AACCCTGTGA ATATGATGGG    1140

GGCTTCCAAG CGTATTATGG AAATGTTCCT GATGCGCAAG AGCGAAGAGA TCGCTATTTC    1200

TACTGCTCGT TTTGCAAATG TAGCATTTTC AGATGGCTCA CTGCTTCATG GTTTTAATCA    1260

GCGACTGCAG AAACAACAGC CAATTGTGGC TCCTCACGAT ATCAAGCGCT ATTTTGTGAC    1320

TCCACAGGAA TCTGGTGAGT TGTGTTTGAT GTCCTGTATC TTCGGCGAGA ATCGTGACAT    1380

CTTTTTCCCC AAATTAAATG AGGCACTGCA TCTTATCTCC TTTGCCGATA TCGCAGTTTT    1440

GTATTTGAAA CAGCGTGGCT ACGAACCTCA TCTCTGTGAG ACGGAAGATG AGGCTCGTGT    1500

GTTGGCGAAA ACTTTGCCAG CGCAGGGAAA GTGGCCATGC CTTTTCACAT CCAGCGACAC    1560

CACTGGTGAA AAAGATTTCG AGGAATTTTT TACCGACAAA GAGGTGCTTG ATATGAAGCG    1620

CTTTATTAAT CTCGGCATTA TCAAGAATGA TCCACTTTAC GATCCCATGC TTTTAGACCA    1680

TTTTAAAGAA AAAATTGAGC ACATGAGGGC GTCGCTGGAG TGGAGTAAAA AAGACATTGT    1740

AAAACTGTTT TTTGAAATGA TTCCAGATTT TGGGCATAAA GAAACAGGTA AATATCTTGA    1800

       Orf1的终止          Orf2的起始

CAGTAAAATG  TAAGTAGGCC TCCTCGT ATG AATATCAATT CAATTATCGA ATTTGTCCGA 1860

GACGTATACA AAACGAATGA GTTTATTCCT TTGCATGCGC CAGTTTTTGA TGGCAATGAA     1920

AAAAAATATG TATTAGATAC ACTTGAAAGC ACCTTCGTTT CAAGCGTAGG CAAATATGTC     1980

GATGACTTTG GGCGCAAGAT GGAGGCTTAT ACTGGAACGG CGAGAGCTGT TGCGACAGTA     2040

AATGGTACTG CGGCATTAAG TGCTGCGCTG TATCTGGCTG GGGTGAAGCG CGGCGACTTA     2100

GTGGTTACCC AAGCGCTGAC TTTTGTTGCA ACCTGTAATG CCCTTTATCA TTTGGGGGCT     2160

GAACCTGTAT TTATAGATGT CTCGCCTGTC AGTCTCGGTC TTTGCCCTGT TGCGCTGGAT     2220

AGCTGGCTTT CTGAAAATAC CGAGCTGACT GAGCATGGGT GCCAGCATCG TACAACACAT     2280

CAGATTGTTC GCGCTGTGGT GCCAATGCAC ACTTTTGGTC ATCCTGTTGA AATGGATGAA     2340

CTTATTGCGG TCTGCAAGAA GTGGCGAATT GTTCTGGTAG AAGATGCGGC AGAAAGCTTG     2400

GGTTCCTTTT ATAAGGGGCT GCATACTGGT ACGCTTGGTG AGTATGGGGC TCTGAGTTTT     2460

AATGGAAATA AGATTATCAC TACTGGTGGT GGTGGTATGG TTTTTTGTCG CGCGTCTGAG     2520

GAAGGTGTGC GAGCGAAGCA TGTCACCACA ACCGCCAAGG TTCCACATCC ATATGAGTTT     2580

TACCACGATG AGCCTGGTTT TAACTACCGT ATGCCCAACC TGAATGCTGC TCTGGGATGT     2640

GGACAAATGG AACGATTGGA TATGTTTTTA AAGCAAAAAC GCACGCTTGC CCAGCGTTAT     2700

CAAACATTCT TCGAAGGGTC TGAGTTTAAA TTCGTTAAAG AACCTCAATA TGCTCAGTC T    2760

AATTACTGGC TTAATGCCGT AATCTGTGAA AACTTGGATT CACGTGACGC TATTTTGGCA     2820

CAAATGAATG AAGCAAAAGT GATGACACGC CCGATATGGA AACTGATGCA CCGCTTACCA     2880

ATGTTTGAGC ACGCAATGCG GGATGATCTT AAAAACTCTG AGCAAATTGA GGCTCGCTTG     2940

                         Orf2的终止  Orf3的起始

GTCAACTTGC CTAGCTCTCC TGTGGAA TAA GTGCG ATGAC AACAACAACA CGCAAGGTCG 3000

CAGTTTTTAC CGGAACTCGA GCAGAATATG GATTACTCTA TTGGTTAATG AAGGACATCC     3060

