CN1285728C - 对大肠杆菌o154型的o－抗原特异的核酸序列 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O154型(Escherichia coli O154)的O-抗原特异的核酸序列，它是大肠杆菌O154型中控制O-抗原合成的基因簇的核酸序列全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核酸序列，全长13635个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核酸序列功能的SEQ ID NO：1的核酸序列；还包括源于大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核酸序列；本发明通过PCR证实寡核酸序列对大肠杆菌O154型的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核酸序列检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O154型的方法。

Description

对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O154型(Escherichia coli O154)中控制O-抗原合成的基因簇的核酸序列全序列，特别是涉及大肠杆菌O154型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核酸序列，可利用这些对O-抗原特异的寡核酸序列快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O154型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(19154)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核酸序列序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核酸序列序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核酸序列。19154年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核酸序列鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核酸序列鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，nichespecific selection and bacterial populations”.FEMSMicrobiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’sidentification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between the enteroinvasive Escherichiacoli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and andShigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列。它是大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的核酸序列，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核酸序列。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的全长核酸序列序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基合成酶基因，包括rmlA、rmlB、rm1C、rmlD基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf10基因；糖基异构酶基因，包括gne基因；转座酶基因，包括orf11基因。

本发明的又一目的是提供了寡核酸序列，它们分别源于大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核酸序列，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O154型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核酸序列，它们对大肠杆菌O154型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核酸序列还可重新组合，组合后的寡核酸序列对大肠杆菌O154型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供的上述寡核酸序列可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O154型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O154型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核酸序列，全长13635个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核酸序列功能的SEQ ID NO：1的核酸序列。

前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列，其由11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列，其中所述的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基合成酶基因，包括rmlA、rmlB、rmlC、rmlD基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf10基因；糖基异构酶基因，包括gne基因；转位酶基因，包括orf11基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的4654至5949碱基的核酸序列；wzy是SEQ ID NO：1中的9127至9987碱基的核酸序列；rmlA是SEQ ID NO：1中的3177至4055碱基的核酸序列；rmlB是SEQ ID NO：1中的1135至2220碱基的核酸序列；rmlC是SEQ ID NO：1中的4060至4620碱基的核酸序列；rmlD是SEQ ID NO：1中的2220至3119碱基的核酸序列；orf6是SEQ ID NO：1中的5942至7048碱基的核酸序列；orf8是SEQ ID NO：1中的8206至9099碱基的核酸序列；orf10是SEQ ID NO：1中的10159至11058碱基的核酸序列；gne是SEQ ID NO：1中的7071至8201碱基的核酸序列；orf11是SEQ ID NO：1中的11353至12012碱基的核酸序列。

前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列，其中所述的源于wzx基因的寡核酸序列对是：SEQ ID NO：1中的5537至5554碱基的核酸序列和5845至5862碱基的核酸序列；SEQ ID NO：1中的5109至5126碱基的核酸序列和5586至5603碱基的核酸序列。源于wzy基因的寡核酸序列对是：SEQ IDNO：1中的9338至9355碱基的核酸序列和9695至9712碱基的核酸序列；SEQID NO：1中的9275至9294碱基的核酸序列和9707至9724碱基的核酸序列。

前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O154型的O-抗原，并成为细菌疫苗。

前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。

前述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O154型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O154型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O154型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核酸序列序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的核酸序列全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O154型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌0154型O-抗原基因簇的核酸序列序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Centerfor Biotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O154型的O-抗原都是高度特异的。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的全长核酸序列序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长13635个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核酸序列功能的SEQ ID NO：1的核酸序列。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶的基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基合成酶基因(rmlA、rmlB、rmlC、rmlD基因)；糖基转移酶基因(orf6、orf8、orf10基因)；转座酶基因(orf11基因)；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括gne基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核酸序列序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O154型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核酸序列，它们是这些基因中的任何一段寡核酸序列。但是，优先被用的是列于表1中的寡核酸序列对，在表1中也列出了这些寡核酸序列对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核酸序列对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O154型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O154型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核酸序列序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核酸序列”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核酸序列分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核酸序列范围内改变；更确切说这些寡核酸序列是源于wzx基因(核酸序列位置是从SEQ ID NO：1中的4654至5949碱基的核酸序列)；wzy基因(核酸序列位置是从SEQ ID NO：1中的9127至9987碱基的核酸序列)；源于以上基因内的寡核酸序列对大肠杆菌O154型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核酸序列同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核酸序列的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核酸序列对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核酸序列的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核酸序列的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核酸序列的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核酸序列特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核酸序列能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O154型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核酸序列标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核酸序列检测无效时，寡核酸序列的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核酸序列用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核酸序列是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核酸序列。这套寡核酸序列对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O154型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核酸序列特异性杂交，这些基因是：编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核酸序列能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O154型。可用本发明中的寡核酸序列作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核酸序列分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核酸序列可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核酸序列能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核酸序列可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核酸序列被重新组合时，至少能选出一对寡核酸序列与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核酸序列与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核酸序列分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核酸序列，在这里多对寡核酸序列是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核酸序列对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核酸序列可能是糖合成中必须基因的核酸序列。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核酸序列中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核酸序列能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O154型。可用本发明中的寡核酸序列作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核酸序列标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核酸序列对被使用时，其中的一个寡核酸序列分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核酸序列都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核酸序列的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核酸序列序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O154型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O154型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O154型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O154型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCGC)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃ 30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5d。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃ 250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核酸序列序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的核酸序列全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O154型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O154型O-抗原基因簇的核酸序列序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到10个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1、orf2、orf3、orf4编码的蛋白与rmlB、rmlD、rmlA、rmlC基因编码蛋白有73-98％的序列一致性，84-98％的相似性，所以命名orf1、orf2、orf3、orf4为rmlB、rmlD、rmlA、rmlC。我们认为大肠杆菌O154的O抗原中有鼠李糖的存在。

Orf5和orf9是大肠杆菌O154种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。Orf5编码的蛋白与Clostridium acetobutylicum的O-抗原转移酶有29％的序列一致性，55％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf5为wzx。Orf9编码的蛋白与Xanthomonas campestris pv.的O-抗原聚合酶有28％的一致性，47％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有9个跨膜片段，并且有一个大的(61个氨基酸)胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf9为wzy。

orf6、8、10三个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有31-48％的序列一致性和55-68％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这四个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1和2的共有序列的同源性预期值为4.4×e^-8至3.1×e^-21，因此我们推测这三个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆菌O154的O-抗原的寡糖单位可能由四个单糖组成。由于这三个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这四个基因暂命名为orf6，orf8和orf10。

实施例6：特异基因的筛选：

针对大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核酸序列序列中的位置见表1。

表1列出了大肠杆菌O154型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O154型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共13组，它们的来源都列于表中。

在第13组中含有大肠杆菌O154型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1：20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O154型及其O-抗原是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O154型中筛选到对大肠杆菌O154型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核酸序列对大肠杆菌O154型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核酸序列对经PCR检测后证实对大肠杆菌O154型是高度特异的。所有的这些寡核酸序列都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O154型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的结构，共由11个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

