CN1274826C - 对大肠杆菌o65型的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O65型(Escherichia coli O65)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O65型中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15898个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O65型的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O65型的方法。

Description

对大肠杆菌O65型的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O65型(Escherichia coli O65)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O65型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O65型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1935)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O65 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1935年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152 and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O65型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；Qui3NAc合成酶基因，包括rmlBA基因和orf3，4，5，8基因或与rmlBA和orf3，4，5，8有相似功能的基因；GlcNAc异构酶基因Gne和与异构酶基因Gne有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf7、orf9，orf11，orf12基因。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O65型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O65型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O65型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O65型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O65型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O65型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长15898个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O65型的O-抗原特异的核苷酸，其由13个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O65型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因是：wzx是SEQ ID NO：1中的5036至6286碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的10209至11465碱基的核苷酸；rmlBA和orf3，4，5，8基因分别是SEQ IDNO：1中的1138至2214，22112至3074，3077至3472，3473至3925，3930至5039，7205至9094碱基的核苷酸，；orf7是SEQ ID NO：1中的6294至7202碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1中的9085至10212碱基的核苷酸；orf11是SEQ ID NO：1中的11483至12607碱基的核苷酸；orf12是SEQ ID NO：1中的12604至13413碱基的核苷酸；orf13是SEQ ID NO：1中的13444至14460碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O65型的O-抗原特异的核苷酸，其中它是源于所述的wzx基因、wzy基因以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O65型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5824至5844碱基的核苷酸和6187至6207碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5173至5191碱基的核苷酸和5760至5778碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的10829至10847碱基的核苷酸和11391至11409碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10336至10354碱基的核苷酸和10762至10790碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O65型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O65型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O65型的O-抗原，并成为细菌疫苗。

前述的对大肠杆菌O65型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其中它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测人体和环境中的细菌。

前述的对大肠杆菌O65型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O65型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O65型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O65型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTGGCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bi0-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bi0-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O65型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O65型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到7个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对痢大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy7基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O65型的O-抗原都是高度特异的。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长13805个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由13个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；鼠李糖合成没基因(rmlBDAC基因或与rmlBDAC有相似功能的基因)；甘露糖合成酶基因(manBC基因和manBC基因有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf7、orf8，orf10基因；一个转座酶基因orf4；它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O65型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因寡核苷酸，转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；Qui3NAc合成酶基因，包括rmlBA基因和orf3，4，5，8基因或与rmlBA和orf3，4，5，8有相似功能的基因；GlcNAc异构酶基因Gne和与异构酶基因Gne有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf7、orf9，orf11，orf12基因；它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O65型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O65型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O65型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是SEQ ID NO：1中的5036至6286碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从wzy是SEQ ID NO：1中的10209至11465碱基的核苷酸)源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O65型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O65型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O65型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O65型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O65型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O65型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O65型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O65型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O65型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的JumpStart序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGATTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O65型的基因组作5个LongPCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O65型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1，2，3编码的蛋白与Shigella boydi抗原基因簇中rmlBDA基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf1，2，3编码的蛋白与已知的rmlBDA的共有序列的同源性预期值非常高。rmlBDA负责合成鼠李糖O-抗原中的一种稀有单糖。Orf5和orf4编码的蛋白与沙门氏菌的rmlD和转座酶基因编码的蛋白有较高的相似性。Orf11，12编码的蛋白与Shigella flexneri 2a中合成糖的基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性，orf10，12也应该合成甘露单糖，命名为manBC。

Orf6和orf9是大肠杆菌O65种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。Orf6编码的蛋白与大肠杆菌的O-抗原转移酶有34％的序列一致性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf9为wzx。Orf10编码的蛋白与Salmonella enterica O-抗原聚合酶有25％的一致性，46％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有9个跨膜片段，并且有一个大的(61个氨基酸)胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf10为wzy。

orf7，8，10三个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有24-36％的序列一致性和44-53％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这三个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1和2的共有序列的同源性预期值为1×e^-12至5×e^-17，因此我们推测这三个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆菌O65的O-抗原的寡糖单位可能由四个单糖组成。由于这三个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这四个基因暂命名为orf7，orf8，orf10。

实施例6：特异基因的筛选：

针对大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

表1列出了大肠杆菌O65型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O65型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每8-10个菌分为一组，总共13组，它们的来源都列于表中。

在第13组中含有大肠杆菌O65型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O65型及其O-抗原是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O65型中筛选到对大肠杆菌O65型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O65型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O65型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O65型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇的结构，共由13个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O65型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

                    SEQUENCE LISTING

<110>南开大学

<120>对大肠杆菌O65型的O抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O65型的O抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>15898

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

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acttaaggaa gaagttggat tataaaaaaa ttgtttgttt tagtttaggt gcaaatttca    7140

