CN1324135C

CN1324135C - 对大肠杆菌o109型的o－抗原特异的核苷酸

Info

Publication number: CN1324135C
Application number: CNB2003101178643A
Authority: CN
Inventors: 王磊; 孔庆科; 冯露
Original assignee: Nankai University
Current assignee: Nankai University
Priority date: 2003-12-22
Filing date: 2003-12-22
Publication date: 2007-07-04
Anticipated expiration: 2023-12-22
Also published as: CN1554760A

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O109型(Escherichia coli O109)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O109型中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长16597个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ IDNO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O109型的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O109型的方法。

Description

对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O109型(Escherichia coli O109)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O109型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O109型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1935)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O109 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Joumal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1935年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf4、orf5或与orf4、orf5有相似功能的基因；乙酰基转移酶orf6与orf6有相似功能的基因；、氨基转移酶基因orf7、orf8与orf7、orf8有相似功能的基因；、orf11、orf12基因；单糖合成酶基因包括rmlB、A，orf13、orf14基因或与rmlB、A、orf13、orf14有相似功能的基因；脱氢酶基因，包括fnlA基因或与fnlA有相似功能的基因。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O109型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O109型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O109型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O109型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O109型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇的全序列的方法，按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长16597个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的核苷酸，其由14个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；变位酶基因，包括glf基因或与glf有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf4、orf5或与orf4、orf5有相似功能的基因；乙酰基转移酶orf6与orf6有相似功能的基因；、氨基转移酶基因orf7、orf8与orf7、orf8有相似功能的基因；、orf11、orf12基因；单糖合成酶基因包括rmlB、A，orf13、orf14基因或与rmlB、A、orf13、orf14有相似功能的基因；脱氢酶基因，包括fnlA基因或与fnlA有相似功能的基因。。其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的9738至11102碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的3181至4401碱基的核苷酸；orf4是SEQ ID NO：1中的4394至5530碱基的核苷酸；orf5是SEQ ID NO：1中的5546至6709碱基的核苷酸；orf6是SEQ ID NO：1中的6714至7500碱基的核苷酸；orf7是SEQ IDNO：1中的7512至8600碱基的核苷酸；orf8是SEQ ID NO：1中的8606至9745碱基的核苷酸；orf11是SEQ ID NO：1中的12155至12700碱基的核苷酸；orf12是SEQ ID NO：1中的12697至13509碱基的核苷酸；orf13是SEQ ID NO：1中的13527至14507碱基的核苷酸；orf14是SEQ ID NO：1中的14527至15060碱基的核苷酸；rmlA是SEQ ID NO：1中的2209至3081碱基的核苷酸；rmlB是SEQ ID NO：1中的1137至2207碱基的核苷酸；fnlA是SEQ ID NO：1中的11105至12115碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的核苷酸，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的9789至9807碱基的核苷酸和10686至10704碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的9997至10015碱基的核苷酸和10744至10762碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的3410至3429碱基的核苷酸和4374至4392碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的3221至3243碱基的核苷酸和3654至3672碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O109型的O-抗原，并成为细菌疫苗。

前述的对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。

前述的对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O109型，离心收集细胞；用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟；之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚；上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O109型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O109型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bi0-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bi0-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O109型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O109型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到14个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对痢大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O109型的O-抗原都是高度特异的。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ IDNO：1所示，全长16597个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O 109型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由14个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；变位酶基因(glf基因或与glf有相似功能的基因)；糖基转移酶基因(orf4、orf5)；乙酰基转移酶orf6与orf6有相似功能的基因；氨基转移酶基因(orf7、orf8与orf7、orf8有相似功能的基因)；单糖合成酶基因(包括rmlB、A，orf13、orf14基因或与rmlB、A、orf13、orf14有相似功能的基因)；脱氢酶基因(包括fnlA基因或与fnlA有相似功能的基因)；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括flnA基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O109型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因、基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O109型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O109型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的9738至11102碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的3181至4401碱基的核苷酸)源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O109型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O109型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O109型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O109型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O109型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O109型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O109型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O109型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O109型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCTGGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long TemplatePCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5□。取一环大肠杆菌DH5□单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5□混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O109型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O109型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到14个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1，2编码的蛋白与大肠杆菌O-抗原基因簇中rmnAB基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性(71％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf1，2编码的蛋白与已知的rmnAB的共有序列的同源性预期值非常高(3×e^-136)。单糖合成酶基因包括orf11、orf12，orf13、orf14基因与合成单糖的基因有关，有相似功能的基因；比对和检索发现orf6与乙酰基转移酶有很大的相似性；而orf7、orf8与氨基转移酶基因的编码产物同源性高。

Orf3和orf9是大肠杆菌O109种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。Orf9编码的蛋白与大肠杆菌K12的O-抗原转移酶有49％的序列一致性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf9为wzx。Orf3编码的蛋白与Aeromonas hydrophila的O-抗原聚合酶有28％的一致性，50％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有9个跨膜片段，并且有一个大的(61个氨基酸)胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf3为wzy。

orf4，5两个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有24-36％的序列一致性和44-53％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这五个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1和2的共有序列的同源性预期值为1×e^-12至5×e^-17，因此我们推测这两个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键。由于这两个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这四个基因暂命名为orf4，5。

实施例6：特异基因的筛选：

针对大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

表1列出了大肠杆菌O109型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O109型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共13组，它们的来源都列于表中。

在第13组中含有大肠杆菌O109型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O109型及其O-抗原是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O109型中筛选到对大肠杆菌O109型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy和五个糖基转移酶基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O109型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O109型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O109型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇的结构，共由14个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O109型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>对大肠杆菌O109型的O抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O109型的O抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>16597

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

attgtggctg cagggatcaa agaaattctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc 60

gaaaaccact tcggcacttc ttatgaatta gaatctctcc ttgaacagcg cgtgaagcgt 120

caactgctgg cggaagtaca gtctatctgt ccgccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt 180

cagggcgaac ctttaggttt aggccactcc attttgtgtg cacgacccgc cattggtgac 240

aacccatttg tcgtggtgct gccagacgtt gtgatcgacg acgccagcgc cgacccgctg 300

cgctacaacc ttgctgccat gattgcgcgt ttcaatgaaa cgggccgtag ccaggtgctg 360

gcaaaacgta tgccgggtga cctctctgaa tactccgtta ttcagaccaa agaaccgctg 420

gatcgcgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaattcatcg aaaaaccgga tcagccacaa 480

acgctggatt cagacatcat ggccgtgggc cgttatgtgc tttctgccga tatttggccg 540

gaacttgaac gcactcagcc tggtgcatgg gggcgtattc agctgactga tgccattgcc 600

gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgcc atgctgatga caggtgacag ctacgactgc 660

ggtaaaaaaa tgggttatat gcaggcattt gtgaagtatg gactgcgcaa cctgaaagaa 720

ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccga 780

atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cagtgaagat tcgtggcgaa agtaatttgt 840