                     SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>对大肠杆菌O154型的O抗原特异的核酸序列

<130>对大肠杆菌O154型的O抗原特异的核酸序列

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>13635

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

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tccatactcc ataagttcta taagaaaagc cattgaggat gcttataatg caccgctaat    6960

gcgtaaatcc attaatagat tttcatggga tctaacagca aagcagacct atttggctta    7020

tcaagagata ataaataaca gagattgata ttaaaatgac tacaaaaata atgttagtat    7080

ttggtacaag acctgaagcc attaaaatgg ctcctttagt aaatttatta aaaagagatt    7140

ctcgatatga atgtaaggtt tgtgtaactg gtcagcatag agaaatgtta catagtgtat    7200

tggatttatt tgatattaca ccagattaca atttaaatat aatgcggccg gaacaaagtt    7260

tatcgacaat tacagtcgat ataattaatg gtatgtcaga aatatttaaa aatttcaagc    7320

cagagctaat agcaattcat ggtgacacgt caacttcatt cgctgcctcg ttatcagcat    7380

actatcatca aattaaaatt gcacatattg aagctgggct cagaactggc aatttatatt    7440

ctccttggcc tgaagagggt aatagaaaat taacaggagt gcttgcggac ttccattttt    7500

gccctaccga attaactaaa cagaatttaa ttagagaagg cgttgagtta aacaaactgt    7560

ttataacagg aaatacggta attgattctt taatttatat aattaataaa attaaaaaag    7620

atggtgaatt gctaaattac ttacatgaga aattttcatt tattgatcaa tatcgcaaaa    7680

tgatactcat taccggtcat cggcgtgaaa attttggtac tggatttaaa aatatttgtc    7740

aggctataaa aaatctcgca attagtaatc cagatataat atttgtttat ccggttcatt    7800

taaatcctaa tgttcaagaa ccagtcaatt attacttaaa agatgttgat aatgtaaaat    7860

taattccacc tcaagaatat cttccatttg tttatttaat ggaacgttca tatattatct    7920

taactgattc acaggtattc aagaagaaga tccttccttg ggcaaacctg ttctcggtta    7980

tgcgtgaaac tactgaaagg ctagaagctt taaatgcggg taccgtgaag ttagttggta    8040

caaattatga tactatcatt aaggaatttg agtatctaat gaacgataag tcacattatg    8100

aaagtatgtc aaaatctact aatccatacg gaaatggtaa ttcatcaatt aaaattaaag    8160

aaataattga taattatttt tttaattcct tacaaggatg agaatatgaa taaacctaaa    8220

gttgctgttt tactggctac atacaatgga gagtgttgga tcagtgcaca aatcgatagc    8280

attcttgcac aaagagatgt cgacgttaca atttatataa gtgatgattg ctcaactgat    8340

aaaacaaaag agatttgcag taactattca gaaagattta ataatattaa gctactttca    8400

aattcagaac ggatgggggg cgcaagtgct aattttttcc gattattgct ttcaaatgag    8460

tatgatcaac atgattttgt tgctttatct gatcaagatg atatttggaa agaaaacaaa    8520

cttattcatg caattaaaca aattggaact gacggctttt attccagtaa tgtaactgca    8580

ttttatagcg atggaagaca agttttaata aataaatccc agaagatgac ctcctatgat    8640

tatttttttg aaggtggggg gcccggttgt acttacgtct tttcagttga aaatgcattc    8700

aaacttaggg aatttctagt taaacatgtt aatattctta aagatataac ctatcatgat    8760

tggtttatat atgcttttgc aagatcaaat aattataaat ggatcattga tccttggccc    8820

tcaatgtatt accgacagca cagcaataat caaataggtg ctaactcttc ttttggtgga    8880

atcattaaaa gattaaaaat gattagatca aaatggtata gaaaacaagt aactttgatc    8940

gctaatactt tagaagcagc ggattcttct aaaatacaaa aaaatctcaa tagaaattac    9000

tatggaaatc tattgttttc agttaacttt tataagttgc gacgctcata taaagataag    9060

atttttattt taatctttat gttgttgtat ctattttgat tatgataatt atataagatg    9120

gaacatatga acagagttta ctgtttgaat acaactttct taaacccatt aattcctata    9180

ttattaatgg tagctgtttt catattatca tcttttttgt ataaggttga tagtagttca    9240

cttgttatta ttatctcaac cttcttggtt atttccttta tcccattatc attctgtttt    9300

tcaagtaaat attatgtcaa tacatcaaac ctaagtctga agtcatttcc gttaccgtat    9360

acgacaacaa tcattataat tctatcaagc agtgttgaat attttaagtt aggaattcct    9420

ctttttggac atgttatata tgcagagttt gggtatcctt ttttgcacca tgtttcagtt    9480

atgtcatggt tattattatt tacatgtaat tcctttaaga atagaataat ttttatactt    9540

gtaatggttt ttgcatttgt taatccattg ttgatgatta atcgtgattt aatgctatta    9600

acttgttttg tctttatttt tatcctttta ggaaaacgaa aggttagtct aaaaccgata    9660

cttattttag ggagtatatt tctttttgtt tttggtttga tcggtgaata cagaagtcca    9720

ggtgtaatac attcagttga tttacctttt tctttcaact atgaaaaaat gccagcaacg    9780

atagcatggc tttttctata ttttacttct tcctgtttta atatgtatta taatattaaa    9840

acattaggct tgaatttata tgcaagtaat ataaatgttt tcccagaacc ctattactgg    9900

tcatcttttt ttgatagctt tatttttttc ctattgtcat tattttgtat tttattttac    9960

tgttatcaat tagacattat cttttaacaa aaaagacttc agaattaaca ttggcattat   10020

acctttattg tatcttccaa gtgtatacgg gattacttgc tgtaaaagtt tttaatacac   10080

gtacattatt tgttatgctt tttctaggag taatccaatt ctgtaatatt cttttaccta   10140

aaaagagacg ttcataacat gcataaacaa agagtagcta ttctcctatc tcattataat   10200

ggaagtgatt atttaagaga acagttaaat tctattctca accagaatgc agataatttt   10260

tctattgata tatatgtcag ggatgatggt tctaataatg ttaatttggt aaaccttcgg   10320

caaatgacat cctgtttacc tattaatgtt tttgagggaa gcaatatagg tgtgactaaa   10380

agttttttta ctctcttgga gcaggttgat tcatatgatt attatgcctt ttgcgatcag   10440

gatgatgttt ggcttgatga taaaatttca agcgcagtga ccatgatgaa ggattccgaa   10500

ggtccagtat tatactgttc agcttatacc ttggttgatg caaaattaaa tttgataaat   10560

tttgaaaatc acgtcaatga ttcttttgaa aatgcattat ttaaaaactt ttgcacaggt   10620

tgtacatgtt tgataaataa taagttacgc tcgattattt tgaaaactga ttatactaaa   10680

aatgtaccaa tgcacgattg gtggatgttg atggttgcat atttaacagg aacggttatt   10740

