CN1257276C - 对大肠杆菌o43的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O43(Escherichia coli O43)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O43中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长14309个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O43的O-抗原基因簇中的寡糖单位处理基因(包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因)的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O43的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O43的方法。

Description

对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O43(Escherichia coli O43)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O43中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O43并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank etal(1987)“The function of antibody and complement in the lysis ofbacteria”.Rev Infect Dis 177：1750-1753.Pluschke G et al“Role of thecapsule and the O-antigen in resistance of O18：K1 Escherichia coli tocomplement-mediated king”.J Bacteriol 42：907-913]。大肠杆菌是一个种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-436]。

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide  Oantigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encodingthe same col itose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰成糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli 0111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O43的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。

本发明的一个目的是提供了大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的基因：转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf4、orf6、orf11基因；糖合成路径基因，包括rmlB、rmlC。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O43的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因，包括orf2、orf2、orf4、orf6、orf11基因。它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O43的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O43的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O43的O-抗原也是高度特异的。

本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O43的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O43。

本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQID NO：1所示的分离的核苷酸，全长14309个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其包括命名为wzx、orf2、orf3、orf4、wzy、orf6、gmd、fc1、gmm、manC、orf11、manB的12个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述的基因包括：转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf4、orf6、orf11基因。其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO：1中的1083至2096碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO：1中的4712至5938碱基的核苷酸；所述的orf2基因是SEQ ID NO：1中的2412至3155碱基的核苷酸；orf3基因是SEQ ID NO：1中的3152至3673碱基的核苷酸；orf4基因是SEQ ID NO：1中的3652至4740碱基的核苷酸；orf6基因是SEQ IDNO：1中的5935至6984碱基的核苷酸。orf11基因是SEQ ID NO：1中的11007至11753碱基的核苷酸；

前述的对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O43的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的1406至1423碱基的核苷酸和2014至2031碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的1983至2001碱基的核苷酸和2230至2248碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的5421至5439碱基的核苷酸和5781至5799碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的4766至4784碱基的核苷酸和5663至5681碱基的核苷酸，

前述的对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O43的O-抗原，并成为细菌疫苗。

前述的对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于PGR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，可用这些方法检测人体和环境中的细菌。

前述的对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O43型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O51型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O43型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O43型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O43型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy、基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O43型的O-抗原的高度特异性；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O43，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O43的灵敏度。

前述的对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O43，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O43中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O43的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAAGAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCGCGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的ExpandLong Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾，此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O43的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O43的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O43的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在大肠杆菌O43中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O43及其O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：将大肠杆菌O43的冻存菌液接种到有LB培养基的三角瓶中，30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时至饱和，取培养好的菌液稀释，取稀释菌液涂布LB琼脂平板，30℃至40℃，培养数小时计数，计算原液中活菌浓度；在5份重量均为20g的生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入LB培养基，过滤，过滤液于30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时；从培养好的菌液中取数ml于6,000g离心数分钟，去上清，加MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100℃沸水中煮数分钟，裂解液于12,000g离心数分钟，取上清做为PCR模板；用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的1406至1423碱基的核苷酸和2014至2031碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的1983至2001碱基的核苷酸和2230至2248碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的5421至5439碱基的核苷酸和5781至5799碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的4766至4784碱基的核苷酸和5663至5681碱基的核苷酸进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：lμl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环；反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性；参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果；参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果；说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O43的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长14309个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，它的12个基因都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O43的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf4、orf6、orf11基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括rmlB、rmlC。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因对大肠杆菌O43的O-抗原是特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O43的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基转移酶基因包括orf2、orf3、orf4、orf6、orf11基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源于大肠杆菌O43的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O43为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O43及它们的O-抗原是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O43中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选；(7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的1406至2031碱基)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的1983至2248碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O43都是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf4、orf6、orf11基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf4、orf6、orf11基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O43。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf2、orf3、orf4、orf6、orf11基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O43表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf4、orf6、orf11基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O43。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因包括orf2、orf3、orf4、orf6、orf11基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf2、orf3、orf4、orf6、orf11基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O43。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf2、orf3、orf4、orf6、orf11基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O43的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取。

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O43，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O43中的O-抗原基因簇

以大肠杆菌O43的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库。

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD6000.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O43的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序。

从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到，最后获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析。

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O43的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到12个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf1与Salmonel1a typhimurium LT2的O-抗原转运酶Wzx在428个氨基酸中有39％的相同性，63％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法发现orf1有10个潜在的穿膜区，Wzx蛋白的氨基端有一个大约50个氨基酸的保守基序，所以可以确定orf1是wzx基因，命名为wzx。Orf2与Salmonella enterica subsp.enterica的糖基转移酶在224个氨基酸中有37％的相同性，58％的相似性。保守基序的数据库的搜索发现Orf2编码的蛋白属于糖基转移酶2(PF00535，E value＝4.5×e^-33)，推测orf2也是一个糖基转移酶，暂命名为orf2。Orf3与Vibrio cholerae的半乳糖基氧乙酰基转移酶在152个氨基酸中有37％的相同性，55％的相似性。保守基序的数据库的搜索发现它属于细菌转移酶(PF00132 E value＝1.8×e^-5)，大肠杆菌O43的O-抗原结构未知，但推测其中有半乳糖，而且Orf3编码的蛋白对半乳糖残基乙酰基化，因此将Orf3暂命名为orf3。Orf4与Streptococcus pneumoniae的糖基转移酶在174个氨基酸中有27％的相同性，48％的相似性。保守基序的数据库的搜索发现Orf4编码的蛋白属于糖基转移酶1(PF00534，Eva lue＝6.5×e^-6)，推测orf4也是一个糖基转移酶，可能是转移半乳糖残基，暂命名为orf4。Orf5与Shigella flexneri 2a str.的O-抗原聚合酶在359个氨基酸的序列中有27％的相同性，48％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法发现orf5有12个潜在的穿膜区，它与许多Wzy蛋白有相似的二级结构，有一个大的loop，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以确定orf5是wzy基因，命名为wzy。Orf6与eromonas hydrophila的类似于甘露糖的糖基转移酶在344个氨基酸中有44％的相同性，46％的相似性，在genbank中寻找保守的功能域，发现orf6与糖基转移酶家族的保守的功能域PF00534的Evalue为Evalue＝1×e^-25，推测orf6也是一个糖基转移酶，转移GDP-L-fucose，将orf6暂命名为orf6。orf7，orf8，orf9，orf10，orf12分别与不同菌中的gmd，fc1，gmm，manC和manB享有83，73，51，100，99％的同源性。高度的同源性表明它们是合成GDP-L-fucose的基因。说明大肠杆菌O41和O43的O-抗原都有GDP-L-fucose这个糖。Orf7，orf8，orf9，orf10，orf12也被相应的命名为gmd，fc1，gmm，manC和manB。orf11与大肠杆菌O41的糖基转移酶有99％的相同性，说明它们可能是同一个转移酶基因，暂命名为orf11。

实施例6：特异基因的筛选

针对大肠杆菌O43的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

在表1中列出了大肠杆菌O43的O抗原基因簇的转运酶基因、聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166种血清型的大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166种血清型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。

表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共13组。它们的来源都列于表中。

在第2组中含有大肠杆菌O43的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是不含有大肠杆菌O43的基因组DNA，作为阴性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性2分钟后，95℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第2组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O43及其O-抗原都是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O43中筛选到对大肠杆菌O43的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O43的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O43是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O43，并能鉴定它们的O-抗原。

通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O51的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

根据本发明的对大肠杆菌O43型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ ID NO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表3是大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的结构，共由12个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O43的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大肠杆菌O43的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

序列列表

                 SEQUENCE LISTING

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>对大肠杆菌O43的O-抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>14309

