CN1257279C

CN1257279C - 对大肠杆菌o163的o－抗原特异的核苷酸

Info

Publication number: CN1257279C
Application number: CN 200410019044
Authority: CN
Inventors: 王磊; 杨静华; 冯露
Original assignee: Tianjin Biochip Corp
Current assignee: Tianjin Biochip Corp
Priority date: 2004-04-19
Filing date: 2004-04-19
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2024-04-19
Also published as: CN1563059A

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O163(Escherichia coli O163)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O163中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15433个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ IDNO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O163的O-抗原基因簇中的寡糖单位处理基因(包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因)的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O163的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O163的方法。

Description

对大肠杆菌O163的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O163(Escherichia coli O163)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O163中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O163并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank etal(1987)“The function of antibody and complement in the lysis ofbacteria”.Rev Infect Dis 177：1750-1753.Pluschke G et al“Role of thecapsule and the O-antigen in resistance of O18：Kl Escherichia coli tocomplement-mediated king”.J Bacteriol 42：907-913]。大肠杆菌是一个种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]。

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O163的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O163的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。

本发明的一个目的是提供了大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的基因：转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf10、orf11基因；糖合成路径基因，包括manC，manB，fnlA，qnlA，qnlB，。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O163的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因，包括orf5、orf6、orf10基因。它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O163的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O163的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O163的O-抗原也是高度特异的。

本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O163的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O163。

本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O163的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15433个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O163的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其包括命名为manC、manB、wzx、wzy、orf5、orf6、fnlA、qnlA、qnlB、orf10、orf11的11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O163的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特异性的基因包括：转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、off10基因。其中所述的转运酶基因是SEQID NO：1中的4349至5602碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO：1中的5599至6834碱基的核苷酸；所述的orf5基因是SEQ ID NO：1中的6852至7586碱基的核苷酸；orf6基因是SEQ ID NO：1中的7880至8983碱基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO：1中的12196至13389碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O163的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O163的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的4500至4518碱基的核苷酸和5425至5442碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的5100至5117碱基的核苷酸和5503至5520碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的6102至6119碱基的核苷酸和6738至6755碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的6223至6240碱基的核苷酸和6784至6801碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O163的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O163的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O163的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。

前述的对大肠杆菌O163的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测细菌。

前述的对大肠杆菌O163的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O163，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O163中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O163的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；将得到PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上的用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O163的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因设计引物；在每个基因内各设计两对引物，每对引物分布在相应基因内不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O163及其O-抗原都是高度特异的；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O163，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O163的灵敏度。

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O163，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O163中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O163的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATCAAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAGTCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库；反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3MNaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O163的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O163的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O163的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因设计引物；在每个基因内各设计两对引物，每对引物分布在相应基因内不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR，所有引物在大肠杆菌O163中得到阳性结果，在其他组中没有扩增到任何大小正确的带，也就是，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O163及其O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：将大肠杆菌O163的冻存菌液接种到有LB培养基的三角瓶中，30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时至饱和，取培养好的菌液稀释，取稀释菌液涂布LB琼脂平板，30℃至40℃，培养数小时计数，计算原液中活菌浓度；在5份重量均为20g的生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入LB培养基，过滤，过滤液于30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时；从培养好的菌液中取数ml于6,000g离心数分钟，去上清，加MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100℃沸水中煮数分钟，裂解液于12,000g离心数分钟，取上清做为PCR模板；用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的4500至4518碱基的核苷酸和5425至5442碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5100至5117碱基的核苷酸和5503至5520碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的6102至6119碱基的核苷酸和6738至6755碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的6223至6240碱基的核苷酸和6784至6801碱基的核苷酸进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环；反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性；参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果；参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果；说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O163的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长15433个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，它的11个基因都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O163的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf10基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到O-抗原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因对大肠杆菌O163的O-抗原是特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O163的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基转移酶基因包括orf5、orf6、orf10基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源于大肠杆菌O163的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O163为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O163及它们的O-抗原是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O163的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O163中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的4349至5602碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的5599至6834碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O163都是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf10基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf10基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O163。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf5、orf6、orf10基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O163表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf10基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O163。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因包括orf5、orf6、orf10基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf5、orf6、orf10基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O163。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf5、orf6、orf10基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O163的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取。

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O163，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O163中的O-抗原基因簇

以大肠杆菌O163的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库。

首先是连接产物的获得：

用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：

参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：

取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O163的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序。

从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到，最后获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析。

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O163的基因组作6个LongPCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1与Shigella flexneri 2a str.301的mannose-1-phosphate guanyltransferase在478个氨基酸中有78％的相同性，88％的相似性。mannose-1-phosphate guanyltransferase由manC基因编码，高度的相同性表明orf1也是manC基因，命名为manC。Orf2与Escherichia coli O157：H7的phosphomannomutase在454个氨基酸中有85％的相同性，93％的相似性。phosphomannomutase由manB基因编码，高度的相同性表明orf2也是manB基因，命名为manB。Orf3与Escherichia coli的O-抗原转运酶Wzx在412个氨基酸的序列中有24％的相同性，46％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法发现orf5有12个潜在的穿膜区，Wzx蛋白的氨基端有一个大约40个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf3是wzx基因，命名为wzx。Orf5与Yersinia pseudotuberculosis的O-抗原聚合酶在402个氨基酸的序列中有31％的相同性，55％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane and surfaceprotein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179：125-142]发现orf5有9个潜在的穿膜区，它与许多Wzy蛋白有相似的二级结构，有一个大的loop，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以确定orf5是wzy基因，命名为wzy。Orf5与Thermoanaerobacter tengcongensis的糖基转移酶在153个氨基酸中有24％的相同性，49％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf5与糖基转移酶家族的保守的功能域PF00535的Evalue为2×e^-5，推测orf5也是一个糖基转移酶，将orf5暂命名为orf5。Off6与Nostoc sp.PCC 7120的糖基转移酶在289个氨基酸中有26％的相同性，47％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf6与糖基转移酶家族1的保守的功能域PF00534的E value为3.7×e^-7，推测orf6也是一个糖基转移酶，暂命名为orf6。Orf7与Vibrio cholerae O37的UDP-D-GlcNAc 4，6-dehydratase/5-epimerase/3-epimerase在343个氨基酸中有72％的相同性，85％的相似性。UDP-D-GlcNAc 4，6-dehydratase/5-epimerase/3-epimerase由fnlA基因编码，高度的相同性表明orf1也是fnlA基因，命名为fnlA。Orf8与Vibrio cholerae O37的dTDP-4-dehydrorhamnosereductase在285个氨基酸中有54％的相同性，68％的相似性。dTDP-4-dehydrorhamnose reductase由qnlA基因编码，高度的相同性表明orf1也是qnlA基因，命名为qnlA。Orf9与Vibrio cholerae O37的UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase在376个氨基酸中有61％的相同性，79％的相似性。UDP-N-acetylglu-cosamine 2-epimerase由qnlB基因编码，高度的相同性表明orf1也是qnlB基因，命名为qnlB。Orf10与Escherichia coli的糖基转移酶在379个氨基酸中有53％的相同性，68％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf9与糖基转移酶家族1的保守的功能域PF00534的Evalue为3.5×e^-5，因此推测orf10也是一个糖基转移酶，暂命名为orf10。Orf11与Escherichia coli的WbuC protein在127个氨基酸的序列中有39％的相同性，62％的相似性，暂命名为orf11。

实施例6：特异基因的筛选

针对大肠杆菌O163的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

在表l中列出了大肠杆菌O163的O抗原基因簇的转运酶基因、聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166种血清型的大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166种血清型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。

表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共13组。它们的来源都列于表中。

在第8组中含有大肠杆菌O163的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是不含有大肠杆菌O163的基因组DNA，作为阴性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性2分钟后，95℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第3组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O163及其O-抗原都是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O163中筛选到对大肠杆菌O163的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O163的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O163是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O163，并能鉴定它们的O-抗原。

(7)引物灵敏度的检测：将大肠杆菌O163的冻存菌液接种到有LB培养基的三角瓶中，30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时至饱和，取培养好的菌液稀释，取稀释菌液涂布LB琼脂平板，30℃至40℃，培养数小时计数，计算原液中活菌浓度；在5份重量均为20g的生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入LB培养基，过滤，过滤液于30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时；从培养好的菌液中取数ml于6,000g离心数分钟，去上清，加MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100℃沸水中煮数分钟，裂解液于12,000g离心数分钟，取上清做为PCR模板；用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的4500至4518碱基的核苷酸和5425至5442碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5100至5117碱基的核苷酸和5503至5520碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的6102至6119碱基的核苷酸和6738至6755碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的6223至6240碱基的核苷酸和6784至6801碱基的核苷酸进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环；反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性；参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果；参入O个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果；说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O163的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O163的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

根据本发明的对大肠杆菌O163型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ IDNO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表3是大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的结构，共由11个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O163的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大肠杆菌O163的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

