CN1256344C - 对大肠杆菌o19型的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O19型(Escherichia coli O19)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌型中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长12434个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O19型的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O19型的方法。

Description

对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O19型(Escherichia coli O19)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O19型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O19型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对 E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的 E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定 E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf9基因。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf7、orf8、orf9基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O19型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O19型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O19型的O-抗原也是高度特异的。

本发明再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O19型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O19型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于：其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长12434个碱基；或者所述具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ IDNO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸，其中包括命名为rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，wzx，wzy，orf7，orf8，H-repeat，orf^*，orf9的9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的基因中具有高度特异性的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因；聚合酶基因wzy基因；糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf9基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的4157至5413碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的5415至6539碱基的核苷酸；orf7是SEQ ID NO：1中的6527至7429碱基的核苷酸；orf8是SEQ ID NO：1中的7489至8358碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1中的11076至11167碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸，其中还包括源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf7、orf8、orf9基因以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其中源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的4259至4274碱基的核苷酸和4560至4575碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4312至4327碱基的核苷酸和4880至4895碱基的核苷酸。源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5834至5849碱基的核苷酸和6410至6425碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5626至5641碱基的核苷酸和5987至6003碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。

前述的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O19型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。

前述的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。

前述的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O19型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O19型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O19型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O114型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O19型的O-抗原的高度特异性；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O19，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O19的灵敏度。

前述的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O19型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O19型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O19型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bi0-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bi0-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O19型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O19型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到9个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对痢大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O19的第十三组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O19型的O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O19的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50u l稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的4259至4274碱基的核苷酸和4560至4575碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4312至4327碱基的核苷酸和4880至4895碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5834至5849碱基的核苷酸和6410至6425碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5626至5641碱基的核苷酸和5987至6003碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O19的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长12434个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它包括命名为rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，wzx，wzy，orf7，orf8，H-repeat，orf^*，orf9的9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明第二个方面，提供了大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因(orf7、orf8、orf9基因)。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O19型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf7、orf8、orf9基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O19型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O19型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们的长度可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的4157至5413碱基的核苷酸)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的5415至6539碱基的核苷酸)。源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O19型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O19型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O19型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O19型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O19型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O19型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O19型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O19型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O19型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGTTCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管longPCR产物，并用Promega公司的Wizard PCRPreps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5a。取一环大肠杆菌DH5a单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD6000.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000mm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5a混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O19型的基因组作5个LongPCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O19型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到9个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现otf1编码的蛋白与Shigella flexneri O-抗原基因簇中rmlB基因编码的dTDP-glucose 4，6 dehydratase，有94％的氨基酸序列一致性和95％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf1编码的蛋白与已知的RmlB的共有序列的同源性预期值非常高(E value＝5.7×e^-210)。Orf2基因编码的蛋白与Shigella flexneri O-抗原基因簇中rmlD基因编码的dTDP-6-deoxy-L-mannose-dehydrogenas有95％的氨基酸序列一致性和96％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf2编码的蛋白与已知的RmlD的共有序列的同源性预期值非常高(Evalue＝1.5×e^-74)。orf3基因编码的蛋白与Shigella flexneri O-抗原基因簇中rmlA基因编码的glucose-1-phosphate thymidylyltransferase有96％的氨基酸序列一致性和98％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf3编码的蛋白与已知的RmlA的共有序列的同源性预期值非常高(Evalue＝4.1×e^-118)。orf4基因编码的蛋白与Shigella flexneri O-抗原基因簇中rmlC基因编码的dTDP-6-deoxy-D-glucose-3，5epimerase有81％的氨基酸序列一致性和86％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf4编码的蛋白与己知的RmlC的共有序列的同源性预期值非常高(E value＝5.5×e^-123)。rmlBDAC负责合成鼠李糖O-抗原中的一种稀有单糖。因此我们将这四个基因暂命名为rmlB，D，A，和C。

orf5和orf6是大肠杆菌O19种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。orf5编码的蛋白与Shigella flexneri 2a str.301(AAN43639)的O-抗原转移酶有40％的序列一致性和62％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有12个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf5为wzx。orf6编码的蛋白与大肠杆菌(BAA15877)的O-抗原聚合酶有24％的一致性，46％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有10个跨膜片段，并且有一个大的胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf6为wzy。

orf7，8，9三个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有34-40％的序列一致性和52-61％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这两个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族的共有序列的同源性预期值为3.2×e^-14，8.7×e^-16和4.4×e^-32，因此我们推测这三个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆菌O19的O-抗原的寡糖单位可能由四个单糖组成。由于这三个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这三个基因暂命名为orf7，orf8和orf9。

实施例6：特异基因的筛选：

针对大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O19的第十三组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O19型的O-抗原都是高度特异的；这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

实施例7：引物灵敏度的检测。

购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O19的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的4259至4274碱基的核苷酸和4560至4575碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的4312至4327碱基的核苷酸和4880至4895碱基的核苷酸。SEQ ID NO：1中的5834至5849碱基的核苷酸和6410至6425碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5626至5641碱基的核苷酸和5987至6003碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O19的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology 1993.7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O19的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

根据本发明的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ IDNO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表1列出了大肠杆菌O19型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O19型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共12组，它们的来源都列于表中。

在第13组中含有大肠杆菌O19型的基因组DNA作为阳性对照。以每细菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O19型及其O-抗原是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O19型中筛选到对大肠杆菌O19型的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O19型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O19型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O19型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇的结构，共由9个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O19型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

             SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>对大肠杆菌O19型的O抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O19型的O抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>12434

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

atcgaaaaac ccggatcagc cgcagacgct ggactcagac atcatggccg ttggtcgcta    60

tgtgctttct gccgatattt ggccggaact agaacgcact caaccaggtg catggggacg    120

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ctgggtctat gcaggcaaag gaaataactt cgcgaaaacg atgttacgtc tggcaaaaga    2280

