CN1256429C - 对大肠杆菌o24型的o－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O24型(Escherichia coli O24)的O-抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌型中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长18772个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O24型的O-抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O24型的方法。

Description

对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O24型(Escherichia coli O24)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O24型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O24型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena.(1993)“Genetics oflipopolysaccharide biosynthesis in entericbacteria”.MicrobiologicalReviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterialpolysaccharide synthesis and gene nomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigenloci：implication for Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichia coliO111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encoding the samecolitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak of Hemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster ofEscherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的

志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，niche specificselection and bacterial populations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identification of the Enterobacteriaceae”.Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，The Netherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenicrelationships between the enteroinvasive Escherichia coli antigensO28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152and and Shigella O antigens”J.clinMicrobiol，17(4)：681-684]

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。

本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf1、orf9基因。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf1、orf9基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O24型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O24型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O24型的O-抗原也是高度特异的。

本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O24型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O24型。

本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长18772个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸，其是由命名为wbdN，wckD，nnaB，nnaC，nnaA，wbwA，wzy，wzx，orf9的9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述基因中具有高度特异性的基因是：转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf1、orf9基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的11479至12672碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的10411至11463碱基的核苷酸；orf1是SEQ ID NO：1中的1096至1875碱基的核苷酸；orf9是SEQ ID NO：1中的16255至17325碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸，其中它还包括源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf1、orf9基因；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的10527至10542碱基的核苷酸和10829至10844碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10872至10887碱基的核苷酸和11393至11408碱基的核苷酸。源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的11931至11948碱基的核苷酸和12264至12279碱基的核苷酸；SEQ IDNO：1中的11572至11587碱基的核苷酸和12193至12209碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。

前述的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O24型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。

前述的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。

前述的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O24型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O24型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O24型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O24型的O-抗原的高度特异性；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O24，细菌计数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O24的灵敏度。

前述的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O24型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O24型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O24型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCTGCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bi0-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5d细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bi0-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O24型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O24型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到9个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O24的第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O24型的O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O24的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的10527至10542碱基的核苷酸和10829至10844碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10872至10887碱基的核苷酸和11393至11408碱基的核苷酸。SEQ ID NO：1中的11931至11948碱基的核苷酸和12264至12279碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的11572至11587碱基的核苷酸和12193至12209碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μ1反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O24的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长18772个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它总共由命名为wbdN，wckD，nnaB，nnaC，nnaA，wbwA，wzy，wzx，orf9的9个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因(orf1、orf9基因)。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O24型的O-抗原是高度特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf1、0rf9基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O24型的O-抗原都是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O24型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的10411至11463碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的11479至12672碱基的核苷酸)。源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O24型是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O24型。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O24型表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O24型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O24型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O24型的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取：

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O24型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O24型中的O-抗原基因簇：

以大肠杆菌O24型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGTTCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管longPCR产物，并用Promega公司的Wizard PCRPreps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库：

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul100mMDTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5a。取一环大肠杆菌DH5a单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序：

从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O24型的基因组作5个LongPCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O24型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到9个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用ClustralW软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，发现orf7和orf8是大肠杆菌O24种仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。orf8编码的蛋白与Clostridium tetani E88的O-抗原转移酶有20％的序列一致性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有10个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf8为wzx。orf7编码的蛋白与大肠杆菌O104的O-抗原聚合酶有27％的一致性，45％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有10个跨膜片段，并且有一个大的胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf7为wzy。

orf1，9两个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有36-79％的序列一致性和55-89％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，orf1基因编码的蛋白与已知的WbdN的共有序列的同源性预期值为2.1×e^-37，orf9基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1的共有序列的同源性预期值为3.3×e^-45，因此我们推测这两个基因编码糖基转移酶，因此我们将orf1基因名为wbdN，由于orf9基因的确切功能还不能确定，因此我们暂命名为orf9。

orf2基因编码的蛋白与大肠杆菌O104 O-抗原基因簇中编码的WckD蛋白有72％的氨基酸序列一致性，因此我们将orf2基因名为wckD。orf3，4和5基因编码的蛋白分别与大肠杆菌O104 O-抗原基因簇中nnaB，C和A基因编码的NnaB，C和A蛋白有56-77％的氨基酸序列一致性和73-87％的相似性，这三个基因编码的蛋白与已知的NnaB，C和A蛋白的共有序列的同源性预期值为5.4×e^-127至6×e^-55，因此我们将orf3，4和5基因命名为nnaB，C和A。orf6基因编码的蛋白与大肠杆菌O104 O-抗原基因簇中编码的WbwA蛋白有27％的氨基酸序列一致性，因此我们将orf6基因名为wbwA。

实施例6：特异基因的筛选：

针对大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O24的第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O24型的O-抗原都是高度特异的；这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

实施例7：引物灵敏度的检测。

购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O24的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4C的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的10527至10542碱基的核苷酸和10829至10844碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的10872至10887碱基的核苷酸和11393至11408碱基的核苷酸。SEQ IDNO：1中的11931至11948碱基的核苷酸和12264至12279碱基的核苷酸；SEQID NO：1中的11572至11587碱基的核苷酸和12193至12209碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μ1，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O24的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology 1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O24的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。