tgcgaatatt cctgccgttg ttttatataa acaatcagaa taacaacgag ttagcaatag 900

gattttagtc aaaattttcc aggattttcc ttgtttccag agcggattgg taagacaatt 960

agcgtttgaa tttttcgggt ttagcgcgag tgggtaacgc tcgtcacatc gtagacatgc 1020

atgtagtgct ctggtagctg taaagccagg ggcggtagcg tgtattaaca cctctatcaa 1080

tcaacctaag agccgcttat ttcacagcat gctctgaagt aatatggaat aaataagtga 1140

agatacttgt tactggtggc gcaggattta ttggttctgc tgtagttcgt cacattataa 1200

ataatacgca ggatagtgtt gttaatgtcg ataaattaac gtacgccgga aacctggaat 1260

cacttgctga tgtttctgat tctgaacgct atgtttttga acatgcggat atttgcgata 1320

cagctgcaat ggcgcggatt tttgctctgc atcagccgga tgcagtgatg cacttggctg 1380

ctgaaagcca tgtggatcgt tcaattacag gccctgcggc atttattgaa accaatattg 1440

ttggtactta tgtccttttg gaagccgctc gcaattactg gtctgctctt gatagcgaca 1500

agaaaaatag cttccgtttt catcatattt ctactgacga agtctatggc gatctgcctc 1560

atcctgacga agtaaataat acagaagaac tacccttatt tactgagacg acagcttacg 1620

cgccaagcag cccatattct gcttctaaag catccagcga tcatttagtc cgcgcgtgga 1680

aacgtaccta tggtttaccg accattgtga ctaactgttc gaataactac ggcccttatc 1740

actttccgga aaaattgatt ccgctggtaa ttcttaatgc tctggaaggt aaggcattac 1800

ctatttatgg caaaggggat caaattcgtg actggctgta tgttgaagat catgctcgag 1860

cattgtatac cgtggtgact caggggatag taggtgaaac ctacaatatc ggtggtcata 1920

acgaaaaaaa cctggacgtg gtatatacta tttgcgatct tcttgatgaa attttaccga 1980

aggaaggatc ttatcgcgat caaattactt acgtgactga ccgcctaggt catgaccgtc 2040

gttatgccat caatgccgat aagattagtc agactttagg ctggaagcca caagaaacgt 2100

ttgaaagtgg gatccgtaaa acggtggaat ggtatttaaa caatactaat tggtgtcgtc 2160

gtgttcagga cggtagttat agacgtgaac gtttaggatt agaataatat gaaaggaatt 2220

atccttgccg gtggttcagg tacgagactt tatccaataa ccatgggggt ctcgaaacaa 2280

cttctcccta tttatgacaa accaatgatc tattatcctt tgtcagtatt aatgctggca 2340

gggatcaaag aaatattaat tataacaaca cccgaagatc aggaaggatt tattcgtctt 2400

ttaggtgatg gaagtcaatt tggaattgag ttgaaatata aaattcaacc tagtcctgac 2460

gggcttgcac aggcgtttat tttaggggaa gagtttattg gcaatgattc agtatgctta 2520

gttctcggcg ataacatctt ctttggacag agctttagcg cgaagttaag agctgtagct 2580

gagcgagcag aaggtgcaac cgtttttgga tatcaggtaa tggatccaga gagatttggt 2640

gttgtggaat ttgatgataa ttacaaagct atatctattg aagaaaaacc tgaaatcccc 2700

ctttctaatt gggcggtaac tggactatat ttttacgata attcagtagt tgagatagca 2760

aaaactataa agccttctaa acgcggagaa ctggaaataa cgaccatcaa cgagtgttat 2820

ttaaaaatgg ggaaactaaa tgtagaatta ctggggcggg gattcgcgtg gttagatact 2880

ggcacttatg atagcttaat tgaagcgggc agttttgttg aaacagtgca gaaaagacag 2940

ggtttgatgg tagcatgccc ggaagaaatt gcatggcgaa acggttggtt gagtaataat 3000

gaattacatc agcgaggtgc acttttgagt aaaaataatt atggtcaata tcttttaaaa 3060

ttatcaaaac acgaaagatg atcttcaaaa atggctgtgt tagtatttaa gttagaccat 3120

atataatcta agataaatat tcacattaca gccatttcca cttcttctag gttgagtaaa 3180

atgggatgta caacgaatca aaatttgatt tataaaagtc gtgttagtgt tggtagcgtg 3240

attgtacttt tggtgttttg catatatcta ttcatgcctc caatgattat ggtacttctt 3300

tctcaatcat cattgtcagc agggatgatg gtagtcgcta cgctattaca tatttcgttc 3360

gctcactata aaatattaaa ttataaaata ttaactgctg tgttgttaat actcatttat 3420

gggactgtct caacatttta tagccccgat atgaaaccac ttttctctgc gatagcttta 3480

atatatattt atactgccac agtaaagttt ttgaaatatt tacaagagat acacgattta 3540

gatgcaaaaa aagcaatatc atggctctat tatataatga ttatcattgg gataatgggg 3600

gtggttttta atataagatt tgggaattat gctgttaaaa actatcccgt ttttccattt 3660

gcagagccaa gtcactttgc tcttgcatat gcgcccatag caatatgtta ccaattatat 3720

tattgttcaa ataagttcca cagttttcgt acgattggaa taagtttatt gttaggtgtc 3780

ttgtacccca atttaatact agttatcatt ggttgtttac aatttttgat cttacctaaa 3840

agatattcgg taccactgct ttttatttta attgcatctg tggcaatgta tataataaag 3900

gcaggtatgc aagctattga ctatttttat tacaggattt tttttgatta ttcaaactta 3960

aacctttcaa acttagtata tctgcaagga tgggaagctg cttggattgc cttaaaagag 4020

acccggctat ttggattggg ttttcagcta aatggtacac aaagtgctgg tttttttact 4080

gacctgataa actccattaa taaaagtgag ttgaaccgcc ttgatggtgg attccttgct 4140

tccaaactta taagtgagac aggaataata ggtatattct ttgtgctatt cttaattttc 4200

aaggcagtga aaataatttt tataaataaa aaataccaat ttagtttcta taacaaactc 4260

tatttttcga ttatggttag cttacttgtt gagctaatct ttaggggata tggatatttc 4320

tctcctacat ttattttggc gctatctttt ctttcaatac ctaacactgt atgtcgaaac 4380

gagataacta cacatgaata agaagaaaac aaaagtggta atatctggtg tgaatattgt 4440

tgagggtggg gcattaacca cattccaaag tataataggt gcttttagca aatttgaaga 4500

tatatcatta gtatgtttag ttaactcaaa aaaacatttt tgtaactata atattagtga 4560

tattgagttt atagaatatc cattaataaa aaaacgctgg ctgcgtagga taaaatttga 4620

atattatgat tgtaggagaa taagtaaaga aatcaagcct gatatttgga tttcaatgca 4680

tgacatgacc ccaacagtta tatgtaaaaa tcaatttgtc tattgccata atccttcacc 4740

attttatcag agtaaactct ttgatttaaa aatggatcct tcttttttta tattcactct 4800

tctgtataaa tatctgtata aaataaatat cagaaaaaat aaagcagtga ttgtccagca 4860

agattggcta gcccatgctt ttaaaaaatg gtacggcgta aaaaatattc tggtttcaaa 4920

acctgaagaa aacgatataa ataatataag tttaggctgt tcagagcaaa aatcatatgg 4980

cacctatttt tatcctgcac tagccaggac attcaaaaat tttgaagtga taggggaggc 5040

cgttcaaatg ttaagtactc gaaaccctca ggcttatgct aagttaaata tcatacttac 5100

aattgatggc gaagaaaaca aatatgcaaa ctatatttat aataaatact ctcatcttaa 5160

agctataaat tttgttgggc gattaacacg taatgaagtc aatgagtatt attctaaagt 5220

tgatgtttta ctatttccct ctaaattaga aacgtggggg ctaccgattt ctgaggcgaa 5280

aatgaaacat ttgccaatgt tagttgctga cttatcatat gcgaaagaga cagtaggaac 5340

atatgataaa gtaacattta ttgatattaa cgacccaaac gcattggcag agttgtttga 5400

gcgatgcatt actgggcaac atcgttttga aaagtgcagt tatgtgccga atgaagacta 5460

tattcatagt aatagttggt ctgaacttgc tcaaaatatt ttaaataaag catgttcaaa 5520

attaatttaa gaaggtgctg aaattatggc ttttttatca atagtaattc caacccgcaa 5580

cagacctcag tatttggcaa gggttgtgga gttaatagca tcaaacacat gcgaaagtga 5640

agttattgtt gcagataata gcgataatga ttcattgaaa gataaattga aaaaatacac 5700

tgaatctggt ttggtaaaat attattatac atctgaaaat ttaagtgttg tagataattt 5760

tgaaaaggca ttagaaaaag taactgggaa atatattatt tttctaggag atgatgatgg 5820

gattggtcct caaatagaaa acattgctca ttggatggac gacaatcatg ttgatgctgc 5880

attttcatat tcagataaat tcttggtaaa ttattattgg ccgggtgtta aatctaagtt 5940

ttttgatgat aaatactctt cgcgcatttt tatttcaaaa tttgatggct ctgtacaatt 6000

tatcgactcg ataagtgcga gaagtgaagt tagagatgct ccgggaacag gacttaataa 6060

cttacccaga atttatcatg gtttggtttc ttttaacttg atagcaaaaa taaaagctaa 6120

aggtaatctc ttcggtggaa ttagtcctga tatatttagt gcttatcaaa ttgccacaga 6180

agcaaaaaaa attgccaaaa ttaattatcc attcgtgata ccaggcggat gcaaagaaag 6240

tactgctggc caaagagctg caaaatctga taatggaagt ctggctgaaa ccgaacatac 6300

agcacgtttt ggtaattcac ttgtatggga ttcaagaatc cctcagtatt attctcccta 6360

taatgtttgg gcatattcat tgctaaaagc tgttgagcgc actgatggaa aagttaatga 6420

cttcaatttc tatcgccttt acgtaatatc atatcttcgt tataagaatt tcagatcata 6480

tacattaagt gcattatctg aggcctataa aaaaccttca ttggcaggct tcattaaggc 6540

actttttgct gagtttaatt tttttgttaa tcgtgtaacg aataaaatat tgaaaaataa 6600

aaaggaatcg atagctgcga gtgatatcat taaagcatat gaagtgttag attctttcat 6660

taataaaaat aatatcaaaa taaaatatcc tagtcagcaa ggaaattaat gtaatgattg 6720

aattatctga atgtactgag ataagcaaag aatttgaaaa gattgcatgg aatgaatttt 6780

ttgtaaaacg aaatagaggg atatctctcc aataccacta tcctttttta tataataaaa 6840

ataaaaatta cgtcaacatt ataataaaaa tatcaggtgt tacagtagga gggttaatac 6900

ctcagtttaa atatatcgac aacattgttt atggttctat aggtttagta tgtattaaag 6960

atgagtatcg aggcttaggg ttatttaaca agttatttat atatactctt gcatatgcaa 7020