AGAGCGACGA GGAGCTGCAA CTGCAACTGC TCGTCAGTGG TATGCACCTT TCCCCTGAAT     3120

TTGGCAGTAC ATGGCAACAG ATCGAGCAGG ATGGTTTTTC AATTGATGAG AAAATTGAAA     3180

TTTTGCTCTC CTCTGATTCT CCGGTCGGTA TAGCAAAAAG CATGGGGTTG GGGGTTCTGG     3240

GGTTTGCTGA TGCATTATCC CGGCTGAAAC CTGATGTTTT GGTCATTCTT GGCGATCGTT     3300

TTGAAGCTCT TGCGGCGGCG CAAACCGCGA TGATTCTTCG TATTCCTGTT TTCCATCTAC     3360

ATGGCGGTGA AATTACTGAA GGTGCCTACG ATGATGCTAT TAGGCACGCC ATCACGAAAT     3420

TGAGTTATTT ACACGGTACT TCCACGGAAG AATATAAAAA CCGTGTCGTT CAGTTGGGTG     3480

AAAATCCGGC TCGTGTTACT AATGTGGGTG CTATTGGGTT AGAGCATCTG AAGCGTAGCA     3540

AGTTTATGAC GGTCGAAGAG TTATCAACAT CATTGAATTT TTCGCTAAAA AAGCCGTATG     3600

TAGTTGTCAC ATATCATCCG GTTACTTTAG GTGATGAGCC TGCTGAGGCG AGCTTTACAG     3660

CATTGCTGGA CGCGCTTGAT AAATTTCCCG AGCTTCAGGT TATCCTGACC TACCCGAATG     3720

CGGATGATGG CGGCAGAAAA ATTATTCCTT TACTTGAAGC TTATGCTGCT AAATCACCTG     3780

AACGCGTCAA AGCTATCCCG TCACTTGGAC AGATGCGTTA TCTAAGTGCG GTTAAATATG     3840

CTTCAGCGGT GGTGGGAAAC TCTTCCAGCG GCATAATTGA GGTGCCTGCT CTCGACGTTC     3900

CTACGGTAAA TATTGGCGTG CGTCAAAAAG GGCGTATTGC CGCGCAAAGC GTACTCAATT     3960

GTGATGCTAC AACGGAATCT ATCACTGCTG CACTAACGAG TGCGATTTCG CGAAGTTACA     4020

TAAGGGAAGG AGAAAAAATA TCCAATCCTT ATGGGCAAGG GAATGCGAGT GCTAAGATCA     4080

                                                       Orf3的终止

TTGAGATGAT CAAATCCATG AATTTTGTAC CGAGCAAGAC ATTCTACGAC ATTAAG TGAA   4140

       Orf4的起始

ATTGT ATGAC GCTTATTATT GCTGAAGCCG GTGTTAACCA CAACGGCGAC GAAAAACTGG   4200

CTTTTAAACT TGTTGATGCT GCTCATAAAG CAGGTGCTGA TATCGTCAAA TTTCAGACGT     4260

TCAAGGCGAA AAACTTGGTA ACAGCTGAAG CAGTACAGGC GGACTATCAG GTTGCGAACA     4320

CTAAGAAGCA AGAATCACAG TTAGAAATGC TAAGTCGGTT GGAGCTTTCA TGGGAAGCTC     4380

ACCACAAGCT GGTTAGTTAT TGTAATAAAC TTGGTATCGA ATTCCTTTCA ACCGCCTTTG     4440

ATTCCGAGAG CTTGGATTTT CTTGTTAATG AGCTTGGCGT CAAAAGGCTA AAGTTACCTT     4500

CAGGTGAATT GACTAACGCG CCTTTGGTAC TTGAGCATGC GCGCACTGGT TGCGACATTA     4560

TTGTCTCAAC GGGAATGGCG ACATTGGCTG AGATTGAGGC CGCGTTGGGT GTTATTGCTT     4620

TCGGATATAC AGCGCCTGAA GAGGCAGTGC CGAGTATTGA AGCTTTTCAG CGTGCGTACT     4680

CGTCTGAGGT TGGTCAAAAA GCGCTTAAGG AAAAGGTTAT CGTTCTTCAT TGCACTACGG     4740

AATATCCTGC GCCAGTGGAA GAGATTAATC TACGTGCTAT GGATACGTTG CGTCAGGCGT     4800

TTGGATTACC TGTGGGGTAT TCCGATCACA GTGAAGGGAT AATGATTCCT GTGGCCGCTG     4860

TTGCACGTGG TGCGGTTGTG ATCGAAAAAC ACTTCACACT TGATAAAAAC ATGGAAGGAC     4920

CGGACCACAA AGCATCGCTG GAGCCCGTTG AACTGGAGGC AATGATTGCC GCTATTCATC     4980

