CN1249237C

CN1249237C - 对大肠杆菌0132的0－抗原特异的核苷酸

Info

Publication number: CN1249237C
Application number: CN 200410019040
Authority: CN
Inventors: 王磊; 程剑松; 彭霞
Original assignee: Tianjin Biochip Corp
Current assignee: Tianjin Biochip Corp
Priority date: 2004-04-19
Filing date: 2004-04-19
Publication date: 2006-04-05
Anticipated expiration: 2024-04-19
Also published as: CN1563055A

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌0132(Escherichia coli O132)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O132中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长13965个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O132的O-抗原基因簇中的寡糖单位处理基因(包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因)的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O132的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O132的方法。

Description

对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌0132(Escherichia coli O132)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O132中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O132并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank etal(1987)“The function of antibody and complement in the lysis ofbacteria”.Rev Infect Dis 177：1750-1753.Pluschke G et al“Role of thecapsule and the O-antigen in resistance of O18：K1 Escherichia coli tocomplement-mediated king”.J Bacteriol 42：907-913]。大肠杆菌是一个种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]。

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O132的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。

本发明的一个目的是提供了大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的基因：转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因；糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlC、rmlA。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O132的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O132的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O132的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O132的O-抗原也是高度特异的。

本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O132的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O132。

本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长13965个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其包括命名为rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，wzx，glf，orf7、orf8、orf9、wzy、orf11、orf12的12个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特异性的基因包括：转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO：1中的4621至5895碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO：1中的9553至10752碱基的核苷酸；所述的orf7基因是SEQ ID NO：1中的6987至7793碱基的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO：1中的7795至9006碱基的核苷酸；orf11基因是SEQ ID NO：1中的10745至11605碱基的核苷酸；orf12基因是SEQ ID NO：1中的11598至12590碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O132的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，SEQ IDNO：1中的4671至4688碱基的核苷酸和5406至5423碱基的核苷酸，SEQ IDNO：1中的5494至5511碱基的核苷酸和5840至5860碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的10039至10057碱基的核苷酸和10448至10466碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的9893至9911碱基的核苷酸和10245至10263碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O132的O-抗原，以及在制备细菌疫苗中的应用。

前述的对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，可用这些方法检测人体和环境中的细菌。

前述的对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O132型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O132型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O132型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O132型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O132型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O132型的O-抗原的高度特异性；(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O132，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O132的灵敏度。

前述的对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O132，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4MEDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；(2)通过PCR扩增大肠杆菌O132中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O132的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCCTGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand LongTemplate PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾，此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O132的O-抗原基因簇文库；(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌0132的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的结构；(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O132的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在大肠杆菌O132中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O132及其O-抗原都是高度特异的。(7)引物灵敏度的检测：将大肠杆菌O132的冻存菌液接种到有LB培养基的三角瓶中，30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时至饱和，取培养好的菌液稀释，取稀释菌液涂布LB琼脂平板，30℃至40℃，培养数小时计数，计算原液中活菌浓度；在5份重量均为20g的生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入LB培养基，过滤，过滤液于30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时；从培养好的菌液中取数ml于6,000g离心数分钟，去上清，加MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100℃沸水中煮数分钟，裂解液于12,000g离心数分钟，取上清做为PCR模板；用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的4671至4688碱基的核苷酸和5406至5423碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的5494至5511碱基的核苷酸和5840至5860碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的10039至10057碱基的核苷酸和10448至10466碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的9893至9911碱基的核苷酸和10245至10263碱基的核苷酸进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环；反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性；参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果；参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果；说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌0132的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明第一个方面，提供大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长13965个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，其12个基因都位于galF基因和gnd基因间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O132的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlA、rmlC。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因对大肠杆菌O132的O-抗原是特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O132的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基转移酶基因包括orf7、orf8、orf11、orf12基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源于大肠杆菌O132的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O132为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O132及它们的O-抗原是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O132中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的4621至5895碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的9553至10752碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O132都是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌0132。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf7、orf8、orf11、orf12基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，该特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O132表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O132。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf11、orf12基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O132。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf7、orf8、orf11、orf12基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸混合物来检测混合的基因以提供检测特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O132的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取。

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌0132，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O132中的O-抗原基因簇

以大肠杆菌O132的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库。

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD6000.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O132的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序。

从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI 377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到，最后获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析。

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O132的基因组作6个LongPCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1与Shigella boydii的dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶在361个氨基酸中有98％的相同性，99％的相似性。dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱水酶由rmlB基因编码，高度的相同性表明orf1也是rmlB基因，命名为rmlB。Orf2与Shigella boydii的dTDP-D-葡萄糖-4-鼠李糖脱氢酶在299个氨基酸中有96％的相同性，98％的相似性。dTDP-D-葡萄糖-4-鼠李糖脱氢酶由rmlD基因编码，高度的相同性表明orf2也是rmlD基因，命名为rmlD。Orf3与Shigella boydii的葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶在292个氨基酸中有98％的相同性，99％的相似性。葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶由rmlA基因编码，高度的相同性表明orf3也是rmlA基因，命名为rmlA。Orf4与Shigella boydii的dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3，5-变位酶在170个氨基酸中有84％的相同性，87％的相似性。dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3，5-变位酶由rmlC基因编码，较高的相同性表明orf4也是rmlC基因，命名为rmlC。这四个基因共同合成鼠李糖。说明在大肠杆菌O132的O-抗原中有鼠李糖。Orf5与Escherichia coli K12的的O-抗原转运酶Wzx在412个氨基酸的序列中有43％的相同性，66％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法发现orf5有11个潜在的穿膜区，Wzx蛋白的氨基端有一个大约40个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf5是wzx基因，命名为wzx。Orf6与Escherichia coli K12的UDP-吡喃(型)半乳糖变位酶在360个氨基酸中有70％的相同性，83％的相似性。UDP-吡喃(型)半乳糖变位酶由glf基因编码，高度的相同性表明orf1也是glf基因，命名为glf。Orf7与Vibriovulnificus的糖基转移酶在149个氨基酸中有40％的相同性，62％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf7与糖基转移酶家族的保守的功能域PF00535的E value为6.8×e^-5，推测orf7也是一个糖基转移酶，将orf7暂命名为orf7。Orf8与Sinorhizobiummeliloti的糖基转移酶在365个氨基酸中有25％的相同性，47％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf8与糖基转移酶家族1的保守的功能域PF00534的Evalue为3.2×e^-7，推测orf8也是一个糖基转移酶，暂命名为orf8。Orf9与Bacteroidesfragilis的乙酰转移酶和Escherichia coliK12的O-乙酰转移酶在183个氨基酸中有40％的相同性，56％的相似性，与Escherichia coli K12的O-乙酰转移酶在146个氨基酸中有43％的相同性，58％的相似性，暂命名为orf9。Orf10与Streptococcus pneumoniae的O-抗原聚合酶在342个氨基酸的序列中有22％的相同性，47％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane and surface protein sequences withthe hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179：125-142]发现orf10有9个潜在的穿膜区，它与许多Wzy蛋白有相似的二级结构，有一个大的loop，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以确定orf10是wzy基因，命名为wzy。Orf11与Enterococcusfaecalis的糖基转移酶在244个氨基酸中有28％的相同性，48％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf11与糖基转移酶家族的保守的功能域PF00535的Evalue为1.3×e^-3，因此推测orf11也是一个糖基转移酶，暂命名为orf11。Orf12与Clostridium tetani E88的糖基转移酶在192个氨基酸的序列中有27％的相同性，50％的相似性。在genbank中寻找保守的功能域，发现orf12与糖基转移酶家族1的保守的功能域PF00534的Evalue为1.8×e^-2，推测orf12也是一个糖基转移酶，暂命名为orf12。

实施例6：特异基因的筛选

针对大肠杆菌O132的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

在表1中列出了大肠杆菌O132的O抗原基因簇的转运酶基因、聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166种血清型的大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166种血清型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。

表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共13组。它们的来源都列于表中。

在第7组中含有大肠杆菌O132的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是不含有大肠杆菌O132的基因组DNA，作为阴性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性2分钟后，95℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ul PCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第7组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O132及其O-抗原都是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌0132中筛选到对大肠杆菌O132的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O132的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O132是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O132，并能鉴定它们的O-抗原。

通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O51的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

根据本发明的对大肠杆菌O51型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表3是大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的结构，共由12个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O132的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大肠杆菌O132的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

序列列表

SEQUENCE LISTING

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O132的O-抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>13965