序列列表

SEQUENCE LISTING

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>对大肠杆菌O163的O-抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>15433

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60

gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaactgcg cgtgaagcgt 120

caactgctgg cggaagtaca gtccatttgc ccgccgggcg tgaccatcat gaacgtgcgt 180

cagggcgaac ttttaggttt gggccactcc atcttgtgtg cacgacctgc cattggtgac 240

aacccatttg tcgtggtact gccagacgtt gtaatcgacg acgccagcgc tgacccgctg 300

cgctataacc ttgctgccat gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggacgcag ccaggtgctg 360

gcaaaacgta tgccgggcga tctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agaaccgctg 420

gatcgtgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaattcatag aaaaaccgga tcagccacag 480

acgctggact cagacattat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg 540

gaactggaac gcactcagcc aggtgcatgg ggacgtatcc aactgactga tgccattgcc 600

gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgcc atgctgatga ctggtgacag ctacgactgc 660

ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttc gtgaagtatg gcctacgcaa cctgaaagaa 720

ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccga 780

atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cggtgagatt cgtggcgaaa gtaatttgtt 840

tcgaatattc ctgccgttat tttatataac aatcagaaca acaacgagtt agcaatagga 900

ttttagtcaa agttttctag gatttccctt gtttccagag cggattggta gacattagcg 960

ttgaattttc cgggtttagc gcgaggtagg taacgctcgt cacatcgtag acatgtatgc 1020

agtgccctgg tagctgtaaa gccaggggcg gtagcgtgca ttaatacctc tattaatcaa 1080

actgagagcc gcttatttca cagcatgctc tgaagtaata tggaataaat taagtgaaaa 1140

tacttgttac tggtggcgca ggatttattg gttctgctgt agttcgtcac attataaata 1200

atacgcagga tagtgttgtt aatgtcgata aattaacgta cgccggaaac ctggaatcac 1260

ttgcagatgt ttctgattct gaacgctatg tttttgaaca tgcggatatt tgtgatgcag 1320

ctgcaatggc acggattttt gctcagcatc agccggatgc agtgatgcac ctggctgctg 1380

aaagccatgt tgaccgttca attacaggcc ctgcggcatt tattgaaacc aatattgttg 1440

gtacttatgt ccttttggaa gctgctcgga attactggtc tgctcttgat ggcgacaaga 1500

aaaatagctt ccgttttcat catatttcta ctgacgaagt ctatggtgat ttgcctcatc 1560

cagatgaagt aaataataca gaagaattac ccttatttac tgagacaaca gcttacgcac 1620

caagcagccc ttattctgca tcaaaagctt ccagcgatca tttagtccgt gcgtggaaac 1680

gtacctatgg tttaccgacc attgtgacta attgctctaa caattatggt ccttatcatt 1740

tcccggaaaa attgattcca ttggttattc tcaatgctct ggaaggtaaa ggattaccta 1800

tttatggtaa aggggatcaa attcgcgact ggctgtatgt tgaagatcat gcgcgtgcgt 1860

tatataccgt cgtaaccgaa ggtaaagcgg gtgaaactta taacattggt ggacacaacg 1920

aaaagaaaaa catcgatgta gtgctcacta tttgtgattt gttggatgag attgtaccga 1980

aagagaaatc ttatcgtgag caaatcactt atgttgccga tcgtccggga cacgatcgcc 2040

gttatgcgat tgatgctgag aagattggta gcgaattggg atggaaacca caggaaacgt 2100

ttgagagcgg gattcgtaaa acggtggaat ggtacctggc taatgcaaaa tgggttgaga 2160

atgtgaaaag tggtgcctat caatcgtgga ttgaacagaa ctatgagggc cgcaagtaat 2220

gaatatcctc cttttcggca aaacagggca ggtaggttgg gaactacagc gttctcttgc 2280

tcctctgggt aacttgattg ctcttgatgt tcactccact gattattgtg gcgatttcag 2340

caacccagaa ggtgtggctg aaaccgtcaa aaaaattcgc ccagatgtta ttgttaatgc 2400

tgcggctcat accgcagtag ataaagctga gtcagaaccc gaatttgcac aattactcaa 2460

tgcgaccagc gttgaatcaa ttgcaaaagc ggctaatgaa gttggggcct gggtaattca 2520

tttctcaact gactacgtat tccctggaaa tggcgacact ccatggctgg agactgatgc 2580

aaccgcaccg ctaaatgttt acggtgaaac caagttagct ggagaaaaag cattacaaga 2640

gcattgtgcg aagtacctta ttttccggac cagctgggtc tatgcaggta aaggaaataa 2700

cttcgccaaa acaatgttgc gtctggcaaa agagcgtgaa gaattagcgg ttattaacga 2760

tcagtttggt gcgccaacag gtgctgaact gctggctgat tgtacagcac atgccattcg 2820

tgtcgcactg aataaaccgg atgtcgcagg cttgtaccat ttggtagcca gtggtgccac 2880

aacctggtac gattatgctg cgctggtttt tgaagaggcg cgcaaagcag gcattcccct 2940

tgcactcaac aagctcaacg cagtaccaac aactgcctat cctacaccag ctcgtcgtcc 3000

acataactct cgccttaata cagaaaaatt tcagcagaac tttgcgcttg tcttgcctga 3060

ctggcaggtt ggcgtgaaac gaatgctcaa cgaattattt acgactacag caatttaata 3120

gtttttgtat cttgttcgtg atggtggagc aagatgaatt aaaaggaatg atgaaatgaa 3180

aacgcgtaaa ggtattattt tagcgggtgg ttctggtact cgtctttatc ctgtaactat 3240

ggctgtcagt aaacagctgt taccgattta tgataaaccg atgatctatt acccgctctc 3300

tacactgatg ttggcgggta ttcgcgatat tttgattatc agtacgccac aggatactcc 3360

tcgttttcaa caactgctgg gtgacgggag ccagtggggc ctgaatcttc agtacaaagt 3420

tcaaccgagt ccggatggtc ttgcgcaggc gtttattatc ggtgaagagt ttatcggtgg 3480

tgatgattgt gctttggttc taggtgataa tatcttttac ggtcacgatc tgccgaagtt 3540

aatggatgtc gctgttaaca aagaaagtgg tgcaacggta tttgcttatc acgtaaatga 3600

tcctgaacgc tacggtgtcg ttgagtttga taaaagcggt acggcaatta gcctggaaga 3660

aaaaccgcta cagccaaaaa gtaattatgc ggtaactggg ctttattttt atgataacga 3720

tgttgtcgaa atgtcgaaaa atcttaagcc ttctgcccgt ggtgaactgg aaattaccga 3780

tattaaccgt atttatatgg aacaggggcg tttatccgtt gccatgatgg ggcgtggtta 3840

tgcatggctg gatacgggga cgcatcaaag tcttattgag gcaagcaact ttattgcaac 3900

aattgaagag cgtcaggggc tgaaagtttc ctgcccggaa gaaattgctt accgtaaagg 3960

gtttattgat gctgagcaag taaaagtgtt agtacaacct ctgaaaaaaa atgcttatgg 4020

tcagtaccta ctaaaaatga ttgaaggtta ttaataaaat gaacgtaatt aaaactgaaa 4080

ttcctgatgt attaattttt gaaccgaaag tttttggtga tgagcgtggt ttctttatgg 4140

aaagctttaa tcagaaagtt ttcgaagagg ctgtagggcg taaggttgaa tttgttcagg 4200

ataaccattc taagtctaat aaaggcgttt tacgcgggct ccattaccag ttagaacctt 4260

atgcgcaagg caaacttgtg cgctgtgttg ttggtgaggt ctttgatgtt gcggttgaca 4320

ttcgaaaatc gtcacctacg tttggcaagt gggttggtgt gaatttgtcg gcggcgaata 4380

agcgccaatt atggataccg gaaggatttg ctcatggctt tttaagccta acagataaca 4440

ctgaattttt gtataaaact aataacttct ataatagaaa ttatgaaaga tgtttaaaat 4500

ttgatgatat agaattaagc atcaaatggc caattggcga cgaaactgag ttgatcgttt 4560

cagaaaaaga tatgttaggc aatattttta gtaaattata gtttttatca tagcggtatt 4620

taagtttaat acttaccgct atgattttta catctttttt gtaaaggtgc ttaaatgcgc 4680

gctagtccat tttttcggtc agttaaatat ggtattgtat tttctatagt aataatgata 4740

cttactttta ttgtaaggca gtgtattatt aattcgtttg gtgaaaattt aacaggttat 4800

tatttgttaa taaaccaatt agtcggttat ctaaatttag ctgaattggg tttaactacg 4860

gcatcagtat atttattgtt caagccgttg aattctgaaa ataaatatga cattgttggt 4920

tatttttata ttattcacag aatatttaaa tttattgcat cagcaatatt atttattggg 4980

ctaacactct cttttattat gccctattta gtcaaagata atataaattg gcatgatatt 5040

tacataccat gggtttttta tgtcattgca acagcattgt cgtattttta tagtgcagaa 5100