aagagaaata tattcataag ttaattcttt ggacttcgaa gcatagttta tatgagaaat 7080

ttgggtttcg taaaaaaatt caagaatatt tatatattga acccacttgt tcagaaatga 7140

tgagtttcga aaaatatgaa aattgtttta ccgaattaag tgaaactaat aaacctccat 7200

ttgtaaaaga atttattcgt gttcaaagcg gaaatcatat cgcttatctt tttcaagatg 7260

ctaatggcat ttcggtatat gaatacaaag ggaaggtaga aaacgtttta gatatgatta 7320

aagcattttt atctaagccg ctaagaattt tattgtcaaa aaatgatgac ttgtttcaat 7380

taattttaaa agaagttaca agtgctaaac tcaaagaaga tgacactgaa atgtggtaca 7440

cagttgacaa aaaaattgtt gatgttaaaa cacctcatat agcatatatt gacagaatat 7500

aaggaataag catgttacct ttagttaaag ttggaatgcc agataaagat attttaattc 7560

ctcgaattga agaggttctt tatagtgggt ttattgctga gggggaagct gtatatgaat 7620

ttgaaaggcg tttcggagag catttttcac taggggacaa tgtgcttgga atgtacagcg 7680

gaacagctgc gttacatacg gctttgattc ttgcaggtgt aaaagaaggt gatgaggtta 7740

ttactaccag tatgactgct gagccaacaa atttaagtat acttcaggct ggtggaaaac 7800

ctgtgtttgc cgatgttgat gtcttctcgg gtaatccttc tcctgaatca attaaggaaa 7860

agatcactag taagacaaaa gctatccttg tagtgcatta tgctggtatc ccggttagat 7920

tgaaagagat ttctaaatta gcaaaagaga atggcttaaa attaattgag gattgtgccc 7980

atgccctcgg gtccagatat gatggattag gaataggcca gtttggagat tatagtatat 8040

tttctcttca ggctatcaaa catatgacaa ctgttgatgg tggagttctc tacattaaag 8100

acaacgagca gattaaaaga gcaaaaaaaa ttagatggtt tggtatggag aaaggagttg 8160

cccgaactga ggttgatatt actgaactag gttataaata taatatgcat aatgttgcag 8220

cctgtattgg acttgcacaa ttgcaatgcg ttcaggaaag aatacagcgt catatagata 8280

atggtagata ttttgattcc gtaattacaa aaattcctgg gctcgatgtt ccaaaatttg 8340

atgctgtagc ttccccatca tactggttat atacaatttt ttcagatgat tctgatgata 8400

ttcagcgcaa actagatgaa gtaggggtaa tggcttcaaa attacataaa ccaaaccata 8460

ctcatgctat attttcaaat gaaaatatta agttaccaaa tcttgagcat tactacgaaa 8520

aaatgattca tataccttgt ggttggtggg ttgataatga agctcgtgag atgattgttg 8580

aagccttaaa aaagggttga tgtaaatggc aatttcatta ttcaatgctt actacgacaa 8640

aagtatgggg gatttgacta acgaaattct agcgagtggt caaattgcta atggtaaata 8700

cgttgcctta ttttcagaaa gctttgccaa aaaaaatgga aatagtcata tcgttactac 8760

ggataatatg acaaatgcta tggagttagc cctaaaaatg agtggggttg gacctggtga 8820

tgaagtttta acatcgcctt tttcttgtat ggcctctaat tcacctattg ctacactggg 8880

agccacacct gtttgggtag atcttgctcc aggatctact tgtatcaata tagatgaagt 8940

tgaaaagcag atcaccaaaa gaactaaggc attgattttg tatcatttgg ctggttatgc 9000

taatttagcc gaatcagctg tagcattatg taaaaaatat ggaataaagc ttattgaaga 9060

ttgtaataac tcctatttta caaaaatagg caataggaat gttgggactt atggggattt 9120

ttctgtttat tctttttatc cgaatcgatt aattaatact atcgatggtg gtgcaatttc 9180

tgtccgaagt gtagaagact atgttttggc aaaaaaaatg actaagtatg gtcttgatcc 9240

ccaaactttt cgagactcca caggagaaat caatcctcaa agtgacatac ctcatatacg 9300

gcggacgatc ggaatgaata atttatcatc cgcacttggt tatagtcagc tttcttccgt 9360

tgatgcaaga atacagcgca ttaaaataaa cgtctcatta ctttatgaat atttctcaga 9420

gagagatgat gttcatattg ttaaatcttc agataattct aataatgtga actgggtatt 9480

ttttattcaa gtaaataaac gtaatgaatt gctgaaaact cttaaattaa acggaatatt 9540

tgcttcaaaa ctgcatcagt tgaatagctg ttatacgggc tttaagtcaa aagaaatggc 9600

cattcccaat gcagtaaggt tgcaaaatac gctaatagct ttaccttgtg gatggtggct 9660

tgatgaaaat cagattcatc atatgattga tgtcattaat gatagtttag gtttggtaga 9720

atctggtaga tggattgatg attaatgaaa agctaaggaa attgtttggg ttagggctac 9780

ttttctcaag taaattaggc ggactggttg tcgccttatt tttggtgccc atttataacc 9840

attatatgag caatgaagct tttggattcg tgactttatt tttaacattg caatcgctcg 9900

tattattgct cgattgtgga gtaactatta ttctctctcg acataccgcg cttaatgttt 9960

gcaagaaaaa taaaatatcg aataaccaat ggtataacac ggaggtattt cttactattt 10020

tatatttatt gtttgggttt gtttttttta tcttcaaatg gttaggggtt aactggctgt 10080

cattaattag ttatacagat cttttgatga ttattgtggc tctttgggct acggttttgc 10140

aaaatatatg cttaacagtt ttgttggcgg ggaaatattt ctctttatca agtgtgttac 10200

ttatatctgg taacctttta aaggcaggag gcgctgcttt aatcgttaaa tatttttctc 10260

caacaattgg ggcatatgta gcaactcaag ctctgcttgg tatatcatta ctttttgtga 10320

ctcgattttt ctgcgattat tttttgtttt ttaaggatgt gaaaaggaaa attgatttca 10380

atgtcataaa aaaaataata catgaggggc gagcattagt tatatttaat atttctgccg 10440

ctgttttatt aaatcttgac aaaataattg tatctcacaa tatatcacta attgcgctgg 10500

ccccctattt tttagcaagc tcattatgta ttactcctat atctgcattg tcaggtcctg 10560

taatgcagtt tttccaaccc ggattaacaa aagcaatctt taatgattcg ccaaatgtta 10620

ttaagacatt acgggtatat atatcgactt tgtgtgtgtc gacactttta ccttcttata 10680

tcctttgggt gtatcgtgat tcattaattg cattatggct tggaaatact gaattagtta 10740

atattgtcgc agattatacg aagattttac tgcccggaat agcaattgga ggattaggct 10800

atatttctta tgttgtatta attgctattg aggattttaa attccaaagt tttctgtctt 10860

tatctatgac agctatcgtg gttatattag ttgtattttt ctcgatgcga caagatataa 10920

gaagtatttg ctacgtctat gctttttatc attccctatc tactttatta acatgggcaa 10980

gatgttatta tctccccaga acccaaaaat atgcgctgga aacggctaag atgttattta 11040

ttattatgat tgctcttgct gttctttgcg tatttttcaa tctcatcatt aataggattt 11100

aaagatgttc aaaaataagc ggttaatgat tactggtggt acaggttcct ttggtaacac 11160

tgttcttaag cgttttctga aaacagatgt taaagaaatc attgttttta gccgcgatga 11220

gaaaaagcaa gaagatatgc gtattgcttt aggtgattca aaggttaaat tctatatcgg 11280

cgatactcgc tgctatacaa gtattgagca agcgatgcgt ggcgtagatt atgtgtttca 11340

tgccgcagcc ttgaagcaag tcccttcatg tgaattttat cctatggagg ctatcaagac 11400

gaatattctt ggtactgaaa atgtgcttaa tgctgctatt gcaaacaatg tcaaacgcgt 11460

agttttatta agtactgaca aagcagttta tccaattaat gctatgggta tgtcaaaagc 11520

tatggctgaa aaggtactga tcgccaaatc acggatgatt gatgctgata aggggccagt 11580

tctgtgcgca acccggtacg gaaacgtaat ggcttctcgt ggttcagtaa tccctctgtt 11640

cattgataaa atcaagaata atcaagagct tacaattacc gatcctaaaa tgacacgttt 11700

tctgatgtct ttagaagatt cggttgactt ggttttacat gcttttgaaa atgggcaaca 11760

gggggatatc tttgttcaga aggccccggc aagtacaatt gaagacttag ctcaggcaat 11820

caaaggtttg tttaacagtg aagcttcaaa caaaattatt ggtactaggc atggggaaaa 11880

gctttatgaa actcttgtat cccgcgaaga aatggtcaaa gcgcaagata tggggaaata 11940

ctatcgaatc cctgctgata accgcgattt aaattacgat aaatatatcc tggatggtaa 12000

ggtagaagcc aacaatattg atgattatac atctcataac acaactcgac ttagtgttaa 12060

agaagttact gagttgttgc taactttaga ttatgtaaaa gagcaattaa attaattata 12120

ggggctttgc cccttttata tttgaggtta tgttttgaaa ataactaaga cacatttact 12180

tggctgtata gtgattgagc caaaagtatt tagggatgca cgtggttttt ttgtggaaac 12240

atatcaaaaa gaaaaatatc aggaaatcgg cattacagaa gattttgttc aagataaccg 12300

ttcacgttca gcaaaggggg ttttgcgcgg gttacatttt caaacgaatc aaccgcaagg 12360

caagttagtt tctgttacct caggtgctgt ttatgatgtt gcagttgacc tccggcctga 12420

atcagctact tttggttcct actttggctt ggttctttct gcagaattaa ataatcaact 12480

ttatataccg ccaggttttg ctcacggttt ctgtgtattg agcgatagtg cggatttttt 12540

atataaatgt acacaatatt ataatccagc ttctgaaagt ggtattcaat ggaatgaccc 12600

aacattaaaa atcaactggc caatttcaaa tccttttata tctgaaaaag attctacact 12660

gccgtcattc aaagactata tggagaccta cgctcaatga aatacactgt aataggcggt 12720

tctggattca ttggtagtgc aatgtgtaat tatctaaaaa ataataataa gaatgtcttt 12780

attccagagc gtgattatca tttttctgca ggtgaagatt taggtattgt tttttattgt 12840

gcaggctatg gcgattgcat aaataattac gataatgtta ttgacgctaa tgttttgtta 12900

ttaagaaaaa tacttaataa tgttaaattt aaaaaattag tttatgtgtc ctccacaaga 12960

gtatacatga atgagaattg tgcaaaagaa aatgctgatc tacttatatg ccataatgat 13020

aatcgtaaat tatttaatct tacgaagtta gcggctgaag aaatctgcag attaagcaaa 13080

agaaatgtta ttattgtacg tccatctaat gtgtatggat tagctttgaa tagtaagtta 13140

