CN1234857C - 对大肠杆菌o51的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O51(Escherichia coli O51)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O51中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO:1所示的分离的核苷酸，全长13343个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO:1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O51的O-抗原基因簇中的寡糖单位处理基因(包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因)的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O51的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O51的方法。

Description

对大肠杆菌O51的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O51(Escherichia coli O51)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O51中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O51并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

大肠杆菌O51是一种致病菌，曾经从患膀胱炎的病人的尿液中分离到大肠杆菌O51[Hebelka M et al(1993)“Sexual acquisition of acutepyelonephritis in a man”.Scand J Infect Dis，25(1)：141-3]。另外有报道说它是一种兼性的EPEC(Enteropathogenic Escherichia coli)，能引起两岁以下儿童的肠炎[Czirok E et al(1976)“The role in sporadicenteritis of facultatively enteropathogenic Escherichia coliserogroups”Acta Microbiol Acad Sci Hung.23(4)：359-69]。因此对大肠杆菌O51的检测是重要的，需要一个可以快速、准确地检测大肠杆菌O51的方法。

位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank etal(1987)“The function of antibody and complement in the lysis ofbacteria”.Rev Infect Dis 177：1750-1753.Pluschke G et al“Role ofthe capsule and the O-antigen in resistance of O18：K1 Escherichia colito complement-mediated king”.J Bacteriol 42：907-913]。大肠杆菌是一个种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]。

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clus ters：gene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enteric)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Eschericia coli O111”.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O51的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O51的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。

本发明的一个目的是提供了大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的基因：转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因；糖合成路径基因，包括rmlB、rmlD、rmlC、rmlA。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O51的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因，包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因。它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O51的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O51的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O51的O-抗原也是高度特异的。

本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O51的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O51。

本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O51的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQID NO：1所示的分离的核苷酸，全长13343个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O51型的O-抗原特异的核苷酸，其中包括命名为rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，wzx，orf6，wzy，orf8，orf9，orf10，orf11的11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O51的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特异性的基因包括：转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因。其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO：1中的4675至6234碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO：1中的7110至8147碱基的核苷酸；所述的orf6基因是SEQ IDNO：1中的6234至7100碱基的核苷酸；orf8基因是SEQ ID NO：1中的8147至8974碱基的核苷酸；orf9基因是SEQ ID NO：1中的8976至9728碱基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO：1中的9725至10837碱基的核苷酸；orf11基因是SEQ ID NO：1中的10849至12459碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O51的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O51的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的4861至4878碱基的核苷酸和5624至5641碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的5522至5539碱基的核苷酸和6044至6061碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的7735至7718碱基的核苷酸和8123至8140碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的7410至7427碱基的核苷酸和7755至7772碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O51型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。

前述的对大肠杆菌O51型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O51型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。

前述的对大肠杆菌O51型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌。

前述的对大肠杆菌O51的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O51型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O51型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O51型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O51型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O51型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O51型的O-抗原的高度特异性；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O51，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O51的灵敏度。

前述的对大肠杆菌O51的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O51，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O51中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O51的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’ATT GTG GCT GCA GGG ATCAAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehr inger Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库；反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10³的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3MNaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O51的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O51的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O51的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因设计引物；在每个基因内各设计两对引物，每对引物分布在相应基因内不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR，所有引物在大肠杆菌O51中得到阳性结果，在其他组中没有扩增到任何大小正确的带，也就是，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O51及其O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：将大肠杆菌O51的冻存菌液接种到有LB培养基的三角瓶中，30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时至饱和，取培养好的菌液稀释，取稀释菌液涂布LB琼脂平板，30℃至40℃，培养数小时计数，计算原液中活菌浓度；在5份重量均为20g的生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入LB培养基，过滤，过滤液于30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时；从培养好的菌液中取数ml于6,000g离心数分钟，去上清，加MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100℃沸水中煮数分钟，裂解液于12,000g离心数分钟，取上清做为PCR模板；用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的4861至4878碱基的核苷酸和5624至5641碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的5522至5539碱基的核苷酸和6044至6061碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的7735至7718碱基的核苷酸和8123至8140碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的7410至7427碱基的核苷酸和7755至7772碱基的核苷酸进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环；反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性；参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果；参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果；说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O51的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长13343个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，它包括命名为rmlB，rmlD，rmlA，rmlC，wzx，orf6，wzy，orf8，orf9，orf10，orf11的11个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O51的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括fmlB、rmlD、rmlC、rmlA。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是特异的，而本发明涉及的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因对大肠杆菌O51的O-抗原是特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O51的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基转移酶基因包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源于大肠杆菌O51的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O51为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O51及它们的O-抗原是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O51的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O51中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的4675至6234碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的7110至8147碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O51都是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O51。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O51表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O51。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O51。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf6、orf8、orf9、orf10、orf11基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O51的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取。

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O51，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O51中的O-抗原基因簇

以大肠杆菌O51的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库。

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10³的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃ 6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O51的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序。

从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到，最后获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析。

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O51的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到11个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1与Shigella boydii的dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱氢酶在361个氨基酸中有97％的相同性，98％的相似性。dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱氢酶由rmlB基因编码，高度的相同性表明orf1也是rmlB基因，命名为rmlB。Orf2与Shigella boydii的dTDP-D-葡萄糖-4-鼠李糖还原酶在299个氨基酸中有95％的相同性，98％的相似性。dTDP-D-葡萄糖-4-鼠李糖还原酶由rmlD基因编码，高度的相同性表明orf2也是rmlD基因，命名为rmlD。Orf3与Shigella boydii的葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶在292个氨基酸中有97％的相同性，99％的相似性。葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶由rmlA基因编码，高度的相同性表明orf3也是rmlA基因，命名为rmlA。Orf4与Shigella boydii的dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3，5-变位酶在180个氨基酸中有79％的相同性，83％的相似性。dTDP-D-葡萄糖4，6-脱氢酶由rmlC基因编码，较高的相同性表明orf4也是rmlC基因，命名为rmlC。这四个基因共同合成鼠李糖。说明在大肠杆菌O51的O-抗原中有鼠李糖。Orf5与Oceanobacillus perfringens 31的的O-抗原转运酶Wzx在516个氨基酸的序列中有25％的相同性，51％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法发现orf5有14个潜在的穿膜区，Wzx蛋白的氨基端有一个大约40个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf5是wzx基因，命名为wzx。Orf6与clostriduim acetobutylicum的糖基转移酶在149个氨基酸中有29％的相同性，51％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf6与糖基转移酶家族的保守的功能域PF00535的E value为2×e^-5，推测orf6也是一个糖基转移酶，将orf6暂命名为orf6。Orf7与Escherichiacoli的O-抗原聚合酶在329个氨基酸的序列中有26％的相同性，48％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.etal(1984).Analysis of membrane and surfaceprotein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179：125-142]发现orf7有9个潜在的穿膜区，它与许多Wzy蛋白有相似的二级结构，有一个大的loop，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以确定orf7是wzy基因，命名为wzy。Orf8与Enterococcus faecalis V583的糖基转移酶在205个氨基酸中有27％的相同性，48％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf8与糖基转移酶家族2的保守的功能域PF00534的Evalue为5.3×e^-5，推测orf8也是一个糖基转移酶，暂命名为orf8。Orf9与Enterococcus faecalis的糖基转移酶在240个氨基酸中有37％的相同性，51％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf9与糖基转移酶家族2的保守的功能域PF00534的E value为2.3×e^-22，因此推测orf9也是一个糖基转移酶，暂命名为orf9。Orf10与Escherichia coii的糖基转移酶WbgM在367个氨基酸的序列中有31％的相同性，53％的相似性。在genbank中寻找保守的功能域，发现orf9与糖基转移酶家族1的保守的功能域PF00534的Evalue为4.6×e^-46，推测orf10也是一个糖基转移酶，暂命名为orf10。Orf11与Clostridium acetobutylicum的推测的甘油磷酸转移酶WbgM在469个氨基酸的序列中有27％的相同性，44％的相似性。在genbank中寻找保守的功能域，发现orf11与保守的功能域PF00884的E value为1.7×e^-14，推测orf11也是一个糖基转移酶，暂命名为orf11。

实施例6：特异基因的筛选

针对大肠杆菌O51的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

在表1中列出了大肠杆菌O51的O抗原基因簇的转运酶基因、聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166种血清型的大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166种血清型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。