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc      60

gaaaaccact tcgacacctc atatgaatta gaatctctcc ttgagcagcg cgtgaagcgt     120

caactactgg cggaagtgca atctatctgt ccgccgggcg tgaccattat gaacgtgcgt     180

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gaccgtgaag gcaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag     480

acgctggact cagacatcat ggccgtaggt cgttatgtgc tttctgccga tatttggccg     540

gaacttgaac gcacgcagcc aggggcatgg ggacgtattc agctgacaga tgccatcgct     600

gaactggcga aaaaacaatc tgttgatgca gtgctgatga ctggtgacag ctacgactgc     660

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ataaattaca tttacgactg ccgtttatgc atccatccgt gtttataaaa aaatgtatta    2880

tatccaaaca taatggattt agtttaaatt ataaaatagc atcagattgt gatcttttgc    2940

ttaaagtgct aaacgaatca atttcaattg aatatgtcaa tgcttatatt gttatgcggt    3000

taggtggtgt aagtgatgtc aattataaat tgggcagaaa agaatataga gatatatatt    3060

ttaatcattt taatagaaaa ataaaagcta atataggtta tgttgagagt ttattatcgc    3120

attattgtta taaagctata aggattctaa aatgaaatcg ttaaagattt atttatggga    3180

gttgtttttt tcaaaaatac catgtaattt tattcggcga atatttttct ctaaggtttt    3240

aaataacaaa attaataata atatatcatt attgagaaat attcatctaa cttcaactga    3300

tggtatatca attgatgaaa aaacgaccat aaataaaaat gtttatatcg atggaagagg    3360

aggggtgaca attggttcta atgttagtat ctccccttat gtcaggatta ttaccgcgag    3420

tcacgatgta aattgtccta atttttcttt aatactgaag cctgtgataa ttaaagatta    3480

tgtctggata tgcacatctt ctattatttt accaggcgta accttgggct atggagccat    3540

tgtcgcagca ggagcagttg ttacaaaaaa tattcctgat tatgctattg tcgctggcaa    3600

ccctgcgaag gtaattgggt atcgtagtga aaccctgcac tataatccat tatggagacc    3660

cacgtttcaa tgagaaaata ttatatttgt agagattttt ccgaagcctg tggaatttca    3720

aaatatggat atgtattctt tagtacaata ctaaaagaat atggtttcga aaagatccat    3780

ttaaaagatg taaatgatgt tagtcaagta ttatcgaaga tcaattgtga tgataaagtt    3840

tggattgaaa ttgggttggg aacatattta gaaactctat tgtacaagaa attaattagg    3900

aaaaataatc aaaatgtaat aattacatta catgatgcac cgtttattga atatcctatt    3960

ttaaaattta aaaatcaacc tttcaattta ttatccaaaa taaatcaata tgtttttttg    4020

agatggccat ttacgtcatt tttttatagt tatttacata aaacaaagcg tatatataca    4080

ctaaacccta aaggtacaga atcacttctt aaccgttatc gtttgcataa tgtagttact    4140

attccacatg ttttacataa tatagaagaa gtagataata agaaaagtgg tatactacag    4200

ttcttatact ttggttttat aggtaaaaat aaaggattag aatatgcgct cagtttacat    4260

gagaaaataa atacattagt taaaaccccc attacaatga aaattattgg aaaaacacta    4320

gatgaaaaat ctgagaagta ctttcaaaaa ataaaaagaa gatataatga gaatgttgaa    4380

tatttagggt atgttgaaga caaagaactt gatatattaa tgcaacaaga taatattatt    4440

cttttaccaa caaaaaatta taaagttata aaacctacca gtggaagtgt tcttaattcg    4500

ttaaaatatc ttaatattgt atttacaaca aaagttaatg ctaatgaatg tctaataagt    4560

gataaagaaa atggcttttt tttacaagga gatataaata gcgatacatt taatatttta    4620

agcattatta acaattctga tttaagaaat aaaataagat taaatatata taatgatttg    4680

atgatgaagt atataccaat caaagttatt aatgagatca aagttgatga ctatcgctaa    4740

aaaaaaacaa ttgaacttaa taaattttat tcgcaggttc tctatactgt tttttttaat    4800

tattttttta tctttatctc cgaattacat atttattttt tatcctgaac taaaatttgt    4860

aattgctatt ttgggtgcaa tacttgcatt acttggcata tgtgatgtta gaaaaatatt    4920

taaaacatat tcgtctctat tcttattcct tttttatgga gtcctttttt ttacttcgat    4980

aattagttat attatatatg gtaacttgaa tggagtgtat ttttccttat ctattttatt    5040

taagtttctg atagttatca tattcgtaat gtctttaaaa gatattgata ttctatttct    5100

gataaagata ttaataaata ttatggctgt tgtatgtttg ttttctttaa ttggagagtt    5160

tttatacatt ctaaatatta tagcagtaac aaacagtttt gaatttcaaa catatttata    5220

tcatgttatt tcttattggg gagcttttac agtttcattt gatatatatg gcatgaagat    5280

aattagaaat caatcttttt tccaagagcc gggttttttt gcattttaca tttttatcac    5340

aatgattttt atttcaatag tgcagaagct atatagcaaa aaccattttt tcatactata    5400

tggtttgttc ttcttgacta tgctatctac gctttctctt acaggaattg cgttatcagc    5460

catattaagt gtgtacatat ttaggggggt tgttattaat tcaatcgcaa gcattatcag    5520

catgtcaatt ttgacttaca tattgatctc tgataacccc tatgttaata aaataggttc    5580

tttagacgaa cgtttgtacg gattaattaa tggggctaat gtattttatt caaaccccat    5640

ggtttttctt ttaggtgccg gttatgagtc ggaaccgcta tttatgtttg atgggaaatt    5700

caataattta tttttcgaaa tactattata ctctggtatt tttaatttgt ttatttatat    5760

gggttttatt atttatatct tcaggaaatg ttatgggatt aagtttaaat attttcttgt    5820

cattatatat tgtatgacaa caccactatt ttggtcgcct attatgataa tttttaacgt    5880

tgttttactt cgctacaatg gggtaaagca gagtctgtta aggttaaatg aaaaatgatt    5940

ttattagatg gaataatttt ttcgttgcaa atgtcgggtg gaatatcagt ttatttttat    6000

gagctaatta aacatctcga tagccaaaga aaaaagcatg aaatcatttt gtataaaaat    6060