根据本发明的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ IDNO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。

表1列出了大肠杆菌O24型的O抗原基因簇中糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O24型的O抗原基因簇的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ IDNO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共12组，它们的来源都列于表中。

在第13组中含有大肠杆菌O24型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O24型及其O-抗原是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O24型中筛选到对大肠杆菌O24型的O-抗原高度特异的基因：wzx和wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O24型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O24型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O24型，并能鉴定它们的O-抗原。

表3是大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇的结构，共由9个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O24型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

             SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>对大肠杆菌O24型的O抗原特异的核苷酸

<130>对大肠杆菌O24型的O抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>18772

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

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ggttggccta ataaaaattt tgaggggaaa ttttcactga aagaattaaa tcatccagat  15240

catgacagtt acgcaattag tgaaaagagt cacggtagag aagaaatcaa tcttcagatt  15300

gtttgcgaag tccgtgatga acttattgat tttacgtttg aatggaaagg actgaaaaaa  15360

ttatgtgtag cagttttctt tcggtcaata agtgcaaaac aaaataaaga gccagaaatg  15420

acggtcagat attatattag ttctgctgat ttaaccgcag agaagttcgc catagcgctc  15480

cgaaatcact agctcgtgga gaataagttg cactggtgtc tggacgtggt aatgaatgaa  15540

gacgattgca aaataagaag aggaaacgca gcagaattat tttcagggat acggcacatc  15600

gctattaata ttttgacgaa tgataaggta ttcaaggcag ggttaagacg taagatgcga  15660

aaagcaacca tggacagaaa ctacctagcg tcagtccttg cggggaaagg gctttcgtta  15720

tcttgccctg attatatccc ctctctgaaa gatccacgtg tcgtgaccat ccaaagtgaa  15780

ggttagtctg caagtaaaac tagggtatga taaagctagg atcaatgagt aagtttgtcg  15840

tgcgctgtcg tatctgattt taaatatttt ttacacctaa attttttctc agttacgtgc  15900

tggtttttag gagtgcaact ggatcctgaa ccacggtgaa atcgtaaaga aataattttg  15960

atttttttat agagactatt acttagttca gttttatttg ataaaattaa ttaattgaaa  16020

agtagtgaga tgtttttgtg agcggggcta ttttttagat atttgtttac tgtgacaatg  16080

aactgatttg acacagtgca tgttgctatt agccattgcc tgctcctcac tagcccattt  16140

agtatcgtga atacaaatga agtagtgggg aatccattaa cacatatatg ccatttatca  16200

agttgagttg ctatatacat aaaaaaatca cttttactat aagagcgcta taaaatgaaa  16260

aaaatcactt ttgttattgc tgatattact tttgttggag gtattgaaag agtaaataca  16320

ttacttgcga ataaattttt tagcgaagga tataatgtag aaatcatatc cctctacaat  16380

accaataaaa aggttaatta tgagcttaat aattgcatta aagttaattt tgtgaaagat  16440

aattcctact caggtgcacc aggaagtttt gggcggctaa agcaacacat cagttcacag  16500

tttgcgttat ttaaggccat taaaaattca aatgctgatt tttatatcgt taattcattt  16560

ccaatggctt ttttgtcatt tttcaatgtc ttttcaaata aaaaatatgt tgttattgaa  16620

catgtgcact atgactatta cggggtagcc atcaagtttt ttagaaactt attatataag  16680

ttttattaca aagtggtttg tgttaatgaa agtgacttga gtaaattttc caaacattta  16740

aacaatgctg ttaaaatcaa taacccgctg agtttttcat cttcagaaat aacctgtttg  16800

agcgaaaaga aaattatagc ggtaggccgg cttgagtatc aaaagggatt tgatatatta  16860

atagatattt ttgcgagagt taataaggaa catcctggct gggaacttca tatatatggc  16920

gtcggaactt gtgaagagtt tcttagagat aaaataaatc agtataaact aaataatata  16980

aagttaatgg gctgtgttga taacatacag ttatattatc ctaaatattc tgttttcgta  17040

ttttcatcaa ggttcgaagg cttcggaatg gttttattag aagctatgga gtgtggtttg  17100

ccatgtattt catttgattg tcctactggt ccatctgaaa tactagggaa tggacagtat  17160

ggcatcttgg ttgagaatgg gaatgttact aaatttagtg cggaattagc tgatctaatg  17220

tccgataaag aaaagaaaat taaactttca aatatatcaa aaactcgtgc aaaagaattt  17280

catatagaca agatttttag tgaatggaga aaattaatta attagtacgc atagtatgta  17340

actgaaaata tcgtacaaat gatttttatc agaagattac atgctcaatt aatataatta  17400

agtaagttac aaatctctga caggagtaaa caatgtcaaa gcaacagatc ggcgtagttg  17460

gtatggcagt gatggggcgt aaccttgcgc tcaacatcga aagccgtggt tataccgtct  17520

ctattttcaa ccgttcccgc gaaaagacgg aagaagtgat tgccgaaaat ccaggcaaga  17580