tttgatcaac aatcccatat cctttatcgg caacatggag gtaatgttgt cggtggtcga   10800

actagtttta taaaaaaaac aagaagattt atgtttaata ttttatctaa tgatgaaacc   10860

agatcaaaaa tgtatcagca actattgata agtaaagaat tgtataattc tgagaaagta   10920

gcgttattgg agcttatact gaacagtaaa agaaatattt ttcttagaat taagttggtt   10980

atgggcttag gggttaaata tgctaagaaa tacgaaagta ttctagttaa gtttcttatt   11040

ttaattggta ggttctaata taccttaaat agctgcgcgg aatagtagat cactttaagg   11100

gaacttagcc cggattgttt gatctgatca atcaccaaat caaaacaaat caccaaccgg   11160

actgagcgat gccgatcata gcaccaattc cccgtgacga acgacgcctg atgcagaaag   11220

caatccagaa aacgcacgat aaaaattatg cccgcagact gatggccata ctgatgctgc   11280

atcgggcgac ctcgttagcg atgttggcag aatgctctgc cgtggcagtt ccttcgtcgg   11340

acgctgaatt aattggttca cgctgtcggg tgttgcaaga ctgaaatcat tatctgccgg   11400

acgaccccac gctggccttt tgagcatatc tgcactttat tacgtgagct ggtaaacatg   11460

ctcacggcga ttttgggcta ccagcgctca ggcttgagta cagaacttct ggcaataaaa   11520

atcaatgaga taaccggctg ccagttatat gccgggaccg tttgccgctg gttgccgtct   11580

gcagggcttg tgtggcgaag ggccgcacca accctgcgta tccgtgaccc gcataaagat   11640

gaaaagatgg cggcaatcca caaagcactg gacgaatgct gcgcagagca tccggtcttt   11700

tatgaagatg aagtgtatat ccatcttaat cccaaaatcg gtgcagactg gcagctacgt   11760

ggacaacaga aacgcgtggt aacaccgggg cagaaggaaa aatattatct ggccggcaac   11820

agcaaaagtt caacgctgtt catcagcctg ctgaagcggc ttaaagcgac ataccgtcgg   11880

gcgaaaacca tcacgctgat cgtggacaac tacattatcc ataaaagccg ggaaacacag   11940

cgctggctga aggagaaccg aagttcagag ttatttatca gccggtttac tcgccattgg   12000

tgcatcatgt agaacggcta tggcaggcac ttcgcgacac aataacgcgc aatcatcagt   12060

gccggtcaat atggcaactg ctgaaaaaag ttcgccatgt tatggaaacc gtcagccatg   12120

ccctaaggca aacatgggct ggcaaaagtg tagcggtatt aggcgcagct atttataaga   12180

ttataaaact aatctattta acttaaaatt tactacctat aaactcatag ttgaatcgaa   12240

atttaattct taaactacac ctcttcatga tccccctgac tggagtaaac aatgtcaaag   12300

caacagatcg gcgtagtcgg tatggcagtg atggggcgca accttgcgct caacatcgaa   12360

agccgtggtt ataccgtctc tattttcaac cgttcccgtg agaagacgga agaagtgatt   12420

gccgaaaatc caggcaaaaa actggttcct tactatacgg tgaaagagtt tgttgaatct   12480

ctggaaacgc ctcgtcgcat cctgttaatg gtgaaagcag gtgcaggcac ggatgctgct   12540

attgattccc tcaagcctta cctcgataaa ggtgacatca tcattgatgg tggcaatacc   12600

ttcttccagg acaccattcg tcgtaaccgt gaactttctg ccgaaggctt taacttcatt   12660

ggtaccggtg tctccggtgg tgaagaaggc gcgctgaaag gtccttctat tatgcctggt   12720

gggcagaaag aagcctatga actggttgta ccaatcctga ccaaaatcgc cgcagtagct   12780

gaagacgggg agccatgcgt tacctatatt ggtgccgatg gtgcaggtca ctatgtgaag   12840

atggttcaca acggtattga atacggcgat atgcagctga ttgctgaagc ctattctctg   12900

cttaaaggtg gcctgaatct ttccaacgaa gaactggcgc agacctttac cgagtggaat   12960

aacggtgaac tgagcagcta cctgatcgac atcaccaaag atatcttcac caaaaaagat   13020

gaagacggta actacctggt tgatgtgatc ctggatgaag cagcaaacaa aggtacgggc   13080

aaatggacca gccagagtgc gctggatctt ggcgaaccgc tgtcgctgat taccgagtct   13140

gtttttgcac gttatatctc ttctctgaaa gatcagcgtg ttgccgcgtc taaagttctc   13200

tctggtccgc aagcgcagcc agcaggcgac aaagctgagt tcatcgaaaa agttcgtcgt   13260

gcgctgtatc tgggcaaaat cgtttcttac gcgcagggtt tctctcagct gcgtgctgcg   13320

tctgaagagt acaactggga tctgaactac ggcgaaatcg cgaagatttt ccgtgctggc   13380

tgcatcatcc gtgcgcagtt cctgcagaaa atcaccgatg cttatgccga aaatccgcag   13440

atcgctaacc tgctgctggc tccgtacttc aagcaaattg ccgatgacta ccagcaggcg   13500

ctgcgtgatg tcgttgctta tgcagtacag aacggtatcc cggttccgac cttcgcggca   13560

gcggttgcct attatgacag ctaccgcgcc gtagttctgc ctgcgaacct gattcaggct   13620

cagcgcgact actga                                                    13635

表1 大肠杆菌O154型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物	反向引物	PCR产物的长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								Wzx	O-抗原转运酶	4654-5949	5537-5554	5845-5862	325bp	0*	56
5109-5126	5586-5603	494bp	0*	58
					Wzy	O-抗原聚合酶	9127-9987				9338-9355	9695-9712	374bp	0*	56
9275-9294	9707-9724	449bp	0*	58

^*只在大肠杆菌O154型中得到正确的一条带

表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号	该组中含有的菌株	来源
			1、野生型大肠杆菌2、野生型大肠杆菌3、野生型大肠杆菌4、野生型大肠杆菌5、野生型大肠杆菌6、野生型大肠杆菌7、野生型大肠杆菌8、野生型大肠杆菌9、野生型大肠杆菌10、野生型志贺氏菌11、野生型志贺氏菌12、野生型大肠杆菌13、第8组菌株加上大肠杆菌标准菌株	O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20，O21，O22，O23，O24，O59O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O35，O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，O57，O58，O60，O61，O62O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81，O82，O83O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101，O102，O103，O104，O106O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145O146，O147，O148，O150，O152，O153，O156，O157，O158，O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166O168，O169，O170，O171，O172，O173，D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B17，B18F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，Fx变，FY变，DS，DR，O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，O124O154	IMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSabcdddIMVSaIMVS

^*为了检测的方便，我们将每13-17个菌分为一组，总共13组

a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.0172和0173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3 大肠杆菌O154型O抗原基因结构图

GalF RmlB  RmlD RmlA RmlC wzx    orf6  gne  orf8  wzy  orf10  orf11  gnd

表4 大肠杆菌O154型O抗原基因簇基因位置

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC      60

GAAAACCACT TCGACACCTC ATATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT     120

CAACTGCTTG CGGAAGTGCA GTCCATCTGT CCACCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT     180

CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC     240

AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGACG ATGCCAGCGC CGACCCGCTA     300

CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGC TTCAATGAAA CGGGCCGTAG CCAAGTGCTG     360

GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TCCAGACCAA AGAACCGCTG     420

GACCGTGAAG GCAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTCATCG AAAAGCCGGA TCAGCCGCAG     480

ACGCTGGACT CAGACGTCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG     540

GAACTTGAAC GTACTCAGCC TGGTGCGTGG GGACGTATTC AGCTGACAGA TGCAATTGCT     600

GAGCTGGCGA AAAAACAGTC CGTTGATGCA ATGCTGATGA CCGGCGACAG TTACGACTGC     660

GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GACTACGCAA CCTCAAAGAA     720

GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG TATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGA     780

ATGTAACGGT TGATAGGAAA ATTATAACGG CGGTGAAGAT TCGCTCCGAA AGTAATTTGG     840

AGCGAATCTT CGGGACGTTA TTTGTAAATT TTCATAATAA CAAAAGAGTT ATCAATAGTA     900

TTTTAGTCAA AGTTTTCAGG ATTTTCCTTG TTTCCAGAGC GGATTGGTAA GACAATTAGC     960

TTTTGAATCT TTCGGGTTTG GCGCGGGTGG ACAACGCTCG TCACATCGTA GACATGCATG    1020

CAGTGCTCTG GTAGCTGTAA AGCCAGGGGC GGTAGCATGC ATTAATACCT CTATCAATCA    1080

                                                            rmlB的起始

AACTGAGAGC CGCTTATTTC ACAGCATGCT CTGAAGTAAT ATGGAATAAA TTAA GTGAAA  1140

ATACTTGTTA CTGGTGGCGC AGGATTTATT GGTTCTGCTG TAGTTCGTCA CATTATAAAT    1200

AATACGCAGG ATAGTGTTGT TAATGTCGAT AAATTAACGT ACGCCGGAAA CCTGGAATCA    1260

CTTGCTGATG TGTCTGATTC TGAACGCTAT ATTTTTGAAC ATGCGGATAT TTGCGATGCT    1320

GCTGCAATGG CACGGATTTT TGCTCAGCAT CAGCCGGATG CAGTGATGCA CTTGGCTGCT    1380

GAAAGCCATG TTGACCGTTC AATTACAGGT CCTGCGGCAT TTATTGAAAC CAATATTGTT    1440

GGTACTTATG TCCTTTTGGA AGCCGCTCGC AATTACTGGT CTGCTCTTGA TAGCGACAAG    1500

AAAAATAGCT TCCGTTTTCA TCATATTTCT ACTGACGAAG TCTATGGTGA TTTGCCTCAT    1560

CCAGATGAAG TAAATAATAA CGAAGAATTA CCCTTATTTA CTGAGACGAC AGCTTACGCA    1620

CCAAGCAGCC CTTATTCCGC ATCAAAAGCA TCCAGCGATC ATTTAGTCCG CGCGTGGAAA    1680

CGTACCTATG GTTTACCGAC CATTGTGACT AACTGTTCGA ATAACTACGG TCCTTATCAC    1740

TTTCCGGAAA AATTGATTCC ACTAGTAATT CTTAATGCTC TGGAAAGTAA GGCATTACCT    1800

ATTTATGGCA AAGGGGATCA AATTCGTGAC TGGCTGTATG TTGAAGATCA TGCGCGTGCG    1860

TTATATACCG TCGTAACCGA AGGTAAAGCG GGTGAAACTT ATAACATTGG TGGACACAAC    1920

GAAAAGAAAA ACATCGATGT AGTGCTCACT ATTTGTGATT TGTTGGATGA GATTGTACCG    1980

AAAGAGAAAT CTTATCGTGA GCAAATTACT TATGTTGCCG ATCGCCCGGG ACACGATCGC    2040

CGTTATGCGA TTGATGCAGA GAAGATTAGC CGCGAATTGG GCTGGAAACC GCAGGAAACG    2100

TTTGAGAGCG GGATTCGGAA GACAGTGGAA TGGTACCTGT CCAATACAAA ATGGGTTGAT    2160

                                                   rmlB的终止  rmlD的起始

AATGTGAAAA GTGGTGCCTA TCAATCGTGG ATTGAACAGA ACTATGAGGG CCGCCAG TAA  2220

TGAATATCCT CCTTTTCGGC AAAACAGGGC AGGTAGGTTG GGAACTACAG CGTGCTCTGG   2280

CACCTCTGGG TAATTTGATT GCTCTTGATG TTCATTCCAC TGATTACTGT GGTGATTTTA    2340

GTAATCCTGA AGGTGTAGCT GAAACCGTCA AAAAAATTCG CCCTGATGTT ATTGTTAATG    2400

CTGCTGCTCA TACCGCAGTA GATAAGGCTG AGTCAGAACC CGAATTTGCA CAATTACTCA    2460

ATGCGACCAG CGTTGAATCA ATTGCAAAAG CGGCTAATGA AGTTGGGGCC TGGGTAATTC    2520

ATTTCTCAAC TGATTACGTA TTCCCTGGAA ATGGCGACAC GCCATGGCTG GAGACTGATG    2580

CAACTGCACC GCTTAATGTT TACGGTGAAA CCAAGTTAGC TGGAGAAAAA GCATTACAAG    2640

AGCAGTGTGC GAAGCACCTT ATTTTCCGTA CCAGCTGGGT ATATGCAGGT AAAGGAAACA    2700