aataatgatt taattaaaaa ttatgcgacg aatgcagagt ttcgattttc tataaatata    6120

gaaagatttc tgagatgtcg taatttttgt tcagaagcaa caatatttca ttcaagttat    6180

tatcgtttgc cagagaggca gtttagagga aaaataataa ctacagttca tgattttacg    6240

gatgagatat atcccagaaa tgcttatgct aagatactta gttaccaaaa aaagaaaact    6300

attttaaata gcgatggaat tatttgcatc tctgataata ccaaaaggga tctattgaat    6360

tttattcctg aagcaaaagg aattcctata aaagttatat ataatggagt tggagatttc    6420

tcttataatc cagattgtgt aagaaacatt gcttcattta aacagccata tgcattattc    6480

gttggaggac gaaaaaaata caagaacttt aatgtctgtg tccaaacact cagtcaatat    6540

aaaaatatta atcttgtgat tgttggtgga ggtgatctgg attttcaaga attaaaaatg    6600

ttaaatagat atttaaaagg acgttattat aaaaaaggtt atgtagatga ccagcaatta    6660

aataatcttt acacctgcgc tttattttta ttttatccat cccaatatga agggtttggt    6720

attcctgtgt tagaagcaat gaagtctggg tgtcctgtaa ttgcaactga ttgttcttct    6780

gtaagagaga tagcatcagg atatgctctg ctagccaaag aggcaactgt tgaacaattt    6840

tctaagtgta ttaatttatt attagatgaa agttttagag agaaaatgat atataatggt    6900

ctacattatg ccaagaaatt cacttgggat aaatgctttt ctgatactgt tagtttttat    6960

gatgaggtga gatatttaaa atgaaagtag ctctgattac gggtattact ggacaagacg    7020

gttcttattt ggctgaattt ttattagaaa agggatacga agttcacggt atcaaacgtc    7080

gagcatcttc gttcaacact gatcgagttg atcatattta tcaggatcca catattagta    7140

atccaaaatt ccatcttcat tatggtgatc taactgatac ttctaactta acacgtatac    7200

tttcagaagt taggccagat gaagtatata atttaggagc tatgagtcat gttgcagttt    7260

cctttgaatg tccagaatat accgctgatg ttgatgcaat tggaacgtta agattgttgg    7320

agtctattcg ttttttagga ttagaaaata agacaagatt ttatcaagca tcaacatctg    7380

agttgtatgg attggttcaa gaagttccac aaaaagaaac aacgcctttt tatccaagat    7440

caccatatgc agttgccaag ctttatgcct attggataac tgttaactat cgtgaatcat    7500

atggtatgtt tgcttgtaat ggcattttgt tcaatcatga atccccacgc cgtggagaaa    7560

cattcgtaac gcgtaaaatt acacgtgcta tagctaacat ttctcaaggt attgaaaaat    7620

gcctatatct cggtaatctg gattcgcttc gtgattgggg acatgctaaa gattatgttc    7680

gtatgcaatg gatgatgctc caacaagaca aaccagagga tttcgttata gcaacaggta    7740

aacaaatatc tgtgcgtgaa tttgttcgta tgtccgctaa agaagttggg ctggaacttg    7800

aattttcagg taaaggtgtt aatgaaattg cgacggttgt acataaaaca tctgactgtg    7860

ctgttggggt aaacattgga gatgttattg ttcgcgtaga ccctcgctat ttccgtcccg    7920

cagaggttga tacgctgttg ggggatccaa ctaaagcgaa agaagtgtta ggatgggaac    7980

cagaaattac tattgaaaag atgtgttcag aaatggttgc tagtgattta gaaaaagcaa    8040

aacagcatgc atttcttaaa agccatggtt atgacgtagc agtatctctg gagcgttgag    8100

taatgacaaa gaagcgtatt tatgttgcgg ggcatcgtgg tatggttggt tctgctatat    8160

gccgacactt atcagaattt catgatgtcg agttagttgt aaaaactcat aaagaactcg    8220

atttgactaa tcaacaagat gtcgagactt tttttgaaca agagaaaata gatgaagtat    8280

atcttgccgc tgcaaaagta ggtggaattc acgctaataa tacatatccg gcagaattta    8340

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ataaattact ttttttaggt tcaagttgta tttatcctaa gtttgcagag cagccaatga    8460

aagaatcttc acttttaaca ggtgtactcg aaactacaaa tgagccatat gcaatagcta    8520

aaattgcagg tataaaattg tgtgagtctt acaatcgtca atatggatgt gattatcgca    8580

gtgtaatgcc tactaatttg tatggtacga atgataattt tcatcctaat aactcacatg    8640

taattccagc gctcatgagg cgttttcatg aagcaaagga gttggggtta aatgaagtag    8700

ttgtctgggg gactggaaca ccaaaacgtg agtttttata tgttgatgat atggcagctg    8760

cgtcagtata tgtgatggag cttgatgatg aagtttacaa aaaaaatacg caaccaatgt    8820

tatctcatat taacgtaggt actggtgttg attgttctat acgcgaaatg gcagaaacaa    8880

tggctttagt tgttggctat gaaggaaaaa ttgtttttga tagaactaaa ccggatggcg    8940

caccgcgtaa acttatggat gttactcgtc ttgaaaaact gggctggaaa tatcgttata    9000

atttaaagga aggactagaa ttaacttata agtggtttat aaataacctt gactcattta    9060

ggagataata ttgaataaga gattagcacc tgagttattt aaatcaatag tcgaacatac    9120

tccactaatc tcgatagatc ttattataag aaacgaagaa ggtaaggcgc tgcttggcca    9180

gcgcctcaat cgtccagcac aaaattattg gtttgtgccg ggggggcgaa ttcttaaaga    9240

tgagtctttc gagaacgcat tcaaaagagt tacacttgaa gaactaggtg ttcaaattag    9300

tattaatgaa gcaaaatttc ttggtgcata tgaacatttc tacagcgaca acttttcagg    9360

aactaatttt tcaacgcatt atatagtact tgggtatgag attaatacga tgtcacatca    9420

aattaactat ccaacactgc aacatagcac ttacaattgg ttcgatatag ccgaattgtt    9480

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ctacttcctg ttgtaatggc cggtggttct ggaactagat tgtggccact ttctcgaaca    9600

ctatatccga aacaattcct atcgttaact agtcgtttga ctatgctaca agagacctta    9660

agaaggcttg agggggttga acatcgtcct gctctggtta tttgtaatga agttcatcgt    9720

tttatcgttg cagaacagat gcgtaatgaa catttagcga atagtggcat tttacttgag    9780

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ggcgaggatc ctatactgct tgtattagca gccgatcatg atatacaaga ccaagagcgc    9900