actgttttgt taacagcaag tgaaaaacta tatattgttc ggattgtgaa tggtttggct 5160

cgagttatta cttttttaat acaaatagtt gtgcttaaaa atggtggtgg ttttattatt 5220

tttagtgcgt tagagatttt atatgcgcta attcaatata tactatttag atattatgtt 5280

ctaaaactgt acggggcata tttatatagt aagataacac tatcaaaaga acttccgcta 5340

ataaagcaaa caataataaa agagataaaa aagacattta tccacaagtt atcaggtgtt 5400

atgatcttta atacagacta tataattatt agcattttta taggattatc tacaataacg 5460

atatattcat cctatttaat gttcatacaa gcttcagcta taataattgg aacaattgta 5520

agtccattgg gggcatacat tggaaatttt ttacatagaa ccgacagtaa tctaacgtat 5580

ttaaaattca attcaataaa tacgattttt ttcttattgg catcgattgg ttgtattata 5640

tacaacaata tctcaactcc ttttgtacaa ctgtggatgg gcaaagatat cattttttct 5700

caagatattg tggcgttgct agcggttaac tttttttgtt tagtagcgag gagcgctgta 5760

gatattttta aggtcgcata tggatatatg tctgatattc atttaccaat aattgaaggt 5820

actttaaatt taattatatc tttatctttg gttaattttt atggtgtcaa aggtgtcatt 5880

tatggaacta tatgttcaaa tgttatcatt atcatgctgg cgaggccctg gtatttatat 5940

aaagaggcct tcaatttatg cactatagat ttcataaaag atcatattca attatgggta 6000

atatcattaa tgattctcat cactttgtta agtggtcgag ttaatgatat gtatacactt 6060

ttcgagaaat acttaatgaa taattgggat gttagcaata agctaattga acaacttctc 6120

acacatagtc tctttttgat tttatcaaca atatttgtag taattatcta tattatagtc 6180

acccctaaaa attgccttgc ttcagtaaaa atattaacca ataaagggtt ataatgaatc 6240

caatacctat tttcataatg actagaaatg atggtgttta tctgcaggac tgtttgaact 6300

caatccttaa aaataccgta tacccattta atctgtatgt tattgataat aactcttcag 6360

ataaattaca tttaaaaatt cttgaggaat ataaaactcg gcagaatgtg aatgtaataa 6420

gaaataagag taacttatgg gttttaggtc taaataagca tcttgagaaa gttaaaaagg 6480

aaagtgattc ttcttatttt gtgcttactg acggtgatat tatttttcct gagcctggaa 6540

taaatggatg ttggttgact caattagtaa tatatatgga cacgtataaa tgcattggta 6600

aaataggtat gtcactaaat tgggattcga taagggatga cccattctat gaagaaattt 6660

atgagcaaga aaaaaaatta tataataaca ataaaaaaat agaaaatctt tatatatcac 6720

cagtagatac aaccgcagct atatatcgct gggattggtc tatcgaagga tataaatttt 6780

atcctgatca tatacgctat cttagaccgg agctatactc atgtaggact ccaaaagaat 6840

ttaatgcaaa acatttaggt tggttagttt ataaaaataa taatggccaa gcaattaaaa 6900

aactagatga gaaaattaaa tgtttcacct tagttggagc tgatataaaa aaaacacaac 6960

taaaaaaggc tagcctgaag gtgagaatgt ttaattcttt atgtggaaaa cccataaaat 7020

atttttggag tatgcgacgt attttatata ctatattcta tacccttaaa aaaggaattt 7080

ggctttatga taatcattga gaaaacaaga tgataccata ttttttaatg ttcgcatgcc 7140

ttgtgatctt ttctttattt aaaggtaatg acagaagagt attaaatgct tctatgatca 7200

tccttggcat tttttgcgcc atgaggggaa acaatgttga tagagactat gagacgtata 7260

taagtattta tacatatatt atagaaggtt atagctatgc tattgagcca acctttcatc 7320

tattatcaat aatttcaaat acccttacgg gtacaccatt tcttatattt tgcgtttatg 7380

caggacttgc tatttatttt aaaataaaat ttattgaata ttggtcgcct tatttattgc 7440

tttctgtatt gctctatttt tccaatgtgt atttactaca tgagatgact caaattagga 7500

ttgggttagc aagtgccatt ggttttttta gtttgaaata tttaataacc gcagaaaaga 7560

aaaaatattt tatttgggtg ttcatcgcta tgactttcca tttttcaatg gctgtatttt 7620

ttttgttgcc attgttaaat tcaaagcgat tgtctggcag gtatgtcacc atatattgga 7680

taagtattat tttactttac tttttatctt attataaaat tgatttaagt gtctttttaa 7740

aatattttga tataggcata ataaattcaa aatatgattt gtatcgagag caaggggaaa 7800

ataatgatac tagtgtgaat atttattctg cactgcaata ttttcatttg tttgtgattt 7860

ttctaagtat ggtctatcgc gactcgttca gatatgatga aaagtatata attatgttaa 7920

aaatttattc attaggacct ttatcattat tagtgttttc aaatgttcct ggtttttcat 7980

tacgtttatc tgaattgttt aatgtagggg aaatagtttt attaccaatg ctcgttagtc 8040

acattaaaca aattaagcta gcctacctgt cagtaatatt gatttctctt tgtttgttgc 8100

ttattaattt gtattatttg tccttgttga aggaatattc aatctgatgc ttattttacc 8160

tatagttgtt atttataaat gcaaactcga aaattctgca agtttaaata cattattaaa 8220

atgtgaatca aatgaattta taaaggaaat tttcgtatat aataattctc ctgatgaaat 8280

atttataccg gattattata tgggtgttaa agtttataag atagatgatt ataataactc 8340

tggtgttagt agagcttata ataaaggttt aaaacttgct tcaaatctaa attataagta 8400

tgttcttctt ttagaccaag atacatatat tcctaaggac tttttgaaaa tatgtaatga 8460

aactatatca cagcatttaa atataaaact tttctgtcct atattaaaaa caaaacgtgg 8520

tgtcatttgt tctccattgt catataagta tcatagagga tttcatgtta agaatattgt 8580

cgctggggaa aagggattaa gcaaattatc tcctataaat agcggaatga tattagatgt 8640

tgaagccgct cttaagtgtg gtggatataa tgaaaatgtt tttctagatt ttagtgattt 8700

tcaatttatt gagagattta agaaaaaaaa tcattcattc tatgttttac caatagtatt 8760

aacgcaagat ttttcaggag aagaaactga taaagaaaaa acactaaggc gttttcatat 8820

ttattgtata tgtgctaaaa actgtactaa aaaaaatttt acagatcaat ttatctattt 8880

ttttatggtt ttactcagag caatgaagtt gacttttaaa atcaaaacta taaacccatt 8940

aatcactttt tatacaagat atctccgggg gtaagatgat ttctgtatgc attccgactt 9000

ataatggtga gaattatata aaacaacaaa ttctcagcat acttaatgag ttgggtgaag 9060

atgatgagat tgttatttct gatgatggtt caacagatat gacattagca ataatagaag 9120

aaataaatga taaacgaatt attgtaatta aaaatgagga aaacattcaa tgcgaatcct 9180

acaataaccg aactgaaaaa ttgctaaaaa aagtatcatt gaatctgcaa aatgccttat 9240

tacattgtaa aggagattat atatatttag ctgaccaaga tgatatatgg aagaaagggc 9300

ggattactaa tacattacct ttattagcag agaataagcc tattttggtt gtgtgtgatt 9360

gttgtgttgt tgatgaaaat aatactataa cgcagaggtc atattttgat tacgttaccc 9420

cttcgcaaaa tttatggaga acagtaatta agagttcctt tcatgggtgc tgtatgtgtt 9480

ttaatagaat tttattagca aaagcatttc cgtttcctca ctatagtttg gggcatgatt 9540

tatggattgg tttaattgca ataaaatttg gtctcgtata tttttgtcca gaagttttag 9600

tggagtatag gcgacattcg acaactgtta cgtctacagg tagtaaaagt aagaatagtt 9660

ttggatttaa aatacgttac agaattatgt tattaattga atatttgaaa ctatataaaa 9720

gaaaatgaaa aaaattgcac atgttttagt tcttcccaaa atggcaggtt ctcaaaaatt 9780

ttgccatatg cttctctcaa aaatagaggg gtatgaaaaa tttgttcttg tctctgaatg 9840

tgaggatgtc gatttagaac aacgagctga gtttataaaa aattttgaat caattaatgt 9900

caatattatt tggtgtaaga accttaagag aaatattggt aaatctgatg taaaagcttt 9960

tgttgagtta tataatattt ttaaacaata tgattttgat atagttcata ctaattcgac 10020

taagcctggc attctggcta ggattgccgc taaaatggcg ggtgtaaaaa aaataataca 10080

tacagtacac ggcatttctt tttatagagg acaaccttat atcaaaaggt taatatactg 10140

gataatagaa gtttttgcac ttcagtttgg tgatcttaac atatgtgtca ataaattcta 10200

tcagaaatat tataaaattt ttttttggaa gaaaagtatt accatttata atggctatgg 10260

tttttccgaa attaaaaaaa taaacaaaat ggcaaaagac agtaatgaaa aaagattttt 10320

gtttgtagga cggctagatg agcaaaaaga tccgctcaca cttatcaaag cttttgaact 10380