aactggttcc ttattatacg gtgaaagagt ttgttgaatc tctggaaatg cctcgtcgta  17640

tcctgttaat ggtgaaagca ggtgcaggca ctgattctgc tattgattcc ctcaagccat  17700

acctcgataa aggtgacatc atcattgatg gtggtaatac cttcttccag gacaccattc  17760

gtcgtaaccg tgagctttct gccgaaggct ttaactttat cggtaccggt gtctccggtg  17820

gtgaagaagg tgcgctgaaa ggtccttcca ttatgcctgg tgggcagaaa gaagcctatg  17880

aacttgttgc gccgatcctg actaaaattg ccgcagtggc tgaagacggt gagccatgcg  17940

ttacctatat tggtgccgat ggcgcaggtc actatgtgaa gatggttcat aacggtattg  18000

aatacggcga tatgcagctg attgctgaag cctattctct gcttaaaggt ggtctgaacc  18060

tcaccaacga agaacttgcg cagaccttta ccgagtggaa taacggtgaa ctaagcagct  18120

acctgatcga cattaccaaa gacatattca ctaaaaaaga tgaaaacggt aactacctgg  18180

ttgatgtgat cctggatgaa gcggctaaca aaggtaccgg taaatggacc agccagagcg  18240

cgctggatct cggcgaaccg ctgtcgctga ttactgagtc tgtgtttgca cgttatatct  18300

cttctctgaa aaatcagcgc gttgccgcgt ctaaagttct ctctggtccg caagcgcagc  18360

cagcgggcga taaagctgag tttatcgaga aagttcgtcg agctctgtat ttgggcaaaa  18420

tcgtttctta cgctcagggc ttctctcagc tgcgtgcggc gtctgaagag tacaactggg  18480

agctgaacta cggcgaaatc gcgaagattt tccgtgctgg ctgcattatc cgtgcgcagt  18540

tcctgcagaa aattaccgat gcctatgccg aaaatccgca gatcactaac ctgctgctgg  18600

ctccgtactt caagcaaatt gccgatgact atcagcaggc gctgcgcgat gtcgtcgctt  18660

atgcagtaca gaacggtatc ccggttccta cattcgctgc tgcggttgcc tattatgaca  18720

gctaccgtgc cgctgttctg cctgcgaact taatccaggc ccagcgtgac ta          18772

表1大肠杆菌024型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的 引物及PCR数据

基因	功能	基因的碱基位置	正向引物	反向引物	PCR产物的长度	产生正确大小电泳带的组数	PCR的退火温度(℃)
								Wzy	O-抗原聚合酶	10411-11463	10527-10542	10829-10844	318bp	0*	56
			10872-10887	11393-11408	537bp	0*	56
								Wzx	O-抗原转运酶	11479-12672	11931-11948	12264-12276	346bp	0*	56
			11572-11587	12193-12209	638bp	0*	56

*只在大肠杆菌O24型中得到正确的一条带

表2166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号	该组中含有的菌株	来源
			1、野生型大肠杆菌2、野生型大肠杆菌3、野生型大肠杆菌4、野生型大肠杆菌5、野生型大肠杆菌6、野生型大肠杆菌7、野生型大肠杆菌8、野生型大肠杆菌9、野生型大肠杆菌痢疾志贺氏菌10、鲍氏志贺氏菌11、福氏志贺氏菌	O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，O19ab，O20，O21，O22，O23O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，O57，O58，O60，O61，O62，O53O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81，O82，O83，O68O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153O168，O169，O170，O171，O172，O173，D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B17，B18F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6，DS，DR	IMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSabcddd

12、野生型大肠杆菌13、第1组菌株加上大肠杆菌标准菌株

O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119O24

IMVSaIMVSa

为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阳性对照

a.Institute of Medical and Veterinary Science(IMVS)，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

                E.coli O24 O-antigen gene cluster

    

  orf# galF wbdN         wckD  nnaB  nnaC  nnaA             wbwA  wzy  wzx                      orf9    gnd

  ％G+C     30   29  48  36    33    29    32    40 37 41 35 29   28   30     38  45  47 38 40    31

  content

表4大肠杆菌O24型O抗原基因簇基因位置                                         

ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC       60

GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT      120

CAACTACTGG CGGAAGTGCA ATCTATCTGC CCGCCGGGCG TGACTATTAT GAACGTGCGT      180

CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT AGGTCACTCC ATTTTGTGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC      240

AACCCATTTG TCGTGGTACT GCCAGATGTT GTGATCGACG ACGCCAGTGC CGACCCGCTG      300

CGCTACAACC TTGCTGCCAT GATTGCGCGT TTCAATGAAA CGGGCCGTAG CCAGGTGCTG      360

GCAAAACGTA TGCCGGGTGA CCTTTCTGAA TACTCCGTTA TTCAGACCAA AGAGCCGCTG      420

GATCGTGAAG GCAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG      480

ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG      540

GAACTTGAAT GCACTCAGCC TGGTGCATGG GGGCGTATTC AGCTGACTGA TGCCATTGCC      600

GGGCTGGCGA AAAAACAGTC AGTTGACGCC ATGCTGATGA CTGGAGACAG CTACGACTGC      660

GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTT GTGAAGTATG GATTGCGCAA CCTGAAAGAA      720