tttatatcgt cgatattggc tgcaaaagaa tttgcagagg aaggtaagct ggttactttt    9960

ggtattgtgc caaccaaacc cgaaactgga tatggctaca taaaaaccgg agagaattta   10020

aatgaatatg gctttaaagt ttctgctttt gttgaaaaac ctgagctaga tgtggccaaa   10080

aaatatctcg aagatggagg ttatctttgg aatagtggaa tattcatgtt cagggcctct   10140

gtgtttattg atgagttaaa taaatttaga ccagacatac taaaaatatg ccaacaagca   10200

ttgaagtcct ctacacaaga tcttgatttt atccgtatag ataatgactc atttagttgt   10260

tgccctgaag aatctattga ttatgctgtt atggagaaaa caacagaggc tgtggtagtt   10320

ccattaaatg cccactggag cgatgttggt tcttggtctg cattatggga aattagcagc   10380

aaagataaaa gtggaaatgc aattagagga gatgtattaa ttcatgattc ttcggatagt   10440

tatctttact cacaacatag attaattggt gtagtaggag ttaaagattt agtagttgtt   10500

gaaactaaag atgctattct cgttgcgcat aaagataaag ttcagaaggt aaaaaatatt   10560

gttgaacaac ttaaagttaa taaccgtgcg gaatatcagc agcatcgtga aatatttaga   10620

ccatggggca gtcatgactc tatagcagaa gggtctcgat ttcaggttaa acatgttgtt   10680

attcatcctg gacataaaac tgctaaacag atccattacc atcgtactga acattggatt   10740

gttgtttccg gaacagcaaa agtccattat gaggatgaaa tatttcttgt ttctgaaaat   10800

gaatcaactt atataccaat aggtgtaccg cattttattg agaatcctgg aaagatccct   10860

ttggaaatta ttgaagtacg ttcaggtgtt tacttggatg aagatgatgt tgttagaatc   10920

ttaaatgatg atggatatta atgcaacatt ataattcgta atgctgtact gacgttattt   10980

aattatgatt attattggat gttaaaatga aagtcagtat tattacagtg acttataata   11040

gtgaaaagac tttaaggaat actttagagt caatagagct gcaaacctat aacgatatag   11100

agtatataat tattgatggt ggttctaccg ataatacgtt aaaaataatt aacgaagtat   11160

caacaagagt aacaagatgt ctatcagaaa gcgataaagg tatctatgat gctttaaata   11220

aaggtataaa tttatctacg ggagatatta tcgggttcgt tcattctgat gacgttttag   11280

caagacctga tattattgaa actattgtag gccgtttcca tgagacaaaa gcggatgttg   11340

tatacggtga tttggttttt ttcgaaaaaa accaaattga tataatcaaa cgatactggc   11400

gtagtggccc ttttaaacgt tctaagctat cattaggttgggcaccaccg cacccatctt   11460

tctatatgag aagggaatta tataaagacg atggatattt tgatttatcc tataggattg   11520

ctgcagacta tgatcagatg gtcagggttt tgaaacgtga tgatattaaa gttagttatg   11580

ttcctcaagt atttgtaaag atgagattgg gaggggaaag taccagaatt gataacgcga   11640

tatcaagtac aaaggaaatt gtagcagtta tgaaaaacca taatgtaaat tggaaatttg   11700

ctatcattat cagaaaaata tcaaaactaa tgcaattgtt tgcgcataaa taattttata   11760

attggtaagg tttttatatg aaaaaattaa cctgctttaa agcctatgat attcgcggga   11820

aattaggcga agaactgaat gaagatattg cctggcgcat tggtcgcgcc tatggcgaat   11880

ttctcaaacc gaaaaccatt gtgttaggcg gtgatgtccg cctcaccagc gaaaccttaa   11940

aactggcgct ggcgaaaggt ttacaggatg cgggcgtcga tgtgctggat attggcatgt   12000

ccggcactga agagatctat ttcgccacgt tccatctcgg cgtggatggc ggcattgaag   12060

ttaccgccag ccataatccg atggattacg atggcatgaa gctggtgcgc gaaggggctc   12120

gcccgatcag cggtgatacc ggactgcgcg acgtccagcg cctggcagaa gccaacgact   12180

ttcctcccgt cgatgaaacc aaacgcggtc gctatcagca aatcaatctg cgtgacgctt   12240

acgttgatca cctgttcggt tatatcaatg tcaaaaatct cacgccgctc aagctggtga   12300

ttaactccgg gaacggcgca gcgggtccgg tggtggacgc catcgaagcc cgctttaaag   12360

ccctcggcgc gcccgtggaa ttaatcaaag tgcacaacac gccggacggt aatttcccca   12420

acggtattcc taacccgcta ctgccagaat gccgcgacga cacccgcaat gcggtcatta   12480

aacacggcgc ggatatgggc attgcttttg atggcgattt tgaccgctgc ttcctgtttg   12540

acgaaaaagg gcagtttatt gagggctact acattgtcgg cctgctggca gaagcgttcc   12600

tcgaaaaaaa tcctggcgcg aagatcatcc acgatccacg tctctcctgg aacaccgttg   12660

atgtggtgac tgccgcaggt ggtacgccgg taatgtcgaa aaccggacac gcctttatta   12720

aagaacgtat gcgcaaggaa gacgccatct acggtggcga aatgagcgcc caccactatt   12780

tccgtgattt cgcctactgc gacagcggca tgatcccgtg gctgctggtg gctgaactgg   12840

tgtgtctgaa aggaaaaacg ctgggcgaac tggtgcgcga ccggatggca gcatttccgg   12900

caagcggtga gatcaacagc aaactggcgc aacccgttga ggcgattaac cgcgtcgaac   12960

agcattttag ccgtgaggcg ctggcggtgg atcgcaccga tggcatcagc atgacctttg   13020

ccgactggcg ctttaacctg cgctcctcca acaccgaacc ggtggtgcgg ttgaatgtgg   13080

aatcgcgcgg tgatgtgccg ctgatggaag aaaaaacaaa acttatcctt gagttactga   13140

gtaagtaatc cagtaatttc atataaatag gttttaaaag acggaaaaga tgagatatac   13200

agtgtggtat agccaaggta atgctattca ccatctctat tagtgagtta acatctatac   13260

cacatttaag ccgcacactc ggcggtgagc accccctgac aggagtaaac aatgtcaaag   13320

caacagatcg gcgtcgtcgg tatggcagtg atggggcgca accttgcgct caacatcgaa   13380

agccgtggtt ataccgtctc tattttcaac cgttcccgtg aaaagacgga agaagttatt   13440

gccgaaaatc caggcaagaa actggttcct tactatacgg tgaaagagtt tgttgaatct   13500

ctggaaacgc ctcgtcgcat cctgttaatg gtgaaagcag gtgcaggcac ggatgctgct   13560

attgattccc tcaagccata cctcgataaa ggtgacatca tcattgatgg tggtaacacc   13620

ttcttccagg acaccattcg tcgtaaccgt gagctttctg cagaaggctt taactttatc   13680

ggtactggtg tttccggtgg tgaagaaggt gcgctgaaag gtccttccat tatgcctggc   13740

ggacagaaag aagcctatga actggttgca ccgatcctga ccaaaatcgc cgcagtggct   13800

gaagacgggg agccatgcgt tacctatatt ggtgccgatg gcgcaggtca ctatgttaag   13860

atggttcaca acggtattga atacggtgat atgcagctga ttgctgaagc ctattctctg   13920

cttaaaggcg gcctgaatct ctctaacgaa gaactggcac agacctttac cgagtggaat   13980

aacggtgaac tgagcagcta cctgatcgac atcaccaaag acatcttcac taaaaaagat   14040

gaagacggta actacctggt tgatgtgatc ctggatgaag cggctaacaa aggtaccggt   14100

aaatggacca gccagagcgc gctggatctc ggagaaccgc tgtcgctgat taccgagtct   14160

gtgtttgcac gttatatctc ttctctgaaa gatcagcgcg ttgccgcatc taaagttctc   14220

tctggtccgc aagcgcagcc agctggcgac aaggctgagt tcatcgaaaa agttcgtcgt   14280

gcgctgtatc tgggcaaaat cgtttctta                                     14309

表1大肠杆菌O43的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因及其中的引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物位置	反向引物位置	PCR产物长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								wzxwzy	O-抗原转运酶O-抗原聚合酶	1083-23964712..5938	1406-14231983-20015421-54384766-4783	2013-20312230-22485782-57995664-5681	626bp266bp379bp961bp	2222	60606060

表2 166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号	该组中含有的菌株	来源
			O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，018O21，O22，O23，O242、野生型大肠杆菌3、野生型大肠杆菌4、野生型大肠杆菌5、野生型大肠杆菌6、野生型大肠杆菌7、野生型大肠杆菌	O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，O57，O58，O60，O61，O62，O53O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81，O82，O83，O68O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O43，O137，	IMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSa

8、野生型大肠杆菌9、野生型大肠杆菌痢疾志贺氏菌10、鲍氏志贺氏菌11、福氏志贺氏菌12、野生型大肠杆菌13、野生型大肠杆菌

O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153O168，O169，O170，O171，O172，O173，D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B17，B18F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，DS，DRO3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O143，O155，O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119去除大肠杆菌O43的第3组菌

IMVSabcdddIMVSa

为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阴性对照

a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3是大肠杆菌O43的O-抗原基因簇的结构表

E.coli O43 O-antigen gene cluster

 galF    wzx      orf2 orf3     orf4     wzy     orf6     gmd     fcl    gmm   manC     orf11     manB       gnd

         31.1     27.7 33.5     25.0     27.1    29.6     38.3   35.5    36.0  37.5     32.9      54.1

表4是大肠杆菌O43的O-抗原基因簇中的基因的位置表

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC      60

GAAAACCACT TCGACACCTC ATATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT     120

CAACTACTGG CGGAAGTGCA ATCTATCTGT CCGCCGGGCG TGACCATTAT GAACGTGCGT     180

CAGGGTGAAC CTTTAGGTTT AGGCCACTCC ATTTTATGTG CACGACCCGC CATTGGCGAC     240

AACCCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGACG ATGCCAGCGC CGACCCGCTG     300

CGCTACAACC TTGCAGCCAT GATTGCGCGC TTCAACGAAA CGGGACGCAG CCAGGTACTG     360

GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TCCAGACCAA AGAACCGCTG     420

GACCGTGAAG GCAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG     480

ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTAGGT CGTTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG     540

GAACTTGAAC GCACGCAGCC AGGGGCATGG GGACGTATTC AGCTGACAGA TGCCATCGCT     600

GAACTGGCGA AAAAACAATC TGTTGATGCA GTGCTGATGA CTGGTGACAG CTACGACTGC     660

GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GCTTACGCAA CCTGAAAGAA     720