AGATAGAAAA AGCGCTAGGG AATAGCATTA AAGCGCCTAC TGTGTCAGAA ATCAAAAACA     5040

AGAGTGTTGC GCGAAAAAGC CTAGTTGCTG CAAAAACTAT TATAGCGGGG GAAAGCTTCA     5100

CATCCGATAA TCTGGCAATA AAGCGCCCTG GTACAGGTAT GTCTCCTTAT TTATATTGGA     5160

                                                  Orf5的起始   Orf4的终止

ATTTAATAAA TGAAGTTTCT GAAAATGATT ATTTACCGGG GGAGTTGATT A GTGAA TGAT 5220

AATCTTCAGA GAAAACCACT TGTTATTATT GGTGGGGGAG GGCACGCTAG CGTAATTGTT     5280

GATATTTTGA AAAGACAGAA GCGAGAGATT GTTGCTATTA TTAGCCCTGA TGATATCACT     5340

CAGCGAAAGG TATATTCAGG AATTGATGTT TTTTCGAATG ATAATGAAAT CTTTCGTTTC     5400

CAACCAAAGG ATATTCGCTT AATTAATGGA ATTGGTGCCT TACCAGACTC GGAAGTTAGG     5460

TATAAAGTTA ATTTGTACTT TGAAAAAATG GGCTATTGTT TTGAAACAAT TGTAGCTGAT     5520

AACGCATATG TGTCACCCTT TGCCTTTTTG GAAGAAGGAG TACAGATATT TCCTGGTGCC     5580

ATAATTCAAC CAGGGACACA TATTGGTGCC CATACTATTA TTAATACCCG TGTAGTCATT     5640

GAGCATGATG TATCTCTCGG TGCATATAAC GCAATCTCTC CTGGGGCTAT AATATGTGGG     5700

CAGTGTAAAA CTGAAGAGCG TGTATTCATT GGTGCAGGTG CAATTGTTAT TCAGAATATT     5760

GAAATCGGAT CAAGAGCCAC AATCATGGCG AACGCACTGG TAGCAGAAAA TATACATCCC     5820

                                   Orf5的终止            Orf6的起始

CAACAAAAAG TTTATGCTTC ACGCGGTATA GTCAGA TAAT GTTTCAGAAG GTATATA ATG 5880

AATCAGCAAT GGAAAAATGT ATTAATCTCA CCAGATAGCT CGATACTTGA AGCACTCGAA     5940

ATTATCAATA ACGAAGCATT AAGAGTTGCG CTGGTAGTTA ATGAGAATAA CACGTTATTA     6000

GGAGTCATTA CCGATGGTGA TATTCGAAGA GGAATTTTGA AAAACCTGCC TCTGACTGCA     6060

GAAGTACACC AGGTTATGAA TAAAAAACCC GTAACGGCAA GTCCAGTTCT TTCCAAAAAA     6120

GAACTCAATA ATCTGATGTC ATCGCATGGG ATACTGTCTA TACCAATAGT CGATAAGGGT     6180

ATCATTGTGG GGCTGGAGAC TATTACAAGC ATCGCTGCAA CGGAAAAATA TGATAATCCT     6240

GTTTTTATTA TGGCCGGAGG GTTTGGTACT CGTTTGAGAC CACTCACTGA TAATTGCCCT     6300

AAACCAATGC TTAAAGTAGG TGATAAACCT ATTTTAGAGA CAGTGGTAAG AAGCTTTGTT     6360

AAAGCAGGGT TTAGTAATTT ATATATATCA ACCCATTTTC TGCCAGATAT GATTCATCAG     6420

CACTTCGGTG ATGGTGATGC GTTTAATGCA AAAATCACCT ATATACATGA AGAAACTCCC     6480

TTAGGTACGG GAGGAGCGCT GGGATTGCTT CCTGACTCCT TATCAGATTC TTTGCCACTC     6540

ATTATGATCA ATGGTGATGT GCTTACCAAT ATTGATTTTG AGCGGTTACT ATCATTTCAT     6600

AATAATAACA ATGCGGATGC TACAATCTGC GTAAGAAAAT ATGACTACCA GATCCCATAT     6660

GGTGTTATAA CAGGTAATGG TAATAAAATA GTCAGTATGG TTGAAAAGCC AGTACATCAT     6720

TTCTTTGTTA ATGCAGGAAT CTATGTTGTT TCTCCCGATA TTTTTAAATC AGTACCCAAA     6780

AACCATCGAA TTGATATGCC GACGTTACTC GAACAATTTA TGAGTAAGAA TAAAGAGATA     6840