GGGGCGAAGT TCCGCAAATG TATTGAGATA ATTTTAAGTG AATAAAAATC TGATTGGGCG      780

TAACGGCAGC CGAGAAATTT ATAGTAGCAG TAAACTTCTT GTTGTAGAAG TATAGTATAA      840

TGAATATTTC TGTTAGTGAG TTTTTTAATT AATCATAGAG GTAATGGGCA TAAAATCAAT      900

ATGCTAGCGA TTTTTTTTCA GAGGTATTGT TTCTCCTTTT GAATAATCAG ATAATGAATA      960

CTGGATATAA TGTTTTTACA TGAGCTGAGT ATGCTCTTTG CAACATAACT TTTTAATTAG     1020

TGCACTGGTA GCTGTTAAGC CAGGGGCGGT AGCGTGCTTA AGTAATGTTA ATGAAAGCAT     1080

             orf1的起始

ATAAGAAATT TTCAA ATGAA TAAAGAAACT GTTTCAGTTA TTATGCCTGT CTATAATGGG   1140

GCTCGAACTA TAATTTCATC AGTAGAATCG ATTATAAATC AATCATATCA AGACTTTGTT     1200

TTATATATCA TTGACGATTG TAGCACCGAT GATACATTTT CATTAATTTT TAATCGATAT     1260

AAAAACAATC AAAAAATAAG GATGTTGCGG AATGACTCTA ATTTAGGTGT GGCGGAAAGT     1320

AGAAATGTTG GAATAAAAGC AGCAACAGGA AAATATATTT CTTTTTGTGA TGCGGATGAT     1380

TTATGGCACC AGAATAAATT AGAACGACAA ATCGAATTAT TCAACAATGA ATGTGTTGAT     1440

GTGGTATGTT CTAATTATTA TGTGGTGAAT ATTAATGGGG ATGTTATTGG TGAGGTTAAA     1500

GCACCTCATA TCATAACTTA CAGAAAAATG CTTATGAAAA ATCATATAGG GAATTTAACT     1560

GGTATTTATA ATGCTAACAA ATTGGGTAAA TTTTATCAAA AAAATATTGG CCACGAGGAT     1620

TATTTAATGT GGATGGAGAT AATAAACAAA ACAAACGTTG CCATTTGTAT TCAAGACAAT     1680

CTCGCTTATT ACATGCGGAC AAGTAATTCA CTCTCTGCTA ATAAAGTGAA GACTGCAAAA    1740

TGGATGTGGA ATATATATAG ACAATGCTTA CATTTATCTT TTACTAAATC TTTATATTGT    1800

TTTTTTATGT ATGCTTTTAA TGGGGTTATT AAGGAGATAA TGCATTTACC ATTGAAAGCC    1860

           orf1的终止

TTAAGAAAAA AG TAATAAAA AGGTGAGGTT GATGTTTTGA TTTTGTTTTA CACTTTACCG  1920

CCACCTGCAT ATATTTATAT AAAATCAATA ACTAGCTCTT TGATTGTATC TCTGATGTTT    1980

TTAACTTACT ACTTTATCTG CCATTATTAA TAAAAAAGAA GTCTTTATCG GAAACCTAGA    2040

ACGAAAAATT AGATGTTTTT TTTGTTACGA TAAAGAACTA CTGTAGGTGA TTTTATTTCT    2100

TTAGGAATGG GTTTTTATAT TCTGATTATG CTACAAAAAG TGTTTCTATC AGAGGAAAAT    2160

AATTAAAAGT AGGTTCTTAT GCTAAGCGAG GTACATTATA TATTCAAGGG TGAATATGCC    2220

CTGATTGTTT GAAACTGTTT TTCGCACTTT ATATATAAAT AAAACCTTCT TATATAAATA    2280

AGGAGTGCGA AATGGGATTT GAAAAATTGT AGGTGGAGTT TCCAGAGTGG CATAGGATAT    2340

ATGGTAGTAA CTCTTCCCTA AATAACTGTT CAGAATAGTA GAGCACTCAG GGGGGAACTC    2400

AGTCCGGTTT ATGCGATCCT ATCAATCGCT GAATATCCCA AATCATCAAC TGGATTGAGC    2460

AATGCCGGTT ATAGCATTAA TTCCCAGAAC TAAACGACGC CTGATTTAGT AAACGCTCCA    2520

TAAAACAAGG ATAAAAACCA CGCCCGGCGG CTCACAGCCA TGCTAATGCT GCATTGTGGT    2580

GACAGCGTCA GCCATGTTGC CAGCACAGCT TTGCTGTGTC CGCTCATCGA TTGGCCGCTG    2640

GATTAACTGG TTCACGCTGT CTGGCACTGA AGGCCTGAAG TCATTGCCGT CAGGACGTGG    2700

GAGACGTTGT CCGTTCGCAC ATGCTTGCGC ATTATTGCTT GAGCTTGTTG AGCATTCTCC    2760

CGGCGATTTC GGTTATCAGC GTTCCCTCTG GAGTTGCGAA CTGCTGGCGA TAAAAATCCG    2820