tttctccctc aaatcataaa aaatgcaata ttaaataata aaatagatat gtatgttgct 13200

cctgagtata gcaaggatta tgtttcggtt gatgatttgg tacatattat gttcgaactt 13260

gctcataaag agtttaatga tgttcaaacg tttaatatag cctctggggt taatacttcg 13320

gctgcgcaaa ttgccgatat tatcaagcga aagaccaatt gcgaagttat ttggcatgat 13380

gttaatattc aagagaagtt ccccgtaacg gatataacaa aaattaatga gcttgttgcg 13440

cacaattata gagatgttat atctgatttg tcgaaaatga tcgatgtgtt ttataatgaa 13500

ttgcattaaa taattaattt aaaatcatga agaaaatact ttttatttgc cctagttttt 13560

ttaagtatga attggaaatt tataaagaac tttctttgaa ttatgaagtg gaatattggg 13620

atgaaagacc taaaaatagc attatattta aggttttact tcggctaaag tttcgaccat 13680

taattaaaaa agctatcaac cagtattata ttaatctgct gaataacata aatggaaaac 13740

atttcgatta tgtttttgtt ataaatccgg aagctctaga ttataatact atgaacaagc 13800

ttaagcagaa gtgtttaggt gttaataagc aatgttattt tgtattatat ctttgggatt 13860

cactgaaaaa caaacccaat gctcctaaat tgtttccttt gtttgataag gtttcaacat 13920

ttgatcgcaa agactcggat gactttaata taaatctaat acctttattt tacactcgta 13980

aatttgatgc aaagtactat ccagtacaac cattaaagta tgatgtttgt tttattggaa 14040

cagctcactc aaacaggtta aaatatcttg atgaaatttt aaagattata agcaacaata 14100

aacaaatctc aaaatatatt tttctttttt ttcctagccg catgctattc ttaatcaaga 14160

agttgttctg taattcaagt actaagcaca aaatttattt tgaatcgctg ccatcagcaa 14220

aagttgtcga tgctattctt tcatcagcag tcgtaatcga tatacatcat ccctcgcaac 14280

atggcctaac aatgagaact attgaagccg taggtcttaa caaaaaaata ataacaacta 14340

atgctgacat taaaaaatac gatttttatg atccgaaaga tgtgtatgtc tatcaatctg 14400

gtgacagtaa attacctgat gtttttttgt caacgtcaac aactaatttt aagaatcgtg 14460

agatgtattc actcaaatgt tgggttgaaa ataatttaaa aaaataataa gttactgagg 14520

tatgaaatgg caaagttaaa aatggatatt cttagatata agcttttatg tggtgatgag 14580

actaatttaa aataccgtga ttatctaaaa attttctcac caagattatt ttgtgtcttc 14640

ctgtatcgaa cttcaagttt tttctatcaa aaaagaatga aactactttc taaatttttt 14700

tcattaatta atttttatta ttcaaagttg aaatttcacc tctatgctcc attggtggag 14760

ggactttttt taccgcatcc tataagtata gtaatcggtg cgaattcaat aggtgaaaac 14820

tgtacgattt tccagaacgt aactattgga gcgaaaacgc ttgatattgt atataatcgt 14880

aatgtaagac cactcatagg taataacgtt actatttcag ccggtgctgt ggttgtgggg 14940

ccagttgcta taaatgataa tgtttttctt ggtgctaact gcgttgttgt caatagcatt 15000

gaaagtggtg taatagttgg tggtgtacct gccaaaattt taggtaagct aaccttataa 15060

aataagtttt ttattacaat aatttttgac ctgaatttta attagtaatt agtattttca 15120

ttgtttcgct aatctctcat gagaaaatat attcataagt tacttttagt taacattcac 15180

ctcacaattt tcatcgtgag tgtttgaaat accacccctg acaggagtaa acaatgtcaa 15240

agcaacagat cggcgtagtc ggtatggcag tgatggggcg caaccttgcg ctcaacatcg 15300

aaagccgtgg ttataccgtc tctattttca accgttcccg tgaaaagacg gaagaagtga 15360

ttgccgaaaa tccaggcaag aaactggttc cttactatac ggtgaaagag tttgttgaat 15420

ctctggaaac gcctcgtcgc atcctgttaa tggtgaaagc aggtgctggc acggatgctg 15480

ctattgattc cctcaagccg tacctcgata aaggtgacat catcattgat ggtggtaata 15540

cattcttcca ggacaccatt cgccgtaacc gtgagctttc tgccgaaggc tttaacttca 15600

tcggtaccgg tgtttccggt ggtgaagagg gcgcgctgaa aggtccttcc attatgcctg 15660

gtggccagaa agaagcctat gaactggttg ctccgatcct gaccaaaatc gccgcagtag 15720

ctgaagacgg tgagccatgc gttacctata ttggtgccga tggcgcaggt cactatgtga 15780

agatggttca caacggtatt gaatacggtg atatgcagct gattgctgaa gcctattctc 15840

tgcttaaagg tggcctgaat ctctctaacg aagaactggc acagaccttt accgagtgga 15900

ataacggtga actgagcagc tacctgatcg acatcaccaa agacatcttc actaaaaaag 15960

atgaagacgg taactacctg gttgatgtga tcctggatga agcggctaac aaaggtaccg 16020

gtaaatggac cagccagagc gcgctggatc tcggcgaacc gctgtcgctg attaccgagt 16080

ctgtgtttgc acgttatatc tcttctctga aagagcagcg tgttgccgca tctaaagttc 16140

tctctggccc gcaagcgcag ccagctggcg acaaaggtga gttcatcgag aaagttcgtc 16200

gtgcgctgta tctgggtaaa atcgtttctt acgctcaggg tttctctcag ctgcgcgcag 16260

cgtctgaaga gtacaactgg gatctgaact acggcgcaat cgcgaagatt ttccgtgctg 16320

gttgcatcat tcgtgcgcag ttcttgcaga aaatcaccga tgcttatgcc gaaaatccgc 16380

acatcgctaa cctgctgctg gctccgtact tcaagcaaat tgccgatgac taccagcagg 16440

cgctgcgtga tgtcgttgct tatgcagtac agaacggtat cccggttccg accttcgctg 16500

ctgcggttgc ctattacgat agctaccgtg ccgctgttct gcctgcgaac ctgatccagg 16560

cccagcgcga ctatggcgat tgtggctgca gggatca 16597

表1 大肠杆菌O109型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物	反向引物	PCR产物的长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
基因	功能	基因的碱基位置	正向引物	反向引物	PCR产物的长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)	Wzx	O-抗原转运酶	9738-11102	9789-9807	10686-10704	916bp	0*	60
			9997-10015	10744-10762	766bp	0*	60	Wzx	O-抗原转运酶	9738-11102	9789-9807	10686-10704	916bp	0*	60
			9997-10015	10744-10762	766bp	0*	60	Wzy	O-抗原聚合酶	3181-4401	3410-3429	4374-4392	983bp	0*	56
			3221-3243	3654-3672	452bp	0*	55	Wzy	O-抗原聚合酶	3181-4401	3410-3429	4374-4392	983bp	0*	56

*只在大肠杆菌O109型中得到正确的一条带

表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号该组中含有的菌株来源

1、野生型大肠杆菌 O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20， IMVSa

O21，O22，O23，O24，O59

2、野生型大肠杆菌 O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O35，O36，O37， IMVSa

O38，O40，O41，O42，O43

3、野生型大肠杆菌 O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56， IMVSa

O57，O58，O60，O61，O62

4、野生型大肠杆菌 O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78， IMVSa

O79，O80，O81，O82，O83

5、野生型大肠杆菌 O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101， IMVSa

O102，O103，O104，O106

6、野生型大肠杆菌 O107，O108，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVSa

O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128

7、野生型大肠杆菌 O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137， IMVSa

O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145

8、野生型大肠杆菌 O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158， IMVSa

O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166 b

9、野生型大肠杆菌 O168，O169，O170，O171，O172，O173， c

D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12 d

10、野生型大肠杆菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， d

B16，B17，B18

11、野生型大肠杆菌 F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，FX变，FY变，DS，DR，d

12、野生型大肠杆菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151， IMVSa

O155，O124

13、第6组菌株加上大肠杆菌标准菌株O109 IMVS

*为了检测的方便，我们将每13-17个菌分为一组，总共13组

a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3 大肠杆菌O109型O抗原基因结构图

E.coli O109 O-antigen gene cluster

#orts galF rmlB rmlA wzy orf4 orf5 orf6 orf7 orf8 wzx fnlA orf11 orf12 orf13 orf14 gnd％G+C 42.9 38.6 32.3 31.2 32.7 27.6 37.0 35.0 33.1 38.3 37.4 30.5 29.2 32.8content

表4大肠杆菌O109型O抗原基因簇基因位置

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATTCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC 60

GAAAACCACT TCGGCACTTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAACAGCG CGTGAAGCGT 120

CAACTGCTGG CGGAAGTACA GTCTATCTGT CCGCCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT 180

CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC 240

AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGACG ACGCCAGCGC CGACCCGCTG 300

CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGT TTCAATGAAA CGGGCCGTAG CCAGGTGCTG 360

GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTTA TTCAGACCAA AGAACCGCTG 420

GATCGCGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTCATCG AAAAACCGGA TCAGCCACAA 480

ACGCTGGATT CAGACATCAT GGCCGTGGGC CGTTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG 540

GAACTTGAAC GCACTCAGCC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCCATTGCC 600