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaatgcggtc 60

gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgagcagcg cgtgaagcgt 120

caactgcttg cggaagtgca gtccatttgt ccaccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180

cagggcgaac ccttaggttt aggccactcc attttgtgtg cacgacccgc cattggtgac 240

aacccatttg tcgtggtatt gccagacgtt gtgatcgacg acgccagcgc cgacccgctg 300

cgctacaacc ttgctgccat gattgcgcga ttcaacgaaa cgggtcgtag ccaggtgctg 360

gcaaagcgta tgccgggtga cctctctgaa tactcggtca tccagaccaa agaaccactg 420

gaccgtgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag 480

acgttggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540

gaacttgaac gcacgcagcc aggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccatcgct 600

gaactggcga aaaaacagtc tgttgacgcc atgctgatga ctggtgacag ctacgactgc 660

ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttt gtgaagtatg gactgcgtaa cctaaaagaa 720

ggggcgaagt tccggaaagg aattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccgg 780

atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaagat tcgtggcgaa agtaatttgt 840

tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag 900

gattttagtc aaagttttcc aggattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt 960

agcgtttgaa tttttcggat ttagcgcgag tgggtaacgc tcgtcacatc gtagacatgc 1020

atgcagtgct ctggtagctg taaagccagg ggcggtagcg tgcattaata cctctattaa 1080

tcaaactaag agccgcttat ttcacagcat gctctgaagt aatatggaat aaaagagtga 1140

agatacttgt tactggtggc gcaggattta ttggttctgc tgtagttcgt cacattataa 1200

ataatacgca ggatagtgtt gttaatgtcg ataaattaac gtacgccgga aacctggaat 1260

cacttgctga tgtttctgat tctgaacgct atatttttga acatgcggat atttgcgatg 1320

ctgctgcaat ggcacggatt tttgctcagc atcagccgca tgcagtgatg cacctggctg 1380

ctgaaagcca tgttgaccgt tcaattacag gtcctgcggc atttattgaa accaatattg 1440

ttggtactta tgtccttttg gaagccgctc gcaattactg gtctgctctt gatagcgaca 1500

agaaaaatag cttccgtttt catcatattt ctactgacga agtctatggt gatttgcctc 1560

atcctgacga ggtaaataat acagaagaat tacccttatt tactgagaca acagcttacg 1620

cgccaagcag cccttattcc gcatccaaag catccagcga tcatttagtc cgcgcgtgga 1680

aacgtaccta tggtttaccg accattgtga ctaattgctc taacaattat ggtccttatc 1740

atttcccgga aaaattgatt ccattggtta ttctcaatgc tctggaaggt aaagcattac 1800

ctatttatgg taaaggggat caaattcgcg actggctgta tgttgaagat catgcgcgtg 1860

cgttatatac cgtcgtaacc gaaggtaaag cgggtgaaac ttataatatt ggtggacaca 1920

acgaaaagaa aaacatcgat gtagtgctca ctatttgtga tttgttggat gagattgtac 1980

cgaaagagaa atcttaccgc gagcaaatta cttatgttgc cgatcgtccg ggacacgatc 2040

gccgttatgc gattgatgct gagaagattg gtcgcgaatt gggatggaaa ccacaggaaa 2100

cgtttgagag cgggattcgg aagacagtgg aatggtacct gtccaataca aaatgggttg 2160

ataatgtgaa aagtggtgcc tatcaatcgt ggattgaaca gaactatgag ggccgccagt 2220

aatgaatatt ctccttttcg gcaaaacagg gcaggtaggt tgggaactac agcgtgctct 2280

ggcacctttg ggtaatttga ttgctcttga tgttcactcc actgattatt gtggtgattt 2340

tagtaatcct gaaggtgtgg ctgaaaccgt caaaaaaatt cgccctgatg ttattgttaa 2400

tgccgcggct cataccgcag tagataaggc tgagtcagaa cccaaatttg cacaattact 2460

caatgcgacc agcgttgaat caattgcaaa agcggctaat gaagttgggg cctgggtaat 2520

tcattactca actgactacg tatttccggg aaccggtgaa ataccatggc tggagacgga 2580

tgcaaccgca ccgctaaatg tttacggtgt aaccaagtta gctggagaaa aagcattaca 2640

agagcattgt gcgaagcacc ttattttccg gaccagctgg gtctatgcag gtaaaggaaa 2700

taacttcgcc aaaacgatgt tacgtctggc aaaagagcgt gaagaattag cggttattaa 2760

cgatcagttt ggtgcaccaa caggtgctga gctgctggct gattgtacgg cgcatgccat 2820

tcgtgtggca ttgaataagc cagaagtcgc aggtttgtac catctggtag ccagtggtac 2880

cacaacctgg cacgattatg ctgcgcttgt ttttgaagag gcgcgcaaag caggcattcc 2940

ccttgcgctc aacaagctca acgcagtacc aacatcagcc tatcctacac cagctcgtcg 3000

tccacataac tctcgcctta atacagaaaa atttcaacag aactttgcgc ttgtcttgcc 3060

tgactggcag gttggcgtga aacgaatgct caacgaatta tttacgacta cagcaattta 3120

atagtttttg catcttgttc gtgatggtgg agcaagatga attaaaagga atgatgaaat 3180

gaaaacgcgt aaaggtatta ttttagcggg tggttctggt acacgtcttt atcctgtgac 3240

tatggctgtc agtaaacagc tgttaccgat ttatgataaa ccgatgatct attacccgct 3300

ctctacactg atgttggcgg gtattcgcga tattctgatt atcagtacgc cacaggatac 3360

tcctcgtttt caacaactgc tgggtgacgg gagccagtgg gggctaaatc ttcagtacaa 3420

agtgcaaccg agtccagatg gtcttgcgca ggcatttatc atcggtgaag agtttatcgg 3480

tggtgatgat tgtgctttgg ttctaggtga taatatcttt tacggtcacg atctgccgaa 3540

gttaatggat gtcgctgtta acaaagaaag tggtgcaacg gtatttgcct atcacgttaa 3600

tgatcctgaa cgctacggtg tcgttgagtt tgataaaaac ggtacggcaa taagcctgga 3660

agaaaaaccg ttacaaccaa aaagtaatta tgcggtaacc gggctttatt tctatgataa 3720

cgacgttgtc gaaatggcga aaaatcttaa gccttctgcc cgcggtgaac tggaaattac 3780

cgatattaac cgtatttata tggaacaggg gcgtttatcc gttgccatga tggggcgtgg 3840

atatgcatgg ctggacacgg gaacacatca aagtcttatt gaagcaagca actttattgc 3900

aacaattgaa gaacgtcagg gactgaaagt ttcctgtccg gaagaaattg cttaccgtaa 3960

acggtttatt gatgctgagc aggtgaaagt attagccgaa ccgctgaaga aaaatgctta 4020

tggtcagtat ctgctcaaaa tgattaacgg ttattaataa aatgaacgta tttaaaactg 4080

aaattccaca cgtactgatt tttgaaccga aagtttttgg tgatgagcgt ggcttcgttt 4140

ttgagagctt taaccagaag gtttttgagg aagctgtagg ccgcaaagtt gaatttgtcc 4200

aagataacca ttcgaagtct tgtaaaggtg ttttacgcgg gctgcattat cagttagaac 4260

cttatgcaca agggaaattg gtgcggtgcg ttgttggtga agtttttgac gtagctgttg 4320

atattcgtaa atcgtcacca acttttggca aatgggttgg ggtgaattta tctgcagaga 4380

ataagcgcca gttatggatc cctgaaggat ttgcacatgg atttttggtg ctgagtgaga 4440

cggcagagtt tttgtataag acgacgaatt actatgcacc gatatatgaa aaaagtattc 4500

tttggtctga taataaaatt aatattgctt ggcctcttca aggtggtttt attctatccg 4560

ataaagatcg taatgcatcg tgtttagaat aatgtataag cgagtcatac cttgatttat 4620

atgaatgtaa ttaagagtag agtgttccta aatgctgtat atctatttgt tgtacagggc 4680

gtaacatatt tagttccctt aattactcta ccctatttag ttcgggtatt aggagcgcaa 4740