表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共13组。它们的来源都列于表中。

在第7组中含有大肠杆菌O51的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是不含有大肠杆菌O51的基因组DNA，作为阴性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性2分钟后，95℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第3组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O51及其O-抗原都是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O51中筛选到对大肠杆菌O51的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O51的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O51是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O51，并能鉴定它们的O-抗原。

实施例7：引物灵敏度的检测。

购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O51的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ IDNO：1中的4861至4878碱基的核苷酸和5624至5641碱基的核苷酸，SEQ IDNO：1中的5522至5539碱基的核苷酸和6044至6061碱基的核苷酸，SEQ IDNO：1中的7735至7718碱基的核苷酸和8123至8140碱基的核苷酸，SEQ IDNO：1中的7410至7427碱基的核苷酸和7755至7772碱基的核苷酸进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O51的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O51的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

根据本发明的对大肠杆菌O51型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表3是大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的结构，共由11个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O51的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大肠杆菌O51的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

               SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>对大肠杆菌O51的O-抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>13343

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc     60

gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgaactgcg cgtgaagcgt    120

caactgctgg cggaagtaca gtccatttgc ccgccgggcg tgaccatcat gaacgtgcgt    180

cagggcgaac ttttaggttt gggccactcc atcttgtgtg cacgacctgc cattggtgac    240

aacccatttg tcgtggtact gccagacgtt gtaatcgacg acgccagcgc tgacccgctg    300

cgctataacc ttgctgccat gattgcgcgc ttcaatgaaa cgggacgcag ccaggtgctg    360

gcaaaacgta tgccgggcga tctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agaaccgctg    420

gatcgtgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaattcatag aaaaaccgga tcagccacag    480

acgctggact cagacattat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg    540

gaactggaac gcactcagcc aggtgcatgg ggacgtatcc aactgactga tgccattgcc    600

gaactggcga aaaaacagtc cgttgatgcc atgctgatga ctggtgacag ctacgactgc    660

ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttc gtgaagtatg gcctacgcaa cctgaaagaa    720