tattgaaaaa aaatatccta atgtatattt agatattgtt ggcgatggtg aattaaaagg 10440

gcattgcgaa gaattggtgg aaaaattaaa aattcaagat aaggtgatat ttcatggttg 10500

ggtagaaaaa ccatactctt tttacttaaa ttgcaatgta tttatttgcc cgtcaaaata 10560

tgaggcattt ggttttattt tcgttgaagc tgcttatttt aaaaaaccaa taataactac 10620

taatgtagaa ggtattccgg aggtcgtggt agattcgaaa atgggctatt tgattaagcc 10680

gggaaatttc ctagatttat caaagagaat gacaaattta ctagagtcta attctttatg 10740

tgtagctatg ggtgaatatg gtcataaata tgttacaagt aatttcgata ttgagaaatg 10800

tatcgaaaaa tatcaggctg tatatgatga cctttgaagg cttttggtat gatgaaagta 10860

gtgtttaaaa tttatattcc ttatttgatt gtaatgattg ctgtgtttgt catgctaacg 10920

tatacagaca tggtaagtaa attttctagt attgctttag agtacttctg tatatttaca 10980

tccctttttg tttttaaaaa aatttataga ggaataattt ggactttagt cgtagggata 11040

cttggagctc agatatcatc tttatataca agtggaaatt atgtcatacc tcttactctc 11100

tcaaacgttg gtgagtataa tgcgttaggt tttgagcttt tatttaagtt gttatgtata 11160

tcactcttat ttttatgtgt ggcacaaatt atctttagtc ctgtttttac ttatgatatt 11220

ccacggcgga aaacattttt attagctctt cttttcttgc ctctaataaa tggtccttta 11280

gttaagttca cagagactct ttatttttac tataagcaag tgactttttc ccctgcgtat 11340

aattatcctg caattgcaaa aaaattttta aaaacagata tttggcatga tgagtcactt 11400

cttttgaaaa ataaaaaacc taatgtgata gtaattttta ctgaaggaat gtcttttaat 11460

gtaattgata gcgttaataa tttaggcctc ggagtaactc caaagctcga tgaaatcatg 11520

aagaaatcat ttttctttat aaattattat aatcatacag cagctacttt tcgagggtta 11580

agagggcaat taacttctgc ttatcaattt aaagatggtg taggtgcaaa tggtgatggt 11640

ttttttgaaa taacaaatca aaaagttaaa tcaatatata ataaaagatt agtctcttta 11700

ccggagatat tgaattcaaa tggttataag acgatatttc tttcttcaac agaaaaaact 11760

agcactttga atgcgatgct gaaaacctta tcattcaatg aagttttggg aatgggagat 11820

tttgattttt atcagaatga ccgtatgtca gataagcaaa ctttcatagc gcttaaggaa 11880

gttgttgaaa gaaacaagaa taataaattt ttcattggag tttacccatc tggaactcat 11940

catggtttag atagccctga tttgcgtttt agagatggtt caaattctta ttataacaaa 12000

ttttataatt ttgatcatca agttggcaag ttcatagatt atcttacgtc cacaggtctt 12060

ataaataata ccttggtggt tattacggct gatcattcaa ctttccctac accacaattt 12120

aataaatctt ttagttcaaa ttctgattat tttgttgatg caataccttt aataattttg 12180

gggcaggaaa tagagtctaa aaaaaataat gcgcatggga agaatagttt agcattggca 12240

ccaacgatac taaatttatt aaatattaac cattatccta atttcttttt aggctgctcg 12300

ctcttggatg taaaatgcca aagtactttt agtcatatat cggcaattgg aaattctttt 12360

tttaaaaccg gcgataaaaa gtgttcttca gatgattata acgttaaaaa attagataat 12420

tctagcgata taattaattt ctataatgtt agtggttaaa gtataaatac agcttatagt 12480

tgactgatat atatggttaa tgtttttata gtgaatattt tttcaagccg cacaccctcg 12540

cggtgaccac cccctgacag gagtaaacaa tgtcaaagca acagatcggc gtcgtcggta 12600

tggcagtgat ggggcgcaac cttgcgctca acatcgaaag ccgtggttat accgtctcta 12660

ttttcaaccg ttcccgtgag aagacggaag aagtgattgc cgaaaatcca ggcaagaaat 12720

tggttcctta ctttacggtg aaagagtttg ttgaatctct ggaaacgcct cgtcgcatcc 12780

tgttaatggt gaaagcaggt gcaggcacgg atgctgctat tgattctctc aagccatacc 12840

tcgataaagg tgacatcatc attgatggtg gtaatacctt cttccaggac accattcgtc 12900

gtaatcgtga gctttctgcc gaaggcttta acttcattgg taccggtgtc tccggtggtg 12960

aagaaggcgc gctgaaaggt ccttccatta tgcctggtgg gcagaaagaa gcctatgaac 13020

tggttgcacc gatcctgacc aaaatcgccg cagtggctga agacggtgag ccatgcgtta 13080

cctatatcgg tgccgatggc gcaggccatt atgtgaagat ggttcacaac ggtattgaat 13140

acggagatat gcagctgatt gctgaagcct attctctgct taaaggtggc ctgaatcttt 13200

ccaacgaaga actggcgcag acctttaccg agtgggataa cggtgaactg agcagctacc 13260

tgatcgacat caccaaagac atcttcacta aaaaagatga agacggtaac tacctggttg 13320

atgtgattct ggatgaagcg gct 15433

表1大肠杆菌O163的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物位置	反向引物位置	PCR产物长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
基因	功能	基因的碱基位置	正向引物位置	反向引物位置	PCR产物长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)	wzxwzy	O-抗原转运酶O-抗原聚合酶	4349-56025599-6834	4500-45185100-51176102-61196223-6240	5425-54425503-55206738-67556784-6801	1093bp420bp653bp578bp	0000	58585856

表2 166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号	该组中含有的菌株	来源
组号	该组中含有的菌株	来源	1、野生型大肠杆菌2、野生型大肠杆菌3、野生型大肠杆菌4、野生型大肠杆菌5、野生型大肠杆菌6、野生型大肠杆菌7、野生型大肠杆菌8、野生型大肠杆菌9、野生型大肠杆菌痢疾志贺氏菌10、鲍氏志贺氏菌11、福氏志贺氏菌12、野生型大肠杆菌13、野生型大肠杆菌	O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，O19ab，O20，O21，O22，O23，O24O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，034，O35，O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，O57，O58，O60，O61，O62，O53O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81，O82，O83，O68O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O51，O137，O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153O168，O169，O170，O171，O172，O173，D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B17，B18F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，DS，DRO3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119去除大肠杆菌O163的第8组菌	IMVS^aIMVS^aIMVS^aIMVS^aIMVS^aIMVS^aIMVS^aIMVS^abcdddIMVS^a

为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阴性对照

a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3是大肠杆菌O163的O-抗原基因簇的结构表

E.coli O163 O-antigen gene cluster

#orf galF manC manB wzx wzy orf5 orf6 fnlA qnlA qnlB orf10 orf11 gnd

表4是大肠杆菌O163的O-抗原基因簇中的基因的位置表

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC 60

GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAACAGCG CGTGAAGCGT 120

CAACTGCTGG CGGAAGTACA GTCCATTTGC CCGCCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT 180

CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT GGGTCACTCC ATTTTATGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC 240

AATCCATTTG TCGTGGTGCT GCCGGACGTT GTGATCGACG ACGCCAGCGC CGACCCGCTG 300

CGCTACAACC TTGCAGCCAT GATTGCGCGC TTCAACGAAA CGGGCCGCAG TCAGGTGCTG 360

GCAAAACGTA TGCCGGGCGA TCTCTCTGAA TACTCCGTCA TTCAGACAAA AGAACCACTG 420

GACCGTGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG 480

ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG 540

GAACTTGAAC GCACTCAGCC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCCATCGCT 600

GAACTGGCGA AAAAACAGGC TGTTGATGCA ATGCTGATGA CAGGCGACAG CTACGACTGC 660

GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GACTGCGTAA CCTAAAAGAA 720

GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG 780

ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT 840

TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG 900

GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG GGCGGATTGG TAAGACAATT 960

AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TAAGCGCGAG TGGGTAACGC TCGCTACATC GTAGGCATGC 1020

ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGTCTGATGA ATAAATCGAT 1080

TTGTTCAATA TAGTAATCTA CTAGAAAAAC TTTTCATCCC TCATAATTAT CGATGTCAAT 1140

ATTTGAAATA TAATTAGCAA CCAACAGTTG ATTAAAATAG TTCAATGTTT CTGCATAATA 1200

ATTATATTGA TGGTAAAAAA TTAAACATAA CGAACCCTAT TGTTTTATGC GTTTATTTAT 1260

AACGTAAGGC CCATTTAATA GCTCTGTAAA TAATGTAATT CACTTAAATT TTCTTTGTTT 1320

TACCAAATAC CCTTTGGTTT AACCGAATTT TATATTTAAC CTTATCTTCA AGGTATGAGT 1380

Orf1的起始

TATAGCTCTG GGCCTTAGAA TGAGTTAAT A TGATGAATCA CGAAAAAATT TTCCCAATAA 1440

TCATGGCTGG TGGGGCAGGT AGTCGTCTGT GGCCACTGTC CCGCGAGCTT TATCCAAAAC 1500

AATTCATTCG CCTTAAAGGC GAACTCACCA TGTTACAGGC AACTCTAAGC CGTTTGAATA 1560

CTTTGATGTG TAATGATCCG ATTATTATAT GCAACGAACA GCACCGCTTT ATTGTTGCAG 1620

AGCAGGTGCG CCAGCTGAAC AAACGGACCG AAAATATCAT TTTGGAGCCT GTCGGTCGTA 1680

ACACCGCTCC GGCAGTTGCC CTCGCGGCGC TGGCGGCAAA ACGCAGTCGC CCGGACTGTG 1740

ATCCGTTGAT GCTGGTTCTG GCTGCTGACC ATGTTATTCA GAACGAAGAT GCATTTCGCG 1800

AAGCGGTAAA GGTGGCTATC CCTTACGCGG AAAACGGCAA GTTGGTGACT TTCGGCATCG 1860

TGCCTGATAC GCCGGAAACG GGATATGGCT ACATTCGTCG TGGTGAGGCT CTTTTTAGCG 1920

TAGATGAGTT CAAAGCCTTT GCTGTAAAAA CATTTATAGA AAAGCCTAAT CTTGAAACTG 1980

CGATCGATTA CGTCTCAAGT GGTGAGTATT ACTGGAACAG TGGTATGTTC ATGTTCCGTG 2040

CAGGTCGCTA CCTGGAAGAA CTTGAAAAAT ACCGTCCGGA TATCTTAAGT GCCTGCGAAA 2100

AATCGATGGC AGTGGTTGAT CTTGATCTCG ATTTTATCCG CGTGGATGAA GAAGCCTTTC 2160

TCTGCTGTCC GGAAGAGTCC ATTGACTATG CAGTGATGGA ACATACGGCG GATGCCGTGG 2220

TGGTGCCAAT GGATGCGGGC TGGAGTGATG TCGGTTCATG GTCTTCTTTA TGGGAAGTTA 2280

GCGATAAAAC TCGTGAGGGA AATGTTTGCA CTGGAGATGT GATTTCATTG AACTCTGGCA 2340

ATAATCTTAT TTTCTCCGAT ACAAGCTTAA TTGCCACAGT TGGTGTGCAT AATCTAATTA 2400

TAGTACAGAC TAAAGACGCG GTACTGATTG CTGACCGTGC CGCTGTGCAA GACGTTAAAA 2460

AAGTGGTGGA GAAGATCAAG ACTGATGGTC GCCATGAACA CCATATTCAT CGTGAAGTCT 2520

ACCGTCCATG GGGTAAATAT GACTCCATCG ACACCGGTGA GCGTTACCAG GTGAAACGCA 2580

TCACAGTGAA TCCGGGTGAA GGAATGTCGG TGCAGATGCA CCATCACCGT GCCAAACACT 2640

GGGTCGTGGT GGCTGGTACC GCCAAAGTGA CCATCAATGG TGAAGCGAAG CTGCTCGGTG 2700

AAAACGAGTC CATTTATATT CCGCTGGGTG CGACGCATTG CCTGGAAAAC CCGGGGAAAA 2760

TTCCGCTCGA CTTAATTGAG GTGCGCTCTG GCTCCTATCT GGAAGAGGAC GACATCATCC 2820

orf1的终止

GCTTCCAGGA TCGCTACGGG CGGGTG TAGC ACTCCGCATC ATGCCCAGTG GCGCTGAGCT 2880

TGCTGGATCT ACGAATGAAA AAATAGATTT GACCATTCAA GGGTCAGGAC TAATTTTGCC 2940

orf2的起始

TAAAAAGGAG CCATC ATGGA AAAATTAACC TGTTTTAAAG CTTACGATGT TCGCGGCAAG 3000

CTAGGTGAGG AGCTGAATGA AGACATTGCG TGGCGCATCG GCCGCGCGTA TGGCGAATAT 3060

TTTAAGCCAC GAACTATCGT CTTAGGCGGC GATGTGCGTC TGTCCAGCAA AGCCCTGAAG 3120

CTGGCGTTGG CGAAAGGACT GCAGGACGCT GGTGTTGATG TGCTTGATAT CGGCCTTTCC 3180

GGTACCGAAG AGATCTATTT TGCAACTTTC CATTTGGGCG TGGACGGTGG TATTGAAGTG 3240

ACAGCTAGCC ATAACCCGGT GGACTATAAC GGTATGAAGA TTGTGCGCGA AGGTGCACGT 3300

CCTATCAGCG GTGATACCGG CCTGCGCGAT GTGCAGCGCT TGGCTGAGGC CAACGACTTC 3360

CCGGCGGTGA ATGAAGCCAA ACGCGGTAGT TATAAGCAAA TCAACTTGCA AAAAGAGTAC 3420

ATCGACCACT TGCTAGGCTA TGTCAACGTG GCAAACTTCA AACCACTCAC TCTTGTAATC 3480

AATTCCGGAA ATGGAGCGGC AGGACCGGTT GTCGATGCAC TTGAAGCTCG CTTTAAGGCG 3540

CTGAACGTGC CTATAAAATT CGTTAAAGTG AACAATACGC CTGACGGCAA CTTCCCGAAC 3600

GGTATTCCTA ACCCGTTGTT GCCAGAGTGC CGTTCTGATA CAAGCAATGC GGTGATTGAG 3660

CTCGGTGCAG ACATGGGAAT TGCCTTTGAC GGTGATTTCG ACCGCTGCTT CCTGTTCGAC 3720

GAAAAAGGAC AGTTTATCGA GGGTTACTAT ATAGTTGGTC TGCTGGCGGA AGCCTTTCTT 3780

GAAAAACACC CTGGTGCAAA AATTATCCAT GATCCGCGTC TCTCCTGGAA CACTGTTGAT 3840

GTGGTGACTG CCGCAGGTGG CACGCCGGTA ATGTCGAAAA CAGGACACGC CTTTATTAAA 3900

GAACGTATGC GCAAGGAAGA CGCCATCTAC GGTGGCGAAA TGAGCGCGCA CCATTACTTC 3960

CGTGATTTCG CTTACTGTGA TAGCGGCATG ATCCCATGGT TGCTGGTGAC GGAGATGCTG 4020

TGTCTGAAGG GCAAGTCTCT GGGCGAGATG GTTCGCGACC GCATGACTGC CTATCCTGCA 4080

AGCGGTGAAA TCAACAGCAC CTTGGCACAC CCCGCTGAGG CGATAGCGCG GGTGGAGCAG 4140

CACTTTGCGA AAGAGGCACT GGAGGTGGAT CGCACCGATG GTCTTAGCAT GTCGTTTGAT 4200

GAATGGCGCT TCAATCTGCG TTCGTCGAAT ACCGAGCCGG TGGTACGTTT GAACGTCGAA 4260

TCCCGGTCTA ATATCGAGCT AATGGAAATA AAAACTAAAG AGATAATGGC TCTATTAGAT 4320

Orf3的起始Orf2的终止

AATAATAATT CAGGGGGCCG AGCTGAGA AT GTT TAGTCAG CTAATTCAGC AGTTGAGCTC 4380

GTTTGTAGCG AGGATATTAG TATCATTAAT TTCTCTTCTT CTCAGCGTGA TAATTGTACG 4440

GTTATATACG AAAGATATAG TTGGTGATTT TTTTTTGCTA ACCAGTTATT CGACTGTTTT 4500

GGCCCAAGTG TTCTTGTTTG GAATGGCACC TGTTTTAAAC ATTATGTCAT CCAAGGGGGT 4560

TCAGTTAAAT AAAATAGTAA TGGAGATAGC CAAGAAAAAT GTAGTATCTA TGCTATGTAT 4620

GTTTTTATGT GGCTTAATTA TACTGGCTTT TTTTGCTAAA GTTGATTATT CGAGTTTAAT 4680

TGTGCTTTCA CTTCTTTCAG GAGTTCTATT AATTATTAGT GAACTAATGA AGGGACAAGG 4740