gaattagaaa agcaatagcc cttggtgtct ttttattaag cttcggaatt attaaggttt    7200

aagtatgtgt ggaattattg gttatataga tttcgacaaa aattcgaatg ctgatgtact    7260

aaaaaaaatg acagactcct tgcaccatag aggaccagat gatagtggaa ttttagacga    7320

agaatttaat aactgtaagg tggggttcgg ccacagaaga ttatccatac ttgatttatc    7380

atcacatgga catcagccca tgacatttat gaatctttct attgtttata atggtgaggt    7440

ttataatttc aaagaaatac gggaacaatt agaaaaagaa cattatgtat tcaattcaga    7500

ttcggataca gaagtgttgc ttaaaggttg gcactgctgg ggggaggatc taatacagaa    7560

acttaatgga atgtttgctc ttgctgtact tgatcgtact aatcaaacgg ttacattatt    7620

gcgtgataga gcaggagtca agcctctcta ttggtatcgt aaaaataatt tgatattatt    7680

ttctagtgaa ttaaaaggat tacacagaca caatgcgttt tctaaagaaa tatcaaaaga    7740

gggagttaat ctatattttc agtatggata tataccccag ccatatacaa tattcgaaaa    7800

tgtttataag ttagagtctg gacattgttt gaaaattgat cttgtaaatc aagcaataca    7860

gaaaaattgt tattggaatg tttttgatta ttatagaaag gaaaagatca aacttacaga    7920

gagtgaagct atcgtaaaat gcgaaagttt attaagctct gcctgcgaat atcgcatgat    7980

cgctgatgtt cctgtcggtg ttttcttaag tggtgggtat gattcctcta tagttgctgc    8040

attgctacag cgcaataatt ctaaaaaatt aaagacattt actataggct ttaaagaaaa    8100

gtcatataat gaagctggtt atgcaaaaga tatttcaaat tatctaggta ccgaacatac    8160

tgaatattat tgtacgagtg atgatgcttt aaatatactc cctcttcttc ctgatatttg    8220

tgatgaacca tttgcggatc catcaattat ccctacaata cttgttagta ggttagcgaa    8280

aaaagatgtt acggtttcat taagtgcgga tggtggggat gagctctttg ctgggtatga    8340

taaatatact ggtattaaga aaaaaattga tatctttaat ataataccta atatggctta    8400

tccaggaatt agaaaaattc ttgagactaa attagcacat aaggcgtttg aatatgccgg    8460

ttatactgat gtcaataatc gcctatttcg attagcacaa atgatagggc aagatgaagt    8520

tagaatacta aaatcagcat ctatcatttt ttctgattta gagcttaatc accttttagg    8580

cggggcagat gaaatctata ctggattcga tgatcgtttg aatagcaact ggctcgataa    8640

tttgctggca attgattaca aaacctatca ggttgatgat attttattta aagttgatcg    8700

agcaactatg tcttgctctc ttgaaggaag agaaccgctt cttgatcata gactaataga    8760

atttgttgca aggttagagc ccgagttaaa aataaaaaat ggggacagaa aatatatttt    8820

gaagaaaata gcccataaat atatacctca atcattgtta gatcgtccaa aacaaggatt    8880

tggcatccca ctttctgagt ggctaggtgg gcaattaaaa aattatgttt cttattatct    8940

taatcccaaa agaatagctg agtctggaat attaaatcct gtttttgttg attcattatg    9000

tcgagattat tattctggaa atataaataa agttaatttt aaaaaaatat gggttttatt    9060

aatgtttgaa atgtggagag aaaaatggat gtaaagaaca aaaaaataac tatttttatc    9120

agttcgctac gtccgggggg ggccgaggga gtttgtgtta cagttgctaa tggactcgtc    9180

aaacttggtt gggatgttac aattgttgta cttaatatga taagagcgac tcatcaacag    9240

aggctcgata catcaattaa tatcgttaat ctgaattgca ggcacgcacg cgaagcaata    9300

tttcctattt ggagatttct tagttcatca gcctcttcca atttattagt gtttaaccat    9360

caactagcaa ttattctggt attgattaga atttttacta ggaaaaacta tataattatc    9420

tctcgtaata tcaacacatt aagtgttgat ttaaaaaatg caaaaaattt ttggcacaaa    9480

catatcgtta gtttcttaat aaaaagattt tattcaaagg ttgaacatat aatagcacaa    9540

tcacatggaa tgaaagatga tcttattaat ttcttgaata ttaatgcaag taagatatct    9600

gtaatccata atcctgttaa tccttatttt tctgattttg ctaaagcaat aaaatggaat    9660

gattatgata aggatggatt tatattatgt gtgggcagac tggaaagaca aaaagctttt    9720

cattttgcgg ttgatatttt ctcgaaagtt gctgagaaaa gacaagattt gaatctgttt    9780

ataataggtg aggggagttt gagacaagag ctagaagatt atgttagcag gcttaaagtc    9840

actagaaaag tcaagtttct tggactaaga aatgatcttg agaaatatta tagtaaagcc    9900

tctgtggtgt tacttacttc cttatatgaa ggatttccaa atgtattagt ggaatcatta    9960

acattgggaa caccagttgt ggcatttgat tgccctaatg gaccgaatga aattataaat   10020

tctaataacg gtttgcttgt taattataaa gatgtcaatg acggagtcga aaaattaaat   10080

aaagcattga gtcaagaatg ggattatgtg gaaattgcaa aagctgcaag tatatatagt   10140

gaggaatata ttgttaacat ttattccgat gttttaaaac agacatttta ctcaacagaa   10200

cttttaagat gatatacttt acagttttag tgatgttgtt catattaggt gtactcagtt   10260

taattaaaaa aagcaatctg ttttcacctt caatattatt tcctttagtt attgttacaa   10320

ccttacttcc cagcttactt ctgccaagtg ttttttatac accgtcagta tattctgttt   10380

tgtatatatt tgtttgtaca acttcttttt cttttttctc atttctattt gaacaaataa   10440

atattaaatc aaagttgtct tgcaatgtat tatctttcaa tatgtctggg tattatttta   10500

ttgcttttgt tacatttatt ttgtgttttt taatgcttga tgaattttta aacaaaattg   10560

cagggtttgc aaactttgga gcatatgccg aatattatag agctgcctca acatctggtg   10620

aagatgatct aaaggatagt gtaaattatt tagtaagaaa tgctgatatg ttagcattac   10680

cattatctgt aattggattg tatatttggt caacgcgtag agtatcaagc atatttaaaa   10740

taaccgttgt gatctttata ttgttctctt taacccttcc tattattagc gtcgctcgtt   10800

caggtgctat tagagcttgc attgttctac ttggcgtgtt tgttatattt tttcgattta   10860

ggttgaaatt tgccattctt gtattaagtt ttgttgatgc gttatatgtt ggcgctggtt   10920

ttatgtttgg ctatggttct ggtgggtatt catctttttc agaatctata gggtatttct   10980

tggtatcctt tatccggtat ttatctggtg gttattatac atttgattca tatttgcttg   11040

gcaaggttga tattttcttt agatttgcat tcgtagatag cattcttggt aaaatcgata   11100

caacgttgac tttagctggg atggggggta agtgtattgt ctgctaccca gaaaatcatg   11160

ctgagtttgt ccaggttggt ccagctgaaa acttcgtttc aaacgtctat actgtattcg   11220

gtgttgtatt tagcaactta ggttggctag gagtatttta ctttagctta tgcggtgcaa   11280

ttatgggctc actttacaaa gctatgaaaa gcggtagagt cttttttgca attgtatata   11340

gtttcctttt acctggagta gtccttgcgt catttagtga atattttttt gctcaaatcc   11400

cgctactaat aaggttcatt ttgttatata tgattttatt taaattgtct gctcataaaa   11460

aataaactgg agggatttta aattgaaaaa aaaagttctt tacgttgtgt caacactaaa   11520

aaggtcaggg ccaattaatc aattatacaa tttgatcaat aatttctcga aatatgaatt   11580

tgatttgacg attgtaactt tatcgcccga accacaagac tcaaaattag atgatttcat   11640

taacttgggt attaatgtta ttactcttgg gcttagtaga ctcaaggggg tattttttgc   11700

caaacataaa ctaaaaaaga taattgataa aattaatcct gacattgtcc attctcaggg   11760

ggttagagct gattatttaa attatttaat tgttggcggc catatgaaaa ttagcacaat   11820

tcataattat ccgcaaaaag attttattaa aagatatggc cctattgttg gtaccgttct   11880

ggttaagatt caaataaatg ccataaagaa tttcgatatt gttataggtg tttctaaagc   11940

tgttgctaaa aatctaatta gtacttacaa gattaaagat gcatatgcag ttattaatgg   12000

tatagatact gatatttata aacctaaatc cagcaccgat aaaagtaaac taaaagaaaa   12060

actgggtttg gctaaatatg attgcatatg gatatctact gggcatctta gtgtattaaa   12120

acaaccggag attctaatta aatcgttttt aaaaaataag aatgatgctc gttttatcaa   12180