ggggcgaagt tccgtaaagg gattgagaag ctgttaagcg aataatgaaa atctgaccga    780

atgtaacggt tgataagaaa attataacgg cggtgagatt cgtggcgaaa gtaatttgtt    840

tcgaatattc ctgccgttat tttatataac aatcagaaca acaacgagtt agcaatagga    900

ttttagtcaa agttttctag gatttccctt gtttccagag cggattggta gacattagcg    960

ttgaattttc cgggtttagc gcgaggtagg taacgctcgt cacatcgtag acatgtatgc   1020

agtgccctgg tagctgtaaa gccaggggcg gtagcgtgca ttaatacctc tattaatcaa   1080

actgagagcc gcttatttca cagcatgctc tgaagtaata tggaataaat taagtgaaaa   1140

tacttgttac tggtggcgca ggatttattg gttctgctgt agttcgtcac attataaata   1200

atacgcagga tagtgttgtt aatgtcgata aattaacgta cgccggaaac ctggaatcac   1260

ttgcagatgt ttctgattct gaacgctatg tttttgaaca tgcggatatt tgtgatgcag   1320

ctgcaatggc acggattttt gctcagcatc agccggatgc agtgatgcac ctggctgctg   1380

aaagccatgt tgaccgttca attacaggcc ctgcggcatt tattgaaacc aatattgttg   1440

gtacttatgt ccttttggaa gctgctcgga attactggtc tgctcttgat ggcgacaaga   1500

aaaatagctt ccgttttcat catatttcta ctgacgaagt ctatggtgat ttgcctcatc   1560

cagatgaagt aaataataca gaagaattac ccttatttac tgagacaaca gcttacgcac   1620

caagcagccc ttattctgca tcaaaagctt ccagcgatca tttagtccgt gcgtggaaac   1680

gtacctatgg tttaccgacc attgtgacta attgctctaa caattatggt ccttatcatt   1740

tcccggaaaa attgattcca ttggttattc tcaatgctct ggaaggtaaa ggattaccta   1800

tttatggtaa aggggatcaa attcgcgact ggctgtatgt tgaagatcat gcgcgtgcgt   1860

tatataccgt cgtaaccgaa ggtaaagcgg gtgaaactta taacattggt ggacacaacg   1920

aaaagaaaaa catcgatgta gtgctcacta tttgtgattt gttggatgag attgtaccga   1980

aagagaaatc ttatcgtgag caaatcactt atgttgccga tcgtccggga cacgatcgcc   2040

gttatgcgat tgatgctgag aagattggta gcgaattggg atggaaacca caggaaacgt   2100

ttgagagcgg gattcgtaaa acggtggaat ggtacctggc taatgcaaaa tgggttgaga   2160

atgtgaaaag tggtgcctat caatcgtgga ttgaacagaa ctatgagggc cgcaagtaat   2220

gaatatcctc cttttcggca aaacagggca ggtaggttgg gaactacagc gttctcttgc   2280

tcctctgggt aacttgattg ctcttgatgt tcactccact gattattgtg gcgatttcag   2340

caacccagaa ggtgtggctg aaaccgtcaa aaaaattcgc ccagatgtta ttgttaatgc   2400

tgcggctcat accgcagtag ataaagctga gtcagaaccc gaatttgcac aattactcaa   2460

tgcgaccagc gttgaatcaa ttgcaaaagc ggctaatgaa gttggggcct gggtaattca   2520

tttctcaact gactacgtat tccctggaaa tggcgacact ccatggctgg agactgatgc   2580

aaccgcaccg ctaaatgttt acggtgaaac caagttagct ggagaaaaag cattacaaga   2640

gcattgtgcg aagtacctta ttttccggac cagctgggtc tatgcaggta aaggaaataa   2700

cttcgccaaa acaatgttgc gtctggcaaa agagcgtgaa gaattagcgg ttattaacga   2760

tcagtttggt gcgccaacag gtgctgaact gctggctgat tgtacagcac atgccattcg   2820

tgtcgcactg aataaaccgg atgtcgcagg cttgtaccat ttggtagcca gtggtgccac   2880

aacctggtac gattatgctg cgctggtttt tgaagaggcg cgcaaagcag gcattcccct   2940

tgcactcaac aagctcaacg cagtaccaac aactgcctat cctacaccag ctcgtcgtcc   3000

acataactct cgccttaata cagaaaaatt tcagcagaac tttgcgcttg tcttgcctga   3060

ctggcaggtt ggcgtgaaac gaatgctcaa cgaattattt acgactacag caatttaata   3120

gtttttgtat cttgttcgtg atggtggagc aagatgaatt aaaaggaatg atgaaatgaa   3180

aacgcgtaaa ggtattattt tagcgggtgg ttctggtact cgtctttatc ctgtaactat   3240

ggctgtcagt aaacagctgt taccgattta tgataaaccg atgatctatt acccgctctc   3300

tacactgatg ttggcgggta ttcgcgatat tttgattatc agtacgccac aggatactcc   3360

tcgttttcaa caactgctgg gtgacgggag ccagtggggc ctgaatcttc agtacaaagt   3420

tcaaccgagt ccggatggtc ttgcgcaggc gtttattatc ggtgaagagt ttatcggtgg   3480

tgatgattgt gctttggttc taggtgataa tatcttttac ggtcacgatc tgccgaagtt   3540

aatggatgtc gctgttaaca aagaaagtgg tgcaacggta tttgcttatc acgtaaatga   3600

tcctgaacgc tacggtgtcg ttgagtttga taaaagcggt acggcaatta gcctggaaga   3660

aaaaccgcta cagccaaaaa gtaattatgc ggtaactggg ctttattttt atgataacga   3720

tgttgtcgaa atgtcgaaaa atcttaagcc ttctgcccgt ggtgaactgg aaattaccga   3780

tattaaccgt atttatatgg aacaggggcg tttatccgtt gccatgatgg ggcgtggtta   3840

tgcatggctg gatacgggga cgcatcaaag tcttattgag gcaagcaact ttattgcaac   3900

aattgaagag cgtcaggggc tgaaagtttc ctgcccggaa gaaattgctt accgtaaagg   3960

gtttattgat gctgagcaag taaaagtgtt agtacaacct ctgaaaaaaa atgcttatgg   4020

tcagtaccta ctaaaaatga ttgaaggtta ttaataaaat gaacgtaatt aaaactgaaa   4080

ttcctgatgt attaattttt gaaccgaaag tttttggtga tgagcgtggt ttctttatgg   4140

aaagctttaa tcagaaagtt ttcgaagagg ctgtagggcg taaggttgaa tttgttcagg   4200

ataaccattc taagtctaat aaaggcgttt tacgcgggct ccattaccag ttagaacctt   4260

atgcgcaagg caaacttgtg cgctgtgttg ttggtgaggt ctttgatgtt gcggttgaca   4320

ttcgaaaatc gtcacctacg tttggcaagt gggttggtgt gaatttgtcg gcggcgaata   4380

agcgccaatt atggataccg gaaggatttg ctcatggctt tttaagccta acagataaca   4440

ctgaattttt gtataaaact aataacttct ataatagaaa ttatgaaaga tgtttaaaat   4500

ttgatgatat agaattaagc atcaaatggc caattggcga cgaaactgag ttgatcgttt   4560

cagaaaaaga tatgttaggc aatattttta gtaaattata gtttttatca tagcggtatt   4620

taagtttaat acttaccgct atgattttta catctttttt gtaaaggtgc ttaaatgcgc   4680

gctagtccat tttttcggtc agttaaatat ggtattgtat tttctatagt aataatgata   4740

cttactttta ttgtaaggca gtgtattatt aattcgtttg gtgaaaattt aacaggttat   4800

tatttgttaa taaaccaatt agtcggttat ctaaatttag ctgaattggg tttaactacg   4860

gcatcagtat atttattgtt caagccgttg aattctgaaa ataaatatga cattgttggt   4920

tatttttata ttattcacag aatatttaaa tttattgcat cagcaatatt atttattggg   4980

ctaacactct cttttattat gccctattta gtcaaagata atataaattg gcatgatatt   5040

tacataccat gggtttttta tgtcattgca acagcattgt cgtattttta tagtgcagaa   5100

actgttttgt taacagcaag tgaaaaacta tatattgttc ggattgtgaa tggtttggct   5160

cgagttatta cttttttaat acaaatagtt gtgcttaaaa atggtggtgg ttttattatt   5220

tttagtgcgt tagagatttt atatgcgcta attcaatata tactatttag atattatgtt   5280

ctaaaactgt acggggcata tttatatagt aagataacac tatcaaaaga acttccgcta   5340

ataaagcaaa caataataaa agagataaaa aagacattta tccacaagtt atcaggtgtt   5400

atgatcttta atacagacta tataattatt agcattttta taggattatc tacaataacg   5460

atatattcat cctatttaat gttcatacaa gcttcagcta taataattgg aacaattgta   5520

agtccattgg gggcatacat tggaaatttt ttacatagaa ccgacagtaa tctaacgtat   5580

ttaaaattca attcaataaa tacgattttt ttcttattgg catcgattgg ttgtattata   5640

tacaacaata tctcaactcc ttttgtacaa ctgtggatgg gcaaagatat cattttttct   5700

caagatattg tggcgttgct agcggttaac tttttttgtt tagtagcgag gagcgctgta   5760

gatattttta aggtcgcata tggatatatg tctgatattc atttaccaat aattgaaggt   5820

actttaaatt taattatatc tttatctttg gttaattttt atggtgtcaa aggtgtcatt   5880

tatggaacta tatgttcaaa tgttatcatt atcatgctgg cgaggccctg gtatttatat   5940

aaagaggcct tcaatttatg cactatagat ttcataaaag atcatattca attatgggta   6000

atatcattaa tgattctcat cactttgtta agtggtcgag ttaatgatat gtatacactt   6060

ttcgagaaat acttaatgaa taattgggat gttagcaata agctaattga acaacttctc   6120

acacatagtc tctttttgat tttatcaaca atatttgtag taattatcta tattatagtc   6180

acccctaaaa attgccttgc ttcagtaaaa atattaacca ataaagggtt ataatgaatc   6240

caatacctat tttcataatg actagaaatg atggtgttta tctgcaggac tgtttgaact   6300

caatccttaa aaataccgta tacccattta atctgtatgt tattgataat aactcttcag   6360

ataaattaca tttaaaaatt cttgaggaat ataaaactcg gcagaatgtg aatgtaataa   6420

gaaataagag taacttatgg gttttaggtc taaataagca tcttgagaaa gttaaaaagg   6480

aaagtgattc ttcttatttt gtgcttactg acggtgatat tatttttcct gagcctggaa   6540

taaatggatg ttggttgact caattagtaa tatatatgga cacgtataaa tgcattggta   6600

aaataggtat gtcactaaat tgggattcga taagggatga cccattctat gaagaaattt   6660

atgagcaaga aaaaaaatta tataataaca ataaaaaaat agaaaatctt tatatatcac   6720

cagtagatac aaccgcagct atatatcgct gggattggtc tatcgaagga tataaatttt   6780

atcctgatca tatacgctat cttagaccgg agctatactc atgtaggact ccaaaagaat   6840

ttaatgcaaa acatttaggt tggttagttt ataaaaataa taatggccaa gcaattaaaa   6900

aactagatga gaaaattaaa tgtttcacct tagttggagc tgatataaaa aaaacacaac   6960

taaaaaaggc tagcctgaag gtgagaatgt ttaattcttt atgtggaaaa cccataaaat   7020

atttttggag tatgcgacgt attttatata ctatattcta tacccttaaa aaaggaattt   7080

ggctttatga taatcattga gaaaacaaga tgataccata ttttttaatg ttcgcatgcc   7140