GAACTGGCGA AAAAACAGTC CGTTGATGCC ATGCTGATGA CAGGTGACAG CTACGACTGC 660

GGTAAAAAAA TGGGTTATAT GCAGGCATTT GTGAAGTATG GACTGCGCAA CCTGAAAGAA 720

GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGA 780

ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT 840

TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG 900

GATTTTAGTC AAAATTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT 960

AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TTAGCGCGAG TGGGTAACGC TCGTCACATC GTAGACATGC 1020

ATGTAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGTATTAACA CCTCTATCAA 1080

orf1起始

TCAACCTAAG AGCCGCTTAT TTCACAGCAT GCTCTGAAGT AATATGGAAT AAATAAGTGA 1140

AGATACTTGT TACTGGTGGC GCAGGATTTA TTGGTTCTGC TGTAGTTCGT CACATTATAA 1200

ATAATACGCA GGATAGTGTT GTTAATGTCG ATAAATTAAC GTACGCCGGA AACCTGGAAT 1260

CACTTGCTGA TGTTTCTGAT TCTGAACGCT ATGTTTTTGA ACATGCGGAT ATTTGCGATA 1320

CAGCTGCAAT GGCGCGGATT TTTGCTCTGC ATCAGCCGGA TGCAGTGATG CACTTGGCTG 1380

CTGAAAGCCA TGTGGATCGT TCAATTACAG GCCCTGCGGC ATTTATTGAA ACCAATATTG 1440

TTGGTACTTA TGTCCTTTTG GAAGCCGCTC GCAATTACTG GTCTGCTCTT GATAGCGACA 1500

AGAAAAATAG CTTCCGTTTT CATCATATTT CTACTGACGA AGTCTATGGC GATCTGCCTC 1560

ATCCTGACGA AGTAAATAAT ACAGAAGAAC TACCCTTATT TACTGAGACG ACAGCTTACG 1620

CGCCAAGCAG CCCATATTCT GCTTCTAAAG CATCCAGCGA TCATTTAGTC CGCGCGTGGA 1680

AACGTACCTA TGGTTTACCG ACCATTGTGA CTAACTGTTC GAATAACTAC GGCCCTTATC 1740

ACTTTCCGGA AAAATTGATT CCGCTGGTAA TTCTTAATGC TCTGGAAGGT AAGGCATTAC 1800

CTATTTATGG CAAAGGGGAT CAAATTCGTG ACTGGCTGTA TGTTGAAGAT CATGCTCGAG 1860

CATTGTATAC CGTGGTGACT CAGGGGATAG TAGGTGAAAC CTACAATATC GGTGGTCATA 1920

ACGAAAAAAA CCTGGACGTG GTATATACTA TTTGCGATCT TCTTGATGAA ATTTTACCGA 1980

AGGAAGGATC TTATCGCGAT CAAATTACTT ACGTGACTGA CCGCCTAGGT CATGACCGTC 2040

GTTATGCCAT CAATGCCGAT AAGATTAGTC AGACTTTAGG CTGGAAGCCA CAAGAAACGT 2100

TTGAAAGTGG GATCCGTAAA ACGGTGGAAT GGTATTTAAA CAATACTAAT TGGTGTCGTC 2160

orf1终止 orf2起始

GTGTTCAGGA CGGTAGTTAT AGACGTGAAC GTTTAGGATT AGAATAATAT GAAAGGAATT 2220

ATCCTTGCCG GTGGTTCAGG TACGAGACTT TATCCAATAA CCATGGGGGT CTCGAAACAA 2280

CTTCTCCCTA TTTATGACAA ACCAATGATC TATTATCCTT TGTCAGTATT AATGCTGGCA 2340

GGGATCAAAG AAATATTAAT TATAACAACA CCCGAAGATC AGGAAGGATT TATTCGTCTT 2400

TTAGGTGATG GAAGTCAATT TGGAATTGAG TTGAAATATA AAATTCAACC TAGTCCTGAC 2460

GGGCTTGCAC AGGCGTTTAT TTTAGGGGAA GAGTTTATTG GCAATGATTC AGTATGCTTA 2520

GTTCTCGGCG ATAACATCTT CTTTGGACAG AGCTTTAGCG CGAAGTTAAG AGCTGTAGCT 2580

GAGCGAGCAG AAGGTGCAAC CGTTTTTGGA TATCAGGTAA TGGATCCAGA GAGATTTGGT 2640

GTTGTGGAAT TTGATGATAA TTACAAAGCT ATATCTATTG AAGAAAAACC TGAAATCCCC 2700

CTTTCTAATT GGGCGGTAAC TGGACTATAT TTTTACGATA ATTCAGTAGT TGAGATAGCA 2760

AAAACTATAA AGCCTTCTAA ACGCGGAGAA CTGGAAATAA CGACCATCAA CGAGTGTTAT 2820

TTAAAAATGG GGAAACTAAA TGTAGAATTA CTGGGGCGGG GATTCGCGTG GTTAGATACT 2880

GGCACTTATG ATAGCTTAAT TGAAGCGGGC AGTTTTGTTG AAACAGTGCA GAAAAGACAG 2940

GGTTTGATGG TAGCATGCCC GGAAGAAATT GCATGGCGAA ACGGTTGGTT GAGTAATAAT 3000

GAATTACATC AGCGAGGTGC ACTTTTGAGT AAAAATAATT ATGGTCAATA TCTTTTAAAA 3060

orf2终止

TTATCAAAAC ACGAAAGATG ATCTTCAAAA ATGGCTGTGT TAGTATTTAA GTTAGACCAT 3120

ATATAATCTA AGATAAATAT TCACATTACA GCCATTTCCA CTTCTTCTAG GTTGAGTAAA 3180

orf3起始

ATGGGATGTA CAACGAATCA AAATTTGATT TATAAAAGTC GTGTTAGTGT TGGTAGCGTG 3240

ATTGTACTTT TGGTGTTTTG CATATATCTA TTCATGCCTC CAATGATTAT GGTACTTCTT 3300

TCTCAATCAT CATTGTCAGC AGGGATGATG GTAGTCGCTA CGCTATTACA TATTTCGTTC 3360

GCTCACTATA AAATATTAAA TTATAAAATA TTAACTGCTG TGTTGTTAAT ACTCATTTAT 3420

GGGACTGTCT CAACATTTTA TAGCCCCGAT ATGAAACCAC TTTTCTCTGC GATAGCTTTA 3480

ATATATATTT ATACTGCCAC AGTAAAGTTT TTGAAATATT TACAAGAGAT ACACGATTTA 3540

GATGCAAAAA AAGCAATATC ATGGCTCTAT TATATAATGA TTATCATTGG GATAATGGGG 3600

GTGGTTTTTA ATATAAGATT TGGGAATTAT GCTGTTAAAA ACTATCCCGT TTTTCCATTT 3660

GCAGAGCCAA GTCACTTTGC TCTTGCATAT GCGCCCATAG CAATATGTTA CCAATTATAT 3720

TATTGTTCAA ATAAGTTCCA CAGTTTTCGT ACGATTGGAA TAAGTTTATT GTTAGGTGTC 3780

TTGTACCCCA ATTTAATACT AGTTATCATT GGTTGTTTAC AATTTTTGAT CTTACCTAAA 3840

AGATATTCGG TACCACTGCT TTTTATTTTA ATTGCATCTG TGGCAATGTA TATAATAAAG 3900

GCAGGTATGC AAGCTATTGA CTATTTTTAT TACAGGATTT TTTTTGATTA TTCAAACTTA 3960

AACCTTTCAA ACTTAGTATA TCTGCAAGGA TGGGAAGCTG CTTGGATTGC CTTAAAAGAG 4020

ACCCGGCTAT TTGGATTGGG TTTTCAGCTA AATGGTACAC AAAGTGCTGG TTTTTTTACT 4080

GACCTGATAA ACTCCATTAA TAAAAGTGAG TTGAACCGCC TTGATGGTGG ATTCCTTGCT 4140

TCCAAACTTA TAAGTGAGAC AGGAATAATA GGTATATTCT TTGTGCTATT CTTAATTTTC 4200

AAGGCAGTGA AAATAATTTT TATAAATAAA AAATACCAAT TTAGTTTCTA TAACAAACTC 4260

TATTTTTCGA TTATGGTTAG CTTACTTGTT GAGCTAATCT TTAGGGGATA TGGATATTTC 4320

TCTCCTACAT TTATTTTGGC GCTATCTTTT CTTTCAATAC CTAACACTGT ATGTCGAAAC 4380

orf4起始 orf3终止

GAGATAACTA CACATGAATA AGAAGAAAAC AAAAGTGGTA ATATCTGGTG TGAATATTGT 4440

TGAGGGTGGG GCATTAACCA CATTCCAAAG TATAATAGGT GCTTTTAGCA AATTTGAAGA 4500

TATATCATTA GTATGTTTAG TTAACTCAAA AAAACATTTT TGTAACTATA ATATTAGTGA 4560

TATTGAGTTT ATAGAATATC CATTAATAAA AAAACGCTGG CTGCGTAGGA TAAAATTTGA 4620

ATATTATGAT TGTAGGAGAA TAAGTAAAGA AATCAAGCCT GATATTTGGA TTTCAATGCA 4680