gcgcgaagaa ttagcggtta ttaacgatca gtttggtgca ccaacaggtg ctgaactgct    2340

ggctgattgt acggcacatg caattcgtat ggcactgaat aaaccagaag tcgcaggttt    2400

gtaccatctg gtagccagtg gtaccacaac ctggcacgat tatgctgcgc tggtttttga    2460

agaggcacga aaagcaggta ttccccttgc actcaacaag ctcaacgcgg taccaacaac    2520

agcttatcct acaccagctc gtcgtccaca taactctcgt cttaatacag taaaatttca    2580

gcagaacttt gcgcttgtct tgcctgactg gcaggttggc gtgaaacgaa tgctcaacga    2640

attatttacg actacagcaa tttaatagtt tttgcatctt gttcgtgatg gtggagcaag    2700

atgaattaaa aggaatgatg aaatgaaaac gcgtaaaggt attattttag cgggtggttc    2760

tggtactcgt ctttatcctg taactatggc tgtcagtaaa cagctgttac cgatttatga    2820

taaaccgatg atctattatc cgttgtctac actgatgtta gcgggtattc gcgatattct    2880

gattatcagt acgccacagg atactcctcg ttttcaacag ttgctgggtg atggcagcca    2940

gtggggcctg aatcttcaat acaaagtgca accgagccca gacggtcttg cgcaagcatt    3000

tatcatcggt gaagagttta ttggtggtga tgactgtgct ttggttcttg gtgataatat    3060

cttctacggt cacgatctgc cgaagttaat ggaagcagct gttaacaaag aaagtggcgc    3120

aacggtattt gcttatcacg taaatgatcc tgaacgctac ggtgtcgttg agtttgataa    3180

aaacggtacg gcaattagcc tggaagaaaa accgctacag ccaaaaagtg attatgcggt    3240

gactgggctt tatttctatg ataacgacgt tgtcgaaatg gcgaaaaacc ttaagccatc    3300

tgcacgtggt gaactggaaa ttaccgatat taaccgtatt tatatggaac aagggcgttt    3360

gtctgttgct atgatgggtc gtggttatgc atggctggac acggggacac atcaaagtct    3420

tattgaagca agcaacttca ttgcaacaat tgaagagcgt cagggactga aagtttcctg    3480

cccggaagaa attgcttacc gtaaagggtt tattgatgct gagcaggtga aagtattggc    3540

tgaaccgttg aagaaaaatg cttatggtga gtacctgcta aaaatgatta aaggttatta    3600

ataaaatgaa cgtaattaaa acagaaattc cagatgtatt aattttcgag ccgaaagttt    3660

ttggtgatga acgtggtttc ttttttgaga gctttaacca gaaggttttt gaggaagctg    3720

taggccgcaa agttgaattt gttcaggata accattcgaa gtccagtaaa ggtgttttac    3780

gcgggctaca ttatcagtta gacccttatg cacaaggaaa attggtgcgc tgcgtagttg    3840

gtgaagtttt tgatgtagcg gttgatattc gtaaatcgtc acctacattt gggaaatggg    3900

ttggggtaaa tttgtctgct gataataagc gccagttgtg gatcccggaa gggtttgcgc    3960

atggattttt ggtgttgagt gaaacggctg agtttttgta taagacgaca aattattatc    4020

atcctgatgc tgaaggttca ttacgttgga atgatgatga tattaatatt aattggccat    4080

catcatacgg tatcactcta tcaaagaagg atgaaaatgc accgtacttc aacagaataa    4140

tcggtaatgg aattttatga gtttatttaa aaacgctggc tggaatattt taggtctggt    4200

tattccactt attatggcga tccccgttat ggggatcatg gctcgtttat taggtgttga    4260

acgctttggt cttttcacta ttgcttatgc tttaatggga tatgcaagtg tttttgatgg    4320

cggaatatct cgtgcagtta ttcggtttgt atctatttat agaaatgaca atgaaaaagt    4380

taatgttatt ttaggttctt ctatatatac ggtaactgtt ttaagtatcc taatagcatt    4440

attaacttat ttagtatcac caaatttggt tgttttttta aaagtatcac aggatattcg    4500

acatgaagtt gtaatagctc ttcagctact gggggcatgt atccctgcat tactact tac   4560

acaagtatgg cgagcatatc ttgaaggtgt cgaaaatttt tcttctttga acattcaaca    4620

agttctaaca agtcctttca taatattatt accattaacc acaacatggt tttcacaaac    4680

tcttatttca gcagtattag ggttgatttt gggacgctgg attgttgcat ttattagttg    4740

gaaactttgt tcgcgccatc ttaaaaattt caaaagaaca tttagtcgaa aagctttgat    4800

ggagcttatt agctttggtg gatgggtaac tctgagtaat attataggcc ctttaatggg    4860

gtttattgat cgttttgctg tctcacattt cgctggcgct aatgttgttg cttactattc    4920

agggccgtct gatatggtat ctcgacttac tttatttcct ggggctgttg ccagggctct    4980

atttccaaaa ctaagttttg aaactagaga agagagcaaa gttacatatt ttcgatctct    5040

aattctcgtt ttttgtttat cttttctttt agcattgcca tttttcttat tttcaagcga    5100

tatattaggt atatggttag gaaatgagta tagaggagat gcagcggtcg tatttcgcat    5160

attgttaatt ggatttgttt ttaattcaat agcacaaata tgttttgcta gaattcagtc    5220

tgctggattt gcgaaatgga ctggtattgt gcatattatg gaattcatac catacttggt    5280

tcttttgtat ttactgaccg tcaaatattc tttttttgga gctgcgttcg ccttttcatt    5340

aaggtcatta ttggatttta taattctatt cctggttgaa aggatcggta tctataacat    5400

ggataggata taatatgaat gtcgttcaag caatggttat aatatacctt tgttacctaa    5460

ttatatgttt cttctttagg cttgaaataa cacatccagc agttgtacat acgataattt    5520

ggcttataag cgcgagctta gctcttgttt ttgctgaaga aaaatatttg ccaaataact    5580

attatatagt tatagcaaac tcaatgtttt ttattttttc tttcattggt ggaattggtg    5640

tttttaataa aaataaagct tttcagttaa atattgataa aaattcttat gtaaatgctt    5700

taccattttg tttaataata tcattttatt tgattatact aataacctat aatgtgaatg    5760

ttttatcaaa catatcagcg ttccgagatt atctggttgc tgacgatggt gctaattat g   5820

gtttattagg gcgtatcgca atgttatcgc tcttctcttc ttgtttttta cttttgagaa    5880

gtcgaaggct ttttttactt agcgccgtgt tgtgcatccc tataattatt atactaagtg    5940

caaaaacctt agttctattg tatttaataa cgatactaat tttaactcca aacaggct ga   6000

aaatatcaaa actactaatc ttctttagca tatttattct tttctttatt gggataatga    6060

ggcttcgata tccagaagca tcttttaatt taattttata ttatttatat aattatattt    6120

caggtggatt tttggctttt tcacaattgc cgaattcatt taatcaagtt tttggttttt    6180

attctttcag aaacttttac ctttggttaa atgtgctcta tccagtcgag atcgcaaaca    6240

ttcttcaaga gtgggtaaat gtcccatttc ctgtcaatgt atatacgtat cttcgccctt    6300

attatatgga ttttgattat ttatcattat ttttcccaat tatctttggc tttttttcgg    6360