ttgtgatctt ttctttattt aaaggtaatg acagaagagt attaaatgct tctatgatca   7200

tccttggcat tttttgcgcc atgaggggaa acaatgttga tagagactat gagacgtata   7260

taagtattta tacatatatt atagaaggtt atagctatgc tattgagcca acctttcatc   7320

tattatcaat aatttcaaat acccttacgg gtacaccatt tcttatattt tgcgtttatg   7380

caggacttgc tatttatttt aaaataaaat ttattgaata ttggtcgcct tatttattgc   7440

tttctgtatt gctctatttt tccaatgtgt atttactaca tgagatgact caaattagga   7500

ttgggttagc aagtgccatt ggttttttta gtttgaaata tttaataacc gcagaaaaga   7560

aaaaatattt tatttgggtg ttcatcgcta tgactttcca tttttcaatg gctgtatttt   7620

ttttgttgcc attgttaaat tcaaagcgat tgtctggcag gtatgtcacc atatattgga   7680

taagtattat tttactttac tttttatctt attataaaat tgatttaagt gtctttttaa   7740

aatattttga tataggcata ataaattcaa aatatgattt gtatcgagag caaggggaaa   7800

ataatgatac tagtgtgaat atttattctg cactgcaata ttttcatttg tttgtgattt   7860

ttctaagtat ggtctatcgc gactcgttca gatatgatga aaagtatata attatgttaa   7920

aaatttattc attaggacct ttatcattat tagtgttttc aaatgttcct ggtttttcat   7980

tacgtttatc tgaattgttt aatgtagggg aaatagtttt attaccaatg ctcgttagtc   8040

acattaaaca aattaagcta gcctacctgt cagtaatatt gatttctctt tgtttgttgc   8100

ttattaattt gtattatttg tccttgttga aggaatattc aatctgatgc ttattttacc   8160

tatagttgtt atttataaat gcaaactcga aaattctgca agtttaaata cattattaaa   8220

atgtgaatca aatgaattta taaaggaaat tttcgtatat aataattctc ctgatgaaat   8280

atttataccg gattattata tgggtgttaa agtttataag atagatgatt ataataactc   8340

tggtgttagt agagcttata ataaaggttt aaaacttgct tcaaatctaa attataagta   8400

tgttcttctt ttagaccaag atacatatat tcctaaggac tttttgaaaa tatgtaatga   8460

aactatatca cagcatttaa atataaaact tttctgtcct atattaaaaa caaaacgtgg   8520

tgtcatttgt tctccattgt catataagta tcatagagga tttcatgtta agaatattgt   8580

cgctggggaa aagggattaa gcaaattatc tcctataaat agcggaatga tattagatgt   8640

tgaagccgct cttaagtgtg gtggatataa tgaaaatgtt tttctagatt ttagtgattt   8700

tcaatttatt gagagattta agaaaaaaaa tcattcattc tatgttttac caatagtatt   8760

aacgcaagat ttttcaggag aagaaactga taaagaaaaa acactaaggc gttttcatat   8820

ttattgtata tgtgctaaaa actgtactaa aaaaaatttt acagatcaat ttatctattt   8880

ttttatggtt ttactcagag caatgaagtt gacttttaaa atcaaaacta taaacccatt   8940

aatcactttt tatacaagat atctccgggg gtaagatgat ttctgtatgc attccgactt   9000

ataatggtga gaattatata aaacaacaaa ttctcagcat acttaatgag ttgggtgaag   9060

atgatgagat tgttatttct gatgatggtt caacagatat gacattagca ataatagaag   9120

aaataaatga taaacgaatt attgtaatta aaaatgagga aaacattcaa tgcgaatcct   9180

acaataaccg aactgaaaaa ttgctaaaaa aagtatcatt gaatctgcaa aatgccttat   9240

tacattgtaa aggagattat atatatttag ctgaccaaga tgatatatgg aagaaagggc   9300

ggattactaa tacattacct ttattagcag agaataagcc tattttggtt gtgtgtgatt   9360

gttgtgttgt tgatgaaaat aatactataa cgcagaggtc atattttgat tacgttaccc   9420

cttcgcaaaa tttatggaga acagtaatta agagttcctt tcatgggtgc tgtatgtgtt   9480

ttaatagaat tttattagca aaagcatttc cgtttcctca ctatagtttg gggcatgatt   9540

tatggattgg tttaattgca ataaaatttg gtctcgtata tttttgtcca gaagttttag   9600

tggagtatag gcgacattcg acaactgtta cgtctacagg tagtaaaagt aagaatagtt   9660

ttggatttaa aatacgttac agaattatgt tattaattga atatttgaaa ctatataaaa   9720

gaaaatgaaa aaaattgcac atgttttagt tcttcccaaa atggcaggtt ctcaaaaatt   9780

ttgccatatg cttctctcaa aaatagaggg gtatgaaaaa tttgttcttg tctctgaatg   9840

tgaggatgtc gatttagaac aacgagctga gtttataaaa aattttgaat caattaatgt   9900

caatattatt tggtgtaaga accttaagag aaatattggt aaatctgatg taaaagcttt   9960

tgttgagtta tataatattt ttaaacaata tgattttgat atagttcata ctaattcgac  10020

taagcctggc attctggcta ggattgccgc taaaatggcg ggtgtaaaaa aaataataca  10080

tacagtacac ggcatttctt tttatagagg acaaccttat atcaaaaggt taatatactg  10140

gataatagaa gtttttgcac ttcagtttgg tgatcttaac atatgtgtca ataaattcta  10200

tcagaaatat tataaaattt ttttttggaa gaaaagtatt accatttata atggctatgg  10260

tttttccgaa attaaaaaaa taaacaaaat ggcaaaagac agtaatgaaa aaagattttt  10320

gtttgtagga cggctagatg agcaaaaaga tccgctcaca cttatcaaag cttttgaact  10380

tattgaaaaa aaatatccta atgtatattt agatattgtt ggcgatggtg aattaaaagg  10440

gcattgcgaa gaattggtgg aaaaattaaa aattcaagat aaggtgatat ttcatggttg  10500

ggtagaaaaa ccatactctt tttacttaaa ttgcaatgta tttatttgcc cgtcaaaata  10560

tgaggcattt ggttttattt tcgttgaagc tgcttatttt aaaaaaccaa taataactac  10620

taatgtagaa ggtattccgg aggtcgtggt agattcgaaa atgggctatt tgattaagcc  10680

gggaaatttc ctagatttat caaagagaat gacaaattta ctagagtcta attctttatg  10740

tgtagctatg ggtgaatatg gtcataaata tgttacaagt aatttcgata ttgagaaatg  10800

tatcgaaaaa tatcaggctg tatatgatga cctttgaagg cttttggtat gatgaaagta  10860

gtgtttaaaa tttatattcc ttatttgatt gtaatgattg ctgtgtttgt catgctaacg  10920

tatacagaca tggtaagtaa attttctagt attgctttag agtacttctg tatatttaca  10980

tccctttttg tttttaaaaa aatttataga ggaataattt ggactttagt cgtagggata  11040

cttggagctc agatatcatc tttatataca agtggaaatt atgtcatacc tcttactctc  11100

tcaaacgttg gtgagtataa tgcgttaggt tttgagcttt tatttaagtt gttatgtata  11160

tcactcttat ttttatgtgt ggcacaaatt atctttagtc ctgtttttac ttatgatatt  11220

ccacggcgga aaacattttt attagctctt cttttcttgc ctctaataaa tggtccttta  11280

gttaagttca cagagactct ttatttttac tataagcaag tgactttttc ccctgcgtat  11340

aattatcctg caattgcaaa aaaattttta aaaacagata tttggcatga tgagtcactt  11400

cttttgaaaa ataaaaaacc taatgtgata gtaattttta ctgaaggaat gtcttttaat  11460

gtaattgata gcgttaataa tttaggcctc ggagtaactc caaagctcga tgaaatcatg  11520

aagaaatcat ttttctttat aaattattat aatcatacag cagctacttt tcgagggtta  11580

agagggcaat taacttctgc ttatcaattt aaagatggtg taggtgcaaa tggtgatggt  11640

ttttttgaaa taacaaatca aaaagttaaa tcaatatata ataaaagatt agtctcttta  11700

ccggagatat tgaattcaaa tggttataag acgatatttc tttcttcaac agaaaaaact  11760

agcactttga atgcgatgct gaaaacctta tcattcaatg aagttttggg aatgggagat  11820

tttgattttt atcagaatga ccgtatgtca gataagcaaa ctttcatagc gcttaaggaa  11880

gttgttgaaa gaaacaagaa taataaattt ttcattggag tttacccatc tggaactcat  11940

catggtttag atagccctga tttgcgtttt agagatggtt caaattctta ttataacaaa  12000

ttttataatt ttgatcatca agttggcaag ttcatagatt atcttacgtc cacaggtctt  12060

ataaataata ccttggtggt tattacggct gatcattcaa ctttccctac accacaattt  12120

aataaatctt ttagttcaaa ttctgattat tttgttgatg caataccttt aataattttg  12180

gggcaggaaa tagagtctaa aaaaaataat gcgcatggga agaatagttt agcattggca  12240

ccaacgatac taaatttatt aaatattaac cattatccta atttcttttt aggctgctcg  12300

ctcttggatg taaaatgcca aagtactttt agtcatatat cggcaattgg aaattctttt  12360

tttaaaaccg gcgataaaaa gtgttcttca gatgattata acgttaaaaa attagataat  12420

tctagcgata taattaattt ctataatgtt agtggttaaa gtataaatac agcttatagt  12480

tgactgatat atatggttaa tgtttttata gtgaatattt tttcaagccg cacaccctcg  12540

cggtgaccac cccctgacag gagtaaacaa tgtcaaagca acagatcggc gtcgtcggta  12600

tggcagtgat ggggcgcaac cttgcgctca acatcgaaag ccgtggttat accgtctcta  12660

ttttcaaccg ttcccgtgag aagacggaag aagtgattgc cgaaaatcca ggcaagaaat  12720

tggttcctta ctttacggtg aaagagtttg ttgaatctct ggaaacgcct cgtcgcatcc  12780

tgttaatggt gaaagcaggt gcaggcacgg atgctgctat tgattctctc aagccatacc  12840

tcgataaagg tgacatcatc attgatggtg gtaatacctt cttccaggac accattcgtc  12900

gtaatcgtga gctttctgcc gaaggcttta acttcattgg taccggtgtc tccggtggtg  12960

aagaaggcgc gctgaaaggt ccttccatta tgcctggtgg gcagaaagaa gcctatgaac  13020

tggttgcacc gatcctgacc aaaatcgccg cagtggctga agacggtgag ccatgcgtta  13080

cctatatcgg tgccgatggc gcaggccatt atgtgaagat ggttcacaac ggtattgaat  13140

acggagatat gcagctgatt gctgaagcct attctctgct taaaggtggc ctgaatcttt  13200

ccaacgaaga actggcgcag acctttaccg agtgggataa cggtgaactg agcagctacc  13260

tgatcgacat caccaaagac atcttcacta aaaaagatga agacggtaac tacctggttg  13320

atgtgattct ggatgaagcg gct                                          13343

表1大肠杆菌O51的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物位置	反向引物位置	PCR产物长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								wzxwzy	O-抗原转运酶O-抗原聚合酶	4675-62347110-8147	4861-48785522-55397735-77187410-7427	5624-56416044-60618123-81407755-7772	781bp540bp405bp363bp	0000	64585858