TGACATGACC CCAACAGTTA TATGTAAAAA TCAATTTGTC TATTGCCATA ATCCTTCACC 4740

ATTTTATCAG AGTAAACTCT TTGATTTAAA AATGGATCCT TCTTTTTTTA TATTCACTCT 4800

TCTGTATAAA TATCTGTATA AAATAAATAT CAGAAAAAAT AAAGCAGTGA TTGTCCAGCA 4860

AGATTGGCTA GCCCATGCTT TTAAAAAATG GTACGGCGTA AAAAATATTC TGGTTTCAAA 4920

ACCTGAAGAA AACGATATAA ATAATATAAG TTTAGGCTGT TCAGAGCAAA AATCATATGG 4980

CACCTATTTT TATCCTGCAC TAGCCAGGAC ATTCAAAAAT TTTGAAGTGA TAGGGGAGGC 5040

CGTTCAAATG TTAAGTACTC GAAACCCTCA GGCTTATGCT AAGTTAAATA TCATACTTAC 5100

AATTGATGGC GAAGAAAACA AATATGCAAA CTATATTTAT AATAAATACT CTCATCTTAA 5160

AGCTATAAAT TTTGTTGGGC GATTAACACG TAATGAAGTC AATGAGTATT ATTCTAAAGT 5220

TGATGTTTTA CTATTTCCCT CTAAATTAGA AACGTGGGGG CTACCGATTT CTGAGGCGAA 5280

AATGAAACAT TTGCCAATGT TAGTTGCTGA CTTATCATAT GCGAAAGAGA CAGTAGGAAC 5340

ATATGATAAA GTAACATTTA TTGATATTAA CGACCCAAAC GCATTGGCAG AGTTGTTTGA 5400

GCGATGCATT ACTGGGCAAC ATCGTTTTGA AAAGTGCAGT TATGTGCCGA ATGAAGACTA 5460

TATTCATAGT AATAGTTGGT CTGAACTTGC TCAAAATATT TTAAATAAAG CATGTTCAAA 5520

orf4终止 orf5起始

ATTAATTTAA GAAGGTGCTG AAATTATGGC TTTTTTATCA ATAGTAATTC CAACCCGCAA 5580

CAGACCTCAG TATTTGGCAA GGGTTGTGGA GTTAATAGCA TCAAACACAT GCGAAAGTGA 5640

AGTTATTGTT GCAGATAATA GCGATAATGA TTCATTGAAA GATAAATTGA AAAAATACAC 5700

TGAATCTGGT TTGGTAAAAT ATTATTATAC ATCTGAAAAT TTAAGTGTTG TAGATAATTT 5760

TGAAAAGGCA TTAGAAAAAG TAACTGGGAA ATATATTATT TTTCTAGGAG ATGATGATGG 5820

GATTGGTCCT CAAATAGAAA ACATTGCTCA TTGGATGGAC GACAATCATG TTGATGCTGC 5880

ATTTTCATAT TCAGATAAAT TCTTGGTAAA TTATTATTGG CCGGGTGTTA AATCTAAGTT 5940

TTTTGATGAT AAATACTCTT CGCGCATTTT TATTTCAAAA TTTGATGGCT CTGTACAATT 6000

TATCGACTCG ATAAGTGCGA GAAGTGAAGT TAGAGATGCT CCGGGAACAG GACTTAATAA 6060

CTTACCCAGA ATTTATCATG GTTTGGTTTC TTTTAACTTG ATAGCAAAAA TAAAAGCTAA 6120

AGGTAATCTC TTCGGTGGAA TTAGTCCTGA TATATTTAGT GCTTATCAAA TTGCCACAGA 6180

AGCAAAAAAA ATTGCCAAAA TTAATTATCC ATTCGTGATA CCAGGCGGAT GCAAAGAAAG 6240

TACTGCTGGC CAAAGAGCTG CAAAATCTGA TAATGGAAGT CTGGCTGAAA CCGAACATAC 6300

AGCACGTTTT GGTAATTCAC TTGTATGGGA TTCAAGAATC CCTCAGTATT ATTCTCCCTA 6360

TAATGTTTGG GCATATTCAT TGCTAAAAGC TGTTGAGCGC ACTGATGGAA AAGTTAATGA 6420

CTTCAATTTC TATCGCCTTT ACGTAATATC ATATCTTCGT TATAAGAATT TCAGATCATA 6480

TACATTAAGT GCATTATCTG AGGCCTATAA AAAACCTTCA TTGGCAGGCT TCATTAAGGC 6540

ACTTTTTGCT GAGTTTAATT TTTTTGTTAA TCGTGTAACG AATAAAATAT TGAAAAATAA 6600

AAAGGAATCG ATAGCTGCGA GTGATATCAT TAAAGCATAT GAAGTGTTAG ATTCTTTCAT 6660

orf5终止 orf6起始

TAATAAAAAT AATATCAAAA TAAAATATCC TAGTCAGCAA GGAAATTAAT GTAATGATTG 6720

AATTATCTGA ATGTACTGAG ATAAGCAAAG AATTTGAAAA GATTGCATGG AATGAATTTT 6780

TTGTAAAACG AAATAGAGGG ATATCTCTCC AATACCACTA TCCTTTTTTA TATAATAAAA 6840

ATAAAAATTA CGTCAACATT ATAATAAAAA TATCAGGTGT TACAGTAGGA GGGTTAATAC 6900

CTCAGTTTAA ATATATCGAC AACATTGTTT ATGGTTCTAT AGGTTTAGTA TGTATTAAAG 6960

ATGAGTATCG AGGCTTAGGG TTATTTAACA AGTTATTTAT ATATACTCTT GCATATGCAA 7020

AAGAGAAATA TATTCATAAG TTAATTCTTT GGACTTCGAA GCATAGTTTA TATGAGAAAT 7080

TTGGGTTTCG TAAAAAAATT CAAGAATATT TATATATTGA ACCCACTTGT TCAGAAATGA 7140

TGAGTTTCGA AAAATATGAA AATTGTTTTA CCGAATTAAG TGAAACTAAT AAACCTCCAT 7200

TTGTAAAAGA ATTTATTCGT GTTCAAAGCG GAAATCATAT CGCTTATCTT TTTCAAGATG 7260

CTAATGGCAT TTCGGTATAT GAATACAAAG GGAAGGTAGA AAACGTTTTA GATATGATTA 7320

AAGCATTTTT ATCTAAGCCG CTAAGAATTT TATTGTCAAA AAATGATGAC TTGTTTCAAT 7380

TAATTTTAAA AGAAGTTACA AGTGCTAAAC TCAAAGAAGA TGACACTGAA ATGTGGTACA 7440

orf6终止

CAGTTGACAA AAAAATTGTT GATGTTAAAA CACCTCATAT AGCATATATT GACAGAATAT 7500

orf7起始

AAGGAATAAG CATGTTACCT TTAGTTAAAG TTGGAATGCC AGATAAAGAT ATTTTAATTC 7560

CTCGAATTGA AGAGGTTCTT TATAGTGGGT TTATTGCTGA GGGGGAAGCT GTATATGAAT 7620

TTGAAAGGCG TTTCGGAGAG CATTTTTCAC TAGGGGACAA TGTGCTTGGA ATGTACAGCG 7680

GAACAGCTGC GTTACATACG GCTTTGATTC TTGCAGGTGT AAAAGAAGGT GATGAGGTTA 7740

TTACTACCAG TATGACTGCT GAGCCAACAA ATTTAAGTAT ACTTCAGGCT GGTGGAAAAC 7800

CTGTGTTTGC CGATGTTGAT GTCTTCTCGG GTAATCCTTC TCCTGAATCA ATTAAGGAAA 7860

AGATCACTAG TAAGACAAAA GCTATCCTTG TAGTGCATTA TGCTGGTATC CCGGTTAGAT 7920

TGAAAGAGAT TTCTAAATTA GCAAAAGAGA ATGGCTTAAA ATTAATTGAG GATTGTGCCC 7980

ATGCCCTCGG GTCCAGATAT GATGGATTAG GAATAGGCCA GTTTGGAGAT TATAGTATAT 8040

TTTCTCTTCA GGCTATCAAA CATATGACAA CTGTTGATGG TGGAGTTCTC TACATTAAAG 8100

ACAACGAGCA GATTAAAAGA GCAAAAAAAA TTAGATGGTT TGGTATGGAG AAAGGAGTTG 8160

CCCGAACTGA GGTTGATATT ACTGAACTAG GTTATAAATA TAATATGCAT AATGTTGCAG 8220

CCTGTATTGG ACTTGCACAA TTGCAATGCG TTCAGGAAAG AATACAGCGT CATATAGATA 8280

ATGGTAGATA TTTTGATTCC GTAATTACAA AAATTCCTGG GCTCGATGTT CCAAAATTTG 8340

ATGCTGTAGC TTCCCCATCA TACTGGTTAT ATACAATTTT TTCAGATGAT TCTGATGATA 8400

TTCAGCGCAA ACTAGATGAA GTAGGGGTAA TGGCTTCAAA ATTACATAAA CCAAACCATA 8460

CTCATGCTAT ATTTTCAAAT GAAAATATTA AGTTACCAAA TCTTGAGCAT TACTACGAAA 8520

AAATGATTCA TATACCTTGT GGTTGGTGGG TTGATAATGA AGCTCGTGAG ATGATTGTTG 8580

orf7终止 orf8起始

AAGCCTTAAA AAAGGGTTGA TGTAAATGGC AATTTCATTA TTCAATGCTT ACTACGACAA 8640

AAGTATGGGG GATTTGACTA ACGAAATTCT AGCGAGTGGT CAAATTGCTA ATGGTAAATA 8700

CGTTGCCTTA TTTTCAGAAA GCTTTGCCAA AAAAAATGGA AATAGTCATA TCGTTACTAC 8760