gaagaatata tatggaaaag tataaaaata gacgcattta ttatattgta tacccgataa    6420

ccttttacgc aatagcaatg cagctatttg atgatcaata tcttacatgg ttatcaaact    6480

ggatattgct tataattaca ggctatataa tgacttggga gggggtatgt cgaaaatagc    6540

agttttgata gtaacgtata atccagtttt aagtgtgttg gatgatctaa ttggaaagat    6600

aaaaaaagct aaatataatt tagaaatatt tctcgttgat aatgctagtg aaaatgctaa    6660

tatattaaaa gctaaattta aggacgagcc caatatatta ttccttgatg aaaatttggg    6720

attggctggg gcacaaaatg taggtctgaa aaaaatatta cgaacagact gtgaagcagt    6780

cctttttttt gatcaagata cttcccctac agatgtattt tttactaatt tgatagagtc    6840

tatgtcaaag ttagctctac agggagaaaa aattggtgct attggacctg ttttttacga    6900

ctcaaggaca ggaaccaaat atccatttat tctcttaaaa agaatccgag ctaagaaggt    6960

ttttccaaca ggtaatgtcc cgcttaaagt ttcattttta ataaactcag gtatgctagt    7020

accagtaagc acattaaaag atgttgggtt aatgaaagag gaattattta tagactatgt    7080

cgatattgaa tggtgcctcc gagctgcaag taaaaagttt aacttttacg ctattcccga    7140

tgcaacgatg agtcatgcat taggagatga gcgtaaatca attttgggaa gagaaattag    7200

catacacagc cctttgagac gttattattt agcaagaaat tctatttata tgctgcgttt    7260

accatacgtt cctttggggt ataaaataag agaaattttg ttttcattgt tgagaacagc    7320

gatatttata tcaactgtta ataataagaa ggtttatgtt gattttattc taaaaggttg    7380

gtcggatggc attaaaaaaa attatgggaa gtatgttgga ataaagtaga tatttttttt    7440

gaaacgaata aacttggaca aatttaatcc ctttcaatgg agaaaaaagt gattagttcg    7500

gttacagtta catataaccc agatattgaa tgcctcagac agcaactttt atcagtacgt    7560

aagcaggttg atttatgtgt aattgttgat aatggctcaa acaatattat tgagattaaa    7620

aaattaaatt atgagtttga tttttatctt attcaatttg atgataatta tggtctcgca    7680

tatgcacaaa atagtggtat agaatatgcc atatcttctg gtacagaata tttattattg    7740

ttggatcaag atagtatctt gaaagatgaa ttttctaaga acatgaagca tatatatata    7800

aaatataatg ttgggatttt aggaccttca ttttatgatc ctcaaaacaa taaaatttat    7860

tttgggactt gttataaagg accttttatt agccgtaagt ctatcggtga ggttaccgat    7920

gttacttttg tcattgcatc gggctccttt ttttcatcag atgtttataa aaaaattgga    7980

ggaatgaaat ctgaactttt tgtggattat attgatgttg aatggtctct tagagcaaaa    8040

aatatgggat acagagtgtg tatgactaac agggctttaa tggctcatac aattggtgat    8100

tccagaatta caatttttgg gcggacaata tcggtgcata gccccataag acgttattat    8160

ttagttagaa atagtttcta tatgctaagg ttgcactatg tgcctattgg atataaagtt    8220

cgcgaaattt tctttaattg tttacgatca ataatttctc taataataag tgacaaaaag    8280

ggtaatgtaa taactaaact aggtcaagga atatatgacg gtattcgtgg gaaatatggt    8340

gattataaag atagataata ttaattcatc cgttgcgtca caattaaatt agaattcatg    8400

tacaaattaa tacaaaggaa aagtaatact taaagtatat tcaacactaa ataattcact    8460

tttcctatca tggaaagatc atcggtgtgc tgtaggcaca aagatgcaaa acgggacgtt    8520

ttgcatgtaa taagcataag cttgtaaaga gatggtggca ggcagggaaa gatcatcaga    8580

agttcacttt ttgtactaaa taattcgcat tttatgttta aaaattgaga tattccttat    8640

tacctaaagc tgttttttat tgcttataca tgatcaaata ctccttacat aattaaggag    8700

aacaaaatgg aacttaaaaa gttgatggaa catatttcta ttatccccga ttacagacaa    8760

gcctggaaag tagaacataa attgacagat attctactgt tgactatttg cgccgtcatt    8820

tctggtgcag aaggctggga agatatagag gattttggtg aaacacatct cgattttttg    8880

aagcaatatg gtgattttga aaatggtatt cctgtccacg ataccattgc cagagttgta    8940

tcctgtatca gtcctgcaaa gtttcacgag tgctttatta actggatgcg tgactgccat    9000

tcctcaaatg ataaagacgt tattgcaatt gatggaaaaa cgctccggca ctcttatgac    9060

aagaatcgcc gcaagggagc gattcatgtc attagtgcgt tctcaacaat gcacagtctg    9120

gttctcgggc agattaagac ggatgagaaa tccaatgaga ttacagccat tcctgaactt    9180

cttaacatgc tggatattaa aggaaaaatc atcacaactg atgcgatggg gtgccagaaa    9240

gatattgcag agaagataca aaaacagggc ggtgattatt tattcgctgt aaaaggaaac    9300

caggggcggc ttaataaagc ctttgaggaa aaatttccgc tgaaagaatt aaataatcca    9360

gagcatgaca gttacgctat tagtgaaaag agtcacggca gagaagaaat ccgtcttcat    9420

attgtttgcg atgtccctga tgaacttatt gatttcacgt ttgaatggaa agggctgaag    9480

aaattatgcg tggcagtctc ctttcggtcc ataatagcag aacaaaagaa agagccagaa    9540

atgacggtca gatattatat cagttctgct gatttaaccg cagagaagtt cgccacagca    9600

atccgaaacc actggcacgt ggagaataag ctgcactggc gtctggacgt ggtaataaat    9660

gaagacgact gcaaaataag aagaggaaat gcagcagaat tattttcagg gatacggcac    9720

atcgctatta atattttgac gaatgataag gtattcaagg cagggttaag acgtaagatg    9780

cgaaaagcag ccatggacag aaactatctg gcgtcagtcc ttgcggggag cgggctttcg    9840

taatctcgcc ctgacatgga cctctaaggc gatattaatt gtttgaaaat tatatctcaa    9900

atttaaaaat gagctgtatg ctgttagagt ataaaatatg tgtttttata ttggaaggtt    9960

tttagtgagc atgattttaa ccaaaaatat aaatacttta ctttcataca ctataacatc    10020

aattaaggat ggaataaatg gtgaaacggg ggaatataaa ggataacaac tcattatgaa    10080

aaaaataata catatccaag tgttgccaaa aatgtctggg gttcagcaag tctcttttga    10140

tattttgtca gggattaatg acgaaaatgt acaaaaattt atattatgtg gttcaccaga    10200

tggcagttca gatgatgatt ttaaacagaa atttactgat ataggtgtta gggttattac    10260

gatgccttca ttaaaacgaa atatcgggtg gcatgatttt cgatgtttca ttgatttata    10320

caatttcttt aaaaaggaaa agtttgatat agttcataca aactcaacta agccaggaat    10380

aatagctaga atagccgcta gattagctgg gacaaaactc attattcaca cagtacatgg    10440