CTAATGTTCC CGATTCATGA GTATTGGCTT GATATAGGGC GAATAGATGA TTTTAATCGG     6900

                               Orf6的终止  Orf7的起始

GCACAGGCCG ATATTCATTC TTTAGGGCTG GAT TAAAA AT GAAAAAGGTC GCTGTAATCG 6960

GGTTGGGAAA TATCGCAACA AGACATCGCC ACAATCTTAA AAAACTTTTT CCAGGAATTA     7020

TTGTTTTTTC TATGTCTTCA AGTGAGCGAG TGCTATCCGA GTTAGTGAGT GACTGTGATG     7080

GTTACTTAGC TAATGTAGAT GCTATCATAC AAGAGCAAGT CGATTTTGTA ATTGTAGCAT     7140

CACCAGCAAC TTACCATTTA CGGCATAGTG AAAAACTTTT GGCAGCAGGA ATTCCCTACT     7200

TTTTATTGAA AAACCCTGTT ACAGCTTCGT TTGATGACGC TAAGAAGTTA CATGAAATAG     7260

CTGAAAGACA CGCAACTCCG GTGGCTATAG GATATTGTTT ACGCTATTTG CCTTCTGCAA     7320

AAATAATTAA AAAAATAATT GAGGATAAAT TTATTGGCAG TATTTACAAT GTCAATATTG     7380

AGATTGGTCA ATATCTGCCG GATTGGAGAC CGTCAAAATC ATATCGTGAA AGTGTATCAG     7440

CAAGTAAAGT TTTGGGTGGC GGAGCGCTAC TCGAATTAAG TCATGAGCTG GATTATGCGC     7500

AATGGCTATT TGGTGAACTG AAACTTGTGA ATTCAGTGCT ACGGACTTCG TCAGAACTTG     7560

AAATGGATGT CGAATCTTTA GCTGATATTA TAGTGATAAA TTCCGCCGGT TCGCTTATTA     7620

ATATCCATCT TGATTTCCTT CAAAAGAAAC CATGGCGACA ATGTCATATT ATTGGCAGTA     7680

AGGGACGAAT TGTCTGGGAT CTTATCCGCA ATGAAATCAT TCATCATACT CGACAGAGTA     7740

CCGATATTAT CTTTAGTGAT CCTGGCTGGG ATAAAAATGG TATGTATACA GATATGCTGC     7800

TCGACTTCAT TGCGGAAATA TCCGGGAGTG ATAACAACTG TGTGACATTG GAGTCATCAA     7860

                                            Orf8的起始

TAAATATTGT TAGCTTAATT GATAAGATAA AAGAAACAAG TCA ATGCCTT GGAGAAGTTC   7920

Orf7的终止

AA TGAAAATA AACGCTTTTA TATTTGCACG TGGGGGATCA AAAGGATTAC CTGGTAAAAA   7980

TATTAAACCT CTAGCAGGCA AACCTCTCCT GCAATACTCT ATTGAGACTG CCAAACAGAG     8040

TCCTTCGATT TCCTCTATAT ATGTTTCAAC CGACGATGAT GATATTGCTC TCGTTGCAGA     8100

AAATTGTGGT GCTACTGTTA TTCGTAGACC GGCGGAGCTT GCCGGAGATA CTAGTCCAGA     8160

ATGGTTGGCA TGGCGTCACG CAATTGAGTG GGTTCAGAAG GAAGTGGGGG ATTTCGATGG     8220

CTTTGTAAGT TTACCGACTA CAAGCCCTTT GCGAAGTGTC GATGATGTCG AATGTGCTAT     8280

TGCTAAAAGA GTCGAGTCTG GTGCTGACAT ATGCATTTCA GTCACTCCGG CGAGCAGAAG     8340

TCCTTATTTT AATATGGTAA AATTTCACGA AAGTGGTTAT GTGAGGCTTG TCAATGAACC     8400

GGAAGGGAAA GTGCTCAGAC GGCAGGATTC ACCAGACGTA TTTGATATTA CTACTGTTGT     8460

GTACGCGACA ACGCCAAAAT TTGTTTTGAA TAATTATGGG CTATTCTCAG GCAAAGTTGC     8520

AAGCATTATT GTTCCTAAAG AACGTGCCGT TGATATAGAT GATATTTTTG ATTTTTACAT     8580

                            Orf9的起始Orf8的终止

GGCGGAAATT TTACTTAAGG AATTGAATC G TGGC TAATAT ACTTAAAGGG AAAAAAATCC 8640

TTATTGCTGG TGCCGGTGGA TTGCTAGGCA CTCATCTTGT TAAAAAAGTC ATAGATGAAG     8700