GGATAATATG ACAAATGCTA TGGAGTTAGC CCTAAAAATG AGTGGGGTTG GACCTGGTGA 8820

TGAAGTTTTA ACATCGCCTT TTTCTTGTAT GGCCTCTAAT TCACCTATTG CTACACTGGG 8880

AGCCACACCT GTTTGGGTAG ATCTTGCTCC AGGATCTACT TGTATCAATA TAGATGAAGT 8940

TGAAAAGCAG ATCACCAAAA GAACTAAGGC ATTGATTTTG TATCATTTGG CTGGTTATGC 9000

TAATTTAGCC GAATCAGCTG TAGCATTATG TAAAAAATAT GGAATAAAGC TTATTGAAGA 9060

TTGTAATAAC TCCTATTTTA CAAAAATAGG CAATAGGAAT GTTGGGACTT ATGGGGATTT 9120

TTCTGTTTAT TCTTTTTATC CGAATCGATT AATTAATACT ATCGATGGTG GTGCAATTTC 9180

TGTCCGAAGT GTAGAAGACT ATGTTTTGGC AAAAAAAATG ACTAAGTATG GTCTTGATCC 9240

CCAAACTTTT CGAGACTCCA CAGGAGAAAT CAATCCTCAA AGTGACATAC CTCATATACG 9300

GCGGACGATC GGAATGAATA ATTTATCATC CGCACTTGGT TATAGTCAGC TTTCTTCCGT 9360

TGATGCAAGA ATACAGCGCA TTAAAATAAA CGTCTCATTA CTTTATGAAT ATTTCTCAGA 9420

GAGAGATGAT GTTCATATTG TTAAATCTTC AGATAATTCT AATAATGTGA ACTGGGTATT 9480

TTTTATTCAA GTAAATAAAC GTAATGAATT GCTGAAAACT CTTAAATTAA ACGGAATATT 9540

TGCTTCAAAA CTGCATCAGT TGAATAGCTG TTATACGGGC TTTAAGTCAA AAGAAATGGC 9600

CATTCCCAAT GCAGTAAGGT TGCAAAATAC GCTAATAGCT TTACCTTGTG GATGGTGGCT 9660

TGATGAAAAT CAGATTCATC ATATGATTGA TGTCATTAAT GATAGTTTAG GTTTGGTAGA 9720

orf9起始 orf8终止

ATCTGGTAGA TGGATTGATG ATTAATGAAA AGCTAAGGAA ATTGTTTGGG TTAGGGCTAC 9780

TTTTCTCAAG TAAATTAGGC GGACTGGTTG TCGCCTTATT TTTGGTGCCC ATTTATAACC 9840

ATTATATGAG CAATGAAGCT TTTGGATTCG TGACTTTATT TTTAACATTG CAATCGCTCG 9900

TATTATTGCT CGATTGTGGA GTAACTATTA TTCTCTCTCG ACATACCGCG CTTAATGTTT 9960

GCAAGAAAAA TAAAATATCG AATAACCAAT GGTATAACAC GGAGGTATTT CTTACTATTT 10020

TATATTTATT GTTTGGGTTT GTTTTTTTTA TCTTCAAATG GTTAGGGGTT AACTGGCTGT 10080

CATTAATTAG TTATACAGAT CTTTTGATGA TTATTGTGGC TCTTTGGGCT ACGGTTTTGC 10140

AAAATATATG CTTAACAGTT TTGTTGGCGG GGAAATATTT CTCTTTATCA AGTGTGTTAC 10200

TTATATCTGG TAACCTTTTA AAGGCAGGAG GCGCTGCTTT AATCGTTAAA TATTTTTCTC 10260

CAACAATTGG GGCATATGTA GCAACTCAAG CTCTGCTTGG TATATCATTA CTTTTTGTGA 10320

CTCGATTTTT CTGCGATTAT TTTTTGTTTT TTAAGGATGT GAAAAGGAAA ATTGATTTCA 10380

ATGTCATAAA AAAAATAATA CATGAGGGGC GAGCATTAGT TATATTTAAT ATTTCTGCCG 10440

CTGTTTTATT AAATCTTGAC AAAATAATTG TATCTCACAA TATATCACTA ATTGCGCTGG 10500

CCCCCTATTT TTTAGCAAGC TCATTATGTA TTACTCCTAT ATCTGCATTG TCAGGTCCTG 10560

TAATGCAGTT TTTCCAACCC GGATTAACAA AAGCAATCTT TAATGATTCG CCAAATGTTA 10620

TTAAGACATT ACGGGTATAT ATATCGACTT TGTGTGTGTC GACACTTTTA CCTTCTTATA 10680

TCCTTTGGGT GTATCGTGAT TCATTAATTG CATTATGGCT TGGAAATACT GAATTAGTTA 10740

ATATTGTCGC AGATTATACG AAGATTTTAC TGCCCGGAAT AGCAATTGGA GGATTAGGCT 10800

ATATTTCTTA TGTTGTATTA ATTGCTATTG AGGATTTTAA ATTCCAAAGT TTTCTGTCTT 10860

TATCTATGAC AGCTATCGTG GTTATATTAG TTGTATTTTT CTCGATGCGA CAAGATATAA 10920

GAAGTATTTG CTACGTCTAT GCTTTTTATC ATTCCCTATC TACTTTATTA ACATGGGCAA 10980

GATGTTATTA TCTCCCCAGA ACCCAAAAAT ATGCGCTGGA AACGGCTAAG ATGTTATTTA 11040

orf9终止

TTATTATGAT TGCTCTTGCT GTTCTTTGCG TATTTTTCAA TCTCATCATT AATAGGATTT 11100

orf10起始

AAAGATGTTC AAAAATAAGC GGTTAATGAT TACTGGTGGT ACAGGTTCCT TTGGTAACAC 11160

TGTTCTTAAG CGTTTTCTGA AAACAGATGT TAAAGAAATC ATTGTTTTTA GCCGCGATGA 11220

GAAAAAGCAA GAAGATATGC GTATTGCTTT AGGTGATTCA AAGGTTAAAT TCTATATCGG 11280

CGATACTCGC TGCTATACAA GTATTGAGCA AGCGATGCGT GGCGTAGATT ATGTGTTTCA 11340

TGCCGCAGCC TTGAAGCAAG TCCCTTCATG TGAATTTTAT CCTATGGAGG CTATCAAGAC 11400

GAATATTCTT GGTACTGAAA ATGTGCTTAA TGCTGCTATT GCAAACAATG TCAAACGCGT 11460

AGTTTTATTA AGTACTGACA AAGCAGTTTA TCCAATTAAT GCTATGGGTA TGTCAAAAGC 11520

TATGGCTGAA AAGGTACTGA TCGCCAAATC ACGGATGATT GATGCTGATA AGGGGCCAGT 11580

TCTGTGCGCA ACCCGGTACG GAAACGTAAT GGCTTCTCGT GGTTCAGTAA TCCCTCTGTT 11640

CATTGATAAA ATCAAGAATA ATCAAGAGCT TACAATTACC GATCCTAAAA TGACACGTTT 11700

TCTGATGTCT TTAGAAGATT CGGTTGACTT GGTTTTACAT GCTTTTGAAA ATGGGCAACA 11760

GGGGGATATC TTTGTTCAGA AGGCCCCGGC AAGTACAATT GAAGACTTAG CTCAGGCAAT 11820

CAAAGGTTTG TTTAACAGTG AAGCTTCAAA CAAAATTATT GGTACTAGGC ATGGGGAAAA 11880

GCTTTATGAA ACTCTTGTAT CCCGCGAAGA AATGGTCAAA GCGCAAGATA TGGGGAAATA 11940

CTATCGAATC CCTGCTGATA ACCGCGATTT AAATTACGAT AAATATATCC TGGATGGTAA 12000

GGTAGAAGCC AACAATATTG ATGATTATAC ATCTCATAAC ACAACTCGAC TTAGTGTTAA 12060

orf10终止

AGAAGTTACT GAGTTGTTGC TAACTTTAGA TTATGTAAAA GAGCAATTAA ATTAATTATA 12120

orf11起始

GGGGCTTTGC CCCTTTTATA TTTGAGGTTA TGTTTTGAAA ATAACTAAGA CACATTTACT 12180

TGGCTGTATA GTGATTGAGC CAAAAGTATT TAGGGATGCA CGTGGTTTTT TTGTGGAAAC 12240

ATATCAAAAA GAAAAATATC AGGAAATCGG CATTACAGAA GATTTTGTTC AAGATAACCG 12300

TTCACGTTCA GCAAAGGGGG TTTTGCGCGG GTTACATTTT CAAACGAATC AACCGCAAGG 12360

CAAGTTAGTT TCTGTTACCT CAGGTGCTGT TTATGATGTT GCAGTTGACC TCCGGCCTGA 12420

ATCAGCTACT TTTGGTTCCT ACTTTGGCTT GGTTCTTTCT GCAGAATTAA ATAATCAACT 12480

TTATATACCG CCAGGTTTTG CTCACGGTTT CTGTGTATTG AGCGATAGTG CGGATTTTTT 12540

ATATAAATGT ACACAATATT ATAATCCAGC TTCTGAAAGT GGTATTCAAT GGAATGACCC 12600

AACATTAAAA ATCAACTGGC CAATTTCAAA TCCTTTTATA TCTGAAAAAG ATTCTACACT 12660

orf12起始 orf11终止

GCCGTCATTC AAAGACTATA TGGAGACCTA CGCTCAATGA AATACACTGT AATAGGCGGT 12720

TCTGGATTCA TTGGTAGTGC AATGTGTAAT TATCTAAAAA ATAATAATAA GAATGTCTTT 12780

ATTCCAGAGC GTGATTATCA TTTTTCTGCA GGTGAAGATT TAGGTATTGT TTTTTATTGT 12840