TGAGGTCATC GGTTGTCCGC TACATGCTCA ACCATCCGGC GATGGTTACC TGCTGCCGGA    2880

CTGGTATGGC GCAGATTAGT GCCAACACTT CGTATCCGGG ACACGAATAA GGAAGAAAAA    2940

ATGGCAGCGA TTAATGTGGC GTTAGTCAGT TGTAGCACAG AACCCTCGGC GTTTTACTAA    3000

GATGAAGAGG ATATCCACCT CAATCCCAAA ATTGGCGCTG ACTGGCAGTT ACGTGGGCAG    3060

AAATAGCAAA GGTTCATCAT TATTTATCAG TATGTTAAAA CATCTGAAGG CGACATACCT    3120

GCGGGCAAAA ACGATAACAC TCATTGTCGA TAACTACATC ATCCACATAA GCCGTGAAAC    3180

GTTGCGCTGG CTGAAAGCAA ACCCAAAGTT CAAGGGCATT TATCAGCCAG TTTACTAGCC    3240

GTGGGTCAAT CATGTTGCTG ACTTTAGTCA GTTTCGGGCG CATGGCGGCT GAAACAGATA    3300

ACCACCTGCT ATGAGGGGGG GGCTGATTTT GAACGGTTGT GGCAAGCGTT TCATGAAATA    3360

ATAACTCAAA ATCACCTGTG CAGTTCAATG TGGCAGCTGT TGAACAAGGT TCGTCACATT    3420

ATGGATGCCG TCAGCTCATT TCCCAGTGGA AAGCATAGGC TGGCTAAAGT GTAGCGGTAT    3480

TAGGAGCAGT TATTTAGCAG AAGATATAAT GAAAAGCTAC CACATCAGGA GTTGACGTTC    3540

                                             orf2的起始

ACTACTTTTG ATCTTTGGAT AATAAACATC GAATGGCAAT CAT ATGAAGA AAAAATTGAT  3600

AATTATCGGA GCTGGCGGGT TTGCAAA GC TGTAATTGAT AGTTTAGATC ATGCATGTTA    3660

TGAAATTCAT GGTTTCATCG ATAGTTTTAA ATGCGGAGAA CATCAAGGCT ATAAAATAAT    3720

TTCGAGAACA ATAGATAGTT TAGATGAACC TCATAAATAT TGCTACTTTA TTGCGATTGG    3780

CGAACCCTAT TATAGGGCTA TCTGGTTGGA AACCATTAAT GCCATGAAAC TTGAAACTAT    3840

AAATGTTATT GACAGAACGG CAATAATTTC TAAAGGCGCA ATTCTTGGGT CATGCATCTA    3900

TGTTGGTAAG ATGGCAATAG TAAATTGTGA TTCGCATCTT GAGGATGGTG TTGTCATTAA    3960

TACAAGGGCT CTCGTTGAAC ATGGTAATTA TATATCATAT TGTTCCAATA TATCGACTAA    4020

CGTCGTCTTG AATGGTGATG TTTTTGTTGG TAGAAAATGT TTTATAGGAA GTTGTACAGT    4080

CGTTAATGGA CAACTGAAAA TAGGCGATTC GTCCATAGTC GGCTCTGGTT CAGTTGTTAT    4140

TCGAAATGTT GATGAAAACG TTGTAGTCGC TGGTTCTCCA ACTAGACTTA TTAGGAAGAG    4200

orf2的终止 orf3的起始

G TAAAAGA AT GTCATCTGTA TATATAGTTG CGGAAATTGG GTGTAATCAT AATGGAGATT4260

ATAATTTAGC TAAATTGATG ATCGATGAGG CTTATAGTGC TGGTGTAGAT GCTGTTAAAT    4320

TTCAGACATT TAAAGCTGAT AGCTTAATAT CAAAATATGC ACCTAAAGCA GAGTATCAAA    4380

TTAAAACGAC AGGAAATAGT GAGTCACAGT TGGAAATGAC TCGGAAGTTA GAGCTTTCCT    4440

GTGAGGAATA TATCAAGTTA GAAGAGTATT CTAAAAGTTT AGGTTTGGAT GTTTTTTCAA    4500

CTCCTTTTGA TTTGGAATCT ATAGAATTTT TATACACAAG AAAACAAACT ACATGGAAAA    4560

TACCATCTGG TGAGTTGCTT AATCTTCCAT ATTTAGAAAA AATTGCGTTA TTGCCAGGTG    4620

ATAAAAAAAT TATTCTATCG ACAGGTATGG CAACTCTCGC CGAAATAAAG CAAGCATTGA    4680

AGATATTTAC TGATAATGGA GTTAAAGCCG AGGATATTAC TATCTTACAT TGTAATACAG    4740

AGTATCCTAC ACCTTATGAA GATGTTAATC TTAATGTTCT TGCTGGATTA AAAAAAATCT    4800

TCCAAGAATA TAACATTGGT TTTTCTGATC ATTCTCCTGG ATACTTTGCC GGTATAGCGG    4860

CTGTACCTTA TGGAATAACG TTTATTGAAA AACATTTTAC TTTAAATAAA GATTTTGAAG    4920