表2 166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号	该组中含有的菌株	来源
			1、野生型大肠杆菌2、野生型大肠杆菌3、野生型大肠杆菌4、野生型大肠杆菌5、野生型大肠杆菌6、野生型大肠杆菌7、野生型大肠杆菌8、野生型大肠杆菌9、野生型大肠杆菌痢疾志贺氏菌10、鲍氏志贺氏菌11、福氏志贺氏菌12、野生型大肠杆菌13、野生型大肠杆菌	O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，O19ab，O20，O21，O22，O23，O24O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，O57，O58，O60，O61，O62，O53O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81，O82，O83，O68O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O51，O137，O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153O168，O169，O170，O171，O172，O173，D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B17，B18F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，DS，DRO3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119去除大肠杆菌O51的第3组菌	IMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSabcdddIMVSa

为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阴性对照

a.Institude of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.0172和0173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3是大肠杆菌O51的O-抗原基因簇的结构表

galF        rmlB     rmlD   rmlA   rmlC       wzx     orf6      wzy    orf8   orf9    orf10     orf11        gnd

                    1kb

表4是大肠杆菌O51的O-抗原基因簇中的基因的位置表

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC      60

GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAACTGCG CGTGAAGCGT     120

CAACTGCTGG CGGAAGTACA GTCCATTTGC CCGCCGGGCG TGACCATCAT GAACGTGCGT     180

CAGGGCGAAC TTTTAGGTTT GGGCCACTCC ATCTTGTGTG CACGACCTGC CATTGGTGAC     240

AACCCATTTG TCGTGGTACT GCCAGACGTT GTAATCGACG ACGCCAGCGC TGACCCGCTG     300

CGCTATAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGC TTCAATGAAA CGGGACGCAG CCAGGTGCTG     360

GCAAAACGTA TGCCGGGCGA TCTCTCTGAA TACTCCGTCA TTCAGACCAA AGAACCGCTG     420

GATCGTGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTCATAG AAAAACCGGA TCAGCCACAG     480

ACGCTGGACT CAGACATTAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG     540

GAACTGGAAC GCACTCAGCC AGGTGCATGG GGACGTATCC AACTGACTGA TGCCATTGCC     600

GAACTGGCGA AAAAACAGTC CGTTGATGCC ATGCTGATGA CTGGTGACAG CTACGACTGC     660

GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTC GTGAAGTATG GCCTACGCAA CCTGAAAGAA     720

GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGA     780

ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CGGTGAGATT CGTGGCGAAA GTAATTTGTT     840