GTGGTTATGT TATTGCCGGT GATTTTGACT TAGTGTCAAC ACAGAACAAA TTAAATGAGC     8760

TGGGTATCAC AACTGGATAT GAATTACATC AACTTGATGT AACAAGTCTT GAATCTGTTC     8820

AGGAAATACT AGCCATTGCA CCTGATCTGG ATGGTGCTAT TAATACGACT TATCCTCGAA     8880

ATAAAACTTA TGGTGCCCAC TTTTACGATG TAACGCTGGA AAGTTTCAAC GAAAATCTTT     8940

CGTTGCATCT TGGAAGTTCA TTTCTTTTCT CACAACAGTG TGCAGCATAT TTCAAAAAAA     9000

ATCAGCGTTC ATTTTCACTT GTAAATATTT CTTCTATTTA TGGTGTCGTG GCACCAAAAT     9060

TCGAAATATA CGAAAATACT AAAATGACGA TGCCTGTTGA ATATGCGGCA ATAAAATCGG     9120

CATTGTTACA TTTAAACAAA TATATTGTAG CTTATGTTAG AGATAGTCGA TTTAGAGTTA     9180

ATGCTGTAAG CCCTGGCGGT ATTTTTGATC ATCAACCAGA TGCTTTTTTA GAAGCATATA     9240

AAAAAGAAAC TAATGGTGCA GGGATGCTTG GTGTTACAGA AATGCTTGGA AGTATTGTAT     9300

TTTTGCTTTC TGATGCGTCA AAATATGTAA CGGGACAAAA TATTATTGTT GATGACGGCT     9360

Orf10的起始Orf9的终止

TTTCATT ATG ATTTCTTTTA TAAAAAAAAT AAAATTTTGG ATTGTGTGCA ACAGGTTAGG   9420

ACCTGATATA CCACTTAGTC ACTTATTATT ATATTCACGT CGCTTGGGGC GTATGATTTG     9480

TAAACGGAAA TTCAAAAGTT TTGGCAATAA CTCTTCTTTT CGGCCTTTTG CATATGCTAT     9540

TGAAACACAA AAGATTGCTA TCGGTGATAA TGTTGTTATC AGGCCTGGTA CAATGTTATT     9600

TGCTTCACCA TATGGTGAAG AAAAAAAACT TCATATCCTT ATTGAAGATG ATGTTTTAAT     9660

TGGTTCTTCT GTACATATTT ATGTATCCAA CCATAAGTTT TTTGATATAA CATTACCTAT     9720

CTCTAAGCAA GGTCATTCAG TGGTGAAACC TGTTATTCTG AAAAAAGGTT GTTGGATTGG     9780

TGCTAATGTA ACCATTTTAC CTGGAGTGGT AGTCGGTGAA AATTCGGTTG TTGGTGCAAA     9840

TAGTGTAGTT ACGAAAAGTA TCTCTCCTTT TACAGTTGTT GCAGGAAACC CAGCCAAAAT     9900

            Orf11的起始 Orf10的终止

TATAAAGAAA TTAA ATGAG T GAATATAAAA GAATTTTTCA GTATTTAGCA TTTGACCTTA 9960

CAAATAAGGT TTTACCATTC GTAGTTCCAT ACTTTATTGC TTCCTATTTG AGTTCAGTAG     10020

AGTTAGGGTA TTATACAACT AAACAGCTTT TATTTTTACT GTTCTTTAAT ATCATAAGTA     10080

TGGGGGGAGG CGCAAAATTA CTAGTCTCTA TCTCAAAGAA AGATGGAGAG GAGAAAAAAA     10140

TCTCATCCAT TTTATTAAAA ATGTTTTGTT TTAATGCCTG TGTTATTTTA TTTTTTTATG     10200

TATTACTTCC TTTTTTCATT GTTAGTGAAA ATGTAATTAA AGATTATATA CCATTGGTAA     10260

TATGCTCTTT ATTTTATTCT ATTATACAGC TGCAATTGTC GATTTATAGA GGATATAATA     10320

GAATAAATGC TTACGGGATG TTAAATCTAA GCCTCTCAGT TTGTGTTTGT ATCGTGATAT     10380

TCAGTTATAT ATTATATTTC AAAACGCAAC TAGGGTTATG GTATTGGCTA ATTATACCAT     10440

ATGCACTTTT TTCTATTAAA TTTTTGAAAT ATTATCTGAC AGAGCGAGTA TTATCATCTG     10500

CTGTTTTACT TGATACATTA AAATTTTGTT TTTATCAATT TCCTCATGTG CTAAGTTCGT     10560

GGTGTCGTTT AGGTATTGAT AGGCTATTTT TGGCTAATAT ATTCGCTATG TCATTGGTTG     10620