GTCCTGATCA TAAAGCATCG ATTACTCCTG ATGAGCTGAG GTTATTGTGT AATGGCATAA    4980

GAGCGATTGA AAGAGCATTA GGTAGTTTTG ATAAAAGAGT TACTAACTCT GAGAGGAAAA    5040

ATAAACTAGT GGCAAGAAAA TCTATTGTTG CTAAGCGTGA TATAAAAAAA GGGGAAATTT    5100

TTACTACCGA TAACATTACT ACAAAACGAC CCGGAAATGG AATTAGTCCT ATGTATTGGT    5160

ATGAGGTTTT AGGTAAAAAA GCGGAGCAGG ATTTTTTAGA GGATCAATTA ATAAAAGTAT    5220

                      orf3的终止 orf4的起始

CTGGTTTTGA AGAACAAGAG ATT TAAAT AT GAGGAAAAAG ATTGCAATTA TCCCAGCTCG5280

TTCTGGGTCA AAAGGATTAC CCAATAAAAA TATTTTAATG CTTTTTGATA AGCCGTTAAT    5340

TGCATATACA ATTGAAGCTG CTATCAAAAG TGAATTATTT GAGAAAGTTA TTGTTTCGAC    5400

AGACTCTTGT GAATATAAGG ATATTGCTTT ACGCCATGGT GCTGAAGTTA TTATGAGGGA    5460

CAAAAGTCTA GCTTCTGATA CAGCAACATC ATACATGGTT GTAAAAGATG TGTTAGAGAA    5520

AAATATTAGC TGTGATTATT TTGTTTTATT ACAGCCAACT TCGCCATTTA GGAATTATAA    5580

ACATATAAGG GAAGCTGTTG AAAAGTTTGA AAATACAGAT GACATTGATT TTTTGGTTTC    5640

AATGGTTAAA ACAAATAAAA GTGCAGATTT AATTAATCAG TTGGCTCCCA ATGATAATTT    5700

AAAATATTTC AATGCGGACT TTGCTAATTA TAGAAGGCAA AACCAAGAGA ACTATTGTCC    5760

TAATGGTGCC ATATTTATAG GTAATGTCGA TGCATATCTT AGACAGAAAC ATTTTTTTGG    5820

TGAAAGAAGT ATTGCTTATG TGATGGATAG AATTGATTCA TTAGATATTG ATGACAAACT    5880

TGATTTTGAG TTTGCGATAT CTCTAATGCT TAAAAAAAAT AGGATGAAAG ACCTTCAAAA    5940

GGAAATCTTG AAAAGAATAA AGGAAAAGGA ATTTTTTTTT GATAAAATAA AGCCGGTGAC    6000

ATTAGTTGGT CATTCAATTA TCGATTATTG GAATGTTACT CATTTAAATG GACGTGAAGT    6060

GAATAATTTA GGTATTGCTG GCATCAATAG TAAGGAGTAT TATGATCTTA TCATAAAAAA    6120

TAACATTATT AAATTTGGTG ATACAGTCAT ACTTATGCTT GGTACAAATG ATATTGTTGT    6180

TGATGACTGG AGTGTTGACT TTACAATTCT TTGGATTGAA AAAATAGTTA AACATATAAA    6240

AAAAATAAAT CACAATGCTA GTATATATAT TTTGTCGATC CCGCCAGTGT TGGGACGTAT    6300

TGATAGAAAC AATGAAACAA TAAGAAAATT AAACTCCGAA TTGTCAAAGT TTTTTGAAAA    6360

TTATCAAAAT GTTATTTTTA TAACTCTTTC AAAAGTTTTT TATGATCAAT ATGGAAATCT    6420

AAAGGAAAAC TTTACATATG ATGGACTGCA CTTTAGTCAG TTAGCTTATA ATCAATTGAC    6480

                  orf5的起始 orr的终止

GAAAGAGATA GAGGAAAAAA TAAA ATGAAA AAAATATTAT ATATAACAGG CTCAAGAGCA  6540

GAGTATGGGA TAATGAAGAG GCTGTTAAGA AAACTTAAGG ATAACGAACA TATTGAACTT    6600

TCAATTATTG CAACCGGAAT GCATTGTGAT GCGAAGTATG GCTATACATA TCAGAATATT    6660

ATTGACGATG GTTTCGAAGT TAAAGAGTTA TTTGATATAA ATATAGAGTC ATCAACAAAC    6720

AGTGGTATCA TTTCTACAAT GAGTCGAGCT CAAAATTTGT TTGGTGCTTA TTTTGAGGAA    6780

TATAAATATG ATGCAATAAT AATACTTGGC GATAGATATG AAATGCTTTC TGTAGCTATA    6840

GCGGCATCTA TACATGGTAT TCCAATAATC CATTTACATG GAGGAGAACA GACACTAGGC    6900

AATTATGATG AATTCATTCG CCATTGTATA ACAAAAATGA GTCACTTGCA TTTAGTTGCA    6960

ACAGAGAAAT ATAGGGAAAG AGTAATACAA CTAGGCGAGT TGCCGTCTTG GGTCATAAAT    7020