agttacggag tattaagttt ttcactggca atcatacagt attttatact tttgaccgat 4800

tatggtttta acctatctgc aacacaaaaa atttcagtta tatgtggtga tataaataaa 4860

atcagcaatg tattttggtc ggtaacatgt tgtaagattt tgctgatgat aatttcagct 4920

atactagttt atactgttac caaagtattt gatgtgatga atggtcatga attagtaata 4980

ttttcatgct ttggacttgt attaggaaat attctgtttc cagtatggtt ttttcaaggg 5040

aaggagcaaa tggggttgag ctcgatctcg aatataatat cgaagctatt ggcaatccct 5100

ctgatcttct tattggtcaa taatcctaat gatgcatgga ttgctgcaat aataacatct 5160

tttacttcga tatctggtgg attaatttca ctaactataa tttaccataa aaaatgggta 5220

cattgggttg gtataagaga tctaaaaatt attcaggaat ttaaagatgg atggcatttg 5280

tttatttcaa ctgcggcaat aagcatgtat accacaagta ttgttgtagt tttaggaatt 5340

ttttctggac caatttccgt cggttatttt actgctgcag atcgtattag gcaagcagtt 5400

caggggttaa ttacccctat tacgcaggca tgctatccaa ggattaatta tctttacaga 5460

acttctccag aaaagggctt tgagctagtc agaaaattat tatattttca gggaggtata 5520

accttaacgt taagtataat actcatgatg ttcgcaagtg ttatcgttaa aatcttattt 5580

ggaaacggtt tcgaaagatc agattctgta ctaaccatta tggcattttg cccattcata 5640

gtagggataa gtaatgtgtt aggaattcag atattagttg cattaggata taaaaaagta 5700

ttcagtaaaa tacttttatg ctcaggcggg ttatgtttga tattgattgg cccgtctaca 5760

tatctctata gtgagaatgg tgcagcatta agtgtgctaa taactgaggt tcttgtgacg 5820

attgcaatgc ttattgttgt gcttgcaaaa aaagtcccta tttttaaaag agagaatttg 5880

aataatgaag tatgattaca ttattgttgg agctagtctc tacggcgctg tcctggcctg 5940

tgaacttcat aaggctggaa aaaaagttat ggttattgag agacgtgagc atattggtgg 6000

taatatttac actgaaaatg ttgaaggaat acatgttcac aagtatggcg ctcatatatt 6060

tcatacgaat gataaaataa tttgggatta tgtcaattca ttcgtggaat ttaatcgctt 6120

tactaactca cctttagcaa attacaaagg tgcattatat aatctcccat ttaatatgaa 6180

tacattttat caattatggg gagtgcggac gcctgatgaa gcaattaaga aaattaatga 6240

acaaaaacaa gaaatcaatg ctaaaacacc gtctaatctt gaggagcaag caatatcatt 6300

agttggtaga gatatatatg agaggttcat taaaggttat acagaaaaac agtgggggcg 6360

aaaagctaca gaacttcccg cttttattgt taaacgcata ccagtaaggt ttacctttga 6420

taataactat ttctctgatc gctatcaagg cattccgatc ggtggatatt ctggattagt 6480

agaaaagatg cttgatggtg ttgatgttca tttaaatgtt gattatctag aaaaccgtga 6540

ttattttgac tctattgctg ataggataat ttacacggga ccaatcgatg ccttttataa 6600

ttattgcttt ggatatcttg aatatcggac gttattattt aaaacagaaa ttataaaacg 6660

gccaaacttc caaggtaatg cggttatcaa ctatacagaa cgcgatattc cgtttacgcg 6720

tataattgaa cataagcatt ttgattatat agattcgcaa cttacagtta taacaaaaga 6780

gtttcccggc gaatggaaac ctggtgatga accgtactat ccagtaaatg atgacaaaaa 6840

catgacgatt tataagaaat atcgggaatt gtctaagaaa aataccaagt ttgtatttgg 6900

aggcagattg gctgagtata agtattatga tatgcatcag gttattagat cagctttaaa 6960

tcaagtaaaa ttggaaataa attgatatgc tgtattgtat aatagtaagc cataatcatg 7020

aacaacatgt caaaaatcta ctaagttttg ctgattataa cccctgctca gatgtaaaaa 7080

tcttggtaaa agacaacatc ggaaatgatg agttaaagag agtctgtgaa aaatatgagg 7140

ttgaatattt ttgtaactat aaaaaaatgg ggtttggtca aaataataat gaaatggtaa 7200

gcaaaataat taataaacat aaaataaacg ataatttgga ttatgtttta tttcttaatc 7260

ctgacgtttt aattaagcat gaagtattgg ttagttttta taagtacatt atttctaaaa 7320

atataaaggc aagtacaatt gaccttttta aaaatgaaga ttttactaaa cgcgatgagt 7380

ttatcaggaa atttcctact cttactgatt ttgtaagttc gatcatattt aacatcaaca 7440

agacaaaaat tgacaggtca aaaattattg aaccatgtga aatcgattgg tgtgctggtt 7500

catttttatg tattaatttg gctatttttc gcgatataat gggattcgat gaacgctact 7560

atatgtattg tgaagacata gatctttgtt atagattaaa attaaaaaaa atcaaattag 7620

tttatctccc tcagtttaaa gcaatacatt tagcaatgca tgagaatcgt aagattttat 7680

ctaaggcttt ccgctggcat gtaagtaatg caatatattt tattattaaa aaatctattt 7740

tcaaaagctt tgattcttat tccaattcag taaaaaccat cttcagagga tgaaatgaaa 7800

gtattacatg tagctacggg gtttcctttt ttatatgttg gtggtattac aaactatgtc 7860

agatctctag ttatttctca acgtaatgcc ggacacgaag ttcatgtctt gtctggtgga 7920

tgttcatcag aaaatcttga gtatgtaact aatatttatt caaaaaaaat taaacctttc 7980

tcactaaagc tgagcattga agatgaaaaa tatgcaaaag aagtattaaa tatatgccga 8040

gagtatgata tcgtccattt tcatatggtg ttagactttc cttcttcatt attaagtcgc 8100

ttatcaaaag agattcccaa atatgtagtg agcctgcatg actacttttt gatttgtcct 8160

cgtatattta tgagtgatta taaaaacaac atttgtcatg aggtgaatat tgataagtgt 8220

aatgtctgct gtggttattt tgattctatt gatattgcac gtaaaataag ttctaaatta 8280

tctattccac taccacgaat taaaactaat gaacctgcaa gaagaattga aaatgttaaa 8340

acatttctag agggtgcaag tttattgctg cctgtttctg aaaaagttaa agagatatac 8400

agtaaactcg tacctaatgc ttcttacaag gttcttcata ttggtaatat cactgcaacg 8460

gaattgccct tgcctaaaga agaaaacgga aagataatta ttggtatatt aggaactctt 8520

tcttatatta aggggagtga tattattttg aaaataataa aacaaactac caataaaaat 8580

attgaatttc acttctatgg aagagctgat aagaaatggc tgactagatt agaaaaatat 8640

ggacttataa acaaggggac atatgtacaa gaaaatttga aagaaataat atctactatc 8700

aatttaggcc tcgtcgttcc gatatgggaa gataatgccc ctcaggttgt tatggagttt 8760

ctcaacctaa aaactcctgt tttagcgaca agtagaggtg gtataccaga tttcatacaa 8820

catttggtaa atggatatct ttttgatccg gatgatcaat gctccttcca ggcgtttatt 8880

gcttggataa ataatctaaa tagaaaaact atagtacagt tgaatgctgg tgtgaaaaag 8940

cttaaaacac ctgagcaaca tgagaaagaa atcgataggg tttatcatgt tatcaaaaat 9000

atataaatat ggactggtag cttcaataat aatttttttt tctaaattaa agaactctat 9060

tataaattca tcatataaac ggcgctttgg tatcaaaaat atatcaattg ggccgggggg 9120

atttatatca aactcttcca gaatatattt ttcagataac ttttatgctg ggacaaattt 9180

atggattgag aatgtaaaaa acaaaggaat aattgtaata ggctctaatt gtaggtttag 9240

taataatgtt catatagcgt gcataaaccg aataacaatt ggcaaagggg tgctaatagg 9300

tagtaatgta ttaattacgg atcatagtca tgggaaactt gtcgctgaag aaaaatttat 9360

tagcccttat gagcgtactc tcttttctaa gggagaggtc attattggtg acaatgtatg 9420

gatatgcgat ggtgttatga tcttgccagg agttacgatt ggctctggag ctattatagc 9480

tgctaattcc gttgttgtta gcaacatacc atcgtttact gttgcggcag gaacacctgc 9540