ATTTTGCCAA GACAATGTTA CGTCTGGCAA AAGAGCGTGA AGAATTAGCC GTTATTAATG    2760

ATCAGTTTGG TGCGCCAACT GGCGCAGAGT TGCTGGCTGA TTGTACGGCA CATGCCATGC    2820

GTGTGGCACT GAATAAACCG GAAGTCGCAG GTTTGTACCA TCTGGTAGCC AGTGGTACCA    2880

CAACCTGGCA CGATTATGCT GCGCTGGTTT TTGAAGAGGC GCGCAAAGCA GGCATACCCC    2940

TTGCACTCAA CAAGCTCAAC GCAGTAGCAA CAACAGCCTA TCCTACACCA GCTCGTCGTC    3000

CACATAACTC TCGCCTTAAT ACAGAAAAAT TTCAGCAGAA TTTTGCGCTT GTTTTGCCTG    3060

                                                             rmlD的终止

ACTGGCAGGT TGGCGTGAAA CGAATGCTCA ACGAATTATT TACGACTACA GTAATT TAAT  3120

                                                             rmlA的起始

AGTTTTTGCA TCTTGTTCGT GATGATGGAG CAAGATGAAT TGAAAGGAAT GATGAA ATGA  3180

AAACGCGTAA AGGTATTATT TTAGCGGGTG GTTCTGGTAC TCGTCTTTAT CCTGTGACTA    3240

TGGCTGTCAG TAAACAGCTA TTACCTATAT ATGATAAGCC GATGATCTAT TACCCGCTTT    3300

CTACACTGAT GTTAGCGGGT ATTCGCGATA TTTTGATTAT CAGTACGCCA CAGGATACTC    3360

CTCGTTTTCA ACAACTGCTT GGTGACGGTA GCCAGTGGGG GCTAAATCTT CAGTACAAAG    3420

TGCAACCGAG TCCAGATGGT CTTGCGCAGG CATTTATCAT CGGTGAAGAG TTTATCGGTG    3480

GTGATGATTG TGCTTTGGTT CTCGGTGATA ATATCTTTTA CGGTCACGAT CTGCCGAAGT    3540

TAATGGATGT CGCTGTTAAC AAAGAAAGTG GCGCAACGGT ATTTGCCTAT CACGTTAATG    3600

ATCCTGAACG CTACGGTGTC GTTGAGTTTG ATAAAAACGG TACGGCAATA AGCCTGGAAG    3660

AAAAACCGTT ACAACCAAAA AGTAATTATG CGGTAACTGG GCTTTATTTC TATGATAATG    3720

ACGTTGTCGA AATGGCGAAA AACCTTAAGC CTTCTGCCCG TGGCGAACTG GAAATTACCG    3780

ATATTAACCG TATATATATG GAGCAGGGGC GTTTATCTGT TGCCATGATG GGACGTGGTT    3840

ATGCATGGCT GGACACGGGG ACACATCAAA GTCTTATTGA AGCAAGTAAC TTCATTGCAA    3900

CAATTGAAGA GCGTCAGGGG CTGAAAGTTT CCTGTCCGGA AGAAATTGCT TACCGTAAAG    3960

GCTTTATTAA TGCTGAACAA GTGCAAGTGT TAGCTGAATC GCTAAAGAAA AATGCTTATG    4020

                                      rmlA的终止  rmlC的起始

GGCAGTATTT ATTAAAGGTG GTTGAAGGTT AT TAATAAA A TGAAAGTCAT AAAAACTAGT4080

ATTCCGGATG TTTTAATTTT TGAACCAAAA GTATATGGAG ATGAACGTGG CTTTTTTATG    4140

GAAAGCTTTA ATCAAAAAGT TTTCGATGAG GCTGTAGGGC GTAAAATTGA ATTTGTGCAG    4200

GATAACCACT CTCAATCTAG TAAAGGCGTG TTGCGAGGGT TACATTATCA ATTAGAACCT    4260

TATGCTCAAG GAAAGCTTGT TCGCTGTGTT GAAGGTGAAG TATTTGACGT CGCAGTTGAC    4320

ATACGTAAAT CATCACCCAC TTTTGGACAG TGGGTAGGTG TATATTTAAA TGCTAAAAAC    4380

AAGCGACAAT TATGGATACC GGAAGGATTT GCTCATGGAT TTATTGTAAC TAGCGAAAAA    4440

GCCACATTCC TTTATAAAGC AACTAATTAC TATATGCCCT CTCATGAAGG TGGGATAATA    4500

TGGAACGATA AATCATTGAA TATACAATGG CCTTTAATGA GAGAAATGAT TATATCAGCA    4560

                                                                rmlC的终止

AAAGATCAAC AGCAAATATC GCTGACTGAA TATTTAGAAA TTGAATCATC AAAAAAA TGA  4620

                                  wzx的起始

TGAGTTGGTA TAAACCCAAA CCAAAACTAA CTA ATGATTA GAGATTTCAT GTTAAGATTC  4680

TTTTCTAACA AAGTAAAAGA TCATGATTTT TTGAAGGTGT TTACCAATGC GTCATATTTA    4740

ACCATATCAC AAGGGGTATC TTATTTGATA CCCTTAATTA CTTTAAGTTA TGTTATATCT    4800

CTATTAGGAT TAGAAAAATT TGGTCGTTAC TCTGTAATAC TAATAACTGC GACATTACTT    4860

CAAGTCGTGA CAGATTATGG TTTTATGTTT ATCTCACCAA AAGAAATATC TATGCAGGTG    4920

ATAATAAGCA AAAGAGTATC AGGAAGTATA TATATCAACC ACTATATTAA AGTCGTTATT    4980

TCTACTGTTG ATTTTTTGTT TTTTTATACA ATAGTATGTT ATTTAATAAT AGATGAATAT    5040

GATTTATTAA TTAATTTTCT ACTTGGTTAT TTGATTGTAA TATCACAATC TTTATATCCT    5100

ACTTGGTTTT TCCAAGGGAT ACAGAAAATG AAAATAATAG CAGGACTTTC TATAATTGCA    5160

AAAATTATAA ACTGCTTATT AGTTATATTT TTTTTGAAAA TTAGTGCAGA GATAAATATT    5220

CTAATATTAT CACAAGCTTT TCCAATGTTT GTTGTGTCAT TTTATGCAAA TTTAATTATA    5280

ATAAAAAAAT ATATATATCT CGTGAAACCT TCTTGGACTT CGATTCGAAC GTTATTTCTT    5340

GAAGGTAGTG GTTTATTTTT GGCCAATATA TCATCAGCAA TTCTTACAAA CTCAACAATT    5400

CCTATACTAT CTATATATGC AACTCCGACA CAGTTAGGTG CGTATGCAGC AATTGAAAGG    5460

ATAATAAAAT CAATTTATAC AATTTTTTTT CCTATATCAC AAGCGATATA TCCTTATAAT    5520

TGTAAACGTT TCTCATATAG CCTGAGTGAT GGAATTACTG CTGTAAAAAA AACCGGCATA    5580