TCGAATATTC CTGCCGTTAT TTTATATAAC AATCAGAACA ACAACGAGTT AGCAATAGGA     900

TTTTAGTCAA AGTTTTCTAG GATTTCCCTT GTTTCCAGAG CGGATTGGTA GACATTAGCG     960

TTGAATTTTC CGGGTTTAGC GCGAGGTAGG TAACGCTCGT CACATCGTAG ACATGTATGC    1020

AGTGCCCTGG TAGCTGTAAA GCCAGGGGCG GTAGCGTGCA TTAATACCTC TATTAATCAA    1080

ACTGAGAGCC GCTTATTTCA CAGCATGCTC TGAAGTAATA TGGAATAAAT TAAGTGAAAA    1140

TACTTGTTAC TGGTGGCGCA GGATTTATTG GTTCTGCTGT AGTTCGTCAC ATTATAAATA    1200

ATACGCAGGA TAGTGTTGTT AATGTCGATA AATTAACGTA CGCCGGAAAC CTGGAATCAC    1260

TTGCAGATGT TTCTGATTCT GAACGCTATG TTTTTGAACA TGCGGATATT TGTGATGCAG    1320

orf1的起始

CTGCA ATGGCACGGATTTTT GCTCAGCATC AGCCGGATGC AGTGATGCAC CTGGCTGCTG   1380

AAAGCCATGT TGACCGTTCA ATTACAGGCC CTGCGGCATT TATTGAAACC AATATTGTTG    1440

GTACTTATGT CCTTTTGGAA GCTGCTCGGA ATTACTGGTC TGCTCTTGAT GGCGACAAGA    1500

AAAATAGCTT CCGTTTTCAT CATATTTCTA CTGACGAAGT CTATGGTGAT TTGCCTCATC    1560

CAGATGAAGT AAATAATACA GAAGAATTAC CCTTATTTAC TGAGACAACA GCTTACGCAC    1620

CAAGCAGCCC TTATTCTGCA TCAAAAGCTT CCAGCGATCA TTTAGTCCGT GCGTGGAAAC    1680

GTACCTATGG TTTACCGACC ATTGTGACTA ATTGCTCTAA CAATTATGGT CCTTATCATT    1740

TCCCGGAAAA ATTGATTCCA TTGGTTATTC TCAATGCTCT GGAAGGTAAA GGATTACCTA    1800

TTTATGGTAA AGGGGATCAA ATTCGCGACT GGCTGTATGT TGAAGATCAT GCGCGTGCGT    1860

TATATACCGT CGTAACCGAA GGTAAAGCGG GTGAAACTTA TAACATTGGT GGACACAACG    1920

AAAAGAAAAA CATCGATGTA GTGCTCACTA TTTGTGATTT GTTGGATGAG ATTGTACCGA    1980

AAGAGAAATC TTATCGTGAG CAAATCACTT ATGTTGCCGA TCGTCCGGGA CACGATCGCC    2040

GTTATGCGAT TGATGCTGAG AAGATTGGTA GCGAATTGGG ATGGAAACCA CAGGAAACGT    2100

TTGAGAGCGG GATTCGTAAA ACGGTGGAAT GGTACCTGGC TAATGCAAAA TGGGTTGAGA    2160

                                                    orf1的终止orf2的起始

ATGTGAAAAG TGGTGCCTAT CAATCGTGGA TTGAACAGAA CTATGAGGGC CGCAAG TAAT  2220

GAATATCCTC CTTTTCGGCA AAACAGGGCA GGTAGGTTGG GAACTACAGC GTTCTCTTGC    2280

TCCTCTGGGT AACTTGATTG CTCTTGATGT TCACTCCACT GATTATTGTG GCGATTTCAG    2340

CAACCCAGAA GGTGTGGCTG AAACCGTCAA AAAAATTCGC CCAGATGTTA TTGTTAATGC    2400

TGCGGCTCAT ACCGCAGTAG ATAAAGCTGA GTCAGAACCC GAATTTGCAC AATTACTCAA    2460

TGCGACCAGC GTTGAATCAA TTGCAAAAGC GGCTAATGAA GTTGGGGCCT GGGTAATTCA    2520

TTTCTCAACT GACTACGTAT TCCCTGGAAA TGGCGACACT CCATGGCTGG AGACTGATGC    2580

AACCGCACCG CTAAATGTTT ACGGTGAAAC CAAGTTAGCT GGAGAAAAAG CATTACAAGA    2640

GCATTGTGCG AAGTACCTTA TTTTCCGGAC CAGCTGGGTC TATGCAGGTA AAGGAAATAA    2700

CTTCGCCAAA ACAATGTTGC GTCTGGCAAA AGAGCGTGAA GAATTAGCGG TTATTAACGA    2760

TCAGTTTGGT GCGCCAACAG GTGCTGAACT GCTGGCTGAT TGTACAGCAC ATGCCATTCG    2820

TGTCGCACTG AATAAACCGG ATGTCGCAGG CTTGTACCAT TTGGTAGCCA GTGGTGCCAC    2880

AACCTGGTAC GATTATGCTG CGCTGGTTTT TGAAGAGGCG CGCAAAGCAG GCATTCCCCT    2940

TGCACTCAAC AAGCTCAACG CAGTACCAAC AACTGCCTAT CCTACACCAG CTCGTCGTCC    3000

ACATAACTCT CGCCTTAATA CAGAAAAATT TCAGCAGAAC TTTGCGCTTG TCTTGCCTGA    3060

                                                       Orf2的终止

CTGGCAGGTT GGCGTGAAAC GAATGCTCAA CGAATTATTT ACGACTACAG CAATT TAATA  3120

                                                       Orf3的起始

GTTTTTGTAT CTTGTTCGTG ATGGTGGAGC AAGATGAATT AAAAGGAATG ATGAA ATGAA  3180

AACGCGTAAA GGTATTATTT TAGCGGGTGG TTCTGGTACT CGTCTTTATC CTGTAACTAT    3240

GGCTGTCAGT AAACAGCTGT TACCGATTTA TGATAAACCG ATGATCTATT ACCCGCTCTC    3300

TACACTGATG TTGGCGGGTA TTCGCGATAT TTTGATTATC AGTACGCCAC AGGATACTCC    3360

TCGTTTTCAA CAACTGCTGG GTGACGGGAG CCAGTGGGGC CTGAATCTTC AGTACAAAGT    3420

TCAACCGAGT CCGGATGGTC TTGCGCAGGC GTTTATTATC GGTGAAGAGT TTATCGGTGG    3480

TGATGATTGT GCTTTGGTTC TAGGTGATAA TATCTTTTAC GGTCACGATC TGCCGAAGTT    3540

AATGGATGTC GCTGTTAACA AAGAAAGTGG TGCAACGGTA TTTGCTTATC ACGTAAATGA    3600

TCCTGAACGC TACGGTGTCG TTGAGTTTGA TAAAAGCGGT ACGGCAATTA GCCTGGAAGA    3660

AAAACCGCTA CAGCCAAAAA GTAATTATGC GGTAACTGGG CTTTATTTTT ATGATAACGA    3720

TGTTGTCGAA ATGTCGAAAA ATCTTAAGCC TTCTGCCCGT GGTGAACTGG AAATTACCGA    3780

TATTAACCGT ATTTATATGG AACAGGGGCG TTTATCCGTT GCCATGATGG GGCGTGGTTA    3840

TGCATGGCTG GATACGGGGA CGCATCAAAG TCTTATTGAG GCAAGCAACT TTATTGCAAC    3900

AATTGAAGAG CGTCAGGGGC TGAAAGTTTC CTGCCCGGAA GAAATTGCTT ACCGTAAAGG    3960

GTTTATTGAT GCTGAGCAAG TAAAAGTGTT AGTACAACCT CTGAAAAAAA ATGCTTATGG    4020

                                  Orf3的终止orf4的起始

TCAGTACCTA CTAAAAATGA TTGAAGGTTA T TAATAAA ATGAACGTAATT AAAACTGAAA 4080

TTCCTGATGT ATTAATTTTT GAACCGAAAG TTTTTGGTGA TGAGCGTGGT TTCTTTATGG    4140

AAAGCTTTAA TCAGAAAGTT TTCGAAGAGG CTGTAGGGCG TAAGGTTGAA TTTGTTCAGG    4200

ATAACCATTC TAAGTCTAAT AAAGGCGTTT TACGCGGGCT CCATTACCAG TTAGAACCTT    4260

ATGCGCAAGG CAAACTTGTG CGCTGTGTTG TTGGTGAGGT CTTTGATGTT GCGGTTGACA    4320

TTCGAAAATC GTCACCTACG TTTGGCAAGT GGGTTGGTGT GAATTTGTCG GCGGCGAATA    4380

AGCGCCAATT ATGGATACCG GAAGGATTTG CTCATGGCTT TTTAAGCCTA ACAGATAACA    4440

CTGAATTTTT GTATAAAACT AATAACTTCT ATAATAGAAA TTATGAAAGA TGTTTAAAAT    4500

TTGATGATAT AGAATTAAGC ATCAAATGGC CAATTGGCGA CGAAACTGAG TTGATCGTTT    4560

                                     Orf4的终止

CAGAAAAAGA TATGTTAGGC AATATTTTTA GTAAATTA TAGTTTTTATCA TAGCGGTATT   4620

                                                       Orf5的起始

TAAGTTTAAT ACTTACCGCT ATGATTTTTA CATCTTTTTT GTAAAGGTGC TTAA ATGCGC  4680

GCTAGTCCAT TTTTTCGGTC AGTTAAATAT GGTATTGTAT TTTCTATAGT AATAATGATA    4740

CTTACTTTTA TTGTAAGGCA GTGTATTATT AATTCGTTTG GTGAAAATTT AACAGGTTAT    4800

TATTTGTTAA TAAACCAATT AGTCGGTTAT CTAAATTTAG CTGAATTGGG TTTAACTACG    4860

GCATCAGTAT ATTTATTGTT CAAGCCGTTG AATTCTGAAA ATAAATATGA CATTGTTGGT    4920

TATTTTTATA TTATTCACAG AATATTTAAA TTTATTGCAT CAGCAATATT ATTTATTGGG    4980

CTAACACTCT CTTTTATTAT GCCCTATTTA GTCAAAGATA ATATAAATTG GCATGATATT    5040

TACATACCAT GGGTTTTTTA TGTCATTGCA ACAGCATTGT CGTATTTTTA TAGTGCAGAA    5100

ACTGTTTTGT TAACAGCAAG TGAAAAACTA TATATTGTTC GGATTGTGAA TGGTTTGGCT    5160

CGAGTTATTA CTTTTTTAAT ACAAATAGTT GTGCTTAAAA ATGGTGGTGG TTTTATTATT    5220