taaggttatt aaatgcattg gggcgtgaga accacttcaa taatacttat tttattaact 9600

gtttttttcc ctggaattgt gctttgggga ggaaatttta aaatagagtt gattgtatta 9660

tgtattatgt cattatgctt aatattaagg ataaatcagg tactactttg cataaaacct 9720

atttctatta ttatattctc ctatatgctt tatgtattgt tgggtggaac tggtttattt 9780

tctggaacat ttgatttttt ttcgttaaga aatattcttt atccctttat taaagcattg 9840

gttttagtga tttttctgtt tttatttttg ttaaaaaaaa cacaaacacc cttgtatgat 9900

attaataggc ttattttatt atgtttcttt atagattcaa ttttcaaagt tatagaaata 9960

atgtttcctt cagttgttag tgcttggcta aatataatta gtatagatga ttggtggaaa 10020

gataccctag gtatgagaaa tcttgggttc agaggtgtgt cgatatacga ttactcagta 10080

gcagctacgt tggctgtttt aattgatttc tctttacgaa gcagaaaaaa aataaatttt 10140

ataatttacc cattagtatt actctctgct ttatcatccg gtagaacagg tttagtagtt 10200

atatttatat ttacattggt ttatttttat cgttatgcac ctaaaattat aatatcaggt 10260

tttatattta taatactaat aatgtatttg tcactatttc actctaatga gcttatacat 10320

aatcagcaac tatcatggat gttcgagcct ttgttaaaca ttcttaatgg aaatattgag 10380

accgagtcga cagatgatct tttagagaat catctgttta tgccggataa tatcttagga 10440

tatggtctat gggggcaata tggagatatg cttggaagca ctattagagg atcagactct 10500

ggttatattc tgattatcct atatggtggt tgggtaggtt ttattttctt tcttatttgt 10560

tcattttcct atttattgta tgcatatatt aaaagtcagg ataaaaaatt atctattgca 10620

atatttttta cttttatgct gattatgata aaaggtccaa taatttatag cgattataat 10680

gcattcattt taatgtcttt attgattgca ccatcgttct atattttttt taaggctaaa 10740

gaaaatgagt aacaattatt atattgtttg tcttgtagta atatataaag aaaaaatctt 10800

cgcgtctgga actattagat ctctccttca ttctttttct gaattaaaag acactaataa 10860

aaaaatactc gttaagttat gggataactc ccccgactca cagagttcca ctgacttaaa 10920

tagacttaaa gaattgtttt tacaaaatga tatattatta agttatcagc atcaaaagaa 10980

taattatccg ttatcgattg tgtataatca tttttttcaa gaatttatac atcaagctcg 11040

ctttctaatg ttgttggatc aagattcaat atttggtcct gagtattttc aagagtttta 11100

taatgctgag aagagaagta atgtagatct atttttgccc aaaatcatgc ataaaggcag 11160

aataatcagt cctacaaaga tatattatgc aaaaggtttt tattacaagg aaattgcatc 11220

tggttttatt tcatcaaaaa aactaggtgc tataaatagt ggtatgatta tttcttctaa 11280

atatcttatc cgaacgcgtt tttcttatga tataagactt ggcaattact gtacagatga 11340

cttttttatg aagaaattcc gggaaaataa aggtattgca tatattctag attattcatt 11400

cgatcatgac ttaacattgt ccaccttaaa tgataatagt gactccttga gaagacgcta 11460

tgaggaaatg atcaaaggta aaaggttagt atatagcaat aatatatttg agatgatatt 11520

tatcaggcta tatattattc taaatagatg ttatatatca ttgaaatata aagatctgaa 11580

atatttgaaa ggattttatg aataagttaa tcatttctat cccacaattt aatctctctg 11640

gtggaaattt ggtgtcattg gagctaggtc ttttcctaaa gaaaaaagga ttagatgtat 11700

acgggcattc tggatttagg ttaaaaaaaa ttgatgagat tgagcttaat attcctaaaa 11760

gaggtctatg taacactatc ataaatataa taagtttctt ttgttcttct ttttattctt 11820

tattttctaa atattatata gctacacacc atttgacgtc attatttaat tttataaaac 11880

ctgcaaaatt ctcacttatc caagacattg aatcattgtt ttaccctaag cgtctgagtt 11940

ggtttggaac tatattatgg agaaattatc taaaatctga cactctgtta tatacaagta 12000

agtatcttga acaaagaata cataacaata ataaccctaa aacaattggc tttccattta 12060

ttaaaacatc tactaacttt agtcttacag gtgagaaaat ttatgacgct ttaatgattt 12120

tacgtgatgg agattataaa aattataatc taactttaag tgagttttat agactgaata 12180

acaacggatt tacagttgca ttagtaaatg cgtctcgaaa tagcttacca tttaatccat 12240

tgatattctc taatttgtgt agggatgatt ttattaaagt gcttatgatg tcaaaaaggt 12300

ttatatgttt gtcaaagtgg gaaggacttg gtcttcctaa tttagaagca tattccttag 12360

gattagaaat catatcaaca aaaatacctt cagcacaaat aatagaggag atagatccta 12420

atgctattac tattatagat agtattgaac aagttgaaaa ggccattatc agtaatagag 12480

ttcaaatctc tgataataaa atgtacttaa gatccgaatc attgactgac ttggattcgc 12540

tgtggaaaga acacatattc agcacaatcc gatattatat gggccaatag tgttcttaag 12600

tctataaaat cctattaact atgaatcaac aaaatgttga taaatataat gaatacattc 12660

aaactgcact ttgttgtgcg ttgcgccact gataggagta aacaatgtca aagcaacaga 12720

tcggcgtagt cggtatggca gtgatggggc gcaaccttgc gctcaacatc gaaagccgtg 12780

gttataccgt ctctattttc aaccgttccc gtgagaagac agaagaggtg attgccgaaa 12840

atccaggcaa gaaactggtt ccttactata cggtgaaaga gtttgttgaa tctctggaaa 12900

cgcctcgtcg catcctgtta atggtgaaag caggtgcagg cacggatgct gctattgatt 12960

ccctcaagcc gtacctcgat aaaggtgaca tcatcattga tggtggtaac accttcttcc 13020

aggataccat ccgtcgtaac cgcgagcttt ctgcagaagg ttttaacttt ataggtaccg 13080

gtgtctccgg tggtgaagaa ggtgcgctga aaggtccttc cattatgcct ggtggccaga 13140

aagaagccta tgagctggtt gcgccgatcc tgaccaaaat cgccgccgtt gctgaagatg 13200

gcgaaccgtg cgttacatat attggtgccg atggcgcagg tcactatgtg aagatggttc 13260

acaacggtat tgaatacggt gatatgcaac tgattgctga agcctattct ctcctgaaag 13320

gcggcctgaa tctttctaac gaagaactgg cacagacctt taccgagtgg aataacggtg 13380

aactgagcag ctacctgatc gacatcacca aagacatctt cactaaaaaa gatgaagacg 13440

gtaactacct ggttgatgtg atcctggatg aagcggctaa caaaggtacc ggtaaatgga 13500

ccagccagag cgcgctggat ctcggcgaac cgctgtcgct gattaccgag tctgtgtttg 13560

cacgttatat ctcttctctg aaagagcagc gtgttgccgc atctaaagtt ctctctggcc 13620

cgcaagcgca gccagctggc gacaaaggtg agttcatcga gaaagttcgt cgtgcgctgt 13680

atctgggtaa aatcgtttct tacgctcagg gtttctctca gctgcgcgca gcgtctgaag 13740

agtacaactg ggatctgaac tacggcgaaa tcgcgaagat tttccgtgct ggctgcatca 13800

tccgtgcgca gttcctgcag aaaatcaccg atgcttatgc cgaaaatccg cagatcgcta 13860

acctgctgct ggctccgtac ttcaagcaaa ttgccgatga ctaccagcag gcgctgcgtg 13920

atgtcgttgc ttatgcagta cagaacggta tcccggttcc gacct 13965

表1大肠杆菌0132的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物位置	反向引物位置	PCR产物长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
基因	功能	基因的碱基位置	正向引物位置	反向引物位置	PCR产物长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)	wzxwzy	O-抗原转运酶O-抗原聚合酶	4621-58959553-10752	4671-46885494-551110039-100579893-9911	5406-54235840-586010448-1046610245-10263	752bp366bp428bp371bp	2222	60606060