GGGGCGAAGT TCCGTAAAGG GATTGAGAAG CTGTTAAGCG AATAATGAAA ATCTGACCGG     780

ATGTAACGGT TGATAAGAAA ATTATAACGG CGGTGAAGAT TCGTGGCGAA AGTAATTTGT     840

TGCGAGTGTT CCTGCCATTG TTTTATATAA ACAATCAGAA TAACAACGAG TTAGCAATAG     900

GTTTTTAGTC AAAGTTTTCC AGGATTTTCC TTGTTTCTAG AGCGGATTGG TAAGACAATA     960

AAAACCTGTC AGTTTAGTTA TTTTTACAGG AATAACTTTA GATATCGTTG GTATATATGC    1020

AGTATGGTGG TAGCTGTAGA GCCAAGGGCG GTAGCGTGGA TAATTTAAAG GATTAGGGGT    1080

  Orf1的起始

GA ATGAGCTT AGTTAAAATA ATTCCAAAAC ATTTATGGGT CGCCGCTTCA TCTTGGGGAG  1140

CTAGAGGGAT TAGCGCTTGT GTACAAATTG TAAGTGTGCA TTATTTAGTC TCTTTACTCG    1200

GAGAGGATAA ATATTCTGCT TTTATTTTAC TGGGGGGGTT AATTACATGG TGTAATTTAT    1260

CTGACTTCGG TATCGGAAAT AGTATATTAA ATTATATCGC AGAAAGAAGG GCACAAGACA    1320

AAAATTACGA ATATTTTATA TTAGTAGGAT CTGTTATCGT TTTTATATTA TTTTTTATTG    1380

TAGCAGTGTT TCTTTGTTTT TTATCAATGA CAGTGGCAGA ACAATATCTA AAAATATACT    1440

CAGATGCTAT TATTAATAAT AAAATTATTT TGTTTTATAT ATCAACATTG ATTTTTTGTG    1500

GTACTGCGCT TGCCGGGATT ATTTACAAAA TATGGTATGC TGAGCAAATT GGTTGGTTAT    1560

CAAACTTATT TCCGGCAGTC TGCGCATTAA TTGGGCTTTT AAATATTATT GTTGTTCGTA    1620

AAATTGACGG TAACTTTAGT GATTTGCTGA TTGTTTTTGT TTTATTTTAT TTGCCGGCTT    1680

TGATTATACC TATTTATCTT TTGTTGAAAA GATATCGATT TGAAATAAGA AAAACAAAAT    1740

TGAATCGAAG GCTTTTTGCT GGTGCAAGTC TTAAGATTAT TGAAAGGGCT CGACCATTTT    1800

TTATTTTTGC AGTCATGGGG GCGATCGTCC TTCAAACTGA TTTAATAGTA CTATCTCAAA    1860

AAGGAGATGC AAGTGAAATC ATATTATATG GAGTGTTATT AAAGATATTT AATGTGATAT    1920

ATTTTATTTA TAGCGCAGTT CTCCAGGCGT GGTGGCCAGT TTGTACCGAA TTACGCATAA    1980

AAAAACAATG GGTGGAACTT AAAAAAAGTA TAAGGCTATC TGTAGGGTTA GGTGCATTAG    2040

CAATAACCAC GTTAATTTTT CTTGTTTATT GTTTACAAGA TGTTGTATTT AAATTGCTAG    2100

GTTTAGGGGG AATAGAAAAA GGTTCATTTA TATTATATTG TTTGTTTTGT TTGTATTTTA    2160

TCATTCGTGC ATGGTGTGAT ACCTATGCAG TTTTGTTACA AACAATGAAT AGTATGAAGC    2220

CGCTGTTTAT TATTGTACCG ATCCAAGCGT TGATTAATTT TATATTGCAG TGGTATTTTA    2280

TATCAATTCT ATCACTGACA GGTATATTAA TTGGTTCAAT AATATCATTC TTGTGTACTG    2340

                                                       Orf1的终止

TCGCAATATA TTTACCCTAC AAATTCAATC AACAAATAAA AAAACAAACA CACTGATAGA    2400

            Orf2的起始

GGGAGTGGTT G ATGCGGAAA AAATTATCAA TAGTGACTGT CGTATATAAT GGGGAGAGGT  2460

TCATTGAAAA TGCAATCAAT AGTGTTATAT CCCAAAAAAA TGAGCAAGTT GAATATATTA    2520

TAGTAGATGG GGGGTCTACA GATTCAACGT TAAATATTAT AGAAAAATAT AAAAATAAAA    2580

TAGATATTTT TATTTCAGAA AAAGATAAAG GTATATATGA TGCAATGAAT AAAGGATGGA    2640

GCAAAGCTAC TGGAGAATAT GTGGCTTTCT TGAATAGTGA TGATTTTTAT CAGCCTGGAT    2700

TGCTAAATTC CGTTTTAAAT GAAACTAATA AAAATCCGGA TATGATAGTA ACTAATACGT    2760

TGATTCAGGA TGGCGAGGGA AAAAGAAAAT TATTTAATAG AGTGACTAGA AAAGAAGATT    2820

ATAAATTACA TTTACGACTG CCGTTTATGC ATCCATCCGT GTTTATAAAA AAATGTATTA    2880

TATCCAAACA TAATGGATTT AGTTTAAATT ATAAAATAGC ATCAGATTGT GATCTTTTGC    2940

TTAAAGTGCT AAACGAATCA ATTTCAATTG AATATGTCAA TGCTTATATT GTTATGCGGT    3000

TAGGTGGTGT AAGTGATGTC AATTATAAAT TGGGCAGAAA AGAATATAGA GATATATATT    3060

TTAATCATTT TAATAGAAAA ATAAAAGCTA ATATAGGTTA TGTTGAGAGT TTATTATCGC    3120

                                   Orf2的终止

ATTATTGTTA TAAAGCTATA AGGATTCTAA A AGGAAATCG TTAAAGATTT ATTTATGGGA  3180

                                 Orf3的起始

GTTGTTTTTT TCAAAAATAC CATGTAATTT TATTCGGCGA ATATTTTTCT CTAAGGTTTT    3240

AAATAACAAA ATTAATAATA ATATATCATT ATTGAGAAAT ATTCATCTAA CTTCAACTGA    3300

TGGTATATCA ATTGATGAAA AAACGACCAT AAATAAAAAT GTTTATATCG ATGGAAGAGG    3360

AGGGGTGACA ATTGGTTCTA ATGTTAGTAT CTCCCCTTAT GTCAGGATTA TTACCGCGAG    3420

TCACGATGTA AATTGTCCTA ATTTTTCTTT AATACTGAAG CCTGTGATAA TTAAAGATTA    3480

TGTCTGGATA TGCACATCTT CTATTATTTT ACCAGGCGTA ACCTTGGGCT ATGGAGCCAT    3540

TGTCGCAGCA GGAGCAGTTG TTACAAAAAA TATTCCTGAT TATGCTATTG TCGCTGGCAA    3600

                                                       Orf4的起始

CCCTGCGAAG GTAATTGGGT ATCGTAGTGA AACCCTGCAC TATAATCCAT T ATGGAGACC  3660

          Orf3的终止

CACGTTTCAA  TGAGAAAATA TTATATTTGT AGAGATTTTT CCGAAGCCTG TGGAATTTCA  3720

AAATATGGAT ATGTATTCTT TAGTACAATA CTAAAAGAAT ATGGTTTCGA AAAGATCCAT    3780

TTAAAAGATG TAAATGATGT TAGTCAAGTA TTATCGAAGA TCAATTGTGA TGATAAAGTT    3840