TTTAGTGCGT TAGAGATTTT ATATGCGCTA ATTCAATATA TACTATTTAG ATATTATGTT    5280

CTAAAACTGT ACGGGGCATA TTTATATAGT AAGATAACAC TATCAAAAGA ACTTCCGCTA    5340

ATAAAGCAAA CAATAATAAA AGAGATAAAA AAGACATTTA TCCACAAGTT ATCAGGTGTT    5400

ATGATCTTTA ATACAGACTA TATAATTATT AGCATTTTTA TAGGATTATC TACAATAACG    5460

ATATATTCAT CCTATTTAAT GTTCATACAA GCTTCAGCTA TAATAATTGG AACAATTGTA    5520

AGTCCATTGG GGGCATACAT TGGAAATTTT TTACATAGAA CCGACAGTAA TCTAACGTAT    5580

TTAAAATTCA ATTCAATAAA TACGATTTTT TTCTTATTGG CATCGATTGG TTGTATTATA    5640

TACAACAATA TCTCAACTCC TTTTGTACAA CTGTGGATGG GCAAAGATAT CATTTTTTCT    5700

CAAGATATTG TGGCGTTGCT AGCGGTTAAC TTTTTTTGTT TAGTAGCGAG GAGCGCTGTA    5760

GATATTTTTA AGGTCGCATA TGGATATATG TCTGATATTC ATTTACCAAT AATTGAAGGT    5820

ACTTTAAATT TAATTATATC TTTATCTTTG GTTAATTTTT ATGGTGTCAA AGGTGTCATT    5880

TATGGAACTA TATGTTCAAA TGTTATCATT ATCATGCTGG CGAGGCCCTG GTATTTATAT    5940

AAAGAGGCCT TCAATTTATG CACTATAGAT TTCATAAAAG ATCATATTCA ATTATGGGTA    6000

ATATCATTAA TGATTCTCAT CACTTTGTTA AGTGGTCGAG TTAATGATAT GTATACACTT    6060

TTCGAGAAAT ACTTAATGAA TAATTGGGAT GTTAGCAATA AGCTAATTGA ACAACTTCTC    6120

ACACATAGTC TCTTTTTGAT TTTATCAACA ATATTTGTAG TAATTATCTA TATTATAGTC    6180

                                               Orf5的终止Orf6的起始

ACCCCTAAAA ATTGCCTTGC TTCAGTAAAA ATATTAACCA ATAAAGGGTT A TAATGAATC  6240

CAATACCTAT TTTCATAATG ACTAGAAATG ATGGTGTTTA TCTGCAGGAC TGTTTGAACT    6300

CAATCCTTAA AAATACCGTA TACCCATTTA ATCTGTATGT TATTGATAAT AACTCTTCAG    6360

ATAAATTACA TTTAAAAATT CTTGAGGAAT ATAAAACTCG GCAGAATGTG AATGTAATAA    6420

GAAATAAGAG TAACTTATGG GTTTTAGGTC TAAATAAGCA TCTTGAGAAA GTTAAAAAGG    6480

AAAGTGATTC TTCTTATTTT GTGCTTACTG ACGGTGATAT TATTTTTCCT GAGCCTGGAA    6540

TAAATGGATG TTGGTTGACT CAATTAGTAA TATATATGGA CACGTATAAA TGCATTGGTA    6600

AAATAGGTAT GTCACTAAAT TGGGATTCGA TAAGGGATGA CCCATTCTAT GAAGAAATTT    6660

ATGAGCAAGA AAAAAAATTA TATAATAACA ATAAAAAAAT AGAAAATCTT TATATATCAC    6720

CAGTAGATAC AACCGCAGCT ATATATCGCT GGGATTGGTC TATCGAAGGA TATAAATTTT    6780

ATCCTGATCA TATACGCTAT CTTAGACCGG AGCTATACTC ATGTAGGACT CCAAAAGAAT    6840

TTAATGCAAA ACATTTAGGT TGGTTAGTTT ATAAAAATAA TAATGGCCAA GCAATTAAAA    6900

AACTAGATGA GAAAATTAAA TGTTTCACCT TAGTTGGAGC TGATATAAAA AAAACACAAC    6960

TAAAAAAGGC TAGCCTGAAG GTGAGAATGT TTAATTCTTT ATGTGGAAAA CCCATAAAAT    7020

ATTTTTGGAG TATGCGACGT ATTTTATATA CTATATTCTA TACCCTTAAA AAAGGAATTT    7080

               Orf6的终止    Orf7的起始

GGCTTTATGA TAATCAT TGA GAAAACAAG ATGATACCATA TTTTTTAATG TTCGCATGCC 7140

TTGTGATCTT TTCTTTATTT AAAGGTAATG ACAGAAGAGT ATTAAATGCT TCTATGATCA    7200

TCCTTGGCAT TTTTTGCGCC ATGAGGGGAA ACAATGTTGA TAGAGACTAT GAGACGTATA    7260

TAAGTATTTA TACATATATT ATAGAAGGTT ATAGCTATGC TATTGAGCCA ACCTTTCATC    7320

TATTATCAAT AATTTCAAAT ACCCTTACGG GTACACCATT TCTTATATTT TGCGTTTATG    7380

CAGGACTTGC TATTTATTTT AAAATAAAAT TTATTGAATA TTGGTCGCCT TATTTATTGC    7440

TTTCTGTATT GCTCTATTTT TCCAATGTGT ATTTACTACA TGAGATGACT CAAATTAGGA    7500

TTGGGTTAGC AAGTGCCATT GGTTTTTTTA GTTTGAAATA TTTAATAACC GCAGAAAAGA    7560

AAAAATATTT TATTTGGGTG TTCATCGCTA TGACTTTCCA TTTTTCAATG GCTGTATTTT    7620

TTTTGTTGCC ATTGTTAAAT TCAAAGCGAT TGTCTGGCAG GTATGTCACC ATATATTGGA    7680

TAAGTATTAT TTTACTTTAC TTTTTATCTT ATTATAAAAT TGATTTAAGT GTCTTTTTAA    7740

AATATTTTGA TATAGGCATA ATAAATTCAA AATATGATTT GTATCGAGAG CAAGGGGAAA    7800

ATAATGATAC TAGTGTGAAT ATTTATTCTG CACTGCAATA TTTTCATTTG TTTGTGATTT    7860

TTCTAAGTAT GGTCTATCGC GACTCGTTCA GATATGATGA AAAGTATATA ATTATGTTAA    7920

AAATTTATTC ATTAGGACCT TTATCATTAT TAGTGTTTTC AAATGTTCCT GGTTTTTCAT    7980

TACGTTTATC TGAATTGTTT AATGTAGGGG AAATAGTTTT ATTACCAATG CTCGTTAGTC    8040

ACATTAAACA AATTAAGCTA GCCTACCTGT CAGTAATATT GATTTCTCTT TGTTTGTTGC    8100

                                         Orf7的终止Orf8的起始

TTATTAATTT GTATTATTTG TCCTTGTTGA AGGAATATTC AATC TGATGC TTATTTTACC  8160

TATAGTTGTT ATTTATAAAT GCAAACTCGA AAATTCTGCA AGTTTAAATA CATTATTAAA    8220

ATGTGAATCA AATGAATTTA TAAAGGAAAT TTTCGTATAT AATAATTCTC CTGATGAAAT    8280

ATTTATACCG GATTATTATA TGGGTGTTAA AGTTTATAAG ATAGATGATT ATAATAACTC    8340

TGGTGTTAGT AGAGCTTATA ATAAAGGTTT AAAACTTGCT TCAAATCTAA ATTATAAGTA    8400

TGTTCTTCTT TTAGACCAAG ATACATATAT TCCTAAGGAC TTTTTGAAAA TATGTAATGA    8460

AACTATATCA CAGCATTTAA ATATAAAACT TTTCTGTCCT ATATTAAAAA CAAAACGTGG    8520

TGTCATTTGT TCTCCATTGT CATATAAGTA TCATAGAGGA TTTCATGTTA AGAATATTGT    8580

CGCTGGGGAA AAGGGATTAA GCAAATTATC TCCTATAAAT AGCGGAATGA TATTAGATGT    8640

TGAAGCCGCT CTTAAGTGTG GTGGATATAA TGAAAATGTT TTTCTAGATT TTAGTGATTT    8700

TCAATTTATT GAGAGATTTA AGAAAAAAAA TCATTCATTC TATGTTTTAC CAATAGTATT    8760

AACGCAAGAT TTTTCAGGAG AAGAAACTGA TAAAGAAAAA ACACTAAGGC GTTTTCATAT    8820

TTATTGTATA TGTGCTAAAA ACTGTACTAA AAAAAATTTT ACAGATCAAT TTATCTATTT    8880

TTTTATGGTT TTACTCAGAG CAATGAAGTT GACTTTTAAA ATCAAAACTA TAAACCCATT    8940

                              Orf8的终止Orf9的起始

AATCACTTTT TATACAAGAT ATCTCCGGGG G TAAG ATGATTTCTGTATGC ATTCCGACTT 9000

ATAATGGTGA GAATTATATA AAACAACAAA TTCTCAGCAT ACTTAATGAG TTGGGTGAAG    9060

ATGATGAGAT TGTTATTTCT GATGATGGTT CAACAGATAT GACATTAGCA ATAATAGAAG    9120

AAATAAATGA TAAACGAATT ATTGTAATTA AAAATGAGGA AAACATTCAA TGCGAATCCT    9180

ACAATAACCG AACTGAAAAA TTGCTAAAAA AAGTATCATT GAATCTGCAA AATGCCTTAT    9240

TACATTGTAA AGGAGATTAT ATATATTTAG CTGACCAAGA TGATATATGG AAGAAAGGGC    9300

GGATTACTAA TACATTACCT TTATTAGCAG AGAATAAGCC TATTTTGGTT GTGTGTGATT    9360

GTTGTGTTGT TGATGAAAAT AATACTATAA CGCAGAGGTC ATATTTTGAT TACGTTACCC    9420

CTTCGCAAAA TTTATGGAGA ACAGTAATTA AGAGTTCCTT TCATGGGTGC TGTATGTGTT    9480

TTAATAGAAT TTTATTAGCA AAAGCATTTC CGTTTCCTCA CTATAGTTTG GGGCATGATT    9540

TATGGATTGG TTTAATTGCA ATAAAATTTG GTCTCGTATA TTTTTGTCCA GAAGTTTTAG    9600

TGGAGTATAG GCGACATTCG ACAACTGTTA CGTCTACAGG TAGTAAAAGT AAGAATAGTT    9660