tagtgttttt atttttttag gggatggaga gctcagtgag tctcttatta tgaaatacaa   12240

acatgaaaaa aaaataatat ttgcaggtcg tgttcataat gtagttgagt atttgcaagc   12300

ctccgattat ttcgcatcag catctagtac agaaggttta cctatggcag taattgaagc   12360

attatcttgt gggttacctg tcttattatc aagaattggg cctcatgaag aaataattgg   12420

gcttgatgaa agcattggag tgttattcga tagtgatgac gcatctgaat cattcatgac   12480

aatggttaca aaggataaaa cggcgctttc ccactcttgt cgaagtttgg cgcttaattt   12540

ctttagtgca gaagcaatgg gagctaacta caaagatata tataataaga gtataaaaac   12600

taaatgaaat tttcagtatt aatgtctgtt tataaagatg ataacccttt atatttgaat   12660

caatcaatag aaagcatctg gatacatcaa acattaaaac caacccagat agttctggtc   12720

caagatggtg tattaacaga ggctctctat ggtgttgtaa ataaatggaa acaaaaggta   12780

ggtgattcat ttaccattgt ttcgctagat agaaatatgg ggctgggggc agctttaaat   12840

agagggttat tatattgcaa gtatgagttg gttgccagga tggatagtga tgatatcgca   12900

ttaccagata gatttcaaat tcaagttgaa tatatgataa aaaattgcga gattattgct   12960

tctagtggtt atgttgagga gtgggatgaa gaaatgggta cattattggg tatacgatat   13020

gttccattgg aaactgattc gattataaaa atggcccgtt ttcgctcccc tcttagtcat   13080

cctgcatcaa tatttagacg tgatattgtt ttatctttgg gggggtatcc tgaattacgt   13140

aaggcacagg attttgccct ttggtcttta ttattaaaga ataaatacaa gctatcaaat   13200

ttagggactg ttttagtaaa gatgcgagca ggaaatagta tgatttatag acgtggattc   13260

agccatttga gatatgaaat ggaacttctt aaatatcaac gaatgatagg gtttttacct   13320

tttggtttgt tttgtgttaa ttttgtttta aaggctgggc ttcgtttatc tcccggattt   13380

gtaaagaaga ttgcatataa atttttacgc taatagagcg catgtttaac tcaaggtgaa   13440

tgtatgtcca tcctaatcac aggtggagcc ggttatattg gttctcacac agtattacag   13500

ttactcagga atgagtatga tgttgttgtt attgataatt tgattaattc taatctggag   13560

tctttaaagc gagttgaggg cttagttgga aaaaaaatta cgacttatat aggcgatgta   13620

actgatagta cgtttctaaa aacgattttt gataatcact ctgtcaccga tgttatacat   13680

ttcgctgggt taaagtcagt ttcagaatct attaatgatc ccttgctgta ttataaaaat   13740

aatgtacaag gttctctttg tcttattact gaaatggcaa aggcgggggt ttataattta   13800

atatttagtt cctcagcaac tgtgtatggt tcccctcagt cagtaccatt gactgaaatg   13860

agtccattag gactgacaac aaatccatat ggtacttcta aattaatgat tgagcagatt   13920

ttaagagatt tcactaattc caatcctaat tttaaagtcg tatgcctaag atattttaat   13980

cctgttggtg ctgatccttc tggttgtata ggtgaatccc caataggaac tccaaataat   14040

atttttcctt atttgactca ggttgcgttg ggaaaatttc cctatttatc aatttttgga   14100

gatgattacc caactataga cggaacaggc gttcgtgact atatccatgt ggtagattta   14160

gcattggggc atcttgcagc attaaagttt aaacaaaatg aaacatcgtt tgcagttttt   14220

aacttaggaa ctgggacagg ctattctgtt cttgagttag ttaatacttt tgaagaagtg   14280

acaggaatta agatcccatg tcggatcgtt gggagacggc ctggagatgt tgcggaatgt   14340

tggtcagatc cttctcttgc caaaaaagta cttttttggg aggcgaagaa aactttggtc   14400

gatatggttc gtgatgcttg gaattggcaa caaaagaacc caagtggata ctcatcttaa   14460

ctcataaatg caaactggat tattatttat atttcgtaga gtaacttcaa ataaattttt   14520

atttatgttc tgagcagtct tcgtgacagg agtaaacaat gtcaaagcaa cagatcggcg   14580

tcgtcggtat ggcagtgatg gggcgcaacc ttgcgctcaa catcgaaagc cgtggttata   14640

ccgtctctat tttcaaccgt tcccgtgaga aaacggaaga agtaattgcc gaaaacccag   14700

gcaagaaact ggttccttac tatacggtga aagagtttgt tgaatctctg gaaacgcctc   14760

gtcgcatcct gttaatggtg aaagcaggtg caggcacgga tgctgctatt gattccctca   14820

agccatacct caataaaggt gacatcatca ttgatggtgg taacaccttc ttccaggaca   14880

ccattcgtcg taaccgtgag ctttctgccg aaggctttaa cttcattggt accggtgtct   14940

ccggtggtga agaaggcgcg ctgaaaggtc cttccattat gcctggtggg cagaaagaag   15000

cctatgaact ggttgcgccg atcctgacca aaatcgccgc agtggctgaa gacggtgagc   15060

catgcgttac ctatattggt gccgatggcg caggtcacta tgtgaagatg gttcacaacg   15120

gtattgaata cggagatatg caactgattg ctgaagccta ttctctgctt aaaggtggcc   15180

tgaacctcac caacgaagaa ctggcgcaga cctttaccga atggaataac ggtgaactga   15240

gcagctacct gatcgacatc accaaagata tcttcaccaa aaaagatgaa gacggtgact   15300

acctggttga tgtgatcctg gatgaagcgg ctaacaaagg tacgggcaaa tggaccagcc   15360

agagcgcgct ggatctcggt gaaccactgt cgcttattac cgagtctgtg tttgcacgtt   15420

atatctcgtc tctgaaagat cagcgcgttg ccgcgtctaa agttctctct ggcccgcaag   15480

cgcagccagc tggcgacaag gctgagttca tcgaaaaagt tcgtcgtgct ctgtatctgg   15540

gcaaaatcgt ttcttacgcc caaggcttct ctcagctgcg tgctgcgtct gaagagtaca   15600

actgggatct gaactacggc gaaatcgcga agattttccg tgctggctgc atcatccgtg   15660

cgcagttcct gcagaaaatc accgatgcat acgccgaaaa tccgcagatc gctaacctgc   15720

tgctggctcc gtacttcaag caaattgccg atgactacca gcaggcgctg cgtgatgtcg   15780

ttgcttatgc ggtacagaac ggtatcccgg ttccgacctt cgcagctgcg gttgcctatt   15840

atgacagcta ccgtgccgct gttctgcctg cgaacctaat ccaggctcag cgcgacta     15898

表1大肠杆菌O65型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物	反向引物	PCR产物的长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								Wzx	O-抗原转运酶	5036-6286	5824-5844	6187-6207	584p	0*	56
			5173-5191	5760-5778	605p	0*	55
								Wzy	O-抗原聚合酶	10209-11465	10829-10847	11391-11409	580bp	0*	56
			10336-10354	10762-10790	454bp	0*	54

^*只在大肠杆菌O65型中得到正确的一条带

表2 166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号	该组中含有的菌株	来源
			1、野生型大肠杆菌2、野生型大肠杆菌3、野生型大肠杆菌4、野生型大肠杆菌5、野生型大肠杆菌6、野生型大肠杆菌7、野生型大肠杆菌8、野生型大肠杆菌9、野生型大肠杆菌10、野生型大肠杆菌11、野生型大肠杆菌12、野生型大肠杆菌13、第4组菌株加上大肠杆菌标准菌株	O1，O2，O5，O7，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O19ab，O20，O21，O22，O23，O24，O59O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O35，O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，O57，O58，O60，O61，O62O62，O63，O64，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81，O82，O83O84，O85，O86，O87，O88，O89，O91，O92，O98，O99，O101，O102，O103，O104，O106O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，O138，O139，O140，O141，O142，O143，O144，O145O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166O168，O169，O170，O171，O172，O173，D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B17，B18F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，FX变，FY变，DS，O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，O124O65	IMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSabcdddIMVSaIMVS

^*为了检测的方便，我们将每13-17个菌分为一组，总共13组

a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3大肠杆菌O65型O抗原基因结构图

E.coli O65 O-antigen gene cluster

#orfgalF rmlB rmlA orf3 orf4  orf5    wzx     orf7   orf8          orf9    wzy     orf11  orf12   gne    gnd