GATACTACTC AATGATGCTT CAGTTTGGTT TGATTGTTAG CGCAGTACTT CAGTCATTGA     10680

ATAATTATTA TTCCCCTTAT CTCTTCAGAG TTCTCTCAGA AAGACAATCG TATAAAAAAC     10740

TGTCTCTATT TAGTAAAAAT AATAAAGCTG CTCGTTCATC GTTTCTGTTT TTTGTAGCCT     10800

CTTTTGTTAT CGTTATAGTG GTGAATATTT TTGCATATGT CGTTGTTCAT TATTTTTTAC     10860

CCAGCGAGTA TTCTCCATAT TACTATCTGG TACCATTGGT TACTTTTGCC TATGGATTGC     10920

AAGGATGCTA CTTTGCAGTT GTTAATTATA TTTATTTTTG GGGGAAGACT CAGTATCTTA     10980

ATATCCCATC GATATTATCA TGCTTATTTC AGGTGGTAAT TGGCTACTTC TTTATCTTAC     11040

ATTTCTCTCT ATTGGGAGCA TCATTAAGTT TATTAATGTC TTGGAGTTTG CAACTGCTAT     11100

                    Orf12的起始      Orf11的终止

TTACATTAGG GGGGGTGATG T ATGTTGCAA AAAACAAA TA AAAAGGGATT TCAATTGGCT 11160

TTAGTTGAGT CCTTACTGCA ACTAAAAACT TTAGATAGTT ATTCTGGAAA TAATAAAAAT     11220

AACATTCATC TTTTTGTTCG ACTAAATGGT GAGCAGAAAA ATGAGGAGGA GATACTCAAT     11280

TTTATTAAAC CAAGAGCATG TCATTATTCT TCAGTTCAAT TTGTAAGCAT TCGACGAAAT     11340

GATAAGTTCT CTTTACTCTT TAATATTCTG AAATTAAGAT TATTTCTTTT TTGTAAACGA     11400

AAGGTAATTT TGATCATTGG TGATCCACGC GCTCTGTGGA TGAATATGAT ATCATCGTTT     11460

AAAAATGTTC ATGATGTAAT ATACTTAGAG GATGGAATGT CAACAGTCCT CTTTTATCAG     11520

ACCTTTAAAC CTAAGTACCC ACATAAACAT TATAAACTGG TTACACGCCT GAAACTGGAT     11580

GGTAATGCCT TTCTGTCTCT TATTCCTTTG GAAGTAAAAA AGAATACGGT TATGCGGATC     11640

GACAATGATG TGGCTTTGTT CATCGGTATG CCGATGATTG AAAATAACGC GTTGAGTAAA     11700

AAGAAATATT TATCTTATCT GCATAAAATT ATTATGTCTT TGAAGAATAT GAAGATAACA     11760

AAGTTTTATT ATGCTCCCCA TAGATATGAA AATGAAAATA ATTTTTATTT ATATGAGAAT     11820

TTGGGTTTTC ATATGTTAGA TACAGATTGT GCTATTGAAG ATTATCTCAA CAGCAAGAAC     11880

ATTATCCCGG CGGTGTATGC TAGTTTTTAT TCAACAGCCT TATTACAGAT AGATACTTTA     11940

TTTTATGGAG TTAGTGTTAT TTGTTATGTA ATTAATGTTG AAGAGTTGAA TTATGACTTT     12000

CGTAATCCAG CATTATATGC ATATGAATAT TATAACAAAA CTCCCTCTAT TATAAAGGTT     12060

    Orf13的起始Orf12的终止

GATTTGC ATG AT TGAATTTT TATTGTTCAT ATTATGTAGC TTTATCTTAT ATCAGGTTTT 12120

TTATGTTACT AAGGAATTTA AGAGTAATCT TTTCTTAATC ATGTGGGGGT ATACTTTTCT     12180

ATTCGTAACT CCCGTTATAT ACATTTTTTA TGGTGGTGAG AAATATCGTG TCTTTAGTGA     12240

TGAAAGTGCA TTAACATTTT ATTTGTTGGG TTGTCTCTCC GCTGCGTTTA TAATTTTAAT     12300

GCTTCTGTTC AAGGTTTCAC TTAACCGAAT AAAAATATGT AAAATCAATT TATTTATCTC     12360

CGATTTTATA TTAAAAATTA TATTTTCTTT CTGTATAATG TTTGTTGTTC TTTATATTCT     12420

ATTTTATTGG AGGGAGTGGC CTTTTTTTGA TTTTGTCTCG GGAGATATCT CAGACCGTCC     12480

GGATATTGTA AAAGGAACCT TTCAAGGTTT TTTTATCTAT TCTTTATTTA CGAGCATAAT     12540