GCAGGCTATG GCGATTGCAT AAATAATTAC GATAATGTTA TTGACGCTAA TGTTTTGTTA 12900

TTAAGAAAAA TACTTAATAA TGTTAAATTT AAAAAATTAG TTTATGTGTC CTCCACAAGA 12960

GTATACATGA ATGAGAATTG TGCAAAAGAA AATGCTGATC TACTTATATG CCATAATGAT 13020

AATCGTAAAT TATTTAATCT TACGAAGTTA GCGGCTGAAG AAATCTGCAG ATTAAGCAAA 13080

AGAAATGTTA TTATTGTACG TCCATCTAAT GTGTATGGAT TAGCTTTGAA TAGTAAGTTA 13140

TTTCTCCCTC AAATCATAAA AAATGCAATA TTAAATAATA AAATAGATAT GTATGTTGCT 13200

CCTGAGTATA GCAAGGATTA TGTTTCGGTT GATGATTTGG TACATATTAT GTTCGAACTT 13260

GCTCATAAAG AGTTTAATGA TGTTCAAACG TTTAATATAG CCTCTGGGGT TAATACTTCG 13320

GCTGCGCAAA TTGCCGATAT TATCAAGCGA AAGACCAATT GCGAAGTTAT TTGGCATGAT 13380

GTTAATATTC AAGAGAAGTT CCCCGTAACG GATATAACAA AAATTAATGA GCTTGTTGCG 13440

CACAATTATA GAGATGTTAT ATCTGATTTG TCGAAAATGA TCGATGTGTT TTATAATGAA 13500

orf12终止 orf13起始

TTGCATTAAA TAATTAATTT AAAATCATGA AGAAAATACT TTTTATTTGC CCTAGTTTTT 13560

TTAAGTATGA ATTGGAAATT TATAAAGAAC TTTCTTTGAA TTATGAAGTG GAATATTGGG 13620

ATGAAAGACC TAAAAATAGC ATTATATTTA AGGTTTTACT TCGGCTAAAG TTTCGACCAT 13680

TAATTAAAAA AGCTATCAAC CAGTATTATA TTAATCTGCT GAATAACATA AATGGAAAAC 13740

ATTTCGATTA TGTTTTTGTT ATAAATCCGG AAGCTCTAGA TTATAATACT ATGAACAAGC 13800

TTAAGCAGAA GTGTTTAGGT GTTAATAAGC AATGTTATTT TGTATTATAT CTTTGGGATT 13860

CACTGAAAAA CAAACCCAAT GCTCCTAAAT TGTTTCCTTT GTTTGATAAG GTTTCAACAT 13920

TTGATCGCAA AGACTCGGAT GACTTTAATA TAAATCTAAT ACCTTTATTT TACACTCGTA 13980

AATTTGATGC AAAGTACTAT CCAGTACAAC CATTAAAGTA TGATGTTTGT TTTATTGGAA 14040

CAGCTCACTC AAACAGGTTA AAATATCTTG ATGAAATTTT AAAGATTATA AGCAACAATA 14100

AACAAATCTC AAAATATATT TTTCTTTTTT TTCCTAGCCG CATGCTATTC TTAATCAAGA 14160

AGTTGTTCTG TAATTCAAGT ACTAAGCACA AAATTTATTT TGAATCGCTG CCATCAGCAA 14220

AAGTTGTCGA TGCTATTCTT TCATCAGCAG TCGTAATCGA TATACATCAT CCCTCGCAAC 14280

ATGGCCTAAC AATGAGAACT ATTGAAGCCG TAGGTCTTAA CAAAAAAATA ATAACAACTA 14340

ATGCTGACAT TAAAAAATAC GATTTTTATG ATCCGAAAGA TGTGTATGTC TATCAATCTG 14400

GTGACAGTAA ATTACCTGAT GTTTTTTTGT CAACGTCAAC AACTAATTTT AAGAATCGTG 14460

orf13终止

AGATGTATTC ACTCAAATGT TGGGTTGAAA ATAATTTAAA AAAATAATAA GTTACTGAGG 14520

orf14起始

TATGAAATGG CAAAGTTAAA AATGGATATT CTTAGATATA AGCTTTTATG TGGTGATGAG 14580

ACTAATTTAA AATACCGTGA TTATCTAAAA ATTTTCTCAC CAAGATTATT TTGTGTCTTC 14640

CTGTATCGAA CTTCAAGTTT TTTCTATCAA AAAAGAATGA AACTACTTTC TAAATTTTTT 14700

TCATTAATTA ATTTTTATTA TTCAAAGTTG AAATTTCACC TCTATGCTCC ATTGGTGGAG 14760

GGACTTTTTT TACCGCATCC TATAAGTATA GTAATCGGTG CGAATTCAAT AGGTGAAAAC 14820

TGTACGATTT TCCAGAACGT AACTATTGGA GCGAAAACGC TTGATATTGT ATATAATCGT 14880

AATGTAAGAC CACTCATAGG TAATAACGTT ACTATTTCAG CCGGTGCTGT GGTTGTGGGG 14940

CCAGTTGCTA TAAATGATAA TGTTTTTCTT GGTGCTAACT GCGTTGTTGT CAATAGCATT 15000

orf14终止

GAAAGTGGTG TAATAGTTGG TGGTGTACCT GCCAAAATTT TAGGTAAGCT AACCTTATAA 15060

AATAAGTTTT TTATTACAAT AATTTTTGAC CTGAATTTTA ATTAGTAATT AGTATTTTCA 15120

TTGTTTCGCT AATCTCTCAT GAGAAAATAT ATTCATAAGT TACTTTTAGT TAACATTCAC 15180

CTCACAATTT TCATCGTGAG TGTTTGAAAT ACCACCCCTG ACAGGAGTAA ACAATGTCAA 15240

AGCAACAGAT CGGCGTAGTC GGTATGGCAG TGATGGGGCG CAACCTTGCG CTCAACATCG 15300

AAAGCCGTGG TTATACCGTC TCTATTTTCA ACCGTTCCCG TGAAAAGACG GAAGAAGTGA 15360

TTGCCGAAAA TCCAGGCAAG AAACTGGTTC CTTACTATAC GGTGAAAGAG TTTGTTGAAT 15420

CTCTGGAAAC GCCTCGTCGC ATCCTGTTAA TGGTGAAAGC AGGTGCTGGC ACGGATGCTG 15480

CTATTGATTC CCTCAAGCCG TACCTCGATA AAGGTGACAT CATCATTGAT GGTGGTAATA 15540

CATTCTTCCA GGACACCATT CGCCGTAACC GTGAGCTTTC TGCCGAAGGC TTTAACTTCA 15600

TCGGTACCGG TGTTTCCGGT GGTGAAGAGG GCGCGCTGAA AGGTCCTTCC ATTATGCCTG 15660

GTGGCCAGAA AGAAGCCTAT GAACTGGTTG CTCCGATCCT GACCAAAATC GCCGCAGTAG 15720

CTGAAGACGG TGAGCCATGC GTTACCTATA TTGGTGCCGA TGGCGCAGGT CACTATGTGA 15780

AGATGGTTCA CAACGGTATT GAATACGGTG ATATGCAGCT GATTGCTGAA GCCTATTCTC 15840

TGCTTAAAGG TGGCCTGAAT CTCTCTAACG AAGAACTGGC ACAGACCTTT ACCGAGTGGA 15900

ATAACGGTGA ACTGAGCAGC TACCTGATCG ACATCACCAA AGACATCTTC ACTAAAAAAG 15960

ATGAAGACGG TAACTACCTG GTTGATGTGA TCCTGGATGA AGCGGCTAAC AAAGGTACCG 16020

GTAAATGGAC CAGCCAGAGC GCGCTGGATC TCGGCGAACC GCTGTCGCTG ATTACCGAGT 16080

CTGTGTTTGC ACGTTATATC TCTTCTCTGA AAGAGCAGCG TGTTGCCGCA TCTAAAGTTC 16140

TCTCTGGCCC GCAAGCGCAG CCAGCTGGCG ACAAAGGTGA GTTCATCGAG AAAGTTCGTC 16200

GTGCGCTGTA TCTGGGTAAA ATCGTTTCTT ACGCTCAGGG TTTCTCTCAG CTGCGCGCAG 16260

CGTCTGAAGA GTACAACTGG GATCTGAACT ACGGCGCAAT CGCGAAGATT TTCCGTGCTG 16320

GTTGCATCAT TCGTGCGCAG TTCTTGCAGA AAATCACCGA TGCTTATGCC GAAAATCCGC 16380

ACATCGCTAA CCTGCTGCTG GCTCCGTACT TCAAGCAAAT TGCCGATGAC TACCAGCAGG 16440

CGCTGCGTGA TGTCGTTGCT TATGCAGTAC AGAACGGTAT CCCGGTTCCG ACCTTCGCTG 16500

CTGCGGTTGC CTATTACGAT AGCTACCGTG CCGCTGTTCT GCCTGCGAAC CTGATCCAGG 16560

CCCAGCGCGA CTATGGCGAT TGTGGCTGCA GGGATCA 16597

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1、一种对大肠杆菌O109型的O-抗原特异的引物对，其特征在于所述引物对选自：SEQ ID NO：1中的9789至9807碱基的正向引物和10686至10704碱基的反向引物、SEQ ID NO：1中的9997至10015碱基的正向引物和10744至10762碱基的反向引物、SEQ ID NO：1中的3410至3429碱基的正向引物和4374至4392碱基的反向引物或者SEQ ID NO：1中的3221至3243碱基的正向引物和3654至3672碱基的反向引物。

2、权利要求1所述的引物对在检测环境中大肠杆菌O109型中的应用。