ATAGGTGCTA TGGGAGCCGA GAATACAGTA TCTTTGTCAA TACCAGAACA TAAAGAGCTA    7080

CAATCAAAAT ATGAAAATTC ATTAAGCAAT TATTTCATGA TTCTTTTTCA CCCCGAAACC    7140

TTAACTAAAA ATAAATCTGT TCATGATCAA ATAAAAGAAT TAATTAAAGC ATTGGATATT    7200

GCACATCAAA AATATCATTG TAATTTTATA TTTATCGGTA CTAACGCGGA TACAAATTCA    7260

GATATTATTA CTAAGGAAAT TCTCACGTTT TGTGAGTCAT ATAACTTTCC TTATTTACTA    7320

TCATTACCAA CTCAAGATTA CTTAGGATTA TGTAAATATT CGTTAGGACT TATTGGGAAT    7380

TCATCTTCTG GACTAATAGA GATCCCATCT CTTGGAGTGC CTACTATTAA TATTGGTTCT    7440

AGACAGGCTG GACGAGAACG AGGAAAGTCC GTGATTGATG TGGAATGTTG CTATACAGAT    7500

ATTCTTGAGA AGATAGATGA CGTTATTTCA AATCGAATAG ATAGAACTTA TTATAATCCT    7560

TATTATAAAG AAAATAGTGC CGAGATAGCT ATGTCTAGTA TAATTAGTTT CTTAGATTGG    7620

ATTAGTGATA ACAAAAATCG CATTAAAAAG TTTTATGATA TTCCTAAAGT CACTACTCTA    7680

        orf5的终止

ATTAATTCA T AATAACCAGG CAGTCTTAGT CTATGTAACA CTAGTTCACA TTACTAAAAG  7740

TAACAGTTGT AAAAGTAGAT ATACTACCTA TTTACTCTCT AATCTTCACT ATCTCTAACA    7800

TATCATAAAT ATTAAGATAA TTATTTGTGG TGATTAATAT ACACGATTAT TGATTCTGAT    7860

ATAACCGAAA ATCTTTGAAA TTACAGTCCG AGAACGAGGT AGTTAAGATG ACATAAACAT    7920

ATAAGTTTCT CTTGAACCCC ATCTGCGGGC TGTTCGTATA TATTTGGGGA GTCAGAGCGA    7980

ATATGACTCA CTGTGGATAA CTATTTGTTA AAGGCTGGCT GTTCATCATA TGTATCTGGA    8040

TACGCCAGCA TTAGCGGGAT ATTAGGCGAT GATGGGGACT TACTGGTGCT GAATATTAGT    8100

TTCGGAAAAA CTTGAATGTC AAAGGCGGAA ACTGTGCTAC AGATAATGAT ATCTTTTGCC    8160

AGGCTTCTTC CTATTTTACG CACGCGGAGT TTATTGCTTC CTGAAAAAAT ATGGGACTAC    8220

TGAATACGTT GCGTGAGCAT TACTGAGGCG GACCTGTATG GAGTGAGCTG TATATTGCCC    8280

CAGGAACAAT TACTGATGCT GCCTTTTGGT GCTAATTAAT ACTTACTATG TGTTCAATAA    8340

TTGAGTTATT CCTTTATCTA AAAATTTTTA TCGTCGCTTA TATCTGATCA AATACCGGTT    8400

ATATAAATAA GGAGGACGAA ATGAAATTTA AATAATCAGT GGAACATATC CGACAGTTAA    8460

ATATTTGTGC CGTCACATTT CTGGTGCAGA AGTTGGCAGA TATAGAAGAT TTTGGTTATA    8520

CACATCCAAG CAATATGGTA GTTTGAAAAC GGTATTCCTA CGCGCTGTAC CATTGCCAGA    8580

GTTCTATCCT ATATCTCTGA GAAAAATGTA TGAACGATGA CCAGTCGGAA AGATACTGCT    8640

GCAGATCGCT GAGTTATTCC TCAGTTCGTG GCAGAATGTT TGGAGCAACT ATGTGTGGCT    8700

GATTTTACTT ATGGTACGCC CTGAGTTTAT ATGTGCACGA AAGCCCAAAT GAACTAAGAG    8760

TCTCTTGGAA CATTGGACAC AATCATTTTT CGCGCGGATA ACGACTCGGA AGTTATCTCT    8820

CTCTCACTGA CTGGCGAGTA GAAAAACATG GAGTAAAACT GGAGTTTATC CTACAGGGTA    8880

AGCCAATGCA TAACACTTGC TTTGAGCGCT TTAACCGGAC ATATCGTACG GAAATACTCG    8940

ATTTTTATCT GTTCAGCACG CTGAATGAAG TGCAGGAAAT CACGGAAAAA AGGTTGTCAG    9000

AATCTAACTC CTCATGAATA ACTGCACAAT GTGACTACGG AGAAATATTG ATAACACATG    9060

ATTTGGCCGG AAGTTCAAAA CAGCATAGAT CTAAAGCAGG TATCTTTACA GAACAGCCCC    9120