CCGATGGTGG TATTTGCTTT GATCACTAGT GTTTCTATTG TGATTACTTT TTATGTCATG    5640

AGAAATTATA TTGATATATA CATTTATCAA TATGTATTAG TTGTAATTTT CCTAAGTCTA    5700

TGGCTTATTG TCGGGGTGAT TAATAATGTC TTAGGGATAC AATTTCTATG CGCATACAAT    5760

TGTAAGGATT TTTATAGTAA AGCTTTTTTT GTATCATCTT CATTAACGAT ACCTTTTATG    5820

TTTTGGTTTA GTTCTTGGAT ACCTGCAATC GGTACTTCGT TTGCCGTTTT GATGGGTGAA    5880

TCATTACTAG GGGTAATACT TTTTATAAAG ATCTACAATA TTAATAAAAG GGTGAAATTA    5940

orf6的起始  wzx的终止

A GTGAT TAAT GTAGTTTTCT GTATAAGGAA AGACTGGAAG GAGCGTCCTG GAGGAGATGT6000

GATTCAATTG GTTGAGACTA AGAACGCAAT TGAGTCAGCG TATAAATGCT CTATTAACAT    6060

TATCAGTGAT CCGGATGAAA TTTTGAATAT TCACCCTGAT ATTGTCCACA TATTCAATAT    6120

GCAAACTTTT GAGGAAAGTA AGTTATTTCT TACAAAAGCA AAGCAAATCG GCGCATTTTG    6180

TGTTCTTTCT ACCGTTTATT GGGATATGCA TGATGCATTC TTTGTTAATG CAATGCAAAA    6240

AATGCATATT TATCCTAGTG GAAAATATTT TGAACTTTTA AAAAGAGTAT TTCATTTAAC    6300

GTGTAAAGTA AGTGTTTCTA TTATTAATAA GCCATATTCG CTTACAAATA AGTATAGAAA    6360

AGATATGGCT AACTTTCTAG GGGAGTTTGA TGCATGGTTA CCGAATTCAG AAGAGGAGTA    6420

TGAAATAATT CAGAGAGAGT TCAGATTAAA AAAGGAAAAA TATATAGCCT TAAATGCCGT    6480

AAGTAATAAT GTTTTTTGTT TTAATTATAA TGAGAATAGA AATGGCATAT TATGTGTTGG    6540

AAGATTTGAA CCAATAAAAA ATCAGTTATC TGTATGCAAA GCATTATTAA ATACAGAACT    6600

CAATTTGATA TTAATTGGAG CTGCTCACGC ACATAATAAA GATTACTTAA AAAAAATACA    6660

AAAAGTCAAT GCTGTTAATA ATAATATTCA CATAATCACT AAAAATATCG AGCAATATGA    6720

ATTAAATAGT TATTACAATA AATGCCGTGT CCATGTATTA GCTTCTTTTC GTGAATCTCC    6780

TGGTTTAAGT TCATTAGAAG CTTTAGCCAC CGGTGCAAAT ATTGTTGTAT CTTCAAGCCA    6840

GTTTTGTCCA ATTGATACTT ACTTTAAAGA GATAATTGGG AAACATGTCT TTTTATGTAA    6900

TCCATACTCC ATAAGTTCTA TAAGAAAAGC CATTGAGGAT GCTTATAATG CACCGCTAAT    6960

GCGTAAATCC ATTAATAGAT TTTCATGGGA TCTAACAGCA AAGCAGACCT ATTTGGCTTA    7020

                          orf6的终止                 gne的起始

TCAAGAGATA ATAAATAACA GAGAT TGATA TTAAAATGAC TACAAAAATA  ATGTTAGTAT7080

TTGGTACAAG ACCTGAAGCC ATTAAAATGG CTCCTTTAGT AAATTTATTA AAAAGAGATT    7140

CTCGATATGA ATGTAAGGTT TGTGTAACTG GTCAGCATAG AGAAATGTTA CATAGTGTAT    7200

TGGATTTATT TGATATTACA CCAGATTACA ATTTAAATAT AATGCGGCCG GAACAAAGTT    7260

TATCGACAAT TACAGTCGAT ATAATTAATG GTATGTCAGA AATATTTAAA AATTTCAAGC    7320

CAGAGCTAAT AGCAATTCAT GGTGACACGT CAACTTCATT CGCTGCCTCG TTATCAGCAT    7380

ACTATCATCA AATTAAAATT GCACATATTG AAGCTGGGCT CAGAACTGGC AATTTATATT    7440

CTCCTTGGCC TGAAGAGGGT AATAGAAAAT TAACAGGAGT GCTTGCGGAC TTCCATTTTT    7500

GCCCTACCGA ATTAACTAAA CAGAATTTAA TTAGAGAAGG CGTTGAGTTA AACAAACTGT    7560

TTATAACAGG AAATACGGTA ATTGATTCTT TAATTTATAT AATTAATAAA ATTAAAAAAG    7620

ATGGTGAATT GCTAAATTAC TTACATGAGA AATTTTCATT TATTGATCAA TATCGCAAAA    7680

TGATACTCAT TACCGGTCAT CGGCGTGAAA ATTTTGGTAC TGGATTTAAA AATATTTGTC    7740

AGGCTATAAA AAATCTCGCA ATTAGTAATC CAGATATAAT ATTTGTTTAT CCGGTTCATT    7800

TAAATCCTAA TGTTCAAGAA CCAGTCAATT ATTACTTAAA AGATGTTGAT AATGTAAAAT    7860

TAATTCCACC TCAAGAATAT CTTCCATTTG TTTATTTAAT GGAACGTTCA TATATTATCT    7920

TAACTGATTC ACAGGTATTC AAGAAGAAGA TCCTTCCTTG GGCAAACCTG TTCTCGGTTA    7980

TGCGTGAAAC TACTGAAAGG CTAGAAGCTT TAAATGCGGG TACCGTGAAG TTAGTTGGTA    8040

CAAATTATGA TACTATCATT AAGGAATTTG AGTATCTAAT GAACGATAAG TCACATTATG    8100

AAAGTATGTC AAAATCTACT AATCCATACG GAAATGGTAA TTCATCAATT AAAATTAAAG    8160

                                     gne的终止     orf8的起始

AAATAATTGA TAATTATTTT TTTAATTCCT TACAAGGA TG AGAAT ATGAA TAAACCTAAA8220

GTTGCTGTTT TACTGGCTAC ATACAATGGA GAGTGTTGGA TCAGTGCACA AATCGATAGC    8280

ATTCTTGCAC AAAGAGATGT CGACGTTACA ATTTATATAA GTGATGATTG CTCAACTGAT    8340

AAAACAAAAG AGATTTGCAG TAACTATTCA GAAAGATTTA ATAATATTAA GCTACTTTCA    8400

AATTCAGAAC GGATGGGGGG CGCAAGTGCT AATTTTTTCC GATTATTGCT TTCAAATGAG    8460

TATGATCAAC ATGATTTTGT TGCTTTATCT GATCAAGATG ATATTTGGAA AGAAAACAAA    8520

CTTATTCATG CAATTAAACA AATTGGAACT GACGGCTTTT ATTCCAGTAA TGTAACTGCA    8580

TTTTATAGCG ATGGAAGACA AGTTTTAATA AATAAATCCC AGAAGATGAC CTCCTATGAT    8640