TATGTATATT CTCTCCCAAA TCTTCAATGG AGGTTTGAAT AACATTCTCT TTCTTATTCT 4800

TATAGTCGTT TTTATACCAA ATAAAGAAGA AACAGATCTC GAGGATATTA TTTATTTTTA 4860

TGCGTTAGCA TATATGTGTG TTATTGTAGG TGGTTCTATA TACTTGCGCA TTAAATATAA 4920

GGTAAGTAAG AGTAAAGGAT TAATTGATGA TGTTATTACG TATTCAATTA TTTTACCGAT 4980

ATTCATATCA ACTGTTATTG TATATATGTT CTCACAAATA GACCTGTGGT TTGTATCTCG 5040

TTTATTTGAT AATGATGTAG TCGCTCAGTA TGGATTAGCA ATTAGATTGA CGGCAGTATT 5100

GAGTTTTTCG ACTTTATCAG TTAGAGCTAT AGCAGCAGCA AGAATCCCAA AATTAATGAA 5160

CGACATTCAG GCGTTGCAAA AAGATGTATC CCTCAGTTGT TTATTTTCAT TTTTAGTGAG 5220

TTTAGTGATT TTAAGTGGGA TAGCATTATT TGGCAAATTA TTTATTGGCC TTGTTTATGG 5280

CAACAGCTAT GAATTAACTT GGTATGTTCT ACTAATTTTC TCATTTGGAC AGATGATTAA 5340

TGCTGCAACT GGTCCCTGCG ATTATTTACT AAGTCATACA GGGCATGGAA GATACCTTAT 5400

GATAATCTCA CTTGTTTCAT TCTTATTTTT AATGACTCTA TTGGCAATAA TAACAATAAG 5460

ATTCAACAGT GTGTTTTTAT TCTGTGGCGC TGTATCATTT ACAATCTGCT TGCAAAATCT 5520

GATTATAATG TACGTAGCAT TTAAAAAAAC GGGTGTACTT TCACTACCCT TAATAAATTT 5580

orf4的起始Orf3的终止

TAAAAGAGCA TATGTATC AT GACAAGGAAA ATGAATACTG CAGTTTTATC ATTCATGATG 5640

TTATATATTC TTACTAGTCT TATTTCAGTT TATCAAACAT TGAATCAAGA TTTATTTCCT 5700

GGTGAACTTC ATAGATATGT AAGAACTATT GCTGATGATG AGGTTGTGAT TATAACAACT 5760

CTGAATATTA TATCCTTCAT AATATGTTAT ATAACATTTT TGTTATTTCA AAAATTTAGG 5820

TTCAGGCTGA ACAAAAACTA TCATTATGAA TTGAATGATA AGCGTATCCA TTTCATAATT 5880

TTCGTAGTGT TAATATCTCA ACTTATTTTT CTCTACTACA CAGGTATTGG TAAAGTTACT 5940

GTTAATGTCG AACAGCGTAG TACTTCATCA TTTAGCGCTT TTTTTGCAAT CTTGAAGCCA 6000

GAACCTTTTA TTTTTTTCTA TTTTTTATAT TATAGATTGA AACCCGGATT TACTTTTATT 6060

AAAAATAAGA TTTTTATTTT TAATATGTTT TTGTTTATTG TTTTTAAATT ATTTCAAGGG 6120

TGGACAAGTT TTTTGTTAAT ACTTTTCTTT CTTGAAGTTC ATGCCAGAGT ACAATTTACT 6180

AAAAACAGGT TGAGATATGT ACTCTTTATA CCTTTAATTA TTATTTTTTT TGGTGGCTGG 6240

GTTTATCAGT ATGCTTATGT ATTAAAGAAT GAAATTAGGG GGGCGAAAGT TGAAAGTATT 6300

ACGTACTTGC AGGGAGTGGA ACATCTTGCA TCACGTTTAT CGATGAATCC TAACTCGCTT 6360

GGGGCTTATC AAAATTATTC TAAAGTTATA AACTTATATC AGCAAGAAGG TCTTGCTCTC 6420

AAAGAATCAA AAGCATTTCT TCGACCTATT ACACCAGGTG GTTTGGTGGA TAAAAATTTC 6480

AGAAATATAA ATAATAATGT AATGACATCA TATACACCGG ATCTAAATCA ATTTACGAGT 6540

TCAGATTTTG GCATTGTAAT GTACTATTCA ATATTGTTTA ATGCAAGTCT ACCTGATTTT 6600

GTATTAAGTA TAATAATGAC TGTTTTACTG TTAGTAATTG CTAAAATGTT TTTTGATTCA 6660

ATTAGTAGTA TTCCTGGACA GTGCGATATT TTATTCTTTT TTGTATTGTT CTATACCTTT 6720

TATACTGTTA GTTTAGAAAA TGTTTTTGGG CAAAACTTTA TTCCTTATAT CTTTAGTTTT 6780

Orf4的终止

GTAATATATT ATTTTTTAGG TGGAATAAAG AAAGTACACT TTGTAGAAAA T TAATTTGAG 6840

Orf5的起始

ATTGTGTGAT TATGATAGTT AAAATGTGGC CTCTTCAAAA AGAATCAACG GCAAATCAAT 6900

ATACTTCGTT GATTCTACAT GATGTGATTG AATATAAACC TCACAAATGG AATCTGAAAA 6960

ATGTGTTGGA TATGAGGTTC GATATTTTCC ATATGCATTG GCCTGAAACT TATTTAAACT 7020

TACCTAAACG GTATCAACAG TTAATTGGGA CTCTGTGTGT TGTATTGTTT TTAGTTGTAT 7080

GCAAGCTTTT TTCTAAAAAA ATCGTATGGA CCGTTCATAA TTTCAAGCCT CATGAAAATC 7140

ACAATAATAT TAAGATATCA GAATTTTTTC GTACATTCCT TGTTCGAATG GTAGATAAAT 7200

TTATTTTTTT AACAGAAGTT AGCAAAGATG AATTTCTGAA AATTTACAAT ATTGATAATT 7260

CAAGATTAAC TGTGATACAT CACCCACTGT ATCAAGTAAA TGAGTGTTGC CATGATATTT 7320

CAGCAGCTAA TCATTCATCA ATTAATAATA AATATCTTTT TTTCGGATTA ATTAGGCCTT 7380

ATAAAAACAT AGAGTTATTA ATGAATGAAT TTATTAAATA TGATTCTGAT TCGGTATTGA 7440

TAATTATGGG AGGGTGCTCC AACACATTAG CTACTGAATT AAGGAACATG AAGAAAAAAA 7500

TTGATTTTAA AGAACGCATC AAATTTAAAT TTGGGTACTA TAATGAACAA CAACTTCAGC 7560

Orf5的终止

AGAGCTCAAT CAATGTAAAG GTG TAATAAT ACCATACTCA GACATAATTG AATTTCTGGT 7620

GTGCTATATC GTGCAATAAC TGCGGGTGTA AATGTGTTAC TGCCTCGTAT AAGATATACA 7680

GAAGAATTGG TCAATTCTCT TAAATATCAA GGTGCTGTAT TTTGTGACCC TCCACTTGAT 7740

ACGAATGATA TAGCGACGTT TAATGGCATA CCCTCAGTAA ATCATAATAA TTTTGATGTG 7800

GATACATATA ACACATATAT AAAAAATGCA CATTATGAAC TTTATCAAAC CATAATTTAA 7860

orf6的起始

GACTTAAATT AAGCGTAAA A TGAAGAATAT ATTAATAGTT TGTGATTATT TTTATCCCGC 7920

TTTCAAAGCG GGAGGGCCTA TTAAAAGTCT CGGAAATATA GCCAAAACTT TCAATGACAG 7980

AAATTACATA ACCGTATTGA CCTACAATCA GGATATTGAT GGTCAGATCA TAAATAAATC 8040

TGGCACTGAA ATTTTTGAAA AAAATATTGT CGTTTATTAT GCTCAAAACC TGCTGAATTT 8100

TGTTAAATTG TATTTAAAAC TTTACAAAAC AGCTGATATA ATCTATTTAA ATAGTTTTTT 8160

TTCGAGTAGA ACTACGTTTC CTGCATTAAT GCTTAAGAAG ACTAGCGCGA AGGTTTTGCT 8220

GGCCCCTCGT GGTGAACTAA CATTAGGTGC ATTGACGTTA AAACCATTAA AAAAGAAAAT 8280

ATATATAAAA TTATTTAATA TTTTCGCTAA CAAAAATGAA ATTTATTTTC AATTTACATC 8340

TGAAGAAGAA AAGAATGAAT CATTGATATC CTTAAAAAAA GGATTTTCAT ATACTGTCAT 8400

TCCTAATATG CATGATCCGA TTCCACCTTA TATATATAAG CATAAGAAGG AAGGTGAAAT 8460

CCATATTTCA TTTATTTCGC GTATTTCCCC CAAAAAAAAT CTCAAAGCAG TGCTATTGTC 8520

TCTTTTAAAT ATAGCCCAAG GCGACATACT CCTTAGTATT GCAGGAAATA TCGAGGATGA 8580