aatcgcattt catagaaaag aaaatactgt aaggaaaatt ttttactatt gccttgaaaa    10500

ttttgcaaca ctttttggta gcattaatgt gacagtgaac gagaattatt taaaatatta    10560

tccattcgtt aaaagtcaca ttgtatataa tggagttgat ttcaacgttc tttgctgcaa    10620

taaaaaggat catgattttt tacatattgc atttatggct agacttgata aacaaaaaaa    10680

ccctttggag tttataagag ccgttaatat tattaagaaa aaattaccaa atgagcgttt    10740

gaaatttaca ttggctggct gtggtgagtt agaaaatgaa tgtaaaaaat taatagaaca    10800

ttttcatctt acagatgtta ttgatatgcc tggatggata gtagataaaa acacatttta    10860

taactctgtc gatattattt gccagccatc caattgggag gcttttggct tagtatttgt    10920

tgaggccgca ttttttgaaa ttccatctgt ttcaaggaat attgaaggga ttcctgaggt    10980

tattttagat aatgaaactg ggcttttgta tgagggtgga gaagccgagt tgagtgaaaa    11040

gctgatatca ttaattcatg ataaaaagaa aatttcttgg ttaggtttga atgctaaaga    11100

atatgtctta aagcatttca ccaaagatat catggttgaa aaatattcaa aactgtatga    11160

tttataagta tctaattaaa tttcactatg atttttgcat tatgatatta tagacccgtg    11220

tattttttca agccgcacgc cctcgcggtg accaccccct gacaggagta aacaatgtca    11280

aagcaacaga tcggcgtagt cggtatggca gtgatggggc gcaaccttgc gctcaacatc    11340

gaaagccgtg gttataccgt ctctattttc aaccgttccc gtgaaaagac ggaagaagtg    11400

attgccgaaa atccaggcaa gaaactggtt ccttactata cggtgaaaga gtttgttgaa    11460

tctctggaaa cgcctcgtcg catcctgtta atggtgaaag caggtgcagg cacggatgct    11520

gctattgatt ccctcaagcc atacctcgat aaaggtgaca tcattattga tggtggtaat    11580

accttcttcc aggacaccat tcgtcgtaac cgtgagcttt ctgccgaagg ttttaacttc    11640

atcggtaccg gtgtttccgg cggtgaagag ggggcgctga aagggccttc catcatgcct    11700

ggtgggcaga aagaagccta tgaactggtt gcgccgatcc tgaccaaaat cgccgccgtt    11760

gctgaagatg gcgaaccgtg cgttacctat attggtgccg atggcgcagg tcactatgtg    11820

aagatggttc acaacggtat tgaatatggc gatatgcagc tgattgctga agcctattct    11880

ctgcttaaag gtggcctgaa cctcaccaac gaagaactgg cgcagacctt taccgagtgg    11940

aataacggtg aactgagtag ctacctgatc gacatcacca aagacatctt cactaaaaaa    12000

gatgaagacg gtaactacct ggttgatgtg atcctggatg aagcggctaa caaaggtacc    12060

ggtaaatgga ccagccagag cgcgctggat ctcggagaac cgctgtcgct gattaccgag    12120

tctgtgtttg cacgttatat ctcttctctg aaagagcagc gtgttgccgc atctaaagtt  12180

ctctctggcc cacaagcgca gccagctggc gacaaaggtg agttcatcga aaaagttcgt  12240

cgtgctctgt atctgggtag tcgcgctgcg cctggattaa gttcgcaggc agaacagcgg  12300

cacggtagct atcgtaatag gcaaccgcag cggcgaaggt cggaaccggg ataccgttct  12360

gtactgcata agcaacaaca cacgcagcgc ctgctggtag tcatcggcaa tttgcttgaa  12420

gtacggagcc agca                                                    12434

表1大肠杆菌019型的O抗原基因簇中的寡糖单位处理基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物	反向引物	PCR产物的长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								Wzx	O-抗原转运酶	4157-5413	4259-4274	4560-4575	317bp	0*	56
			4312-4327	4880-4895	584bp	0*	56
								Wzy	O-抗原聚合酶	5415-6539	5834-5849	6410-6425	592bp	0*	56
			5626-5641	5987-6003	378bp	0*	56

^*只在大肠杆菌O19型中得到正确的一条带

表2166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号                  该组中含有的菌株                                 来源

1、野生型大肠杆菌   O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，     IMVS^a

                    O20，O21，O22，O23，O24

2、野生型大肠杆菌   O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，     IMVS^a

                    O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43

3、野生型大肠杆菌   O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，     IMVS^a

                    O57，O58，O60，O61，O62，O53

4、野生型大肠杆菌   O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77.O78，          IMVS^a

                    O79，O80，O81，O82，O83，O68

5、野生型大肠杆菌   O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，         IMVS^a

                    O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97

6、野生型大肠杆菌   O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，            IMVS^a

                    O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117

7、野生型大肠杆菌   O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，          IMVS^a

                    O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140

8、野生型大肠杆菌   O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，          IMVS^a

                    O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153                  b

9、野生型大肠杆菌   O168，O169，O170，O171，O172，O173，                            c

    痢疾志贺氏菌    D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13          d

10、鲍氏志贺氏菌    B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，  d

                    B16，B17，B18

11、福氏志贺氏菌    F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，      d

                    DS，DR

12、野生型大肠杆菌  O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155， IMVS^a

                    O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119

 13、第1组菌株加上大肠杆菌标准菌株O19                                               IMVS³

为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阳性对照

a.Institute of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余米自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3大肠杆菌O19型O抗原基因结构图