％G+C    43   37   31   35    34      28      31     33            32      32      32      34     37

content

表4大肠杆菌O65型O抗原基因簇基因位置

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC      60

GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAACAGCG CGTAAAGCGT     120

CAACTACTGG CGGAAGTACA GTCCATTTGC CCGCCGGGCG TGACTATTAT GAACGTGCGT     180

CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT GGGCCACTCC ATTTTATGTG CACGACCTGC CATTGGTGAC     240

AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGATG ACGCCAGCGC CGACCCGCTG     300

CGCTACAACC TTGCGGCCAT GATTGCGCGC TTCAACGAAA CGGGCCGCAG CCAGGTGCTG     360

GCAAAACGTA TGCCAGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TTCAGACCAA AGAGCCGCTG     420

GACCGCGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG     480

ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG     540

GAACTTGAAC GCACTCAGCC AGGTGCATGG GGACGTATCC AACTGACAGA TGCCATTGCC     600

GAACTGGCGA AAAAACAGTC TGTTGATGCA ATGCTGATGA CTGGTGACAG CTACGACTGC     660

GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTC GTGAAGTATG GGCTGCGCAA CCTCAAAGAA     720

GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG     780

ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CAGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT     840

TGCGAATATT CCTGCCGTTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG     900

GATTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCCAG AGCGGATTGG TAAGACAATT     960