TGGATTGAAA TTGGGTTGGG AACATATTTA GAAACTCTAT TGTACAAGAA ATTAATTAGG    3900

AAAAATAATC AAAATGTAAT AATTACATTA CATGATGCAC CGTTTATTGA ATATCCTATT    3960

TTAAAATTTA AAAATCAACC TTTCAATTTA TTATCCAAAA TAAATCAATA TGTTTTTTTG    4020

AGATGGCCAT TTACGTCATT TTTTTATAGT TATTTACATA AAACAAAGCG TATATATACA    4080

CTAAACCCTA AAGGTACAGA ATCACTTCTT AACCGTTATC GTTTGCATAA TGTAGTTACT    4140

ATTCCACATG TTTTACATAA TATAGAAGAA GTAGATAATA AGAAAAGTGG TATACTACAG    4200

TTCTTATACT TTGGTTTTAT AGGTAAAAAT AAAGGATTAG AATATGCGCT CAGTTTACAT    4260

GAGAAAATAA ATACATTAGT TAAAACCCCC ATTACAATGA AAATTATTGG AAAAACACTA    4320

GATGAAAAAT CTGAGAAGTA CTTTCAAAAA ATAAAAAGAA GATATAATGA GAATGTTGAA    4380

TATTTAGGGT ATGTTGAAGA CAAAGAACTT GATATATTAA TGCAACAAGA TAATATTATT    4440

CTTTTACCAA CAAAAAATTA TAAAGTTATA AAACCTACCA GTGGAAGTGT TCTTAATTCG    4500

TTAAAATATC TTAATATTGT ATTTACAACA AAAGTTAATG CTAATGAATG TCTAATAAGT    4560

GATAAAGAAA ATGGCTTTTT TTTACAAGGA GATATAAATA GCGATACATT TAATATTTTA    4620

AGCATTATTA ACAATTCTGA TTTAAGAAAT AAAATAAGAT TAAATATATA TAATGATTTG    4680

ATGATGAAGT ATATACCAAT CAAAGTTATT AATGAGATCA AAGTTGATGA CTATCGC TAA  4740

                               Orf5的起始                      Orf4的终止

AAAAAAACAA TTGAACTTAA TAAATTTTAT TCGCAGGTTC TCTATACTGT TTTTTTTAAT    4800

TATTTTTTTA TCTTTATCTC CGAATTACAT ATTTATTTTT TATCCTGAAC TAAAATTTGT    4860

AATTGCTATT TTGGGTGCAA TACTTGCATT ACTTGGCATA TGTGATGTTA GAAAAATATT    4920

TAAAACATAT TCGTCTCTAT TCTTATTCCT TTTTTATGGA GTCCTTTTTT TTACTTCGAT    4980

AATTAGTTAT ATTATATATG GTAACTTGAA TGGAGTGTAT TTTTCCTTAT CTATTTTATT    5040

TAAGTTTCTG ATAGTTATCA TATTCGTAAT GTCTTTAAAA GATATTGATA TTCTATTTCT    5100

GATAAAGATA TTAATAAATA TTATGGCTGT TGTATGTTTG TTTTCTTTAA TTGGAGAGTT    5160

TTTATACATT CTAAATATTA TAGCAGTAAC AAACAGTTTT GAATTTCAAA CATATTTATA    5220

TCATGTTATT TCTTATTGGG GAGCTTTTAC AGTTTCATTT GATATATATG GCATGAAGAT    5280

AATTAGAAAT CAATCTTTTT TCCAAGAGCC GGGTTTTTTT GCATTTTACA TTTTTATCAC    5340

AATGATTTTT ATTTCAATAG TGCAGAAGCT ATATAGCAAA AACCATTTTT TCATACTATA    5400

TGGTTTGTTC TTCTTGACTA TGCTATCTAC GCTTTCTCTT ACAGGAATTG CGTTATCAGC    5460

CATATTAAGT GTGTACATAT TTAGGGGGGT TGTTATTAAT TCAATCGCAA GCATTATCAG    5520

CATGTCAATT TTGACTTACA TATTGATCTC TGATAACCCC TATGTTAATA AAATAGGTTC    5580

TTTAGACGAA CGTTTGTACG GATTAATTAA TGGGGCTAAT GTATTTTATT CAAACCCCAT    5640

GGTTTTTCTT TTAGGTGCCG GTTATGAGTC GGAACCGCTA TTTATGTTTG ATGGGAAATT    5700

CAATAATTTA TTTTTCGAAA TACTATTATA CTCTGGTATT TTTAATTTGT TTATTTATAT    5760

GGGTTTTATT ATTTATATCT TCAGGAAATG TTATGGGATT AAGTTTAAAT ATTTTCTTGT    5820

CATTATATAT TGTATGACAA CACCACTATT TTGGTCGCCT ATTATGATAA TTTTTAACGT    5880

                                                        (红字)Orf6的起始

TGTTTTACTT CGCTACAATG GGGTAAAGCA GAGTCTGTTA AGGTTAAATG AAAAA TGATT  5940

                                                            Orf5的终止

TTATTAGATG GAATAATTTT TTCGTTGCAA ATGTCGGGTG GAATATCAGT TTATTTTTAT    6000

GAGCTAATTA AACATCTCGA TAGCCAAAGA AAAAAGCATG AAATCATTTT GTATAAAAAT    6060

AATAATGATT TAATTAAAAA TTATGCGACG AATGCAGAGT TTCGATTTTC TATAAATATA    6120

GAAAGATTTC TGAGATGTCG TAATTTTTGT TCAGAAGCAA CAATATTTCA TTCAAGTTAT    6180

TATCGTTTGC CAGAGAGGCA GTTTAGAGGA AAAATAATAA CTACAGTTCA TGATTTTACG    6240

GATGAGATAT ATCCCAGAAA TGCTTATGCT AAGATACTTA GTTACCAAAA AAAGAAAACT    6300

ATTTTAAATA GCGATGGAAT TATTTGCATC TCTGATAATA CCAAAAGGGA TCTATTGAAT    6360

TTTATTCCTG AAGCAAAAGG AATTCCTATA AAAGTTATAT ATAATGGAGT TGGAGATTTC    6420

TCTTATAATC CAGATTGTGT AAGAAACATT GCTTCATTTA AACAGCCATA TGCATTATTC    6480

GTTGGAGGAC GAAAAAAATA CAAGAACTTT AATGTCTGTG TCCAAACACT CAGTCAATAT    6540

AAAAATATTA ATCTTGTGAT TGTTGGTGGA GGTGATCTGG ATTTTCAAGA ATTAAAAATG    6600

TTAAATAGAT ATTTAAAAGG ACGTTATTAT AAAAAAGGTT ATGTAGATGA CCAGCAATTA    6660

AATAATCTTT ACACCTGCGC TTTATTTTTA TTTTATCCAT CCCAATATGA AGGGTTTGGT    6720

ATTCCTGTGT TAGAAGCAAT GAAGTCTGGG TGTCCTGTAA TTGCAACTGA TTGTTCTTCT    6780

GTAAGAGAGA TAGCATCAGG ATATGCTCTG CTAGCCAAAG AGGCAACTGT TGAACAATTT    6840

TCTAAGTGTA TTAATTTATT ATTAGATGAA AGTTTTAGAG AGAAAATGAT ATATAATGGT    6900

CTACATTATG CCAAGAAATT CACTTGGGAT AAATGCTTTT CTGATACTGT TAGTTTTTAT    6960

                      Orf7的起始(红字)