表4大肠杆菌O19型O抗原基因簇基因位置

ATCGAAAAAC CCGGATCAGC CGCAGACGCT GGACTCAGAC ATCATGGCCG TTGGTCGCTA    60

TGTGCTTTCT GCCGATATTT GGCCGGAACT AGAACGCACT CAACCAGGTG CATGGGGACG    120

TATTCAGCTG ACTGATGCCA TTGCCGAACT GGCGAAAAAA CAGTCCGTTG ATGCCATGCT    180

GATGACTGGA GACAGCTACG ACTGCGGTAA AAAAATGGGC TATATGCAGG CGTTTGTGAA    240

GTATGGGCTG CGCAACCTAA AAGAAGGGGC GAAGTTCCGT AAAGGGATTG AGAAGCTGTT    300

AAGCGAATAA TGAAAATCTG ACCGAATGTA ACGGTTGATA AGAAAATTAT AACGGCAGTG    360

AAGATTCGTG GCGAAAGTAA TTTGTTGCGA ATATTCCTGC CGTTGTTTTA TATAAACAAT    420

CAGAATAACA ACGAGTTAGC AATAGGATTT TAGTCAAAGT TTTCCAGGAT TTTCCTTGTT    480

TCCAGAGCGG ATTGGTAAGA CAATTAGCGT TTGAATTTTT CGGGTTTAGC GCGAGTGGGT    540

AACGCTCGTC ACATCGTAGG CATGCATGCA GTGCTCTGGT AGCTGTAAAG CCAGGGGCGG    600

TAGCGTGCAT TAATACCTCT ATTAATCAAG CTAAGAGCCG CTTATTTACA GTATGCTCTG    660

                        orf1的起始

AAGTAATATG GAATAAAAAA  GTGAAGATAC TTGTTACTGG TGGCGCAGGA TTTATTGGTT  720

CTGCTGTAGT TCGTCACATT ATAAATAATA CGCAGGATAG TGTTGTTAAT GTCGATAAAT    780

TAACGTACGC CGGAAACCTC GAATCACTTG CTGATGTTTC TGATTCTGAA CGCTATGTTT    840

TTGAACGTGC GGATGTTTGC GATGCAGCTG CAATGGCGCG GATTTTTGCT CTGCATCAGC    900

CGGATGCAGT GATGCACTTG GCTGCTGAAA GCCATGTGGA TCGTTCCATT ACAGGCCCTG    960

CGGCATTTAT TGAAACCAAT ATTGTTGGTA CTTATGTCCT TTTGGAAGCC GCTCGCAATT    1020

ACTGGTCTGC TCTTGATAGC GACAAGAAAA ATAGCTTCCG TTTTCATCAT ATTTCTACTG    1080

ACGAAGTCTA TGGCGATTTG CCTCATCCTG ACGAAGTAAA TAATAAAGAA GAATTACCCC    1140

TCTTTACTGG GACGACAGCT TACGCGCCAA GCAGCCCATA TTCTGCTTCT AAAGCATCCA    1200

GCGATCATTT AGTCCGCGCG TGGAAACGTA CCTATGGTTT ACCGACCATT GTGACTAACT    1260

GTTCGAATAA CTACGGCCCT TATCACTTTC CGGAAAAATT GATTCCGCTG GTAATTCTTA    1320

ATGCTCTGGA AGGTAAGGCA TTACCTATTT ATGGCAAAGG GGATCAAATT CGTGACTGGC    1380

TGTATGTTGA AGATCATGCG CGTGCGTTAT ATACCGTCGT AACCGAAGGT AAAGCGGGTG    1440

AAACTTATAA CATTGGTGGA CACAACGAAA AGAAAAACAT CGATGTAGTG CTCATTATTT    1500

GTGATTTGTT GGATGAGATT GTACCGAAAG AGAAATCTTA CCGCGAGCAA ATTACTTATG    1560

TTGCCGATCG TCCGGGACAC GATCGCCGTT ATGCGATTGA TGCTGACAAG ATTAGCCGCG    1620

AATTGGGTTG GAAACCACAG GAAACGTTTG AGAGCGGGAT TCGTAAAACG GTGGAATGGT    1680

ACCTGGCTAA TGCAAAATGG GTCGGAAATG TGAAAAGTGG TGCCTATCAG TCATGGATTG    1740

                 orf1的终止orf2的起始

CACAGAACTA TGAGGGTCGC CAG TAATGAA TATCCTCCTT TTCGGCAAAA CAGGGCAGGT  1800

AGGTTGGGAA CTACAGCGTG CTCTGGCACC TCTGGGTAAT TTGATTGCTC TTGATGTCCA    1860

CTCCACTGAT TATTGTGGTG ATTTTAGTAA CCCTGAAGGG GTGGCTGAAA CAGTCAAAAG    1920

AATTCGACCT GATGTTATTG TTAATGCTGC GGCTCATACC GCAGTAGATA AGGCTGAGTC    1980

AGAACCCGAA TTTGCACAAT TACTCAATGC AACTAGCGTT GAATCAATTG CAAAAGCGGC    2040

TAATGAAGTT GGGGCTTGGG TAATTCATTA CTCAACTGAC TACGTATTCC CTGGAAATGG    2100

TGACATGCCA TGGCTGGAGA CGGATACAAC CGCTCCGCTG AATGTTTATG GTGAAACTAA    2160

GTTAGCCGGA GAAAAAGCAT TACAAGAACA TTGTCCTAAG CACCTTATTT TCCGGACTAG    2220

CTGGGTCTAT GCAGGCAAAG GAAATAACTT CGCG AAACG ATGTTACGTC TGGCAAAAGA    2280

GCGCGAAGAA TTAGCGGTTA TTAACGATCA GTTTGGTGCA CCAACAGGTG CTGAACTGCT    2340

GGCTGATTGT ACGGCACATG CAATTCGTAT GGCACTGAAT AAACCAGAAG TCGCAGGTTT    2400

GTACCATCTG GTAGCCAGTG GTACCACAAC CTGGCACGAT TATGCTGCGC TGGTTTTTGA    2460

AGAGGCACGA AAAGCAGGTA TTCCCCTTGC ACTCAACAAG CTCAACGCGG TACCAACAAC    2520

AGCTTATCCT ACACCAGCTC GTCGTCCACA TAACTCTCGT CTTAATACAG TAAAATTTCA    2580

GCAGAACTTT GCGCTTGTCT TGCCTGACTG GCAGGTTGGC GTGAAACGAA TGCTCAACGA    2640

                       orf2的终止

ATTATTTACG ACTACAGCAA TT TAATAGTT TTTGCATCTT GTTCGTGATG GTGGAGCAAG  2700

                       orf3的起始

ATGAATTAAA AGGAATGATG AA ATGAAAAC GCGTAAAGGT ATTATTTTAG CGGGTGGTTC  2760

TGGTACTCGT CTTTATCCTG TAACTATGGC TGTCAGTAAA CAGCTGTTAC CGATTTATGA    2820

TAAACCGATG ATCTATTATC CGTTGTCTAC ACTGATGTTA GCGGGTATTC GCGATATTCT    2880

GATTATCAGT ACGCCACAGG ATACTCCTCG TTTTCAACAG TTGCTGGGTG ATGGCAGCCA    2940

GTGGGGCCTG AATCTTCAAT ACAAAGTGCA ACCGAGCCCA GACGGTCTTG CGCAAGCATT    3000

TATCATCGGT GAAGAGTTTA TTGGTGGTGA TGACTGTGCT TTGGTTCTTG GTGATAATAT    3060

CTTCTACGGT CACGATCTGC CGAAGTTAAT GGAAGCACCT GTTAACAAAG AAAGTGGCGC    3120

AACGGTATTT GCTTATCACG TAAATGATCC TGAACGCTAC GGTGTCGTTG AGTTTGATAA    3180

AAACGGTACG GCAATTAGCC TGGAAG AAA ACCGCTACAG CCAAAAAGTG ATTATGCGGT    3240

GACTGGGCTT TATTTCTATG ATAACGACGT TGTCGAAATG GCGAAAAACC TTAAGCCATC    3300