AATCCCCGGG ATATATTTTC ATTTAAA GA TAAAAAAGGA AAATTGTTTA ATTTACTTTT     12600

CTTTATTTTT GTTTGTTTTA GTATGGTGGT AAGTGGTAAT AAAGGTGTTT TTCTATATTT     12660

TATTATTTTT AATGTGTTAT TTGAATGGAA AAAGATACGT CTAAGTACGT ATTTGATTAT     12720

TATCGTAGGT CTGATGGCTA TCTATGCCTT AATTCGTCTG CCATTTATAG GTGACAATTT     12780

TTCTTTATCA TATCTAATTG AATCGATATC TGAGAGGATT TTTTTAACGC AAGGGATGGC     12840

TATGCCAGCC GTTATCGAGT TAGCAAAGTC AACCGATGTG ACAATGATGA ACTCTAATGA     12900

TCTAAAATAC ACACTTTTTA ATTTCGTTTA TGGCTATAGC CCCGGTTCGA TGCCTCTTTT     12960

TTATACAGCT GAATTATATG TCAGGTATGG TTGGTTAATG ATGTCTTTCA TATCTGTAAT     13020

AATTTCGCTT GTATTTGGAT TTGGTGCATT TGTTATTAAT AAGACAAAGG ATTCTGCCAT     13080

TAGATGGGTT TATTATATCT CTTTATATGC ACTAATAATG GGAGGGGTAG GAAGTGCTAA     13140

TCTTTTCTTT TTTATTGTGG CAATTTTATG GTGGTTATTA TTAACTCTCA GTAATGGAAC     13200

                    Orf13的终止                Orf14的起始

AATTACAAGT AGGAGTGGCA AG TGATTGCA GAAGTATCAA TAATT ATGCC GATGTACAAT 13260

GCTGAACATT ATGTCAGAGC GTCAATTTGT TCAATTTTAA ATCAGACGTT TAAAAATTTT     13320

TTATTATATA TTATTGACGA CTGCTCTACG GATTCATCAA AGCAGATTGC TGAATCTTTT     13380

AACGACCCGC GAATAATCAT TATTTCGAAT GCTATCAATG TTGGAGTTGC TCGAACTCGT     13440

AATAAAGGAA TAGAGCTTGC GCAGACGAAA TATATCGCAT TTTGTGATAG TGATGATATC     13500

TGGCATGAGC AAAAACTGGA AAAACAAATC TCACTACTTG ATAGTGGGAA ATATAATGTT     13560

GTTGGAAGTT TTTACTCAAC TTTTAAGGAT GGAAAGTTTG AAAGTGCAAA GTTAATATCT     13620

GCGCCTGAAC TTGTTTGTTA TCGTGATATG CTTAAATCTA ATTGGATTGG TAATCTTACT     13680

GGCATTTATA ATGCTTATGT TTTAGGTAAG GTTTTTCAAC AAGAAATTGG TCATGAAGAT     13740

TATGTAATGT GGTTGAAACT TATTGAAAAA AGTCGAGTTG CTTACATTAT TCAAGAACCT     13800

TTGGCTTATT ATAGGATTAG GTCCTCATCT CTTTCTTCGA ATAAAATGAA AGCTTGCTTG     13860

TGGCAGTGGA GAATTTATCG GAAAATGCTT CATTTTAATA TTTTTAGAAC TTCTTGTTAT     13920

                                       Orf14的终止

ATGTTCTTTT ATATTATTGC TGCATTAAAT AAAAGACGG T AATTATTTAA TGCACATATT   13980

TTATAAGTGA GTAAATTTTA CAATTACTGG GTTAATTTAA GGGGTGGAAT ATTTCTGTTA     14040

TTGTTTATGT TTTTAATATA GAATCGATGT AAATTAAAAC CTCACAGGTC GTGTGGAGAC     14100

CGCATCTGAC AGGAGTAAAC AATGTCAAAG CAACAGATCG GCGTCGTCGG TATGGCAGAG     14160

ATGGGGCGCA ACCTTGCGCT CAACATCGAA AGCCGTGGTT ATACCGTCTC TATTTTCAAC     14220

CGTTCCCGTG AAAAGACGGA AGAAGTGATT GCCGAAAATC CAGGCAAGAA ACTGGTTCCT     14280

TACTATACGG TGAAAGAGTT TGTTGAATCT CTGGAAACGC CTCGTCGCAT CCTGTTAATG     14340

GTGAAAGCAG GTGCAGGCAC GGATGCTGCT ATTGATTCCC TCAAGCCATA CCTCGATAAA     14400