表2166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号该组中含有的菌株来源

1、野生型大肠杆菌 O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18， IMVSa

O19ab，O20，O21，O22，O23，O24

2、野生型大肠杆菌 O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35， IMVSa

O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43

3、野生型大肠杆菌 O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56， IMVSa

O57，O58，O60，O61，O62，O53

4、野生型大肠杆菌 O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78， IMVSa

O79，O80，O81，O82，O83，O68

5、野生型大肠杆菌 O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99， IMVSa

O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，

6、野生型大肠杆菌 O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSa

O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117

7、野生型大肠杆菌 O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O51，O137， IMVSa

O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140

8、野生型大肠杆菌 O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158， IMVSa

O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153 b

9、野生型大肠杆菌 O168，O169，O170，O171，O172，O173， c

痢疾志贺氏菌 D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13 d

10、鲍氏志贺氏菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， d

B16，B17，B18

11、福氏志贺氏菌 F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6， d

DS，DR

12、野生型大肠杆菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，IMVSa

O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119

13、野生型大肠杆菌去除大肠杆菌05132第7组菌

为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阴性对照

a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3是大肠杆菌O132的O-抗原基因簇的结构表

E.coli O132 O-antigen gene cluster

orf galF rmlB rmlD rmlArmlC wzx glf orf7 orf8 orf9 wzy orf11 orf12 gnd

G+C％ 43.2 46.6 43.3 39.2 33.5 34.0 27.6 32.3 34.3 28.6 28.0 29.7

content

表4是大肠杆菌O132的O-抗原基因簇中的基因的位置表

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAATGCGGTC 60

GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT 120

CAACTGCTTG CGGAAGTGCA GTCCATTTGT CCACCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT 180

CAGGGCGAAC CCTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC 240

AACCCATTTG TCGTGGTATT GCCAGACGTT GTGATCGACG ACGCCAGCGC CGACCCGCTG 300

CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGA TTCAACGAAA CGGGTCGTAG CCAGGTGCTG 360

GCAAAGCGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCGGTCA TCCAGACCAA AGAACCACTG 420

GACCGTGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG 480

ACGTTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG 540

GAACTTGAAC GCACGCAGCC AGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCCATCGCT 600

GAACTGGCGA AAAAACAGTC TGTTGACGCC ATGCTGATGA CTGGTGACAG CTACGACTGC 660

GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GACTGCGTAA CCTAAAAGAA 720

GGGGCGAAGT TCCGGAAAGG AATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG 780

ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT 840

TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG 900

GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT 960

AGCGTTTGAA TTTTTCGGAT TTAGCGCGAG TGGGTAACGC TCGTCACATC GTAGACATGC 1020

ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGCATTAATA CCTCTATTAA 1080

Orf1的起始

TCAAACTAAG AGCCGCTTAT TTCACAGCAT GCTCTGAAGT AATATGGAAT AAAAGA GTGA 1140

AGATACTTGT TACTGGTGGC GCAGGATTTA TTGGTTCTGC TGTAGTTCGT CACATTATAA 1200

ATAATACGCA GGATAGTGTT GTTAATGTCG ATAAATTAAC GTACGCCGGA AACCTGGAAT 1260

CACTTGCTGA TGTTTCTGAT TCTGAACGCT ATATTTTTGA ACATGCGGAT ATTTGCGATG 1320

CTGCTGCAAT GGCACGGATT TTTGCTCAGC ATCAGCCGCA TGCAGTGATG CACCTGGCTG 1380

CTGAAAGCCA TGTTGACCGT TCAATTACAG GTCCTGCGGC ATTTATTGAA ACCAATATTG 1440

TTGGTACTTA TGTCCTTTTG GAAGCCGCTC GCAATTACTG GTCTGCTCTT GATAGCGACA 1500

AGAAAAATAG CTTCCGTTTT CATCATATTT CTACTGACGA AGTCTATGGT GATTTGCCTC 1560

ATCCTGACGA GGTAAATAAT ACAGAAGAAT TACCCTTATT TACTGAGACA ACAGCTTACG 1620

CGCCAAGCAG CCCTTATTCC GCATCCAAAG CATCCAGCGA TCATTTAGTC CGCGCGTGGA 1680

AACGTACCTA TGGTTTACCG ACCATTGTGA CTAATTGCTC TAACAATTAT GGTCCTTATC 1740

ATTTCCCGGA AAAATTGATT CCATTGGTTA TTCTCAATGC TCTGGAAGGT AAAGCATTAC 1800

CTATTTATGG TAAAGGGGAT CAAATTCGCG ACTGGCTGTA TGTTGAAGAT CATGCGCGTG 1860

CGTTATATAC CGTCGTAACC GAAGGTAAAG CGGGTGAAAC TTATAATATT GGTGGACACA 1920

ACGAAAAGAA AAACATCGAT GTAGTGCTCA CTATTTGTGA TTTGTTGGAT GAGATTGTAC 1980

CGAAAGAGAA ATCTTACCGC GAGCAAATTA CTTATGTTGC CGATCGTCCG GGACACGATC 2040

GCCGTTATGC GATTGATGCT GAGAAGATTG GTCGCGAATT GGGATGGAAA CCACAGGAAA 2100

CGTTTGAGAG CGGGATTCGG AAGACAGTGG AATGGTACCT GTCCAATACA AAATGGGTTG 2160

ATAATGTGAA AAGTGGTGCC TATCAATCGT GGATTGAACA GAACTATGAG GGCCGCCAGT 2220

orf1的终止orf2的起始

AATGAATATT CTCCTTTTCG GCAAAACAGG GCAGGTAGGT TGGGAACTAC AGCGTGCTCT 2280

GGCACCTTTG GGTAATTTGA TTGCTCTTGA TGTTCACTCC ACTGATTATT GTGGTGATTT 2340

TAGTAATCCT GAAGGTGTGG CTGAAACCGT CAAAAAAATT CGCCCTGATG TTATTGTTAA 2400

TGCCGCGGCT CATACCGCAG TAGATAAGGC TGAGTCAGAA CCCAAATTTG CACAATTACT 2460

CAATGCGACC AGCGTTGAAT CAATTGCAAA AGCGGCTAAT GAAGTTGGGG CCTGGGTAAT 2520

TCATTACTCA ACTGACTACG TATTTCCGGG AACCGGTGAA ATACCATGGC TGGAGACGGA 2580

TGCAACCGCA CCGCTAAATG TTTACGGTGT AACCAAGTTA GCTGGAGAAA AAGCATTACA 2640

AGAGCATTGT GCGAAGCACC TTATTTTCCG GACCAGCTGG GTCTATGCAG GTAAAGGAAA 2700

TAACTTCGCC AAAACGATGT TACGTCTGGC AAAAGAGCGT GAAGAATTAG CGGTTATTAA 2760

CGATCAGTTT GGTGCACCAA CAGGTGCTGA GCTGCTGGCT GATTGTACGG CGCATGCCAT 2820

TCGTGTGGCA TTGAATAAGC CAGAAGTCGC AGGTTTGTAC CATCTGGTAG CCAGTGGTAC 2880

CACAACCTGG CACGATTATG CTGCGCTTGT TTTTGAAGAG GCGCGCAAAG CAGGCATTCC 2940

CCTTGCGCTC AACAAGCTCA ACGCAGTACC AACATCAGCC TATCCTACAC CAGCTCGTCG 3000

TCCACATAAC TCTCGCCTTA ATACAGAAAA ATTTCAACAG AACTTTGCGC TTGTCTTGCC 3060

Orf2的终止

TGACTGGCAG GTTGGCGTGA AACGAATGCT CAACGAATTA TTTACGACTA CAGCAATT TA 3120

Orf3的起始

ATAGTTTTTG CATCTTGTTC GTGATGGTGG AGCAAGATGA ATTAAAAGGA ATGATGAA AT 3180

GAAAACGCGT AAAGGTATTA TTTTAGCGGG TGGTTCTGGT ACACGTCTTT ATCCTGTGAC 3240

TATGGCTGTC AGTAAACAGC TGTTACCGAT TTATGATAAA CCGATGATCT ATTACCCGCT 3300

CTCTACACTG ATGTTGGCGG GTATTCGCGA TATTCTGATT ATCAGTACGC CACAGGATAC 3360

TCCTCGTTTT CAACAACTGC TGGGTGACGG GAGCCAGTGG GGGCTAAATC TTCAGTACAA 3420

AGTGCAACCG AGTCCAGATG GTCTTGCGCA GGCATTTATC ATCGGTGAAG AGTTTATCGG 3480

TGGTGATGAT TGTGCTTTGG TTCTAGGTGA TAATATCTTT TACGGTCACG ATCTGCCGAA 3540

GTTAATGGAT GTCGCTGTTA ACAAAGAAAG TGGTGCAACG GTATTTGCCT ATCACGTTAA 3600

TGATCCTGAA CGCTACGGTG TCGTTGAGTT TGATAAAAAC GGTACGGCAA TAAGCCTGGA 3660

AGAAAAACCG TTACAACCAA AAAGTAATTA TGCGGTAACC GGGCTTTATT TCTATGATAA 3720

CGACGTTGTC GAAATGGCGA AAAATCTTAA GCCTTCTGCC CGCGGTGAAC TGGAAATTAC 3780

CGATATTAAC CGTATTTATA TGGAACAGGG GCGTTTATCC GTTGCCATGA TGGGGCGTGG 3840

ATATGCATGG CTGGACACGG GAACACATCA AAGTCTTATT GAAGCAAGCA ACTTTATTGC 3900

AACAATTGAA GAACGTCAGG GACTGAAAGT TTCCTGTCCG GAAGAAATTG CTTACCGTAA 3960

ACGGTTTATT GATGCTGAGC AGGTGAAAGT ATTAGCCGAA CCGCTGAAGA AAAATGCTTA 4020

Orf3的终止 orf4的起始

TGGTCAGTAT CTGCTCAAAA TGATTAACGG TTAT TAATAA A ATGAACGTA TTTAAAACTG 4080

AAATTCCACA CGTACTGATT TTTGAACCGA AAGTTTTTGG TGATGAGCGT GGCTTCGTTT 4140

TTGAGAGCTT TAACCAGAAG GTTTTTGAGG AAGCTGTAGG CCGCAAAGTT GAATTTGTCC 4200

AAGATAACCA TTCGAAGTCT TGTAAAGGTG TTTTACGCGG GCTGCATTAT CAGTTAGAAC 4260

CTTATGCACA AGGGAAATTG GTGCGGTGCG TTGTTGGTGA AGTTTTTGAC GTAGCTGTTG 4320

ATATTCGTAA ATCGTCACCA ACTTTTGGCA AATGGGTTGG GGTGAATTTA TCTGCAGAGA 4380

ATAAGCGCCA GTTATGGATC CCTGAAGGAT TTGCACATGG ATTTTTGGTG CTGAGTGAGA 4440

CGGCAGAGTT TTTGTATAAG ACGACGAATT ACTATGCACC GATATATGAA AAAAGTATTC 4500

TTTGGTCTGA TAATAAAATT AATATTGCTT GGCCTCTTCA AGGTGGTTTT ATTCTATCCG 4560

Orf4的终止

ATAAAGATCG TAATGCATCG TGTTTAGAA T AATGTATAAG CGAGTCATAC CTTGATTTAT 4620

orf5的起始

ATGAATGTAA TTAAGAGTAG AGTGTTCCTA AATGCTGTAT ATCTATTTGT TGTACAGGGC 4680

GTAACATATT TAGTTCCCTT AATTACTCTA CCCTATTTAG TTCGGGTATT AGGAGCGCAA 4740

AGTTACGGAG TATTAAGTTT TTCACTGGCA ATCATACAGT ATTTTATACT TTTGACCGAT 4800

TATGGTTTTA ACCTATCTGC AACACAAAAA ATTTCAGTTA TATGTGGTGA TATAAATAAA 4860

ATCAGCAATG TATTTTGGTC GGTAACATGT TGTAAGATTT TGCTGATGAT AATTTCAGCT 4920

ATACTAGTTT ATACTGTTAC CAAAGTATTT GATGTGATGA ATGGTCATGA ATTAGTAATA 4980

TTTTCATGCT TTGGACTTGT ATTAGGAAAT ATTCTGTTTC CAGTATGGTT TTTTCAAGGG 5040

AAGGAGCAAA TGGGGTTGAG CTCGATCTCG AATATAATAT CGAAGCTATT GGCAATCCCT 5100

CTGATCTTCT TATTGGTCAA TAATCCTAAT GATGCATGGA TTGCTGCAAT AATAACATCT 5160

TTTACTTCGA TATCTGGTGG ATTAATTTCA CTAACTATAA TTTACCATAA AAAATGGGTA 5220

CATTGGGTTG GTATAAGAGA TCTAAAAATT ATTCAGGAAT TTAAAGATGG ATGGCATTTG 5280

TTTATTTCAA CTGCGGCAAT AAGCATGTAT ACCACAAGTA TTGTTGTAGT TTTAGGAATT 5340

TTTTCTGGAC CAATTTCCGT CGGTTATTTT ACTGCTGCAG ATCGTATTAG GCAAGCAGTT 5400

CAGGGGTTAA TTACCCCTAT TACGCAGGCA TGCTATCCAA GGATTAATTA TCTTTACAGA 5460

ACTTCTCCAG AAAAGGGCTT TGAGCTAGTC AGAAAATTAT TATATTTTCA GGGAGGTATA 5520