TGCACGTGGT GAACTGGAAA TTACCGATAT TAACCGTATT TATATGGAAC AAGGGCGTTT    3360

GTCTGTTGCT ATGATGGGTC GTGGTTATGC ATGGCTGGAC ACGGGGACAC ATCAAAGTCT    3420

TATTGAAGCA AGCAACTTCA TTGCAACAAT TGAAGAGCGT CAGGGACTGA AAGTTTCCTG    3480

CCCGGAAGAA ATTGCTTACC GTAAAGGGTT TATTGATGCT GAGCAGGTGA AAGTATTGGC    3540

                                                       orf3的终止

TGAACCGTTG AAGAAAAATG CTTATGGTGA GTACCTGCTA AAAATGATTA AAGGTTATTA    3600

    orf4的起始

ATAAA ATGAA CGTAATTAAA ACAGAAATTC CAGATGTATT AATTTTCGAG CCGAAAGTTT  3660

TTGGTGATGA ACGTGGTTTC TTTTTTGAGA GCTTTAACCA GAAGGTTTTT GAGGAAGCTG    3720

TAGGCCGCAA AGTTGAATTT GTTCAGGATA ACCATTCGAA GTCCAGTAAA GGTGTTTTAC    3780

GCGGGCTACA TTATCAGTTA GACCCTTATG CACAAGGAAA ATTGGTGCGC TGCGTAGTTG    3840

GTGAAGTTTT TGATGTAGCG GTTGATATTC GTAAATCGTC ACCTACATTT GGGAAATGGG    3900

TTGGGGTAAA TTTGTCTGCT GATAATAAGC GCCAGTTGTG GATCCCGGAA GGGTTTGCGC    3960

ATGGATTTTT GGTGTTGAGT GAAACGGCTG AGTTTTTGTA TAAGACGACA AATTATTATC    4020

ATCCTGATGC TGAAGGTTCA TTACGTTGGA ATGATGATGA TATTAATATT AATTGGCCAT    4080

CATCATACGG TATCACTCTA TCAAAGAAGG ATGAAAATGC ACCGTACTTC AACAGAATAA    4140

           orf5的起始orf4的终止

TCGGTAATGG AATTTT ATGA GTTTATTTAA AAACGCTGGC TGGAATATTT TAGGTCTGGT    4200

TATTCCACTT ATTATGGCGA TCCCCGTTAT GGGGATCATG GCTCGTTTAT TAGGTGTTGA      4260

ACGCTTTGGT CTTTTCACTA TTGCTTATGC TTTAATGGGA TATGCAAGTG TTTTTGATGG      4320

CGGAATATCT CGTGCAGTTA TTCGGTTTGT ATCTATTTAT AGAAATGACA ATGAAAAAGT      4380

TAATGTTATT TTAGGTTCTT CTATATATAC GGTAACTGTT TTAAGTATCC TAATAGCATT      4440

ATTAACTTAT TTAGTATCAC CAAATTTGGT TGTTTTTTTA AAAGTATCAC AGGATATTCG      4500

ACATGAAGTT GTAATAGCTC TTCAGCTACT GGGGGCATGT ATCCCTGCAT TACTACTTAC      4560

ACAAGTATGG CGAGCATATC TTGAAGGTGT CGAAAATTTT TCTTCTTTGA ACATTCAACA      4620

AGTTCTAACA AGTCCTTTCA TAATATTATT ACCATTAACC ACAACATGGT TTTCACAAAC      4680

TCTTATTTCA GCAGTATTAG GGTTGATTTT GGGACGCTGG ATTGTTGCAT TTATTAGTTG      4740

GAAACTTTGT TCGCGCCATC TTAAAAATTT CAAAAGAACA TTTAGTCGAA AAGCTTTGAT      4800

GGAGCTTATT AGCTTTGGTG GATGGGTAAC TCTGAGTAAT ATTATAGGCC CTTTAATGGG      4860

GTTTATTGAT CGTTTTGCTG TCTCACATTT CGCTGGCGCT AATGTTGTTG CTTACTATTC      4920

AGGGCCGTCT GATATGGTAT CTCGACTTAC TTTATTTCCT GGGGCTGTTG CCAGGGCTCT      4980

ATTTCCAAAA CTAAGTTTTG AAACTAGAGA AGAGAGCAAA GTTACATATT TTCGATCTCT      5040

AATTCTCGTT TTTTGTTTAT CTTTTCTTTT AGCATTGCCA TTTTTCTTAT TTTCAAGCGA      5100

TATATTAGGT ATATGGTTAG GAAATGAGTA TAGAGGAGAT GCAGCGGTCG TATTTCGCAT      5160

ATTGTTAATT GGATTTGTTT TTAATTCAAT AGCACAAATA TGTTTTGCTA GAATTCAGTC      5220

TGCTGGATTT GCGAAATGGA CTGGTATTGT GCATATTATG GAATTCATAC CATACTTGGT      5280

TCTTTTGTAT TTACTGACCG TCAAATATTC TTTTTTTGGA GCTGCGTTCG CCTTTTCATT      5340

AAGGTCATTA TTGGATTTTA TAATTCTATT CCTGGTTGAA AGGATCGGTA TCTATAACAT      5400

      orf5的终止orf6的起始

GGATAGGATA  TAAT ATGAAT GTCGTTCAAG CAATGGTTAT AATATACCTT TGTTACCTAA  5460

TTATATGTTT CTTCTTTAGG CTTGAAATAA CACATCCAGC AGTTGTACAT ACGATAATTT      5520

GGCTTATAAG CGCGAGCTTA GCTCTTGTTT TTGCTGAAGA AAAATATTTG CCAAATAACT      5580

ATTATATAGT TATAGCAAAC TCAATGTTTT TTATTTTTTC TTTCATTGGT GGAATTGGTG      5640

TTTTTAATAA AAATAAAGCT TTTCAGTTAA ATATTGATAA AAATTCTTAT GTAAATGCTT      5700

TACCATTTTG TTTAATAATA TCATTTTATT TGATTATACT AATAACCTAT AATGTGAATG      5760

TTTTATCAAA CATATCAGCG TTCCGAGATT ATCTGGTTGC TGACGATGGT GCTAATTATG      5820

GTTTATTAGG GCGTATCGCA ATGTTATCGC TCTTCTCTTC TTGTTTTTTA CTTTTGAGAA      5880

GTCGAAGGCT TTTTTTACTT AGCGCCGTGT TGTGCATCCC TATAATTATT ATACTAAGTG      5940

CAAAAACCTT AGTTCTATTG TATTTAATAA CGATACTAAT TTTAACTCCA AACAGGCTGA      6000

AAATATCAAA ACTACTAATC TTCTTTAGCA TATTTATTCT TTTCTTTATT GGGATAATGA      6060

GGCTTCGATA TCCAGAAGCA TCTTTTAATT TAATTTTATA TTATTTATAT AATTATATTT      6120

CAGGTGGATT TTTGGCTTTT TCACAATTGC CGAATTCATT TAATCAAGTT TTTGGTTTTT      6180

ATTCTTTCAG AAACTTTTAC CTTTGGTTAA ATGTGCTCTA TCCAGTCGAG ATCGCAAACA      6240

TTCTTCAAGA GTGGGTAAAT GTCCCATTTC CTGTCAATGT ATATACGTAT CTTCGCCCTT      6300

ATTATATGGA TTTTGATTAT TTATCATTAT TTTTCCCAAT TATCTTTGGC TTTTTTTCGG      6360

GAAGAATATA TATGGAAAG  TATAAAAATA GACGCATTTA TTATATTGTA TACCCGATAA      6420

CCTTTTACGC AATAGCAATG CAGCTATTTG ATGATCAATA TCTTACATGG TTATCAAACT      648C

                                             orf7的起始orf6的终止

GGATATTGCT TATAATTACA GGCTATATAA TGACTTGGGA GGGGGT ATGT CGAAAA TAGC  6540