AGCGTTTGAA TTTTTCGGGT TTAGCGCGAG TGGGTAACGC TCGTCACATC GTAGACATGC    1020

ATGCAGTGCT CTGGTAGCTG TAAAGCCAGG GGCGGTAGCG TGCATTAATA CCTCTATTAA    1080

                                                         orf1的起始

TCAAACAAAG AGCCGCTTAT TTCACAGCAT GCTCTGAAGT AATATGGAAT AAATTAA GTG  1140

AAAATACTTG TTACTGGTGG CGCAGGATTT ATTGGTTCTG CTGTAGTTCG TCACATTATA    1200

AATAATACGC AGGATAGTGT TGTTAATGTC GATAAATTAA CGTACGCCGG AAACCTGGAA    1260

TCACTTGCTG ATGTTTCTGA TTCTGAACGC TATGTTTTTG AACATGCGGA TGTTTGCGAT    1320

GCAGCTGCAA TGGCACGGAT TTTTGCTCAG CATCAGCCGG ATGCAGTGAT GCACCTGGCT    1380

GCTGAAAGCC ATGTGGATCG TTCAATTACA GGCCCTGCGG CATTTATTGA AACCAATATT    1440

GTTGGTACTT ATGTCCTTTT GGAAGCCGCT CGCAATTACT GGTCTGCTCT TGATAGCGAT    1500

AAGAAAAATA GCTTCCGTTT TCATCATATT TCTACTGACG AAGTATATGG TGATTTGCCT    1560

CATCCTGACG AGGTAAATAA TACAGAAGAA TTACCCTTAT TTACTGAGAC AACAGCTTAC    1620

GCGCCAAGCA GCCCTTATTC CGCATCAAAA GCATCTAGCG ATCATTTAGT CCGTGCGTGG    1680

AAACGTACCT ATGGTTTACC GACCATTGTG ACTAACTGTT CGAATAACTA CGGTCCTTAT    1740

CACTTTCCGG AAAAATTGAT TCCACTAGTA ATTCTTAATG CTCTGGAAGG TAAGGCATTA    1800

CCTATTTATG GTAAAGGGGA TCAAATTCGC GACTGGCTGT ATGTTGAAGA TCATGCACGT    1860

GCGTTATATA CCGTCGTAAC CGAAGGTAAA GCGGGTGAAA CTTATAACAT TGGTGGACAC    1920

AACGAAAAGA AAAACATCGA TGTAGTGCTC ACTATTTGTG ATTTGTTGGA TGAGATTGTA    1980

CCGAAAGAGA AATCTTACCG CGAGCAAATT ACTTATGTTG CCGATCGTCC GGGACACGAT    2040

CGCCGTTATG CCATTGATGC TGAGAAGATT GGTCGCGAAT TGGGATGGAA ACCACAGGAA    2100

ACGTTTGAGA GCGGGATTCG TAAAACAATT AACTGGTATT TGAATAATAA TGATTGGTGC    2160

                                                   orf2的起始 orf1的终止

CGGCGAGTTC AAGATGGCTC TTATCAACGT GAGCGTTTGG GGGTAATTAG  ATGAAAGGAA  2220

TTATTTTAGC TGGTGGTTCT GGAACAAGGC TTTATCCAAT TACAATGGGA GTTTCAAAGC    2280

AGCTATTACC CATTCATGAT AAACCGATGA TTTATTATCC TTTGTCAGTG CTGATGTTGG    2340

CAGGTATACA AGATATTCTT ATTATTACAA CGCCAGAAGA TCAGCAGGGG TTCATAAGAT    2400

TGCTTGGGGA TGGAAGCCAA TTTGGTGTTA ATCTGACATA TGCGATTCAA CCTAGTCCAG    2460

ATGGTTTAGC CCAAGCATTT ATTATTGGTG AAAACTTTAT TGGAAATGAT ACAGTATGCC    2520

TTGTGCTTGG AGATAACATT TTTTTTGGAC AAGGTTTTAC ACCCAAACTC CGGGATGCAG    2580

CAGAAAGAAC ATCAGGTGCC ACAGTCTTTG GATATCAAGT AATGGATCCT GAGAGATTTG    2640

GAGTAGTGGA GTTTGATAGA AATTTTAAAG CTTTAAGTAT TGAAGAAAAA CCTGCCAATC    2700

CAAAATCAAA TTGGGCTGTC ACAGGATTAT ATTTTTATGA CAATAACGTT ATCGATATTG    2760

CAAAGGGTAT TAAACCTTCT AAACGTGGTG AATTAGAAAT TACGGCAGTT AATGAAGTTT    2820

ATCTCAGAAA TAATAATTTA ACTGTTGAAT TACTAGGGCG TGGTTTTGCA TGGCTGGATA    2880

CAGGAACCCA TGACAGCTTG ATTGAAGCTG GGAGTTTTGT AGAAACAGTC CAAAAAAGAC    2940

AAGGGATGAT GGTTGCCTGT CTGGAAGAGA TAGCATGGCG AAATGGTTGG TTAAGTAAGA    3000

TAAAATTGTA TGAGTTAGGT CACAAATTGA GTAAAAATCA GTATGGTCAA TATCTCATTA    3060

        orf2的终止orf3的起始

AACTTGCGAG  TTGACA ATGA AAATTGAATT ACTACCCTTA CAAATCCACG GTGATAGTCG3120

TGGATCATTG ATATCTTTAG AGTATGCCAT TAATATCCCT TTTGATATAA AAAGAGTTTA    3180

CTATATTTTT AATACAAAAG AAGGTGTTAC TAGAGGTTAT CATGCTCATA AACAGTTAAA    3240

GCAAATTGCA ATAGCCATAA CCGGTTCATG TGATTTCACG ATGGATAATG GAAAGGAGAG    3300

AATTACATTA ACATTAAACA ATCCAGCGCA AGGATTATTG ATTGATTCAT GTATTTGGCG    3360

AGAAATGAGT AACTTTACTC CAGATTGTGT ATTAATGATT TTGGCGAGTA ATGAATATGA    3420

                                               orf3的终止 orf4起始

TGAGTCTGAT TATATTCGTG ACTATGAAGA ATTTAAATTA ATGGTAAAA T AAATGTTTAT  3480

ACATGAGCTA AGTGATGTTC AAACAGAACA TATTGGTGAG AACACCAGAG TATGGCAGTA    3540

TTCAGTAATT TTACCCGAAG CAATAATTGG AGAAGATTGT AATATATGCG CACACACTTT    3600

AATAGAAAAT AAAGTAACAA TTGGTAATAG AGTTACAATA AAGTCTGGCG TATATATTTG    3660

GGATGGTGTA ACTATAGAGG ATGATGTTTT TATTGGTCCT GGTGTGGTTT TTACAAATGA    3720

CAAATATCCT CGATCAAAGA GATACCCTGA ACAATATCCA ACTATAATTA TAAAAAAGGG    3780

AGCTTCAATA GGGGCAAATG CAACTATTTT ACCCGGTGTT ACTGTAGGCG AAGGTGCAAT    3840

GGTAGGTGCT GGTTCAGTAG TTACCAAAAA TGTCGAGCCT AATACAATAG TAATCGGAAA    3900

                     orf4的终止 orf5的起始

TCCAGCTAAA GAATTAAAGA GA TAATGTG A TGATTGAATT TTTAAATTTA AAAAAAATAA3960

ACAATCAATA TAAAGATGAA TTAAAGGAAG CTTGTGCAAA AGTTATTGAT TCTGGTTGGT    4020

ATGTTTTAGG AGAATATCTG GAAGAGTTTG AAAAAGATTA TTCAAAGTGG TGTGGTGTAA    4080

AACATACTAT CGGAGTGGCT AACGGATTGG ATGCATTGTC TCTCGTTTTA CGAGCTTGGA    4140

AAGAAATGGG GATGCTGAAA GATGGAGATG AAATAATCGT ACCAGCTAAT ACCTATATAG    4200

CATCTATTCT GGCCATAACT GCTAATAGAT TAGTTCCAGT TCTAACTGAA CCAGATCTAA    4260

TTACATATAA CCTAAGCCCT AAAAATATCG AAAAAAATAT CACAAAGAAA ACCAGAGCAA    4320

TATTGCCAGT GCATCTATAT GGTAATATTT CTCCAATGGA TGATATTATG GCTTTGGCAT    4380

CAAAATATAA ATTACTGGTT CTTGAAGATA GTGCACAGGC ACATGGAGCT TCAATAAATG    4440

GTCGCAAAGC TGGTGCTTGG GGAAACGCTT CAGGTTTCAG CTTCTATCCA GGTAAAAACC    4500

TTGGCGCATT GGGTGATGCC GGGGCCGTTA CTACTAATGA TGATGAATTA GCGTATGTTG    4560

TAAAAGCTTT GAGAAATTAT GGTTCACATA CAAAATATAA AAACTTATAT GAGGGAGTAA    4620

ATAGTAGACT AGATGAGATT CAGGCAGCAA TGCTGTCAGT TAAACTTAAA TATATCGACA    4680

AAGAAGTAGA AAAACGCAGA ATAATAGCTC GTAGTTATCT AAAAAATATA AAAAATATAT    4740