GATGAGGTGA GATATTTAAA     AAAGTAG CTCTGATTAC GGGTATTACT GGACAAGACG  7020

                        Ofr6的终止

GTTCTTATTT GGCTGAATTT TTATTAGAAA AGGGATACGA AGTTCACGGT ATCAAACGTC    7080

GAGCATCTTC GTTCAACACT GATCGAGTTG ATCATATTTA TCAGGATCCA CATATTAGTA    7140

ATCCAAAATT CCATCTTCAT TATGGTGATC TAACTGATAC TTCTAACTTA ACACGTATAC    7200

TTTCAGAAGT TAGGCCAGAT GAAGTATATA ATTTAGGAGC TATGAGTCAT GTTGCAGTTT    7260

CCTTTGAATG TCCAGAATAT ACCGCTGATG TTGATGCAAT TGGAACGTTA AGATTGTTGG    7320

AGTCTATTCG TTTTTTAGGA TTAGAAAATA AGACAAGATT TTATCAAGCA TCAACATCTG    7380

AGTTGTATGG ATTGGTTCAA GAAGTTCCAC AAAAAGAAAC AACGCCTTTT TATCCAAGAT    7440

CACCATATGC AGTTGCCAAG CTTTATGCCT ATTGGATAAC TGTTAACTAT CGTGAATCAT    7500

ATGGTATGTT TGCTTGTAAT GGCATTTTGT TCAATCATGA ATCCCCACGC CGTGGAGAAA    7560

CATTCGTAAC GCGTAAAATT ACACGTGCTA TAGCTAACAT TTCTCAAGGT ATTGAAAAAT    7620

GCCTATATCT CGGTAATCTG GATTCGCTTC GTGATTGGGG ACATGCTAAA GATTATGTTC    7680

GTATGCAATG GATGATGCTC CAACAAGACA AACCAGAGGA TTTCGTTATA GCAACAGGTA    7740

AACAAATATC TGTGCGTGAA TTTGTTCGTA TGTCCGCTAA AGAAGTTGGG CTGGAACTTG    7800

AATTTTCAGG TAAAGGTGTT AATGAAATTG CGACGGTTGT ACATAAAACA TCTGACTGTG    7860

CTGTTGGGGT AAACATTGGA GATGTTATTG TTCGCGTAGA CCCTCGCTAT TTCCGTCCCG    7920

CAGAGGTTGA TACGCTGTTG GGGGATCCAA CTAAAGCGAA AGAAGTGTTA GGATGGGAAC    7980

CAGAAATTAC TATTGAAAAG ATGTGTTCAG AAATGGTTGC TAGTGATTTA GAAAAAGCAA    8040

AACAGCATGC ATTTCTTAAA AGCCATGGTT ATGACGTAGC AGTATCTCTG GAGCGT TGAG  8100

                                                            Orf7的终止

TA ATGACAAA GAAGCGTATT TATGTTGCGG GGCATCGTGG TATGGTTGGT TCTGCTATAT  8160

  Orf8的起始

GCCGACACTT ATCAGAATTT CATGATGTCG AGTTAGTTGT AAAAACTCAT AAAGAACTCG    8220

ATTTGACTAA TCAACAAGAT GTCGAGACTT TTTTTGAACA AGAGAAAATA GATGAAGTAT    8280

ATCTTGCCGC TGCAAAAGTA GGTGGAATTC ACGCTAATAA TACATATCCG GCAGAATTTA    8340

TTTATCAGAA TCTTATGATA GAAAGTAATA TAATCAATTC GGCTCATAGA GCAGGTATTA    8400

ATAAATTACT TTTTTTAGGT TCAAGTTGTA TTTATCCTAA GTTTGCAGAG CAGCCAATGA    8460

AAGAATCTTC ACTTTTAACA GGTGTACTCG AAACTACAAA TGAGCCATAT GCAATAGCTA    8520

AAATTGCAGG TATAAAATTG TGTGAGTCTT ACAATCGTCA ATATGGATGT GATTATCGCA    8580

GTGTAATGCC TACTAATTTG TATGGTACGA ATGATAATTT TCATCCTAAT AACTCACATG    8640

TAATTCCAGC GCTCATGAGG CGTTTTCATG AAGCAAAGGA GTTGGGGTTA AATGAAGTAG    8700

TTGTCTGGGG GACTGGAACA CCAAAACGTG AGTTTTTATA TGTTGATGAT ATGGCAGCTG    8760

CGTCAGTATA TGTGATGGAG CTTGATGATG AAGTTTACAA AAAAAATACG CAACCAATGT    8820

TATCTCATAT TAACGTAGGT ACTGGTGTTG ATTGTTCTAT ACGCGAAATG GCAGAAACAA    8880

TGGCTTTAGT TGTTGGCTAT GAAGGAAAAA TTGTTTTTGA TAGAACTAAA CCGGATGGCG    8940

CACCGCGTAA ACTTATGGAT GTTACTCGTC TTGAAAAACT GGGCTGGAAA TATCGTTATA    9000

ATTTAAAGGA AGGACTAGAA TTAACTTATA AGTGGTTTAT AAATAACCTT GACTCATTTA    9060

     Orf8的终止orf9的起始

GGAGA TAATA TTGAATAAGA GATTAGCACC TGAGTTATTT AAATCAATAG TCGAACATAC 9120

TCCACTAATC TCGATAGATC TTATTATAAG AAACGAAGAA GGTAAGGCGC TGCTTGGCCA    9180

GCGCCTCAAT CGTCCAGCAC AAAATTATTG GTTTGTGCCG GGGGGGCGAA TTCTTAAAGA    9240

TGAGTCTTTC GAGAACGCAT TCAAAAGAGT TACACTTGAA GAACTAGGTG TTCAAATTAG    9300

TATTAATGAA GCAAAATTTC TTGGTGCATA TGAACATTTC TACAGCGACA ACTTTTCAGG    9360

AACTAATTTT TCAACGCATT ATATAGTACT TGGGTATGAG ATTAATACGA TGTCACATCA    9420

AATTAACTAT CCAACACTGC AACATAGCAC TTACAATTGG TTCGATATAG CCGAATTGTT    9480

                                               Orf9的终止orf10的起始

AGCTGATTCT TCAGTTCATC AGTACACAAA AAATTATTTT AAG TGAAGGT TATTTAT ATG9540

CTACTTCCTG TTGTAATGGC CGGTGGTTCT GGAACTAGAT TGTGGCCACT TTCTCGAACA    9600

CTATATCCGA AACAATTCCT ATCGTTAACT AGTCGTTTGA CTATGCTACA AGAGACCTTA    9660

AGAAGGCTTG AGGGGGTTGA ACATCGTCCT GCTCTGGTTA TTTGTAATGA AGTTCATCGT    9720

TTTATCGTTG CAGAACAGAT GCGTAATGAA CATTTAGCGA ATAGTGGCAT TTTACTTGAG    9780

CCGAAAGGTC GTAATACAGC TCCTGCAGTT GCTCTTGCTG CTCTTAAAGC AGTTTCATCA    9840

GGCGAGGATC CTATACTGCT TGTATTAGCA GCCGATCATG ATATACAAGA CCAAGAGCGC    9900

TTTATATCGT CGATATTGGC TGCAAAAGAA TTTGCAGAGG AAGGTAAGCT GGTTACTTTT    9960

GGTATTGTGC CAACCAAACC CGAAACTGGA TATGGCTACA TAAAAACCGG AGAGAATTTA    10020

AATGAATATG GCTTTAAAGT TTCTGCTTTT GTTGAAAAAC CTGAGCTAGA TGTGGCCAAA    10080

AAATATCTCG AAGATGGAGG TTATCTTTGG AATAGTGGAA TATTCATGTT CAGGGCCTCT    10140

GTGTTTATTG ATGAGTTAAA TAAATTTAGA CCAGACATAC TAAAAATATG CCAACAAGCA    10200

TTGAAGTCCT CTACACAAGA TCTTGATTTT ATCCGTATAG ATAATGACTC ATTTAGTTGT    10260

TGCCCTGAAG AATCTATTGA TTATGCTGTT ATGGAGAAAA CAACAGAGGC TGTGGTAGTT    10320

CCATTAAATG CCCACTGGAG CGATGTTGGT TCTTGGTCTG CATTATGGGA AATTAGCAGC    10380

AAAGATAAAA GTGGAAATGC AATTAGAGGA GATGTATTAA TTCATGATTC TTCGGATAGT    10440

TATCTTTACT CACAACATAG ATTAATTGGT GTAGTAGGAG TTAAAGATTT AGTAGTTGTT    10500

GAAACTAAAG ATGCTATTCT CGTTGCGCAT AAAGATAAAG TTCAGAAGGT AAAAAATATT    10560

GTTGAACAAC TTAAAGTTAA TAACCGTGCG GAATATCAGC AGCATCGTGA AATATTTAGA    10620

CCATGGGGCA GTCATGACTC TATAGCAGAA GGGTCTCGAT TTCAGGTTAA ACATGTTGTT    10680

ATTCATCCTG GACATAAAAC TGCTAAACAG ATCCATTACC ATCGTACTGA ACATTGGATT    10740

GTTGTTTCCG GAACAGCAAA AGTCCATTAT GAGGATGAAA TATTTCTTGT TTCTGAAAAT    10800

GAATCAACTT ATATACCAAT AGGTGTACCG CATTTTATTG AGAATCCTGG AAAGATCCCT    10860

TTGGAAATTA TTGAAGTACG TTCAGGTGTT TACTTGGATG AAGATGATGT TGTTAGAATC    10920

                  Orf10的终止

TTAAATGATG ATGGATAT TA ATGCAACATT ATAATTCGTA ATGCTGTACT GACGTTATTT  10980

                          Orf11的起始