AGTTTTGATA GTAACGTATA ATCCAGTTTT AAGTGTGTTG GATGATCTAA TTGGAAAGAT      6600

AAAAAAAGCT AAATATAATT TAGAAATATT TCTCGTTGAT AATGCTAGTG AAAATGCTAA      6660

TATATTAAAA GCTAAATTTA AGGACGAGCC CAATATATTA TTCCTTGATG AAAATTTGGG      6720

ATTGGCTGGG GCACAAAATG TAGGTCTGAA AAAAATATTA CGAACAGACT GTGAAGCAGT    6780

CCTTTTTTTT GATCAAGATA CTTCCCCTAC AGATGTATTT TTTACTAATT TGATAGAGTC    6840

TATGTCAAAG TTAGCTCTAC AGGGAGAAAA AATTGGTGCT ATTGGACCTG TTTTTTACGA    6900

CTCAAGGACA GGAACCAAAT ATCCATTTAT TCTCTTAAAA AGAATCCGAG CTAAGAAGCT    6960

TTTTCCAACA GGTAATGTCC CGCTTAAAGT TTCATTTTTA ATAAACTCAG GTATGCTAGT    7020

ACCAGTAAGC ACATTAAAAG ATGTTGGGTT AATGAAAGAG GAATTATTTA TAGACTATGT    7080

CGATATTGAA TGGTGCCTCC GAGCTGCAAG TAAAAAGTTT AACTTTTACG CTATTCCCGA    7140

TGCAACGATG AGTCATGCAT TAGGAGATGA GCGTAAATCA ATTTTGGGAA GAGAAATTAG    7200

CATACACAGC CCTTTGAGAC GTTATTATTT AGCAAGAAAT TCTATTTATA TGCTGCGTTT    7260

ACCATACGTT CCTTTGGGGT ATAAAATAAG AGAAATTTTG TTTTCATTGT TGAGAACAGC    7320

GATATTTATA TCAACTGTTA ATAATAAGAA GGTTTATGTT GATTTTATTC TAAAAGGTTG    7380

                                                 orf7的终止

GTCGGATGGC ATTAAAAAAA ATTATGGGAA GTATGTTGGA ATAAAG TAGA TATTTTTTTT  7440

                                                 orf8的起始

GAAACGAATA AACTTGGACA AATTTAATCC CTTTCAATGG AGAAAAAA GT GATTAGTTCG  7500

GTTACAGTTA CATATAACCC AGATATTGAA TGCCTCAGAC AGCAACTTTT ATCAGTACGT    7560

AAGCAGGTTG ATTTATGTGT AATTGTTGAT AATGGCTCAA ACAATATTAT TGAGATTAAA    7620

AAATTAAATT ATGAGTTTGA TTTTTATCTT ATTCAATTTG ATGATAATTA TGGTCTCGCA    7680

TATGCACAAA ATAGTGGTAT AGAATATGCC ATATCTTCTG GTACAGAATA TTTATTATTG    7740

TTGGATCAAG ATAGTATCTT GAAAGATGAA TTTTCTAAGA ACATGAAGCA TATATATATA    7800

AAATATAATG TTGGGATTTT AGGACCTTCA TTTTATGATC CTCAAAACAA TAAAATTTAT    7860

TTTGGGACTT GTTATAAAGG ACCTTTTATT AGCCGTAAGT CTATCGGTGA GGTTACCGAT    7920

GTTACTTTTG TCATTGCATC GGGCTCCTTT TTTTCATCAG ATGTTTATAA AAAAATTGGA    7980

GGAATGAAAT CTGAACTTTT TGTGGATTAT ATTGATGTTG AATGGTCTCT TAGAGCAAAA    8040

AATATGGGAT ACAGAGTGTG TATGACTAAC AGGGCTTTAA TGGCTCATAC AATTGGTGAT    8100

TCCAGAATTA CAATTTTTGG GCGGACAATA TCGGTGCATA GCCCCATAAG ACGTTATTAT    8160

TTAGTTAGAA ATAGTTTCTA TATGCTAAGG TTGCACTATG TGCCTATTGG ATATAAAGTT    8220

CGCGAAATTT TCTTTAATTG TTTACGATCA ATAATTTCTC TAATAATAAG TGACAAAAAG    8280

GGTAATGTAA TAACTAAACT AGGTCAAGGA ATATATGACG GTATTCGTGG GAAATATGGT    8340

               orf8的终止

GATTATAAAG ATAGA TAATA TTAATTCATC CGTTGCGTCA CAATTAAATT AGAATTCATG  8400

TACAAATTAA TACAAAGGAA AAGTAATACT TAAAGTATAT TCAACACTAA ATAATTCACT    8460

TTTCCTATCA TGGAAAGATC ATCGGTGTGC TGTAGGCACA AAGATGCAAA ACGGGACGTT    8520

TTGCATGTAA TAAGCATAAG CTTGTAAAGA GATGGTGGCA GGCAGGGAAA GATCATCAGA    8580

AGTTCACTTT TTGTACTAAA TAATTCGCAT TTTATGTTTA AAAATTGAGA TATTCCTTAT    8640

TACCTAAAGC TGTTTTTTAT TGCTTATACA TGATCAAATA CTCCTTACAT AATTAAGGAG    8700

AACAAAATGG AACTTAAAAA GTTGATGGAA CATATTTCTA TTATCCCCGA TTACAGACAA    8760

GCCTGGAAAG TAGAACATAA ATTGACAGAT ATTCTACTGT TGACTATTTG CGCCGTCATT    8820

TCTGGTGCAG AAGGCTGGGA AGATATAGAG GATTTTGGTG AAACACATCT CGATTTTTTG    8880

AAGCAATATG GTGATTTTGA AAATGGTATT CCTGTCCACG ATACCATTGC CAGAGTTGTA    8940

TCCTGTATCA GTCCTGCAAA GTTTCACGAG TGCTTTATTA ACTGGATGCG TGACTGCCAT    9000

TCCTCAAATG ATAAAGACGT TATTGCAATT GATGGAAAAA CGCTCCGGCA CTCTTATGAC    9060

AAGAATCGCC GCAAGGGAGC GATTCATGTC ATTAGTGCGT TCTCAACAAT GCACAGTCTG    9120

GTTCTCGGGC AGATTAAGAC GGATGAGAAA TCCAATGAGA TTACAGCCAT TCCTGAACTT    9180

CTTAACATGC TGGATATTAA AGGAAAAATC ATCACAACTG ATGCGATGGG GTGCCAGAAA    9240

GATATTGCAG AGAAGATACA AAAACAGGGC GGTGATTATT TATTCGCTGT AAAAGGAAAC    9300

CAGGGGCGGC TTAATAAAGC CTTTGAGGAA AAATTTCCGC TGAAAGAATT AAATAATCCA    9360

GAGCATGACA GTTACGCTAT TAGTGAAAAG AGTCACGGCA GAGAAGAAAT CCGTCTTCAT    9420

ATTGTTTGCG ATGTCCCTGA TGAACTTATT GATTTCACGT TTGAATGGAA AGGGCTGAAG    9480

AAATTATGCG TGGCAGTCTC CTTTCGGTCC ATAATAGCAG AACAAAAGAA AGAGCCAGAA    9540

ATGACGGTCA GATATTATAT CAGTTCTGCT GATTTAACCG CAGAGAAGTT CGCCACAGCA    9600

ATCCGAAACC ACTGGCACGT GGAGAATAAG CTGCACTGGC GTCTGGACGT GGTAATAAAT    9660

GAAGACGACT GCAAAATAAG AAGAGGAAAT GCAGCAGAAT TATTTTCAGG GATACGGCAC    9720

ATCGCTATTA ATATTTTGAC GAATGATAAG GTATTCAAGG CAGGGTTAAG ACGTAAGATG    9780

CGAAAAGCAG CCATGGACAG AAACTATCTG GCGTCAGTCC TTGCGGGGAG CGGGCTTTCG    9840