TAATCAAACT GCCAACAGTA TTAGATGACG AGCGTCATGC GTGGCATCTT TTTGTTGTTC    4800

GAACTTGTCA ACGTGAACGT TTCCAGGCTT ATTTAAGCAC AAATGGCATA CAGACATTAA    4860

TTCATTACCC AACCCCACCA CACCTACAAG ACGCTTACAA AAACAAAAGA GTAACAAGTG    4920

GTTTTTCTTT ACCAATCACA GAAATGATAC ATAATGAAGT AGTTTCTTTG CCTATGGATC    4980

                                                orf6的起始orf5的终止

CGACTATGTC TGATAAAGAT ATAGAGCATG TAATTAGCAC GGTTAATAGA TTTAA ATGAA  5040

TTTAATAAGG ACTTCTTTAT TAAGCGTAAT CTCGACATTT TTTAGATTAC TATCTGCTTT    5100

AGTAATAAAT AAAGCTATTG CCACTTTTAT TGGCCCAACG GGTTTAGCTC TGATTGGACA    5160

ATTTCAAAAC TTTACTCAGA TTGCGCTTGT GTTAGCTCAA GGGGGAATAA ATAACGGGGT    5220

TGTTAAATAT AATGCTGAAT TAATTTCAGA AAATAAAGAT ATAACTATTT TAAATAGTAC    5280

GGCCATTCGA ATCAGCTTGT TATCATCGTT GTTCATAGGA TTCTTAATGG CCATCTTTTC    5340

AAATTATTTA TCAGATTATA TATTTAATAG CCCAAATTAC AGTTATGTAT TCATTGTTTT    5400

TGGCATAACG ATATTTTTTT TTGTTATTAA TCAGCTTTTG TTGTCTATAT TAAATGGTTT    5460

AAAAGAAATA AGGTTATTCA TAGGTATTAA TATATCGCAA AGTATTTATA GTTTAATATT    5520

TACATCTTTA GCAATACTAA CATATGGATT AGTTGGTGCT TTAATTGCCA TGGTAACTAA    5580

TCAGTCAATT ATATTTATAA CTGTGGTGTG GCGATTAAGA AAACATCCAA TTATTAGCCT    5640

GAGATTATTT AATGCTAATT ATGATAAGAA AATAGCGAAT AAATTGTTTA AATACTCTGT    5700

AATGGCATTG ACAAGTATAT TAACAGTGCC ATTAACAAAT TTTATTCTTC GCAATTATAT    5760

TGGAAATGTA ATCGGATGGT CACAAGCTGG TTATTGGCAA GCGATATGGT ACATTTCCAG    5820

TATGTATTTG ATGGTTATTA CAACTGCTCT CAATATATAC TATTTACCTC GATTATCTGA    5880

AATTAAAGAT AAGAAAGAAA TAAAAAAGGA GTTGTTAAAT GGTTATGTCC TGATTATACC    5940

TTTTATAGTA TTATTAACGT TGGGTATCTT TTTTTTAAAA GAATACATTG TTCTTATACT    6000

TTTTAATAAA GATTTTTACC CAATGCTTGA GTTGTTTAAG TGGCAACTAG TGGGGGATGT    6060

GATAAAAATA AGCGCTTGGC TTTTGAGTTA TATAATGCTA GCTAAAGCAA TGACTAAAGA    6120

ATTTATCATT ACCGAAATAT TGTTCTCAAT GTTATTTGTG ATTGTTTCAT TGATATATAT    6180

AAATGTATTT GGGTTAATTG GTGTAACTTA TGGATATGCA ACAAATTATA TAATATATTT    6240

                                          orf6的终止   orf7的起始

TATTGTGATG TTTTTAATCT TTAGAAAAAA ATATCTTTTA CAA TAATAAT GAG GTGCGCT6300

TGACAAATAA TAGCTATCCT TTGGTGAGTG TTGCAATTAT CACATATAAC CAAAAAGAAT    6360

ATCTTAGAGA ATGTATTGAG TCTATATTAC TTCAGAACTA TCCAAATTTG CAGATAGTAG    6420

TAGCAGATGA TTGTTCATCA GATGGGACTC AAGATTTATT ATTGAGATAC AGTCAACAAT    6480

ACCCTAATGT ATTCACATTA AAATTATCTG AGAAAAATTT AGGAATAACA GCAAATTCTA    6540

ATTTAGCGCA TTTTGCGTGC AGAGGTAAGT ATATTTTTTG GATGGGTGGA GATGATTTGA    6600

TGCTGCCCGG AAAAATAGCA AAACAAGTAG AGTATATGGA AAATAATCCA GACTGTACAT    6660

TATGCTATCA TAATCTAGAT GTTTTTGACT CTGCAACTAA AAAAAATTTA TACTATTTCA    6720

ATCATTTAAA AAAACAAAAA ATCAATGGGA CAATTAGAGA AATTATCAAG TTTAGGACTT    6780

TTAATGGAGC GTGTTCTACT GTTGTAAGAA AAGACAAAAC ACCAAAGGAA GGGTTTAATG    6840

AACTTATCCC TATTGCTTCT GATTGGTTAT ATTGGGTTGA TACATTAGCA AATGGAGGAA    6900

ATATAAAATA TATAGATGAA GTGTTAGGGA AATACCGTCG GCATGATAAT AACATAACAA    6960

AGAAAACAAA ATGTTTATCC CAAGCAGATA TTGATCATTT GAATACTTGT AACATTATCA    7020

TTGGTAAGTA TCCTCAATAT CTAAGTGAAG CATTATATGC TTACGCTGAG ATATTATTTC    7080

ACTTAAGGAA GAAGTTGGAT TATAAAAAAA TTGTTTGTTT TAGTTTAGGT GCAAATTTCA    7140

                                                            orf7的终止

GAATTAGAAA AGCAATAGCC CTTGGTGTCT TTTTATTAAG CTTCGGAATT ATTAAGGTTT    7200

    orf8的起始

AAGT ATGTGT GGAATTATTG GTTATATAGA TTTCGACAAA AATTCGAATG CTGATGTACT 7260

AAAAAAAATG ACAGACTCCT TGCACCATAG AGGACCAGAT GATAGTGGAA TTTTAGACGA    7320

AGAATTTAAT AACTGTAAGG TGGGGTTCGG CCACAGAAGA TTATCCATAC TTGATTTATC    7380

ATCACATGGA CATCAGCCCA TGACATTTAT GAATCTTTCT ATTGTTTATA ATGGTGAGGT    7440

TTATAATTTC AAAGAAATAC GGGAACAATT AGAAAAAGAA CATTATGTAT TCAATTCAGA    7500

TTCGGATACA GAAGTGTTGC TTAAAGGTTG GCACTGCTGG GGGGAGGATC TAATACAGAA    7560

ACTTAATGGA ATGTTTGCTC TTGCTGTACT TGATCGTACT AATCAAACGG TTACATTATT    7620

GCGTGATAGA GCAGGAGTCA AGCCTCTCTA TTGGTATCGT AAAAATAATT TGATATTATT    7680

TTCTAGTGAA TTAAAAGGAT TACACAGACA CAATGCGTTT TCTAAAGAAA TATCAAAAGA    7740

GGGAGTTAAT CTATATTTTC AGTATGGATA TATACCCCAG CCATATACAA TATTCGAAAA    7800

TGTTTATAAG TTAGAGTCTG GACATTGTTT GAAAATTGAT CTTGTAAATC AAGCAATACA    7860

GAAAAATTGT TATTGGAATG TTTTTGATTA TTATAGAAAG GAAAAGATCA AACTTACAGA    7920

GAGTGAAGCT ATCGTAAAAT GCGAAAGTTT ATTAAGCTCT GCCTGCGAAT ATCGCATGAT    7980

CGCTGATGTT CCTGTCGGTG TTTTCTTAAG TGGTGGGTAT GATTCCTCTA TAGTTGCTGC    8040

ATTGCTACAG CGCAATAATT CTAAAAAATT AAAGACATTT ACTATAGGCT TTAAAGAAAA    8100

GTCATATAAT GAAGCTGGTT ATGCAAAAGA TATTTCAAAT TATCTAGGTA CCGAACATAC    8160

TGAATATTAT TGTACGAGTG ATGATGCTTT AAATATACTC CCTCTTCTTC CTGATATTTG    8220

TGATGAACCA TTTGCGGATC CATCAATTAT CCCTACAATA CTTGTTAGTA GGTTAGCGAA    8280

AAAAGATGTT ACGGTTTCAT TAAGTGCGGA TGGTGGGGAT GAGCTCTTTG CTGGGTATGA    8340

TAAATATACT GGTATTAAGA AAAAAATTGA TATCTTTAAT ATAATACCTA ATATGGCTTA    8400

TCCAGGAATT AGAAAAATTC TTGAGACTAA ATTAGCACAT AAGGCGTTTG AATATGCCGG    8460

TTATACTGAT GTCAATAATC GCCTATTTCG ATTAGCACAA ATGATAGGGC AAGATGAAGT    8520