TATTTTTTTG AAGGTGGGGG GCCCGGTTGT ACTTACGTCT TTTCAGTTGA AAATGCATTC    8700

AAACTTAGGG AATTTCTAGT TAAACATGTT AATATTCTTA AAGATATAAC CTATCATGAT    8760

TGGTTTATAT ATGCTTTTGC AAGATCAAAT AATTATAAAT GGATCATTGA TCCTTGGCCC    8820

TCAATGTATT ACCGACAGCA CAGCAATAAT CAAATAGGTG CTAACTCTTC TTTTGGTGGA    8880

ATCATTAAAA GATTAAAAAT GATTAGATCA AAATGGTATA GAAAACAAGT AACTTTGATC    8940

GCTAATACTT TAGAAGCAGC GGATTCTTCT AAAATACAAA AAAATCTCAA TAGAAATTAC    9000

TATGGAAATC TATTGTTTTC AGTTAACTTT TATAAGTTGC GACGCTCATA TAAAGATAAG    9060

                                        orf8的终止

ATTTTTATTT TAATCTTTAT GTTGTTGTAT CTATTT TGAT TATGATAATT ATATAAGATG  9120

     wzy的起始

GAACAT ATGA ACAGAGTTTA CTGTTTGAAT ACAACTTTCT TAAACCCATT AATTCCTATA  9180

TTATTAATGG TAGCTGTTTT CATATTATCA TCTTTTTTGT ATAAGGTTGA TAGTAGTTCA    9240

CTTGTTATTA TTATCTCAAC CTTCTTGGTT ATTTCCTTTA TCCCATTATC ATTCTGTTTT    9300

TCAAGTAAAT ATTATGTCAA TACATCAAAC CTAAGTCTGA AGTCATTTCC GTTACCGTAT    9360

ACGACAACAA TCATTATAAT TCTATCAAGC AGTGTTGAAT ATTTTAAGTT AGGAATTCCT    9420

CTTTTTGGAC ATGTTATATA TGCAGAGTTT GGGTATCCTT TTTTGCACCA TGTTTCAGTT    9480

ATGTCATGGT TATTATTATT TACATGTAAT TCCTTTAAGA ATAGAATAAT TTTTATACTT     9540

GTAATGGTTT TTGCATTTGT TAATCCATTG TTGATGATTA ATCGTGATTT AATGCTATTA     9600

ACTTGTTTTG TCTTTATTTT TATCCTTTTA GGAAAACGAA AGGTTAGTCT AAAACCGATA     9660

CTTATTTTAG GGAGTATATT TCTTTTTGTT TTTGGTTTGA TCGGTGAATA CAGAAGTCCA     9720

GGTGTAATAC ATTCAGTTGA TTTACCTTTT TCTTTCAACT ATGAAAAAAT GCCAGCAACG     9780

ATAGCATGGC TTTTTCTATA TTTTACTTCT TCCTGTTTTA ATATGTATTA TAATATTAAA     9840

ACATTAGGCT TGAATTTATA TGCAAGTAAT ATAAATGTTT TCCCAGAACC CTATTACTGG     9900

TCATCTTTTT TTGATAGCTT TATTTTTTTC CTATTGTCAT TATTTTGTAT TTTATTTTAC     9960

                         wzy的终止

TGTTATCAAT TAGACATTAT CTTT TAACAA AAAAGACTTC AGAATTAACA TTGGCATTAT  10020

ACCTTTATTG TATCTTCCAA GTGTATACGG GATTACTTGC TGTAAAAGTT TTTAATACAC    10080

GTACATTATT TGTTATGCTT TTTCTAGGAG TAATCCAATT CTGTAATATT CTTTTACCTA    10140

                  orf10的起始

AAAAGAGACG TTCATAAC AT GCATAAACAA AGAGTAGCTA TTCTCCTATC TCATTATAAT  10200

GGAAGTGATT ATTTAAGAGA ACAGTTAAAT TCTATTCTCA ACCAGAATGC AGATAATTTT    10260

TCTATTGATA TATATGTCAG GGATGATGGT TCTAATAATG TTAATTTGGT AAACCTTCGG    10320

CAAATGACAT CCTGTTTACC TATTAATGTT TTTGAGGGAA GCAATATAGG TGTGACTAAA    10380

AGTTTTTTTA CTCTCTTGGA GCAGGTTGAT TCATATGATT ATTATGCCTT TTGCGATCAG    10440

GATGATGTTT GGCTTGATGA TAAAATTTCA AGCGCAGTGA CCATGATGAA GGATTCCGAA    10500

GGTCCAGTAT TATACTGTTC AGCTTATACC TTGGTTGATG CAAAATTAAA TTTGATAAAT    10560

TTTGAAAATC ACGTCAATGA TTCTTTTGAA AATGCATTAT TTAAAAACTT TTGCACAGGT    10620

TGTACATGTT TGATAAATAA TAAGTTACGC TCGATTATTT TGAAAACTGA TTATACTAAA    10680

AATGTACCAA TGCACGATTG GTGGATGTTG ATGGTTGCAT ATTTAACAGG AACGGTTATT    10740

TTTGATCAAC AATCCCATAT CCTTTATCGG CAACATGGAG GTAATGTTGT CGGTGGTCGA    10800

ACTAGTTTTA TAAAAAAAAC AAGAAGATTT ATGTTTAATA TTTTATCTAA TGATGAAACC    10860

AGATCAAAAA TGTATCAGCA ACTATTGATA AGTAAAGAAT TGTATAATTC TGAGAAAGTA    10920

GCGTTATTGG AGCTTATACT GAACAGTAAA AGAAATATTT TTCTTAGAAT TAAGTTGGTT    10980

ATGGGCTTAG GGGTTAAATA TGCTAAGAAA TACGAAAGTA TTCTAGTTAA GTTTCTTATT    11040

               orf10的终止

TTAATTGGTA GGTTC TAATA TACCTTAAAT AGCTGCGCGG AATAGTAGAT CACTTTAAGG  11100

GAACTTAGCC CGGATTGTTT GATCTGATCA ATCACCAAAT CAAAACAAAT CACCAACCGG    11160

ACTGAGCGAT GCCGATCATA GCACCAATTC CCCGTGACGA ACGACGCCTG ATGCAGAAAG    11220

CAATCCAGAA AACGCACGAT AAAAATTATG CCCGCAGACT GATGGCCATA CTGATGCTGC    11280

ATCGGGCGAC CTCGTTAGCG ATGTTGGCAG AATGCTCTGC CGTGGCAGTT CCTTCGTCGG    11340

         orf11的起始

ACGCTGAATT AA TTGGTTCA CGCTGTCGGG TGTTGCAAGA CTGAAATCAT TATCTGCCGG  11400

ACGACCCCAC GCTGGCCTTT TGAGCATATC TGCACTTTAT TACGTGAGCT GGTAAACATG    11460

CTCACGGCGA TTTTGGGCTA CCAGCGCTCA GGCTTGAGTA CAGAACTTCT GGCAATAAAA    11520

ATCAATGAGA TAACCGGCTG CCAGTTATAT GCCGGGACCG TTTGCCGCTG GTTGCCGTCT    11580

GCAGGGCTTG TGTGGCGAAG GGCCGCACCA ACCCTGCGTA TCCGTGACCC GCATAAAGAT    11640