AAAATATTGG GCGGAATGTA TGTTGATAAT AAATAAATTA CCACAGAATG TTAAAGTAAA 8640

TTATCTCGGT GGAATCAAGC CTACTCAGGT AATTGATTTA CTTAAGAGCT CGCATTTGTT 8700

TTTCTTGCCA ACATTAAATG AGAACTATGG GCATGCTATT GTTGAGTCCA TGATAAACTC 8760

AAATGTTGTG CTAATATCCG ATCAAACACC ATGGTCCGAT GTGCAATGGA ATGGCGGTTA 8820

TGTTGCAGGT TATAATGATA CTGATACATT CAAGAAGTGT ATAACCGAAT GTATGAAGTT 8880

CGATGAGTCG CAATTTAATA ATAAATCACG ACAAGTCTAT GACTATGCAC GAAATGCTTT 8940

Orf6的终止

AACTAAACAT GAATATAAAA CATCAACTTT ATTCGATATT TAGATGTAAA TTTATGCTTT 9000

TTCATTTTAC TTAAGTTTCT ATGTAAACAG TTATTCCCAA TTAACGGTGT AGTATTATTT 9060

AACATCTTTT ATTTAAAATT TTCAATGTGG TAATGAATTG AGTTTTATTG CTCGCTTTTC 9120

Orf7的起始

TTCATATAAA AACACTTTAC GTGTTTGCTC ACTCTAGAGG AATTAGT ATG TTTAAAGATA 9180

AGGTTTTACT TATTACAGGT GGCACAGGTT CATTTGGTAA TGCTGTATTA AAGCGTTTTT 9240

TAGATACGAA TATCAAAGAA ATTCGCATTT TTTCGAGAGA TGAGAAAAAA CAAGATGATA 9300

TGCGAAAGAA ATATAGTAAC AATAAACTCA AGTTTTATAT CGGTGACGTA AGGGATTATT 9360

CGAGTGTGTT AAATGCATCT CGAGGAGTTG ATTTTATTTA TCATGCGGCT GCATTAAAAC 9420

AGGTTCCTTC TTGTGAATTT TATCCAATGG AAGCAGTAAA AACTAATATT ATTGGCACTG 9480

ATAATGTTCT GGAAGCAGCT ATTGCCAATA AAGTGTCAAG AGTAGTGTGT TTGAGTACTG 9540

ATAAAGCAGT ATACCCAATC AATGCTATGG GAACATCTAA AGCAATGATG GAAAAGGTCA 9600

TAGTTGCTAA ATCTCGTAAT GTTCCTGATG AAATGGTTAT ATGTGCAACA CGTTATGGGA 9660

ATGTTATGGC TTCAAGAGGT TCTGTTATTC CCCTTTTTGT TAATCAGATA TTAACTGGTA 9720

AACCGATTAC AATCACCGAT CCAAATATGA CTCGTTTCAT GATGACATTA GATGATGCAG 9780

TTGATTTGGT TGTACATGCT TTTAAACACG GACAAAATGG AGATATTTTT GTACAGAAAT 9840

CTCCTGCTGC TACCATTGAA GTTTTGACTC ATGCGATTCT AGAAATTATG AAATCGGCTG 9900

ATCACACTGT TAATATTATC GGTACACGTC ATGGCGAAAA ACTATATGAG GTTTTATGTA 9960

GCAGAGAAGA GATGTTGGTA GCCGAAGATC AAGGTAACTA TTATAGAATA CCGTGCGATA 10020

AGCGAGATTT GAATTATGAA AAATATTTTG AGAAAGGCAA CAAAAAAGTT GAAACAATAG 10080

ATGATTATAA TTCACATAAT ACATATCGTT TAAATACTCA AGAGATGGTT TCATTACTAC 10140

orf8的起始Orf7终止

GTAAACTTAC CTATATCAAT AAAATTGAAG CTGGTGAAAA GGCTGATCCT G ATGAA TAAA 10200

AGAATATTGA TTGTTGGTGC TAATGGCATG CTGGGCAGCA GTCTGCTACG ATATTTTACC 10260

CAATATAGTA GATATGATGT TTTGGGTACT GTACGTAGTA ACAGTGCAAA GGCAAAACTA 10320

TCTAAACAAG GTTTTGATAA TATCATATCT CAAGTTGATG TGCTTGAATA TGAAACAATC 10380

GAGAATGTTA TTTCAGACTG GAAACCAGAT TTTTTATTTA ATTGTGTAGG TATTATCAAA 10440

CAGCTTGACG CTGCGAAGAA TAACATACTT TCATTATCAA TCAATTCTTT GTTGCCACAC 10500

CAACTTGCTA AAACATGTAC TCGTAATGAA ACTAAACTAA TACATTTTTC TACTGATTGC 10560

GTATTTAGTG GTAAGCAAGG TAATTATTGT GAAGAAAGCT TTCCAGATGC TTACGATCTA 10620

TATGGAAAAT CAAAGCAACT TGGTGAAGTG GTTTATGACG GTCATTTAAC TTTACGGACT 10680

TCAATTATTG GGCATGAAAT CTCAAGCCAG CACAGTTTGA TCGATTGGTT TTTATCTCAA 10740

AAAAAATATA TTTATGGATA CTCAAAAGCT ATTTTTTCTG GAATGCCAAC AGTATATGTA 10800

GCCGAGATTA TTCACGACTA TATTCTTCCA AATCCAAACT GTTGTGGGCT AAGACACCTT 10860

AGTGTTGATC CTATTGATAA ATTCAGCTTA TTGAAGCTAG TAAAAAAGCA ATACTCTCAC 10920

AATATTGAGA TTATAGAATC AAGTGATTTA GAGATTGATC GTAGTCTTGA TTCATTTCTA 10980

orf9的起始

TTACGCCAAG AAGTGGGGTT TTATCCAGCA AGTTGGCCTA AACTGATTGA GAAAATGAAT 11040

Orf8的终止

GATGAATACA ATAAATTCTT CCGT TAAAAA AATGAAAGTT GTTACTGTTG TGGGTACCAG 11100

ACCGGAGATA ATTCGTTTAT CGAGAGTAAT GGCTGTTCTT GATCAGTACA CAGAACATAC 11160

CATCATTCAC ACTGGACAGA ACTATGATTA TGAACTTAAT GAGGTTTTCT TCAAGGAGTT 11220

AGAGATCAGA AAACCAGATT ACTTCCTTAA TGCAGCAGGT TCTAACCCAG CTGAAACTAT 11280

TGGTAATATA ATTATTGAAG CAGACAAAAT TTTTGACATA ATTTCTCCAG AGGCTCTTTT 11340

AATACTTGGG GATACAAATA GTGCACTAGT TTCTATTGCA GCTAAAAGAC GTAAAATTCC 11400

AATATTTCAT ATGGAAGCAG GAAACAGATG TTTTGATTAT CGAGTTCCTG AGGAAATTAA 11460

TCGAAAGATT GTGGATCATA TTGCCGATAT AAACCTTACT TACAGCGAAA TTGCTCGTGA 11520

GTACTTGTTG CGTGAAGGGA TTCCTGCAGA TCAGATTATC AAAACAGGTA GCCCAATGCG 11580

TGAGGTTTTA AATTATTATA ATGGAGAGAT AAATAAATCT AAAGCACTCG AAAAGTTGAA 11640

TTTAACTCCT AATGAGTATT TTCTGGTCAG CGCACATCGA GAAGAGAATG TAGATTCTCC 11700

TGAAAAATTA AAAATTTTTA TTAACATTCT TAATAAAATA TCGGATAAAT ATGATTTGCC 11760

AATAATAGTA TCTACGCACC CACGAACCCG TAATCGAATG GATAAGCTTA ATGTAGAAAT 11820

AAGCAATAAT GTTTATTTTA TGAAACCATT CGGTTTCTTA GATTATGTTT CTTTGCAAAA 11880

GAATGCTCGC GTAGTTCTGT CTGACAGCGG TACAATAACG GAAGAATCTT CGATTTTAAA 11940

TTTTCCCGCT CTTAATTTAC GTGAAGTTCA TGAACGTCCG GAAGGTTTCG AAGAAGCTGC 12000

CGTAATGTTC GTTGGGCTGG ATGCTGTTCG TATTTTTCAA GGTATTGAAA TTTTGGATCA 12060

ACAGCAGAGA GGACCGGATA ATCGAGATTT GTATTTGGTC AATGATTATT CGGTTGACAA 12120

TGTATCGCTA AAAGTCCTTA GAATCATAAT GAGCTATACT AATTTTGTTA ACCAAAAGGT 12180

Orf9的终止orf10的起始

TTGGAAAAAG CAA TAATGCG AATAGCGTTA ATCTGTGATG ATTATCTGCC TGATAGCACA 12240

CGTGTTAGTG CAAAAATGAT GCATGAATTG GCTTGTGGAC TTTTAAGAGA AGGCCATGAG 12300

CCGGTTGTAT TTTGCCCTAA TGGTGGTGTT GGTACTGAAT TAAAAGTAAT TTATTTGGAT 12360