TTGGATTTAA AATACGTTAC AGAATTATGT TATTAATTGA ATATTTGAAA CTATATAAAA    9720

Orf10的起始Orf9的终止

GAAA ATGAAA AAAATTGCAC ATGTTTTAGT TCTTCCCAAA ATGGCAGGTT CTCAAAAATT  9780

TTGCCATATG CTTCTCTCAA AAATAGAGGG GTATGAAAAA TTTGTTCTTG TCTCTGAATG    9840

TGAGGATGTC GATTTAGAAC AACGAGCTGA GTTTATAAAA AATTTTGAAT CAATTAATGT    9900

CAATATTATT TGGTGTAAGA ACCTTAAGAG AAATATTGGT AAATCTGATG TAAAAGCTTT    9960

TGTTGAGTTA TATAATATTT TTAAACAATA TGATTTTGAT ATAGTTCATA CTAATTCGAC   10020

TAAGCCTGGC ATTCTGGCTA GGATTGCCGC TAAAATGGCG GGTGTAAAAA AAATAATACA   10080

TACAGTACAC GGCATTTCTT TTTATAGAGG ACAACCTTAT ATCAAAAGGT TAATATACTG   10140

GATAATAGAA GTTTTTGCAC TTCAGTTTGG TGATCTTAAC ATATGTGTCA ATAAATTCTA   10200

TCAGAAATAT TATAAAATTT TTTTTTGGAA GAAAAGTATT ACCATTTATA ATGGCTATGG   10260

TTTTTCCGAA ATTAAAAAAA TAAACAAAAT GGCAAAAGAC AGTAATGAAA AAAGATTTTT   10320

GTTTGTAGGA CGGCTAGATG AGCAAAAAGA TCCGCTCACA CTTATCAAAG CTTTTGAACT   10380

TATTGAAAAA AAATATCCTA ATGTATATTT AGATATTGTT GGCGATGGTG AATTAAAAGG   10440

GCATTGCGAA GAATTGGTGG AAAAATTAAA AATTCAAGAT AAGGTGATAT TTCATGGTTG   10500

GGTAGAAAAA CCATACTCTT TTTACTTAAA TTGCAATGTA TTTATTTGCC CGTCAAAATA   10560

TGAGGCATTT GGTTTTATTT TCGTTGAAGC TGCTTATTTT AAAAAACCAA TAATAACTAC   10620

TAATGTAGAA GGTATTCCGG AGGTCGTGGT AGATTCGAAA ATGGGCTATT TGATTAAGCC   10680

GGGAAATTTC CTAGATTTAT CAAAGAGAAT GACAAATTTA CTAGAGTCTA ATTCTTTATG   10740

TGTAGCTATG GGTGAATATG GTCATAAATA TGTTACAAGT AATTTCGATA TTGAGAAATG   10800

                                    Orf10的终止   Orf11的起始

TATCGAAAAA TATCAGGCTG TATATGATGA CCTT TGAAGGCTTTTGGT ATGATGAAAGTA 10860

GTGTTTAAAA TTTATATTCC TTATTTGATT GTAATGATTG CTGTGTTTGT CATGCTAACG   10920

TATACAGACA TGGTAAGTAA ATTTTCTAGT ATTGCTTTAG AGTACTTCTG TATATTTACA   10980

TCCCTTTTTG TTTTTAAAAA AATTTATAGA GGAATAATTT GGACTTTAGT CGTAGGGATA   11040

CTTGGAGCTC AGATATCATC TTTATATACA AGTGGAAATT ATGTCATACC TCTTACTCTC   11100

TCAAACGTTG GTGAGTATAA TGCGTTAGGT TTTGAGCTTT TATTTAAGTT GTTATGTATA   11160

TCACTCTTAT TTTTATGTGT GGCACAAATT ATCTTTAGTC CTGTTTTTAC TTATGATATT   11220

CCACGGCGGA AAACATTTTT ATTAGCTCTT CTTTTCTTGC CTCTAATAAA TGGTCCTTTA   11280

GTTAAGTTCA CAGAGACTCT TTATTTTTAC TATAAGCAAG TGACTTTTTC CCCTGCGTAT   11340

AATTATCCTG CAATTGCAAA AAAATTTTTA AAAACAGATA TTTGGCATGA TGAGTCACTT   11400

CTTTTGAAAA ATAAAAAACC TAATGTGATA GTAATTTTTA CTGAAGGAAT GTCTTTTAAT   11460

GTAATTGATA GCGTTAATAA TTTAGGCCTC GGAGTAACTC CAAAGCTCGA TGAAATCATG   11520

AAGAAATCAT TTTTCTTTAT AAATTATTAT AATCATACAG CAGCTACTTT TCGAGGGTTA   11580

AGAGGGCAAT TAACTTCTGC TTATCAATTT AAAGATGGTG TAGGTGCAAA TGGTGATGGT   11640

TTTTTTGAAA TAACAAATCA AAAAGTTAAA TCAATATATA ATAAAAGATT AGTCTCTTTA   11700

CCGGAGATAT TGAATTCAAA TGGTTATAAG ACGATATTTC TTTCTTCAAC AGAAAAAACT   11760

AGCACTTTGA ATGCGATGCT GAAAACCTTA TCATTCAATG AAGTTTTGGG AATGGGAGAT   11820

TTTGATTTTT ATCAGAATGA CCGTATGTCA GATAAGCAAA CTTTCATAGC GCTTAAGGAA   11880

GTTGTTGAAA GAAACAAGAA TAATAAATTT TTCATTGGAG TTTACCCATC TGGAACTCAT   11940

CATGGTTTAG ATAGCCCTGA TTTGCGTTTT AGAGATGGTT CAAATTCTTA TTATAACAAA   12000

TTTTATAATT TTGATCATCA AGTTGGCAAG TTCATAGATT ATCTTACGTC CACAGGTCTT   12060

ATAAATAATA CCTTGGTGGT TATTACGGCT GATCATTCAA CTTTCCCTAC ACCACAATTT   12120

AATAAATCTT TTAGTTCAAA TTCTGATTAT TTTGTTGATG CAATACCTTT AATAATTTTG   12180

GGGCAGGAAA TAGAGTCTAA AAAAAATAAT GCGCATGGGA AGAATAGTTT AGCATTGGCA   12240

CCAACGATAC TAAATTTATT AAATATTAAC CATTATCCTA ATTTCTTTTT AGGCTGCTCG   12300

CTCTTGGATG TAAAATGCCA AAGTACTTTT AGTCATATAT CGGCAATTGG AAATTCTTTT   12360

TTTAAAACCG GCGATAAAAA GTGTTCTTCA GATGATTATA ACGTTAAAAA ATTAGATAAT   12420

                           Orf11的终止

TCTAGCGATA TAATTAATTT CTATAATGT TAGTGGTTAAA GTATAAATAC AGCTTATAGT  12480

TGACTGATAT ATATGGTTAA TGTTTTTATA GTGAATATTT TTTCAAGCCG CACACCCTCG   12540

CGGTGACCAC CCCCTGACAG GAGTAAACAA TGTCAAAGCA ACAGATCGGC GTCGTCGGTA   12600

TGGCAGTGAT GGGGCGCAAC CTTGCGCTCA ACATCGAAAG CCGTGGTTAT ACCGTCTCTA   12660

TTTTCAACCG TTCCCGTGAG AAGACGGAAG AAGTGATTGC CGAAAATCCA GGCAAGAAAT   12720

TGGTTCCTTA CTTTACGGTG AAAGAGTTTG TTGAATCTCT GGAAACGCCT CGTCGCATCC   12780

TGTTAATGGT GAAAGCAGGT GCAGGCACGG ATGCTGCTAT TGATTCTCTC AAGCCATACC   12840

TCGATAAAGG TGACATCATC ATTGATGGTG GTAATACCTT CTTCCAGGAC ACCATTCGTC   12900

GTAATCGTGA GCTTTCTGCC GAAGGCTTTA ACTTCATTGG TACCGGTGTC TCCGGTGGTG   12960

AAGAAGGCGC GCTGAAAGGT CCTTCCATTA TGCCTGGTGG GCAGAAAGAA GCCTATGAAC   13020

TGGTTGCACC GATCCTGACC AAAATCGCCG CAGTGGCTGA AGACGGTGAG CCATGCGTTA   13080

CCTATATCGG TGCCGATGGC GCAGGCCATT ATGTGAAGAT GGTTCACAAC GGTATTGAAT   13140

ACGGAGATAT GCAGCTGATT GCTGAAGCCT ATTCTCTGCT TAAAGGTGGC CTGAATCTTT   13200

CCAACGAAGA ACTGGCGCAG ACCTTTACCG AGTGGGATAA CGGTGAACTG AGCAGCTACC   13260

TGATCGACAT CACCAAAGAC ATCTTCACTA AAAAAGATGA AGACGGTAAC TACCTGGTTG   13320

ATGTGATTCT GGATGAAGCG GCT                                           13343

以上仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡依本发明技术实质对以上实施例作修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

Claims (3)

1、一种寡核苷酸，其特征在于，选自SEQ ID NO：1中的4861至4878碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5624至5641碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5522至5539碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的6044至6061碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7735至7718碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的8123至8140碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7410至7427碱基的核苷酸；SEQ IDNO：1中的7755至7772碱基的核苷酸。

2、一种寡核苷酸对，其特征在于，选自SEQ ID NO：1中的4861至4878碱基的核苷酸和SEQ ID NO：1中的5624至5641碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的5522至5539碱基的核苷酸和SEQ ID NO：1中的6044至6061碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7735至7718碱基的核苷酸和SEQ ID NO：1中的8123至8140碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的7410至7427碱基的核苷酸和SEQ IDNO：1中的7755至7772碱基的核苷酸。

3、权利要求1的核苷酸或权利要求2的核苷酸对的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR，或者作为探针用于杂交反应与荧光检测、制造基因芯片或微阵列，供检测大肠杆菌O51型。