ACCTTAACGT TAAGTATAAT ACTCATGATG TTCGCAAGTG TTATCGTTAA AATCTTATTT 5580

GGAAACGGTT TCGAAAGATC AGATTCTGTA CTAACCATTA TGGCATTTTG CCCATTCATA 5640

GTAGGGATAA GTAATGTGTT AGGAATTCAG ATATTAGTTG CATTAGGATA TAAAAAAGTA 5700

TTCAGTAAAA TACTTTTATG CTCAGGCGGG TTATGTTTGA TATTGATTGG CCCGTCTACA 5760

TATCTCTATA GTGAGAATGG TGCAGCATTA AGTGTGCTAA TAACTGAGGT TCTTGTGACG 5820

ATTGCAATGC TTATTGTTGT GCTTGCAAAA AAAGTCCCTA TTTTTAAAAG AGAGAATTTG 5880

orf6的起始 Orf5的终止

AA TAATGAAG TA TGATTACA TTATTGTTGG AGCTAGTCTC TACGGCGCTG TCCTGGCCTG 5940

TGAACTTCAT AAGGCTGGAA AAAAAGTTAT GGTTATTGAG AGACGTGAGC ATATTGGTGG 6000

TAATATTTAC ACTGAAAATG TTGAAGGAAT ACATGTTCAC AAGTATGGCG CTCATATATT 6060

TCATACGAAT GATAAAATAA TTTGGGATTA TGTCAATTCA TTCGTGGAAT TTAATCGCTT 6120

TACTAACTCA CCTTTAGCAA ATTACAAAGG TGCATTATAT AATCTCCCAT TTAATATGAA 6180

TACATTTTAT CAATTATGGG GAGTGCGGAC GCCTGATGAA GCAATTAAGA AAATTAATGA 6240

ACAAAAACAA GAAATCAATG CTAAAACACC GTCTAATCTT GAGGAGCAAG CAATATCATT 6300

AGTTGGTAGA GATATATATG AGAGGTTCAT TAAAGGTTAT ACAGAAAAAC AGTGGGGGCG 6360

AAAAGCTACA GAACTTCCCG CTTTTATTGT TAAACGCATA CCAGTAAGGT TTACCTTTGA 6420

TAATAACTAT TTCTCTGATC GCTATCAAGG CATTCCGATC GGTGGATATT CTGGATTAGT 6480

AGAAAAGATG CTTGATGGTG TTGATGTTCA TTTAAATGTT GATTATCTAG AAAACCGTGA 6540

TTATTTTGAC TCTATTGCTG ATAGGATAAT TTACACGGGA CCAATCGATG CCTTTTATAA 6600

TTATTGCTTT GGATATCTTG AATATCGGAC GTTATTATTT AAAACAGAAA TTATAAAACG 6660

GCCAAACTTC CAAGGTAATG CGGTTATCAA CTATACAGAA CGCGATATTC CGTTTACGCG 6720

TATAATTGAA CATAAGCATT TTGATTATAT AGATTCGCAA CTTACAGTTA TAACAAAAGA 6780

GTTTCCCGGC GAATGGAAAC CTGGTGATGA ACCGTACTAT CCAGTAAATG ATGACAAAAA 6840

CATGACGATT TATAAGAAAT ATCGGGAATT GTCTAAGAAA AATACCAAGT TTGTATTTGG 6900

AGGCAGATTG GCTGAGTATA AGTATTATGA TATGCATCAG GTTATTAGAT CAGCTTTAAA 6960

Orf6的终止 orf7的起始

TCAAGTAAAA TTGGAAATAA AT TGAT ATGC TGTATTGTAT AATAGTAAGC CATAATCATG 7020

AACAACATGT CAAAAATCTA CTAAGTTTTG CTGATTATAA CCCCTGCTCA GATGTAAAAA 7080

TCTTGGTAAA AGACAACATC GGAAATGATG AGTTAAAGAG AGTCTGTGAA AAATATGAGG 7140

TTGAATATTT TTGTAACTAT AAAAAAATGG GGTTTGGTCA AAATAATAAT GAAATGGTAA 7200

GCAAAATAAT TAATAAACAT AAAATAAACG ATAATTTGGA TTATGTTTTA TTTCTTAATC 7260

CTGACGTTTT AATTAAGCAT GAAGTATTGG TTAGTTTTTA TAAGTACATT ATTTCTAAAA 7320

ATATAAAGGC AAGTACAATT GACCTTTTTA AAAATGAAGA TTTTACTAAA CGCGATGAGT 7380

TTATCAGGAA ATTTCCTACT CTTACTGATT TTGTAAGTTC GATCATATTT AACATCAACA 7440

AGACAAAAAT TGACAGGTCA AAAATTATTG AACCATGTGA AATCGATTGG TGTGCTGGTT 7500

CATTTTTATG TATTAATTTG GCTATTTTTC GCGATATAAT GGGATTCGAT GAACGCTACT 7560

ATATGTATTG TGAAGACATA GATCTTTGTT ATAGATTAAA ATTAAAAAAA ATCAAATTAG 7620

TTTATCTCCC TCAGTTTAAA GCAATACATT TAGCAATGCA TGAGAATCGT AAGATTTTAT 7680

CTAAGGCTTT CCGCTGGCAT GTAAGTAATG CAATATATTT TATTATTAAA AAATCTATTT 7740

Orf7的终止orf8的起始

TCAAAAGCTT TGATTCTTAT TCCAATTCAG TAAAAACCAT CTTCAGAGGA TGAA ATGAAA 7800

GTATTACATG TAGCTACGGG GTTTCCTTTT TTATATGTTG GTGGTATTAC AAACTATGTC 7860

AGATCTCTAG TTATTTCTCA ACGTAATGCC GGACACGAAG TTCATGTCTT GTCTGGTGGA 7920

TGTTCATCAG AAAATCTTGA GTATGTAACT AATATTTATT CAAAAAAAAT TAAACCTTTC 7980

TCACTAAAGC TGAGCATTGA AGATGAAAAA TATGCAAAAG AAGTATTAAA TATATGCCGA 8040

GAGTATGATA TCGTCCATTT TCATATGGTG TTAGACTTTC CTTCTTCATT ATTAAGTCGC 8100

TTATCAAAAG AGATTCCCAA ATATGTAGTG AGCCTGCATG ACTACTTTTT GATTTGTCCT 8160

CGTATATTTA TGAGTGATTA TAAAAACAAC ATTTGTCATG AGGTGAATAT TGATAAGTGT 8220

AATGTCTGCT GTGGTTATTT TGATTCTATT GATATTGCAC GTAAAATAAG TTCTAAATTA 8280

TCTATTCCAC TACCACGAAT TAAAACTAAT GAACCTGCAA GAAGAATTGA AAATGTTAAA 8340

ACATTTCTAG AGGGTGCAAG TTTATTGCTG CCTGTTTCTG AAAAAGTTAA AGAGATATAC 8400

AGTAAACTCG TACCTAATGC TTCTTACAAG GTTCTTCATA TTGGTAATAT CACTGCAACG 8460

GAATTGCCCT TGCCTAAAGA AGAAAACGGA AAGATAATTA TTGGTATATT AGGAACTCTT 8520

TCTTATATTA AGGGGAGTGA TATTATTTTG AAAATAATAA AACAAACTAC CAATAAAAAT 8580

ATTGAATTTC ACTTCTATGG AAGAGCTGAT AAGAAATGGC TGACTAGATT AGAAAAATAT 8640

GGACTTATAA ACAAGGGGAC ATATGTACAA GAAAATTTGA AAGAAATAAT ATCTACTATC 8700

AATTTAGGCC TCGTCGTTCC GATATGGGAA GATAATGCCC CTCAGGTTGT TATGGAGTTT 8760

CTCAACCTAA AAACTCCTGT TTTAGCGACA AGTAGAGGTG GTATACCAGA TTTCATACAA 8820

CATTTGGTAA ATGGATATCT TTTTGATCCG GATGATCAAT GCTCCTTCCA GGCGTTTATT 8880

GCTTGGATAA ATAATCTAAA TAGAAAAACT ATAGTACAGT TGAATGCTGG TGTGAAAAAG 8940

orf9的起始

CTTAAAACAC CTGAGCAAC A TGAGAAAGAA ATCGATAGGG TTTATCATGT TATCAAAAAT 9000

Orf8的终止

ATA TAAATAT GGACTGGTAG CTTCAATAAT AATTTTTTTT TCTAAATTAA AGAACTCTAT 9060

TATAAATTCA TCATATAAAC GGCGCTTTGG TATCAAAAAT ATATCAATTG GGCCGGGGGG 9120

ATTTATATCA AACTCTTCCA GAATATATTT TTCAGATAAC TTTTATGCTG GGACAAATTT 9180

ATGGATTGAG AATGTAAAAA ACAAAGGAAT AATTGTAATA GGCTCTAATT GTAGGTTTAG 9240

TAATAATGTT CATATAGCGT GCATAAACCG AATAACAATT GGCAAAGGGG TGCTAATAGG 9300

TAGTAATGTA TTAATTACGG ATCATAGTCA TGGGAAACTT GTCGCTGAAG AAAA TTTAT 9360

TAGCCCTTAT GAGCGTACTC TCTTTTCTAA GGGAGAGGTC ATTATTGGTG ACAATGTATG 9420

GATATGCGAT GGTGTTATGA TCTTGCCAGG AGTTACGATT GGCTCTGGAG CTATTATAGC 9480

TGCTAATTCC GTTGTTGTTA GCAACATACC ATCGTTTACT GTTGCGGCAG GAACACCTGC 9540

orf10的起始Orf9的终止

TAAGGTTATT AA ATGCATTG GGGCG TGAGA ACCACTTCAA TAATACTTAT TTTATTAACT 9600

GTTTTTTTCC CTGGAATTGT GCTTTGGGGA GGAAATTTTA AAATAGAGTT GATTGTATTA 9660

TGTATTATGT CATTATGCTT AATATTAAGG ATAAATCAGG TACTACTTTG CATAAAACCT 9720

ATTTCTATTA TTATATTCTC CTATATGCTT TATGTATTGT TGGGTGGAAC TGGTTTATTT 9780

TCTGGAACAT TTGATTTTTT TTCGTTAAGA AATATTCTTT ATCCCTTTAT TAAAGCATTG 9840

GTTTTAGTGA TTTTTCTGTT TTTATTTTTG TTAAAAAAAA CACAAACACC CTTGTATGAT 9900

ATTAATAGGC TTATTTTATT ATGTTTCTTT ATAGATTCAA TTTTCAAAGT TATAGAAATA 9960

ATGTTTCCTT CAGTTGTTAG TGCTTGGCTA AATATAATTA GTATAGATGA TTGGTGGAAA 10020

GATACCCTAG GTATGAGAAA TCTTGGGTTC AGAGGTGTGT CGATATACGA TTACTCAGTA 10080

GCAGCTACGT TGGCTGTTTT AATTGATTTC TCTTTACGAA GCAGAAAAAA AATAAATTTT 10140

ATAATTTACC CATTAGTATT ACTCTCTGCT TTATCATCCG GTAGAACAGG TTTAGTAGTT 10200