TAGAATACTA AAATCAGCAT CTATCATTTT TTCTGATTTA GAGCTTAATC ACCTTTTAGG    8580

CGGGGCAGAT GAAATCTATA CTGGATTCGA TGATCGTTTG AATAGCAACT GGCTCGATAA    8640

TTTGCTGGCA ATTGATTACA AAACCTATCA GGTTGATGAT ATTTTATTTA AAGTTGATCG    8700

AGCAACTATG TCTTGCTCTC TTGAAGGAAG AGAACCGCTT CTTGATCATA GACTAATAGA    8760

ATTTGTTGCA AGGTTAGAGC CCGAGTTAAA AATAAAAAAT GGGGACAGAA AATATATTTT    8820

GAAGAAAATA GCCCATAAAT ATATACCTCA ATCATTGTTA GATCGTCCAA AACAAGGATT    8880

TGGCATCCCA CTTTCTGAGT GGCTAGGTGG GCAATTAAAA AATTATGTTT CTTATTATCT    8940

TAATCCCAAA AGAATAGCTG AGTCTGGAAT ATTAAATCCT GTTTTTGTTG ATTCATTATG    9000

TCGAGATTAT TATTCTGGAA ATATAAATAA AGTTAATTTT AAAAAAATAT GGGTTTTATT    9060

                   orf9的起始    orf8的终止

AATGTTTGAA ATGTGGAGAG AAAA ATGGAT G TAAAGAACA AAAAAATAAC TATTTTTATC9120

AGTTCGCTAC GTCCGGGGGG GGCCGAGGGA GTTTGTGTTA CAGTTGCTAA TGGACTCGTC    9180

AAACTTGGTT GGGATGTTAC AATTGTTGTA CTTAATATGA TAAGAGCGAC TCATCAACAG    9240

AGGCTCGATA CATCAATTAA TATCGTTAAT CTGAATTGCA GGCACGCACG CGAAGCAATA    9300

TTTCCTATTT GGAGATTTCT TAGTTCATCA GCCTCTTCCA ATTTATTAGT GTTTAACCAT    9360

CAACTAGCAA TTATTCTGGT ATTGATTAGA ATTTTTACTA GGAAAAACTA TATAATTATC    9420

TCTCGTAATA TCAACACATT AAGTGTTGAT TTAAAAAATG CAAAAAATTT TTGGCACAAA    9480

CATATCGTTA GTTTCTTAAT AAAAAGATTT TATTCAAAGG TTGAACATAT AATAGCACAA    9540

TCACATGGAA TGAAAGATGA TCTTATTAAT TTCTTGAATA TTAATGCAAG TAAGATATCT    9600

GTAATCCATA ATCCTGTTAA TCCTTATTTT TCTGATTTTG CTAAAGCAAT AAAATGGAAT    9660

GATTATGATA AGGATGGATT TATATTATGT GTGGGCAGAC TGGAAAGACA AAAAGCTTTT    9720

CATTTTGCGG TTGATATTTT CTCGAAAGTT GCTGAGAAAA GACAAGATTT GAATCTGTTT    9780

ATAATAGGTG AGGGGAGTTT GAGACAAGAG CTAGAAGATT ATGTTAGCAG GCTTAAAGTC    9840

ACTAGAAAAG TCAAGTTTCT TGGACTAAGA AATGATCTTG AGAAATATTA TAGTAAAGCC    9900

TCTGTGGTGT TACTTACTTC CTTATATGAA GGATTTCCAA ATGTATTAGT GGAATCATTA    9960

ACATTGGGAA CACCAGTTGT GGCATTTGAT TGCCCTAATG GACCGAATGA AATTATAAAT    10020

TCTAATAACG GTTTGCTTGT TAATTATAAA GATGTCAATG ACGGAGTCGA AAAATTAAAT    10080

AAAGCATTGA GTCAAGAATG GGATTATGTG GAAATTGCAA AAGCTGCAAG TATATATAGT    10140

GAGGAATATA TTGTTAACAT TTATTCCGAT GTTTTAAAAC AGACATTTTA CTCAACAGAA    10200

   orf10的起始 orf9的终止

CTTTTAAG AT GATATACTTT ACAGTTTTAG TGATGTTGTT CATATTAGGT GTACTCAGTT  10260

TAATTAAAAA AAGCAATCTG TTTTCACCTT CAATATTATT TCCTTTAGTT ATTGTTACAA    10320

CCTTACTTCC CAGCTTACTT CTGCCAAGTG TTTTTTATAC ACCGTCAGTA TATTCTGTTT    10380

TGTATATATT TGTTTGTACA ACTTCTTTTT CTTTTTTCTC ATTTCTATTT GAACAAATAA    10440

ATATTAAATC AAAGTTGTCT TGCAATGTAT TATCTTTCAA TATGTCTGGG TATTATTTTA    10500

TTGCTTTTGT TACATTTATT TTGTGTTTTT TAATGCTTGA TGAATTTTTA AACAAAATTG    10560

CAGGGTTTGC AAACTTTGGA GCATATGCCG AATATTATAG AGCTGCCTCA ACATCTGGTG    10620

AAGATGATCT AAAGGATAGT GTAAATTATT TAGTAAGAAA TGCTGATATG TTAGCATTAC    10680

CATTATCTGT AATTGGATTG TATATTTGGT CAACGCGTAG AGTATCAAGC ATATTTAAAA    10740

TAACCGTTGT GATCTTTATA TTGTTCTCTT TAACCCTTCC TATTATTAGC GTCGCTCGTT    10800

CAGGTGCTAT TAGAGCTTGC ATTGTTCTAC TTGGCGTGTT TGTTATATTT TTTCGATTTA    10860

GGTTGAAATT TGCCATTCTT GTATTAAGTT TTGTTGATGC GTTATATGTT GGCGCTGGTT    10920

TTATGTTTGG CTATGGTTCT GGTGGGTATT CATCTTTTTC AGAATCTATA GGGTATTTCT    10980

TGGTATCCTT TATCCGGTAT TTATCTGGTG GTTATTATAC ATTTGATTCA TATTTGCTTG    11040

GCAAGGTTGA TATTTTCTTT AGATTTGCAT TCGTAGATAG CATTCTTGGT AAAATCGATA    11100

CAACGTTGAC TTTAGCTGGG ATGGGGGGTA AGTGTATTGT CTGCTACCCA GAAAATCATG    11160

CTGAGTTTGT CCAGGTTGGT CCAGCTGAAA ACTTCGTTTC AAACGTCTAT ACTGTATTCG    11220

GTGTTGTATT TAGCAACTTA GGTTGGCTAG GAGTATTTTA CTTTAGCTTA TGCGGTGCAA    11280

TTATGGGCTC ACTTTACAAA GCTATGAAAA GCGGTAGAGT CTTTTTTGCA ATTGTATATA    11340

GTTTCCTTTT ACCTGGAGTA GTCCTTGCGT CATTTAGTGA ATATTTTTTT GCTCAAATCC    11400

CGCTACTAAT AAGGTTCATT TTGTTATATA TGATTTTATT TAAATTGTCT GCTCATAAAA    11460

orf10的终止             orf11的起始

AA TAAACTGG AGGGATTTTA AA TTGAAAAA AAAAGTTCTT TACGTTGTGT CAACACTAAA11520

AAGGTCAGGG CCAATTAATC AATTATACAA TTTGATCAAT AATTTCTCGA AATATGAATT    11580

TGATTTGACG ATTGTAACTT TATCGCCCGA ACCACAAGAC TCAAAATTAG ATGATTTCAT    11640

TAACTTGGGT ATTAATGTTA TTACTCTTGG GCTTAGTAGA CTCAAGGGGG TATTTTTTGC    11700

CAAACATAAA CTAAAAAAGA TAATTGATAA AATTAATCCT GACATTGTCC ATTCTCAGGG    11760

GGTTAGAGCT GATTATTTAA ATTATTTAAT TGTTGGCGGC CATATGAAAA TTAGCACAAT    11820

TCATAATTAT CCGCAAAAAG ATTTTATTAA AAGATATGGC CCTATTGTTG GTACCGTTCT    11880

GGTTAAGATT CAAATAAATG CCATAAAGAA TTTCGATATT GTTATAGGTG TTTCTAAAGC    11940

TGTTGCTAAA AATCTAATTA GTACTTACAA GATTAAAGAT GCATATGCAG TTATTAATGG    12000

TATAGATACT GATATTTATA AACCTAAATC CAGCACCGAT AAAAGTAAAC TAAAAGAAAA    12060

ACTGGGTTTG GCTAAATATG ATTGCATATG GATATCTACT GGGCATCTTA GTGTATTAAA    12120

ACAACCGGAG ATTCTAATTA AATCGTTTTT AAAAAATAAG AATGATGCTC GTTTTATCAA    12180

TAGTGTTTTT ATTTTTTTAG GGGATGGAGA GCTCAGTGAG TCTCTTATTA TGAAATACAA   12240

ACATGAAAAA AAAATAATAT TTGCAGGTCG TGTTCATAAT GTAGTTGAGT ATTTGCAAGC   12300

CTCCGATTAT TTCGCATCAG CATCTAGTAC AGAAGGTTTA CCTATGGCAG TAATTGAAGC   12360

ATTATCTTGT GGGTTACCTG TCTTATTATC AAGAATTGGG CCTCATGAAG AAATAATTGG   12420