GGTGACATCA TCATTGATGG TGGTAACACC TTCTTCCAGG ACACCATTCG TCGTAACCGT     14460

GAGCTTTCTG CAGAAGGCTT TAACTTTATC GGTACCGGTG TTTCCGGTGG TGAAGAAGGC     14520

GCGCTGAAAG GTCCTTCCAT TATGCCTGGT GGGCAGAAAG AAGCCTATGA ACTGGTTGCG     14580

CCGATCCTGA CCAAAATCGC CGCAGTGGCT GAAGACGGTG AGCCATGCGT TACCTATATT     14640

GGTGCCGATG GTGCAGGTCA CTATGTGAAG ATGGTTCACA ACGGTATTGA ATACGGTGAT     14700

ATGCAACTGA TTGCTGAAGC CTATTCTCTG CTTAAAGGTG GTCTGAACCT CTCCAACGAA     14760

GAACTGGCGC AGACCTTTAC CGAGTGGAAT AACGGTGAAC TGAGCAGCTA CCTGATTGAC     14820

ATCACTAAAG ACATCTTCAC TAAAAAAGAT GAAGACGGTA ACTACCTGGT TGATGTGATT     14880

CTGGATGAAG CAGCTAACAA AGGTACCGGT AAATGGACCA GCCAGAGCGC GCTGGATCTC     14940

GGTGAACCGC TGTCGCTGAT TACCGAGTCT GTGTTTGCAC GTTATATCTC TTCTCTGAAA     15000

GATCAGCGTG TTGCCGCATC TAAAGTTCTC TCTGGCCCGC AAGCACAGCC AGCAGGCGAC     15060

AAGGCTGAGT TCATCGAAAA AGTTCGCCGT GCGCTGTATC TGGGCAAAAT CGTTTCTTAC     15120

GCTCAGGGCT TCTCTCAGCT ACGCGCCGCG TCTGAAGAGT ACAACTGGGA TCTGAACTAC     15180

GGTGAAATCG CGAAGATTTT CCGTGCTGGC TGCATCATCC GTGCGCAGTT CCTGCAGAAA     15240

ATCACCGATG CATATGCCGA AAATCCGCAG ATCGCTAACC TGATGCTGGC TCCGTACTTC     15300

AAGCAAATCG CCGATGACTA CCAGCAGGCG CTGCGCGATG TCGTCGCTTA CGCGGTACAG     15360

AACGGTATCC CGGTTCCGAC CTTCGCCGCT GCGGTTGCCT ATTATGACAG CTACCGCGCC     15420

GCTGTTCTGC CTGCGAACCT GATCCAGGCC CAGCGCGACT A                         15461

以上仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡依本发明技术实质对以上实施例作修改、等同变化与修饰，均属本发明技术方案范围内。

Claims (3)

1、一种寡核苷酸，其特征在于，选自SEQ ID NO：1中的10333至10350碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10869至10886碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10020至10037碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10980至10997碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的12267至12284碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的12870至12887碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的12536至12553碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的12874至12891碱基的核苷酸。

2、一种寡核苷酸对，其特征在于，选自SEQ ID NO：1中的10333至10350碱基的核苷酸和SEQ ID NO：1中的10869至10886碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10020至10037碱基的核苷酸和SEQ ID NO：1中的10980至10997碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的12267至12284碱基的核苷酸和SEQ ID NO：1中的12870至12887碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的12536至12553碱基的核苷酸和SEQ ID NO：1中的12874至12891碱基的核苷酸。

3、权利要求1的核苷酸或权利要求2的核苷酸对的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR，或者作为探针用于杂交反应与荧光检测、制造基因芯片或微阵列，供检测大肠杆菌O61型。