AATTATGATT ATTATTGGAT GTTAAA ATGA AAGTCAGTAT TATTACAGTG ACTTATAATA  11040

GTGAAAAGAC TTTAAGGAAT ACTTTAGAGT CAATAGAGCT GCAAACCTAT AACGATATAG    11100

AGTATATAAT TATTGATGGT GGTTCTACCG ATAATACGTT AAAAATAATT AACGAAGTAT    11160

CAACAAGAGT AACAAGATGT CTATCAGAAA GCGATAAAGG TATCTATGAT GCTTTAAATA    11220

AAGGTATAAA TTTATCTACG GGAGATATTA TCGGGTTCGT TCATTCTGAT GACGTTTTAG    11280

CAAGACCTGA TATTATTGAA ACTATTGTAG GCCGTTTCCA TGAGACAAAA GCGGATGTTG    11340

TATACGGTGA TTTGGTTTTT TTCGAAAAAA ACCAAATTGA TATAATCAAA CGATACTGGC    11400

GTAGTGGCCC TTTTAAACGT TCTAAGCTAT CATTAGGTTG GGCACCACCG CACCCATCTT    11460

TCTATATGAG AAGGGAATTA TATAAAGACG ATGGATATTT TGATTTATCC TATAGGATTG    11520

CTGCAGACTA TGATCAGATG GTCAGGGTTT TGAAACGTGA TGATATTAAA GTTAGTTATG    11580

TTCCTCAAGT ATTTGTAAAG ATGAGATTGG GAGGGGAAAG TACCAGAATT GATAACGCGA    11640

TATCAAGTAC AAAGGAAATT GTAGCAGTTA TGAAAAACCA TAATGTAAAT TGGAAATTTG    11700

                                                       Orf11的终止

CTATCATTAT CAGAAAAATA TCAAAACTAA TGCAATTGTT TGCGCATAAA TAATTTTATA   11760

                  Orf12的起始

ATTGGTAAGG TTTTTAT ATG AAAAAATTAA CCTGCTTTAA AGCCTATGAT ATTCGCGGGA  11820

AATTAGGCGA AGAACTGAAT GAAGATATTG CCTGGCGCAT TGGTCGCGCC TATGGCGAAT    11880

TTCTCAAACC GAAAACCATT GTGTTAGGCG GTGATGTCCG CCTCACCAGC GAAACCTTAA    11940

AACTGGCGCT GGCGAAAGGT TTACAGGATG CGGGCGTCGA TGTGCTGGAT ATTGGCATGT    12000

CCGGCACTGA AGAGATCTAT TTCGCCACGT TCCATCTCGG CGTGGATGGC GGCATTGAAG    12060

TTACCGCCAG CCATAATCCG ATGGATTACG ATGGCATGAA GCTGGTGCGC GAAGGGGCTC    12120

GCCCGATCAG CGGTGATACC GGACTGCGCG ACGTCCAGCG CCTGGCAGAA GCCAACGACT    12180

TTCCTCCCGT CGATGAAACC AAACGCGGTC GCTATCAGCA AATCAATCTG CGTGACGCTT    12240

ACGTTGATCA CCTGTTCGGT TATATCAATG TCAAAAATCT CACGCCGCTC AAGCTGGTGA    12300

TTAACTCCGG GAACGGCGCA GCGGGTCCGG TGGTGGACGC CATCGAAGCC CGCTTTAAAG    12360

CCCTCGGCGC GCCCGTGGAA TTAATCAAAG TGCACAACAC GCCGGACGGT AATTTCCCCA    12420

ACGGTATTCC TAACCCGCTA CTGCCAGAAT GCCGCGACGA CACCCGCAAT GCGGTCATTA    12480

AACACGGCGC GGATATGGGC ATTGCTTTTG ATGGCGATTT TGACCGCTGC TTCCTGTTTG    12540

ACGAAAAAGG GCAGTTTATT GAGGGCTACT ACATTGTCGG CCTGCTGGCA GAAGCGTTCC    12600

TCGAAAAAAA TCCTGGCGCG AAGATCATCC ACGATCCACG TCTCTCCTGG AACACCGTTG    12660

ATGTGGTGAC TGCCGCAGGT GGTACGCCGG TAATGTCGAA AACCGGACAC GCCTTTATTA    12720

AAGAACGTAT GCGCAAGGAA GACGCCATCT ACGGTGGCGA AATGAGCGCC CACCACTATT    12780

TCCGTGATTT CGCCTACTGC GACAGCGGCA TGATCCCGTG GCTGCTGGTG GCTGAACTGG    12840

TGTGTCTGAA AGGAAAAACG CTGGGCGAAC TGGTGCGCGA CCGGATGGCA GCATTTCCGG    12900

CAAGCGGTGA GATCAACAGC AAACTGGCGC AACCCGTTGA GGCGATTAAC CGCGTCGAAC    12960

AGCATTTTAG CCGTGAGGCG CTGGCGGTGG ATCGCACCGA TGGCATCAGC ATGACCTTTG    13020

CCGACTGGCG CTTTAACCTG CGCTCCTCCA ACACCGAACC GGTGGTGCGG TTGAATGTGG    13080

AATCGCGCGG TGATGTGCCG CTGATGGAAG AAAAAACAAA ACTTATCCTT GAGTTACTGA    13140

     Orf12的终止

GTAAG TAATC CAGTAATTTC ATATAAATAG GTTTTAAAAG ACGGAAAAGA TGAGATATAC  13200

AGTGTGGTAT AGCCAAGGTA ATGCTATTCA CCATCTCTAT TAGTGAGTTA ACATCTATAC    13260

CACATTTAAG CCGCACACTC GGCGGTGAGC ACCCCCTGAC AGGAGTAAAC AATGTCAAAG       13320

CAACAGATCG GCGTCGTCGG TATGGCAGTG ATGGGGCGCA ACCTTGCGCT CAACATCGAA       13380

AGCCGTGGTT ATACCGTCTC TATTTTCAAC CGTTCCCGTG AAAAGACGGA AGAAGTTATT       13440

GCCGAAAATC CAGGCAAGAA ACTGGTTCCT TACTATACGG TGAAAGAGTT TGTTGAATCT       13500

CTGGAAACGC CTCGTCGCAT CCTGTTAATG GTGAAAGCAG GTGCAGGCAC GGATGCTGCT       13560

ATTGATTCCC TCAAGCCATA CCTCGATAAA GGTGACATCA TCATTGATGG TGGTAACACC       13620

TTCTTCCAGG ACACCATTCG TCGTAACCGT GAGCTTTCTG CAGAAGGCTT TAACTTTATC       13680

GGTACTGGTG TTTCCGGTGG TGAAGAAGGT GCGCTGAAAG GTCCTTCCAT TATGCCTGGC       13740

GGACAGAAAG AAGCCTATGA ACTGGTTGCA CCGATCCTGA CCAAAATCGC CGCAGTGGCT       13800

GAAGACGGGG AGCCATGCGT TACCTATATT GGTGCCGATG GCGCAGGTCA CTATGTTAAG       13860

ATGGTTCACA ACGGTATTGA ATACGGTGAT ATGCAGCTGA TTGCTGAAGC CTATTCTCTG       13920

CTTAAAGGCG GCCTGAATCT CTCTAACGAA GAACTGGCAC AGACCTTTAC CGAGTGGAAT       13980

AACGGTGAAC TGAGCAGCTA CCTGATCGAC ATCACCAAAG ACATCTTCAC TAAAAAAGAT       14040

GAAGACGGTA ACTACCTGGT TGATGTGATC CTGGATGAAG CGGCTAACAA AGGTACCGGT       14100

AAATGGACCA GCCAGAGCGC GCTGGATCTC GGAGAACCGC TGTCGCTGAT TACCGAGTCT       14160

GTGTTTGCAC GTTATATCTC TTCTCTGAAA GATCAGCGCG TTGCCGCATC TAAAGTTCTC       14220

TCTGGTCCGC AAGCGCAGCC AGCTGGCGAC AAGGCTGAGT TCATCGAAAA AGTTCGTCGT       14280

GCGCTGTATC TGGGCAAAAT CGTTTCTTA                                         14309

以上仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡依本发明技术实质对以上实施例作修改、等同变化与修饰，均属本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1、一种对大肠杆菌O43的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于，其wzx序列为SEQ ID NO：1中的1083至2396碱基的核苷酸或wzy序列为SEQ IDNO：1中的4712至5938碱基的核苷酸或者具有上述序列插入、缺失或取代一个或多个核苷酸，但保持wzx、wzy核苷酸特异性检测大肠杆菌O43的O-抗原功能的寡核苷酸。

2、一种对大肠杆菌O43的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于，其为源于wzx基因的寡核苷酸对：SEQ ID NO：1中的1406至1423碱基的核苷酸和2013至2031碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的1983至2001碱基的核苷酸和2230至2248碱基的核苷酸；或源于wzy基因的寡核苷酸对：SEQ ID NO：1中的5421至5438碱基的核苷酸和5782至5799碱基的核苷酸，SEQIDNO：1中的4766至4783碱基的核苷酸和5664至5681碱基的核苷酸。

3、权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O43的O-抗原特异的寡核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在鉴定细菌的O-抗原中的应用。

4、权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O43的O-抗原特异的寡核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测体外及环境中的细菌。