GCTTGATGAA AGCATTGGAG TGTTATTCGA TAGTGATGAC GCATCTGAAT CATTCATGAC   12480

AATGGTTACA AAGGATAAAA CGGCGCTTTC CCACTCTTGT CGAAGTTTGG CGCTTAATTT   12540

CTTTAGTGCA GAAGCAATGG GAGCTAACTA CAAAGATATA TATAATAAGA GTATAAAAAC   12600

orf12的起始 orf11的终止

TAA ATGAAAT TTTCAGTATT AATGTCTGTT TATAAAGATG ATAACCCTTT ATATTTGAAT 12660

CAATCAATAG AAAGCATCTG GATACATCAA ACATTAAAAC CAACCCAGAT AGTTCTGGTC   12720

CAAGATGGTG TATTAACAGA GGCTCTCTAT GGTGTTGTAA ATAAATGGAA ACAAAAGGTA   12780

GGTGATTCAT TTACCATTGT TTCGCTAGAT AGAAATATGG GGCTGGGGGC AGCTTTAAAT   12840

AGAGGGTTAT TATATTGCAA GTATGAGTTG GTTGCCAGGA TGGATAGTGA TGATATCGCA   12900

TTACCAGATA GATTTCAAAT TCAAGTTGAA TATATGATAA AAAATTGCGA GATTATTGCT   12960

TCTAGTGGTT ATGTTGAGGA GTGGGATGAA GAAATGGGTA CATTATTGGG TATACGATAT   13020

GTTCCATTGG AAACTGATTC GATTATAAAA ATGGCCCGTT TTCGCTCCCC TCTTAGTCAT   13080

CCTGCATCAA TATTTAGACG TGATATTGTT TTATCTTTGG GGGGGTATCC TGAATTACGT   13140

AAGGCACAGG ATTTTGCCCT TTGGTCTTTA TTATTAAAGA ATAAATACAA GCTATCAAAT   13200

TTAGGGACTG TTTTAGTAAA GATGCGAGCA GGAAATAGTA TGATTTATAG ACGTGGATTC   13260

AGCCATTTGA GATATGAAAT GGAACTTCTT AAATATCAAC GAATGATAGG GTTTTTACCT   13320

TTTGGTTTGT TTTGTGTTAA TTTTGTTTTA AAGGCTGGGC TTCGTTTATC TCCCGGATTT   13380

                           orf12的终止

GTAAAGAAGA TTGCATATAA ATTTTTACGC  TAATAGAGCG CATGTTTAAC TCAAGGTGAA 13440

orf13的起始

TGT ATGTCCA TCCTAATCAC AGGTGGAGCC GGTTATATTG GTTCTCACAC AGTATTACAG 13500

TTACTCAGGA ATGAGTATGA TGTTGTTGTT ATTGATAATT TGATTAATTC TAATCTGGAG   13560

TCTTTAAAGC GAGTTGAGGG CTTAGTTGGA AAAAAAATTA CGACTTATAT AGGCGATGTA   13620

ACTGATAGTA CGTTTCTAAA AACGATTTTT GATAATCACT CTGTCACCGA TGTTATACAT   13680

TTCGCTGGGT TAAAGTCAGT TTCAGAATCT ATTAATGATC CCTTGCTGTA TTATAAAAAT   13740

AATGTACAAG GTTCTCTTTG TCTTATTACT GAAATGGCAA AGGCGGGGGT TTATAATTTA   13800

ATATTTAGTT CCTCAGCAAC TGTGTATGGT TCCCCTCAGT CAGTACCATT GACTGAAATG   13860

AGTCCATTAG GACTGACAAC AAATCCATAT GGTACTTCTA AATTAATGAT TGAGCAGATT   13920

TTAAGAGATT TCACTAATTC CAATCCTAAT TTTAAAGTCG TATGCCTAAG ATATTTTAAT   13980

CCTGTTGGTG CTGATCCTTC TGGTTGTATA GGTGAATCCC CAATAGGAAC TCCAAATAAT   14040

ATTTTTCCTT ATTTGACTCA GGTTGCGTTG GGAAAATTTC CCTATTTATC AATTTTTGGA   14100

GATGATTACC CAACTATAGA CGGAACAGGC GTTCGTGACT ATATCCATGT GGTAGATTTA   14160

GCATTGGGGC ATCTTGCAGC ATTAAAGTTT AAACAAAATG AAACATCGTT TGCAGTTTTT   14220

AACTTAGGAA CTGGGACAGG CTATTCTGTT CTTGAGTTAG TTAATACTTT TGAAGAAGTG   14280

ACAGGAATTA AGATCCCATG TCGGATCGTT GGGAGACGGC CTGGAGATGT TGCGGAATGT   14340

TGGTCAGATC CTTCTCTTGC CAAAAAAGTA CTTTTTTGGG AGGCGAAGAA AACTTTGGTC   14400

                                                            orf13的终止

GATATGGTTC GTGATGCTTG GAATTGGCAA CAAAAGAACC CAAGTGGATA CTCATCT TAA 14460

CTCATAAATG CAAACTGGAT TATTATTTAT ATTTCGTAGA GTAACTTCAA ATAAATTTTT   14520

ATTTATGTTC TGAGCAGTCT TCGTGACAGG AGTAAACAAT GTCAAAGCAA CAGATCGGCG   14580

TCGTCGGTAT GGCAGTGATG GGGCGCAACC TTGCGCTCAA CATCGAAAGC CGTGGTTATA   14640

CCGTCTCTAT TTTCAACCGT TCCCGTGAGA AAACGGAAGA AGTAATTGCC GAAAACCCAG   14700

GCAAGAAACT GGTTCCTTAC TATACGGTGA AAGAGTTTGT TGAATCTCTG GAAACGCCTC   14760

GTCGCATCCT GTTAATGGTG AAAGCAGGTG CAGGCACGGA TGCTGCTATT GATTCCCTCA   14820

AGCCATACCT CAATAAAGGT GACATCATCA TTGATGGTGG TAACACCTTC TTCCAGGACA   14880

CCATTCGTCG TAACCGTGAG CTTTCTGCCG AAGGCTTTAA CTTCATTGGT ACCGGTGTCT   14940

CCGGTGGTGA AGAAGGCGCG CTGAAAGGTC CTTCCATTAT GCCTGGTGGG CAGAAAGAAG   15000

CCTATGAACT GGTTGCGCCG ATCCTGACCA AAATCGCCGC AGTGGCTGAA GACGGTGAGC   15060

CATGCGTTAC CTATATTGGT GCCGATGGCG CAGGTCACTA TGTGAAGATG GTTCACAACG   15120

GTATTGAATA CGGAGATATG CAACTGATTG CTGAAGCCTA TTCTCTGCTT AAAGGTGGCC   15180

TGAACCTCAC CAACGAAGAA CTGGCGCAGA CCTTTACCGA ATGGAATAAC GGTGAACTGA   15240

GCAGCTACCT GATCGACATC ACCAAAGATA TCTTCACCAA AAAAGATGAA GACGGTGACT   15300

ACCTGGTTGA TGTGATCCTG GATGAAGCGG CTAACAAAGG TACGGGCAAA TGGACCAGCC   15360

AGAGCGCGCT GGATCTCGGT GAACCACTGT CGCTTATTAC CGAGTCTGTG TTTGCACGTT   15420

ATATCTCGTC TCTGAAAGAT CAGCGCGTTG CCGCGTCTAA AGTTCTCTCT GGCCCGCAAG   15480

CGCAGCCAGC TGGCGACAAG GCTGAGTTCA TCGAAAAAGT TCGTCGTGCT CTGTATCTGG   15540

GCAAAATCGT TTCTTACGCC CAAGGCTTCT CTCAGCTGCG TGCTGCGTCT GAAGAGTACA   15600

ACTGGGATCT GAACTACGGC GAAATCGCGA AGATTTTCCG TGCTGGCTGC ATCATCCGTG   15660

CGCAGTTCCT GCAGAAAATC ACCGATGCAT ACGCCGAAAA TCCGCAGATC GCTAACCTGC   15720

TGCTGGCTCC GTACTTCAAG CAAATTGCCG ATGACTACCA GCAGGCGCTG CGTGATGTCG   15780

TTGCTTATGC GGTACAGAAC GGTATCCCGG TTCCGACCTT CGCAGCTGCG GTTGCCTATT   15840

ATGACAGCTA CCGTGCCGCT GTTCTGCCTG CGAACCTAAT CCAGGCTCAG CGCGACTA     15898

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (2)

1、一种对大肠杆菌O65的O-抗原特异的寡核苷酸对，其特征在于，所述寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5824至5844碱基的核苷酸和6187至6207碱基的核苷酸；SEQ ID N0：1中的5173至5191碱基的核苷酸和5760至5778碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10829至10847碱基的核苷酸和11391至11409碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10336至10354碱基的核苷酸和10762至10790碱基的核苷酸。

2、权利要求1的寡核苷酸对的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR，供体外检测大肠杆菌O65。