GAAAAGATGG CGGCAATCCA CAAAGCACTG GACGAATGCT GCGCAGAGCA TCCGGTCTTT    11700

TATGAAGATG AAGTGTATAT CCATCTTAAT CCCAAAATCG GTGCAGACTG GCAGCTACGT    11760

GGACAACAGA AACGCGTGGT AACACCGGGG CAGAAGGAAA AATATTATCT GGCCGGCAAC    11820

AGCAAAAGTT CAACGCTGTT CATCAGCCTG CTGAAGCGGC TTAAAGCGAC ATACCGTCGG    11880

GCGAAAACCA TCACGCTGAT CGTGGACAAC TACATTATCC ATAAAAGCCG GGAAACACAG    11940

CGCTGGCTGA AGGAGAACCG AAGTTCAGAG TTATTTATCA GCCGGTTTAC TCGCCATTGG    12000

      orf11的终止

TGCATCATG T AGAACGGCTA TGGCAGGCAC TTCGCGACAC AATAACGCGC AATCATCAGT  12060

GCCGGTCAAT ATGGCAACTG CTGAAAAAAG TTCGCCATGT TATGGAAACC GTCAGCCATG    12120

CCCTAAGGCA AACATGGGCT GGCAAAAGTG TAGCGGTATT AGGCGCAGCT ATTTATAAGA    12180

TTATAAAACT AATCTATTTA ACTTAAAATT TACTACCTAT AAACTCATAG TTGAATCGAA    12240

ATTTAATTCT TAAACTACAC CTCTTCATGA TCCCCCTGAC TGGAGTAAAC AATGTCAAAG    12300

CAACAGATCG GCGTAGTCGG TATGGCAGTG ATGGGGCGCA ACCTTGCGCT CAACATCGAA    12360

AGCCGTGGTT ATACCGTCTC TATTTTCAAC CGTTCCCGTG AGAAGACGGA AGAAGTGATT    12420

GCCGAAAATC CAGGCAAAAA ACTGGTTCCT TACTATACGG TGAAAGAGTT TGTTGAATCT    12480

CTGGAAACGC CTCGTCGCAT CCTGTTAATG GTGAAAGCAG GTGCAGGCAC GGATGCTGCT    12540

ATTGATTCCC TCAAGCCTTA CCTCGATAAA GGTGACATCA TCATTGATGG TGGCAATACC    12600

TTCTTCCAGG ACACCATTCG TCGTAACCGT GAACTTTCTG CCGAAGGCTT TAACTTCATT    12660

GGTACCGGTG TCTCCGGTGG TGAAGAAGGC GCGCTGAAAG GTCCTTCTAT TATGCCTGGT    12720

GGGCAGAAAG AAGCCTATGA ACTGGTTGTA CCAATCCTGA CCAAAATCGC CGCAGTAGCT    12780

GAAGACGGGG AGCCATGCGT TACCTATATT GGTGCCGATG GTGCAGGTCA CTATGTGAAG    12840

ATGGTTCACA ACGGTATTGA ATACGGCGAT ATGCAGCTGA TTGCTGAAGC CTATTCTCTG    12900

CTTAAAGGTG GCCTGAATCT TTCCAACGAA GAACTGGCGC AGACCTTTAC CGAGTGGAAT    12960

AACGGTGAAC TGAGCAGCTA CCTGATCGAC ATCACCAAAG ATATCTTCAC CAAAAAAGAT    13020

GAAGACGGTA ACTACCTGGT TGATGTGATC CTGGATGAAG CAGCAAACAA AGGTACGGGC    13080

AAATGGACCA GCCAGAGTGC GCTGGATCTT GGCGAACCGC TGTCGCTGAT TACCGAGTCT    13140

GTTTTTGCAC GTTATATCTC TTCTCTGAAA GATCAGCGTG TTGCCGCGTC TAAAGTTCTC    13200

TCTGGTCCGC AAGCGCAGCC AGCAGGCGAC AAAGCTGAGT TCATCGAAAA AGTTCGTCGT    13260

GCGCTGTATC TGGGCAAAAT CGTTTCTTAC GCGCAGGGTT TCTCTCAGCT GCGTGCTGCG    13320

TCTGAAGAGT ACAACTGGGA TCTGAACTAC GGCGAAATCG CGAAGATTTT CCGTGCTGGC    13380

TGCATCATCC GTGCGCAGTT CCTGCAGAAA ATCACCGATG CTTATGCCGA AAATCCGCAG    13440

ATCGCTAACC TGCTGCTGGC TCCGTACTTC AAGCAAATTG CCGATGACTA CCAGCAGGCG    13500

CTGCGTGATG TCGTTGCTTA TGCAGTACAG AACGGTATCC CGGTTCCGAC CTTCGCGGCA    13560

GCGGTTGCCT ATTATGACAG CTACCGCGCC GTAGTTCTGC CTGCGAACCT GATTCAGGCT    13620

CAGCGCGACT ACTGA                                                     13635

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1、一种对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列，其特征在于，其是源于大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇内特异基因中的任何10-20个核酸序列，以及它们的混合或它们的重组。

2、根据权利要求1所述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列，其特征在于，所述O-抗原基因簇内特异基因是：转运酶基因，其为wzx基因；聚合酶基因，其为wzy基因；糖基转移酶基因，其为orf6、orf8、orf10基因；所述wzx基因是SEQ ID NO：1中的4654至5949碱基的核酸序列；wzy基因是SEQ ID NO：1中的9127至9987碱基的核酸序列；orf6基因是SEQ ID NO：1中的5942至7048碱基的核酸序列；orf8基因是SEQ ID NO：1中的8206至9099碱基的核酸序列；orf10基因是SEQ ID NO：1中的10159至11058碱基的核酸序列。

3、根据权利要求1所述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列，其特征在于：其是源于如SEQ ID NO：1所示的分离的大肠杆菌O154型的O-抗原基因簇的核酸序列，该基因簇全长13635个碱基，由11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

4、根据权利要求1所述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核酸序列对是：SEQ ID NO：1中的5537至5554碱基的核酸序列和5845至5862碱基的核酸序列；SEQ ID NO：1中的5109至5126碱基的核酸序列和5586至5603碱基的核酸序列；源于wzy基因的寡核酸序列对是：SEQ ID NO：1中的9338至9355碱基的核酸序列和9695至9712碱基的核酸序列；SEQ ID NO：1中的9275至9294碱基的核酸序列和9707至9724碱基的核酸序列。

5、权利要求1所述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列在检测表达O-抗原的细菌、鉴定环境中和体外细菌的O-抗原和其它多糖抗原的应用。

6、权利要求1所述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O154型的O-抗原，并成为细菌疫苗。

7、根据权利要求1所述的对大肠杆菌O154型的O-抗原特异的核酸序列的应用，其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体外和环境中的细菌。