TAATCTCGCC CTGACATGGA CCTCTAAGGC GATATTAATT GTTTGAAAAT TATATCTCAA    9900

ATTTAAAAAT GAGCTGTATG CTGTTAGAGT ATAAAATATG TGTTTTTATA TTGGAAGGTT    9960

TTTAGTGAGC ATGATTTTAA CCAAAAATAT AAATACTTTA CTTTCATACA CTATAACATC    20020

                                                       0rf9的起始

AATTAAGGAT GGAATAAATG GTGAAACGGG GGAATATAAA GGATAACAAC TCATT ATGAA  10080

AAAAATAATA CATATCCAAG TGTTGCCAAA AATGTCTGGG GTTCAGCAAG TCTCTTTTGA    10140

TATTTTGTCA GGGATTAATG ACGAAAATGT ACAAAAATTT ATATTATGTG GTTCACCAGA    10200

TGGCAGTTCA GATGATGATT TTAAACAGAA ATTTACTGAT ATAGGTGTTA GGGTTATTAC    10260

GATGCCTTCA TTAAAACGAA ATATCGGGTG GCATGATTTT CGATGTTTCA TTGATTTATA    10320

CAATTTCTTT AAAAAGGAAA AGTTTGATAT AGTTCATACA AACTCAACTA AGCCAGGAAT    10380

AATAGCTAGA ATAGCCGCTA GATTAGCTGG GACAAAACTC ATTATTCACA CAGTACATGG    10440

AATCGCATTT CATAGAAAAG AAAATACTGT AAGGAAAATT TTTTACTATT GCCTTGAAAA    10500

TTTTGCAACA CTTTTTGGTA GCATTAATGT GACAGTGAAC GAGAATTATT TAAAATATTA    10560

TCCATTCGTT AAAAGTCACA TTGTATATAA TGGAGTTGAT TTCAACGTTC TTTGCTGCAA    10620

TAAAAAGGAT CATGATTTTT TACATATTGC ATTTATGGCT AGACTTGATA AACAAAAAAA    10680

CCCTTTGGAG TTTATAAGAG CCGTTAATAT TATTAAGAAA AAATTACCAA ATGAGCGTTT    10740

GAAATTTACA TTGGCTGGCT GTGGTGAGTT AGAAAATGAA TGTAAAAAAT TAATAGAACA    10800

TTTTCATCTT ACAGATGTTA TTGATATGCC TGGATGGATA GTAGATAAAA ACACATTTTA    10860

TAACTCTGTC GATATTATTT GCCAGCCATC CAATTGGGAG GCTTTTGGCT TAGTATTTGT    10920

TGAGGCCGCA TTTTTTGAAA TTCCATCTGT TTCAAGGAAT ATTGAAGGGA TTCCTGAGGT    10980

TATTTTAGAT AATGAAACTG GGCTTTTGTA TGAGGGTGGA GAAGCCGAGT TGAGTGAAAA    11040

GCTGATATCA TTAATTCATG ATAAAAAGAA AATTTCTTGG TTAGGTTTGA ATGCTAAAGA    11100

ATATGTCTTA AAGCATTTCA CCAAAGATAT CATGGTTGAA AAATATTCAA AACTGTATGA    11160

   orf9的终止

TTTATAAGTA TCTAATTAAA TTTCACTATG ATTTTTGCAT TATGATATTA TAGACCCGTG    11220

TATTTTTTCA AGCCGCACGC CCTCGCGGTG ACCACCCCCT GACAGGAGTA AACAATGTCA    11280

AAGCAACAGA TCGGCGTAGT CGGTATGGCA GTGATGGGGC GCAACCTTGC GCTCAACATC    11340

GAAAGCCGTG GTTATACCGT CTCTATTTTC AACCGTTCCC GTGAAAAGAC GGAAGAAGTG    11400

ATTGCCGAAA ATCCAGGCAA GAAACTGGTT CCTTACTATA CGGTGAAAGA GTTTGTTGAA    11460

TCTCTGGAAA CGCCTCGTCG CATCCTGTTA ATGGTGAAAG CAGGTGCAGG CACGGATGCT    11520

GCTATTGATT CCCTCAAGCC ATACCTCGAT AAAGGTGACA TCATTATTGA TGGTGGTAAT    11580

ACCTTCTTCC AGGACACCAT TCGTCGTAAC CGTGAGCTTT CTGCCGAAGG TTTTAACTTC    11640

ATCGGTACCG GTGTTTCCGG CGGTGAAGAG GGGGCGCTGA AAGGGCCTTC CATCATGCCT    11700

GGTGGGCAGA AAGAAGCCTA TGAACTGGTT GCGCCGATCC TGACCAAAAT CGCCGCCGTT    11760

GCTGAAGATG GCGAACCGTG CGTTACCTAT ATTGGTGCCG ATGGCGCAGG TCACTATGTG    11820

AAGATGGTTC ACAACGGTAT TGAATATGGC GATATGCAGC TGATTGCTGA AGCCTATTCT    11880

CTGCTTAAAG GTGGCCTGAA CCTCACCAAC GAAGAACTGG CGCAGACCTT TACCGAGTGG    11940

AATAACGGTG AACTGAGTAG CTACCTGATC GACATCACCA AAGACATCTT CACTAAAAAA    12000

GATGAAGACG GTAACTACCT GGTTGATGTG ATCCTGGATG AAGCGGCTAA CAAAGGTACC    12060

GGTAAATGGA CCAGCCAGAG CGCGCTGGAT CTCGGAGAAC CGCTGTCGCT GATTACCGAG    12120

TCTGTGTTTG CACGTTATAT CTCTTCTCTG AAAGAGCAGC GTGTTGCCGC ATCTAAAGTT    12180

CTCTCTGGCC CACAAGCGCA GCCAGCTGGC GACAAAGGTG AGTTCATCGA AAAAGTTCGT    12240

CGTGCTCTGT ATCTGGGTAG TCGCGCTGCG CCTGGATTAA GTTCGCAGGC AGAACAGCGG    12300

CACGGTAGCT ATCGTAATAG GCAACCGCAG CGGCGAAGGT CGGAACCGGG ATACCGTTCT    12360

GTACTGCATA AGCAACAACA CACGCAGCGC CTGCTGGTAG TCATCGGCAA TTTGCTTGAA    12420

GTACGGAGCC AGCA                                                      12434

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1、一种对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于：其wzx序列为SEQ ID NO：1中的4157至5413碱基的核苷酸或wzy序列为SEQ ID NO：1中的5415至6539碱基的核苷酸或者具有上述序列插入、缺失或取代一个或多个核苷酸，但保持wzx、wzy核苷酸特异性检测大肠杆菌O19型的O-抗原功能的寡核苷酸。

2、一种对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于，其为源于wzx基因的寡核苷酸对：SEQ ID NO：1中的4259至4274碱基的核苷酸和4560至4575碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的4312至4327碱基的核苷酸和4880至4895碱基的核苷酸；或源于wzy基因的寡核苷酸对：SEQ ID NO：1中的5834至5849碱基的核苷酸和6410至6425碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的5626至5641碱基的核苷酸和5987至6003碱基的核苷酸。

3、权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的寡核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原中的应用。

4、按照权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O19型的O-抗原特异的寡核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测体外及环境中的细菌。