ATATTTATAT TTACATTGGT TTATTTTTAT CGTTATGCAC CTAAAATTAT AATATCAGGT 10260

TTTATATTTA TAATACTAAT AATGTATTTG TCACTATTTC ACTCTAATGA GCTTATACAT 10320

AATCAGCAAC TATCATGGAT GTTCGAGCCT TTGTTAAACA TTCTTAATGG AAATATTGAG 10380

ACCGAGTCGA CAGATGATCT TTTAGAGAAT CATCTGTTTA TGCCGGATAA TATCTTAGGA 10440

TATGGTCTAT GGGGGCAATA TGGAGATATG CTTGGAAGCA CTATTAGAGG ATCAGACTCT 10500

GGTTATATTC TGATTATCCT ATATGGTGGT TGGGTAGGTT TTATTTTCTT TCTTATTTGT 10560

TCATTTTCCT ATTTATTGTA TGCATATATT AAAAGTCAGG ATAAAAAATT ATCTATTGCA 10620

ATATTTTTTA CTTTTATGCT GATTATGATA AAAGGTCCAA TAATTTATAG CGATTATAAT 10680

GCATTCATTT TAATGTCTTT ATTGATTGCA CCATCGTTCT ATATTTTTTT TAAGGCTAAA 10740

orf11的起始orf10的终止

GAAA ATGAG T AACAATTATT ATATTGTTTG TCTTGTAGTA ATATATAAAG AAAAAATCTT 10800

CGCGTCTGGA ACTATTAGAT CTCTCCTTCA TTCTTTTTCT GAATTAAAAG ACACTAATAA 10860

AAAAATACTC GTTAAGTTAT GGGATAACTC CCCCGACTCA CAGAGTTCCA CTGACTTAAA 10920

TAGACTTAAA GAATTGTTTT TACAAAATGA TATATTATTA AGTTATCAGC ATCAAAAGAA 10980

TAATTATCCG TTATCGATTG TGTATAATCA TTTTTTTCAA GAATTTATAC ATCAAGCTCG 11040

CTTTCTAATG TTGTTGGATC AAGATTCAAT ATTTGGTCCT GAGTATTTTC AAGAGTTTTA 11100

TAATGCTGAG AAGAGAAGTA ATGTAGATCT ATTTTTGCCC AAAATCATGC ATAAAGGCAG 11160

AATAATCAGT CCTACAAAGA TATATTATGC AAAAGGTTTT TATTACAAGG AAATTGCATC 11220

TGGTTTTATT TCATCAAAAA AACTAGGTGC TATAAATAGT GGTATGATTA TTTCTTCTAA 11280

ATATCTTATC CGAACGCGTT TTTCTTATGA TATAAGACTT GGCAATTACT GTACAGATGA 11340

CTTTTTTATG AAGAAATTCC GGGAAAATAA AGGTATTGCA TATATTCTAG ATTATTCATT 11400

CGATCATGAC TTAACATTGT CCACCTTAAA TGATAATAGT GACTCCTTGA GAAGACGCTA 11460

TGAGGAAATG ATCAAAGGTA AAAGGTTAGT ATATAGCAAT AATATATTTG AGATGATATT 11520

TATCAGGCTA TATATTATTC TAAATAGATG TTATATATCA TTGAAATATA AAGATCTGAA 11580

orf12的起始 Orf11的终止

ATATTTGAAA GGATTTT ATG AA TAAGTTAA TCATTTCTAT CCCACAATTT AATCTCTCTG 11640

GTGGAAATTT GGTGTCATTG GAGCTAGGTC TTTTCCTAAA GAAAAAAGGA TTAGATGTAT 11700

ACGGGCATTC TGGATTTAGG TTAAAAAAAA TTGATGAGAT TGAGCTTAAT ATTCCTAAAA 11760

GAGGTCTATG TAACACTATC ATAAATATAA TAAGTTTCTT TTGTTCTTCT TTTTATTCTT 11820

TATTTTCTAA ATATTATATA GCTACACACC ATTTGACGTC ATTATTTAAT TTTATAAAAC 11880

CTGCAAAATT CTCACTTATC CAAGACATTG AATCATTGTT TTACCCTAAG CGTCTGAGTT 11940

GGTTTGGAAC TATATTATGG AGAAATTATC TAAAATCTGA CACTCTGTTA TATACAAGTA 12000

AGTATCTTGA ACAAAGAATA CATAACAATA ATAACCCTAA AACAATTGGC TTTCCATTTA 12060

TTAAAACATC TACTAACTTT AGTCTTACAG GTGAGAAAAT TTATGACGCT TTAATGATTT 12120

TACGTGATGG AGATTATAAA AATTATAATC TAACTTTAAG TGAGTTTTAT AGACTGAATA 12180

ACAACGGATT TACAGTTGCA TTAGTAAATG CGTCTCGAAA TAGCTTACCA TTTAATCCAT 12240

TGATATTCTC TAATTTGTGT AGGGATGATT TTATTAAAGT GCTTATGATG TCAAAAAGGT 12300

TTATATGTTT GTCAAAGTGG GAAGGACTTG GTCTTCCTAA TTTAGAAGCA TATTCCTTAG 12360

GATTAGAAAT CATATCAACA AAAATACCTT CAGCACAAAT AATAGAGGAG ATAGATCCTA 12420

ATGCTATTAC TATTATAGAT AGTATTGAAC AAGTTGAAAA GGCCATTATC AGTAATAGAG 12480

TTCAAATCTC TGATAATAAA ATGTACTTAA GATCCGAATC ATTGACTGAC TTGGATTCGC 12540

orf12的终止

TGTGGAAAGA ACACATATTC AGCACAATCC GATATTATAT GGGCCAA TAG TGTTCTTAAG 12600

TCTATAAAAT CCTATTAACT ATGAATCAAC AAAATGTTGA TAAATATAAT GAATACATTC 12660

AAACTGCACT TTGTTGTGCG TTGCGCCACT GATAGGAGTA AACAATGTCA AAGCAACAGA 12720

TCGGCGTAGT CGGTATGGCA GTGATGGGGC GCAACCTTGC GCTCAACATC GAAAGCCGTG 12780

GTTATACCGT CTCTATTTTC AACCGTTCCC GTGAGAAGAC AGAAGAGGTG ATTGCCGAAA 12840

ATCCAGGCAA GAAACTGGTT CCTTACTATA CGGTGAAAGA GTTTGTTGAA TCTCTGGAAA 12900

CGCCTCGTCG CATCCTGTTA ATGGTGAAAG CAGGTGCAGG CACGGATGCT GCTATTGATT 12960

CCCTCAAGCC GTACCTCGAT AAAGGTGACA TCATCATTGA TGGTGGTAAC ACCTTCTTCC 13020

AGGATACCAT CCGTCGTAAC CGCGAGCTTT CTGCAGAAGG TTTTAACTTT ATAGGTACCG 13080

GTGTCTCCGG TGGTGAAGAA GGTGCGCTGA AAGGTCCTTC CATTATGCCT GGTGGCCAGA 13140

AAGAAGCCTA TGAGCTGGTT GCGCCGATCC TGACCAAAAT CGCCGCCGTT GCTGAAGATG 13200

GCGAACCGTG CGTTACATAT ATTGGTGCCG ATGGCGCAGG TCACTATGTG AAGATGGTTC 13260

ACAACGGTAT TGAATACGGT GATATGCAAC TGATTGCTGA AGCCTATTCT CTCCTGAAAG 13320

GCGGCCTGAA TCTTTCTAAC GAAGAACTGG CACAGACCTT TACCGAGTGG AATAACGGTG 13380

AACTGAGCAG CTACCTGATC GACATCACCA AAGACATCTT CACTAAAAAA GATGAAGACG 13440

GTAACTACCT GGTTGATGTG ATCCTGGATG AAGCGGCTAA CAAAGGTACC GGTAAATGGA 13500

CCAGCCAGAG CGCGCTGGAT CTCGGCGAAC CGCTGTCGCT GATTACCGAG TCTGTGTTTG 13560

CACGTTATAT CTCTTCTCTG AAAGAGCAGC GTGTTGCCGC ATCTAAAGTT CTCTCTGGCC 13620

CGCAAGCGCA GCCAGCTGGC GACAAAGGTG AGTTCATCGA GAAAGTTCGT CGTGCGCTGT 13680

ATCTGGGTAA AATCGTTTCT TACGCTCAGG GTTTCTCTCA GCTGCGCGCA GCGTCTGAAG 13740

AGTACAACTG GGATCTGAAC TACGGCGAAA TCGCGAAGAT TTTCCGTGCT GGCTGCATCA 13800

TCCGTGCGCA GTTCCTGCAG AAA TCACCG ATGCTTATGC CGAAAATCCG CAGATCGCTA 13860

ACCTGCTGCT GGCTCCGTAC TTCAAGCAAA TTGCCGATGA CTACCAGCAG GCGCTGCGTG 13920

ATGTCGTTGC TTATGCAGTA CAGAACGGTA TCCCGGTTCC GACCT 13965

以上仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡依本发明技术实质对以上实施例作修改、等同变化与修饰，均属本发明技术方案的范围内。

Claims

1、一种寡核苷酸，其特征在于，选自SEQ ID NO：1中的4671至4688碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5406至5423碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5494至5511碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5840至5860碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10039至10057碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10448至10466碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9893至9911碱基的核苷酸；SEQID NO：1中的10245至10263碱基的核苷酸。

2、一种寡核苷酸对，其特征在于，选自SEQ ID NO：1中的4671至4688碱基的核苷酸和SEQ ID NO：1中的5406至5423碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5494至5511碱基的核苷酸和SEQ ID NO：1中的5840至5860碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10039至10057碱基的核苷酸和SEQ ID NO：1中的10448至10466碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9893至9911碱基的核苷酸和SEQ ID NO：1中的10245至10263碱基的核苷酸。

3、权利要求1的核苷酸或权利要求2的核苷酸对的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR，或者作为探针用于杂交反应与荧光检测、制造基因芯片或微阵列，供检测大肠杆菌O132型。