GGAATATGTA TTTATAAATA TCCAAATGGA CAAACAAAAG ATATATCAAA AATTAAGCGT 12420

GCATTTAACG AAACTATGCT TTCATTCAAT GCATGGCATT ACCTTTCAAG CGAAATTAAA 12480

CGTAAAAAAA TTGATGGTGT TATTTATTAT TCACCATCAA TTTTCTTTGG GGCTTTTGTA 12540

AAAAAAATTA AAAAATATTG GAAATGTAAA TCATATCTAA TTTTACGTGA TTCATTTCCC 12600

CAATGGTTAG TTGACCAAAG GATAATTCGT AGAAATGGTA TGCTTGAGAA ATATTTTCGT 12660

TTTTTTGAAA AGAAGAATTA TACTGCAGCC AATTATATTG GTGTAATGTC ATCTAAAAAT 12720

AAAGAACTTT TTACATTACA GTATCCCCAT TACAAAAACG TAGATGTCTT ATATAATTGG 12780

GCAGATCTTA ATAGCACTCA AGATGTTTCA CCAAGTGATA TTTTAGAAAG GCTATCATTG 12840

GCTGATAAAG TTATATTTTT CTATGGAGGA AATATAGGTC ATGCTCAAGA CATGGCAAAT 12900

TTAATGAGAT TGGCAATAGG TATGCGTACT ATTAATTACG TTCATTTTCT TTTTGTTGGA 12960

CAAGGGGATG AGGTCGAACT TGTTAAAAAA ACAATTGCCG AAAATGCACT TGAGAACTGT 13020

ACATACTTAC CTGCAATTAG TCAGTCGGAA TATAAATCAA TTTTAAAGGT TGTTCATGTA 13080

GGGTTGTTTA GCCTTGCAAA GAATCATTCT GTGCATAATT TTCCGGGCAA ACTTCTAGGA 13140

TATATGGCAA ATAAATTACC AATTTTAGGT AGTGTGAATG AAGGTAATGA TCTTATGCAA 13200

GTGCTCATTG GCGCAAAGGC TGGATATGTG CACGTTAATG GATATGATGC AGAATTATTG 13260

CAATCAGCTA TAAAATTAGC TACGGAAGAG AAATTAAGGA ATGAATTAGG AGAAAATGGT 13320

CATTCACTTT TAGAGAAGAC CTTTTCTACG CAATCTGCTG TCGAGAACAT TTTGTTACGG 13380

orf10的终止 orf11的起始

CTTAAG TGAA TTATTAAATG TAGGAATTGA T ATGTCGGTT ACTGTATTTT ATAAAGAGCA 13440

GTTAAATGAA TTGTCAAATC TTGCAAGTAA TAACCCTCGG CTAAGGGCTC ATTTAAACTT 13500

ACATAAGAGT TATCAAGATA AGATTCAGAG GATTTTAATT TCCTTAAAGA GGGGAACATA 13560

CATACCGCCA CATTATCATA AATATGATCA TCAGTGGGGA ACATTTCAAG TGATCGAGGG 13620

TATAGTCGAT TTATATATAT TTAATAATTC AGGTACTGTC TTAGATATTA TTAATTTGGG 13680

AGATGTAAAC GGTGCTTTAT TTGCACAAAT AGAACCCTAT ACCATACATA CACTTGTCTG 13740

CCGTTCTCCT TATGCTTCTG TAATCGAAAT TAAAGAAGGG CCTTTTGTTG AGGCAGAGGC 13800

TAAAATTGTT CCCTCTTGGG TGTATCCGGA AGGCTGTAGA GAGTACTTAC GTTCTGATAT 13860

orf11的终止

CGTATCAATG CTTGAAACTC TCAAGATTAA TGAAGTATAT AAGCTT TAAC TGATTAAGGA 13920

TAATATGGAA TCAATTTAAT TAAATCAATC ACCACCTCCC TAGGATGTGG TTTAGGAATA 13980

ACAATTATAA AATTTCTTAA TGTTGAAAGA GGCTGCAGTT TCCCTCTATT TTTTTATTAG 14040

GACCTGAGTT AGCATCAAAG TTACATTCAA GCCGCATACA TCGCGGTGAA CACCCCCTGA 14100

CAGGAGTAAA CAATGTCAAA GCAACAGATC GGCGTCGTCG GTATGGCAGT GATGGGGCGC 14160

AACCTTGCGC TCAACATCGA AAGCCGTGGT TATACCGTCT CTATTTTCAA CCGTTCCCGT 14220

GAAAAGACGG AAGAAGTGAT TGCCGAAAAT CCAGGCAAGA AACTGGTTCC TTACTATACG 14280

GTGAAAGAGT TTGTTGAATC TCTGGAAACG CCTCGTCGCA TCCTGTTAAT GGTGAAAGCA 14340

GGTGCAGGCA CGGATGCTGC TATTGATTCT CTCAAGCCAT ACCTCGATAA AGGTGACATC 14400

ATCATTGATG GCGGTAACAC CTTCTTCCAG GATACCATCC GTCGTAACCG TGAGCTTTCT 14460

GCCGAAGGCT TTAACTTCAT TGGTACCGGT GTTTCCGGTG GTGAACAAGG TGCGCTGAAA 14520

GGTCCTTCCA TTATGCCTGG TGGGCAGAAA GAAGCCTATG AACTGGTTGC ACCGATCCTG 14580

ACCAAAATCG CCGCAGTGGC TGAAGATGGC GAACCGTGTG TTACCTATAT TGGTGCCGAT 14640

GGCGCGGGTC ACTATGTAAA AATGGTTCAC AACGGTATTG AATACGGTGA TATGCAGCTG 14700

ATTGCTGAAG CCTACTCTTT GCTTAAAGGT GGCTTGAACC TTTCCAACGA AGAACTGGCG 14760

CAGACCTTTA CTGAGTGGAA TAACGGTGAA CTGAGCAGCT ACCTGATTGA CATCACAAAA 14820

GACATCTTCA CTAAAAAAGA TGAAGACGGT AACTACCTGG TTGATGTGAT TCTGGATGAA 14880

GCGGCTAACA AAGGTACCGG TAAATGGACC AGCCAGAGCG CGCTGGATCT CGGTGAACCG 14940

CTGTCGCTGA TTACCGAGTC TGTGTTTGCA CGTTATATCT CTTCTCTGAA AGATCAGCGT 15000

GTTGCCGCAT CTAAAGTTCT CTCTGGCCCG CAAGCGCAGC CAGCTGGCGA CAAGGCTGAG 15060

TTCATCGAAA AAGTTCGTCG TGCGCTGTAT CTGGGCAAAA TCGTTTCTTA CGCTCAGGGC 15120

TTCTCTCAGC TACGCGCCGC GTCTGAAGAG TACAACTGGG ATCTGAAATA CGGCGAAATC 15180

GCGAAGATTT TCCGTGCTGG CTGCATCATC CGTGCGCAGT TCCTGCAGAA AATCACCGAT 15240

GCTTATGCCG AAAATCCGCA GATCGCTAAC CTGCTGCTGG CTCCGTACTT CAAGCAAATT 15300

GCCGATGACT ATCAGCAGGC GCTGCGTGAT GTCGTTGCTT ATGCAGTACA GAACGGTATC 15360

CCGGTTCCGA CCTTCGCCGC TGCGGTTGCC TATTATGACA GCTACCGTAA CGGCTGTTCT 15420

GCCTGCGAAC CTA 15433

以上仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡依本发明技术实质对以上实施例作修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1、一种对大肠杆菌O163的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于，其wzx序列为SEQ ID NO：1中的4349至5602碱基的核苷酸或wzy序列为SEQ ID NO：1中的5599至6834碱基的核苷酸或者具有对上述序列插入、缺失或取代一个或多个核苷酸，但保持wzx、wzy核苷酸特异性检测大肠杆菌O163的O-抗原功能的寡核苷酸。

2、一种对大肠杆菌O163的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于，其为源于wzx基因的寡核苷酸对：SEQ ID NO：1中4500至4518碱基的核苷酸和5425至5442碱基核苷酸，SEQ ID NO：1中5100至5117碱基的核苷酸和5503至5520碱基核苷酸；或源于wzy基因的寡核苷酸对：SEQ ID NO：1中6102至6119碱基的核苷酸和6738至6755碱基核苷酸，SEQ ID NO：1中6223至6240碱基的核苷酸和6784至6801碱基核苷酸。

3、权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O163型的O-抗原特异的寡核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原中的应用。

4、按照权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O163型的O-抗原特异的寡核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测体外及环境中的细菌。