GCGAATGTAG GGATGTTGGT ATAATAATTT AAGCTGACTG GAAGGTCTGG GCGAGATGAC    9180

ACTAGTAGAC GATAAAAAGT TTATTGTTAT TCATTTAAAA TAGGAGATAA AGATTTGACG    9240

GCTTTAGTTT AGAGATAACA CCTCTCTAGG AAAATTGAAG AAGTTCTATT TTGCTGTAAT    9300

GCTTTCTTAT GGATGTAGTA ATGAATGAAG ACAGCAGCAA ATTTATATGT AAGTGGAAAA    9360

                    orf6的起始

GTTATTCAAA AGGGTATGT A TGAAAAGTAA TGTTTATATA TGTAAAACAA CATGGGAAAT  9420

TTTCGTTTCT ATTTTGTTGG CTAGCGATAT ATACTACGAC AAGAAAATAA AATCTGTTTT    9480

TGTTATTGAA GTGGCTGAAG AGAACATTAA TTATCTTTCT AAGTTATCTG ATTTTTTCTT    9540

TGTATCAAAG GTTATTCCTG TTAGGTTTTC TTCTAATAAA TATGTTAAGG CTTTATGTTT    9600

TCATTATAGA GTTAGATATT ATTTGCCAAA AATGCTCGGC GAGTATCTTA AAAGTGATGT    9660

AAGGGTTAAT CTATTTATAG ATCAGGGAGT ATTTGGACAA TATTTTATTA AGAATAATAA    9720

AGATGTATAT CTATATGAGC ATGGGAATGG GAATTATTGT GTAGGCCCAT ATCCTAATTA    9780

TAAAATGATA AAAAAATTTT TGGGTATAAC TGAAGGTTAT GGTAGGCACA GTAGAGTAAA    9840

GAGGATATAT CTACAGCATC CAGAAAAAGC TCCTAAGGAT ATTATTCATA AGGTGACGGG    9900

TTTTTCTATA AAGAATTTAT ATAATAAATT GTTCTTGAAA GAACAGCAAA ACTTATTGTC    9960

TTTTTTTGGT ATTCATAAAA TTAATAAAAC GAGTGATGTT ATCATTTTAA CACAACCAAT    10020

CAGTGAGGAT GGTTTTTATA GTGAAAGAGA AAAGATCGAA ATCTATAGGG AGATTATTGA    10080

TAGCCGCTTT CCTTCTGATA AATCTCGCGT AGTTATAAAA CCACATCCTC GTGATAAAAC    10140

AAATTATGGT AAGTACATTC CTGATGTAAT GCTTTTGCCA AGAAGTTTTC CTATGGAAAT    10200

ATTAAACTTC ACGAATATTA GGTTTATTAA AGCAATAACA ATCTGTTCAA GCGCTGTTTA    10260

TAATTTTGAG TATGATATTT CTGTGGATTA TATAGGAACA TTAAGATACC CCAAATTAAT    10320

TAAAGCATTG GGAAGATTGC CTGCACAGTA TGTGCATAAG GATAACTATA AAAACATTCA    10380

  orf6的终止                     orf7的起始

ATAT TAACAG GGTGTTAATA GGGAGTTAAT ATGATACCTT ATGTTATGTT TTATTGTTCC  10440

TCTTTAGTTT TAGTTGTTCT ATCTTTGGTA CTGAAAAAGT ATGATTGGTT TTGGTTGTTG    10500

TTTCTTCTAT TTTTTTCAGC TGTGTTTGTT GGTCTTAGGG TAGATGTCGG TGCCGATTAT    10560

ACTGAATATG CCCAAATTTA TAATCAATCT GGTAATATTA CAAATTTTGA ATTGGGTTTT    10620

GATATAATAT TTAACTATGG GAAAAGGCTT GGATATGATT ATGTATTTGT GTCTTTATTT    10680

TTCTTTTTGC TAACTACATT ATTTTTTATC TACTCAATCA AAGAGTTGAA TTATAAGACA    10740

CTTATTTATT TTTGTTTTTT GCTTTTCATG TTTGTCCCTT TAACATCAAC AATCCGACAA    10800

GGCTTAGCTA TTCCTTTTTT TGTAATGTGC ATTTTGAACT CTGATAGGCC CAAAGTCTAC    10860

TTTACAAGTA TAGCCTTAGG GTGTCTTTTT CATTACTCAA TTTTATTTAT GTTTTTTTTC    10920

TTTTGGGTCA GACATATTAA GCAGTCGTAT TGTAGGGCTT TTTTAATTGT TTTGCTTTTT    10980

TCATTGTTGA GTATTTTTAA TATCGTTGAG TATATAATTA TGTTATTAAA TTATATGCCT    11040

GGTTTAGGGG CTATAAGCAC TAAACTTCTT ATGTATACTC AGCGATATCA AGTTGAGTTT    11100

TCAATGAATT CTTTTGTTTA TAAATTGGCT GGTTTACTAT TGATTACAAT GTTTATGCCA    11160

TTTATAAAAG TAAACGAAAA ATTACGTTGT AGTTACAACT TGTATTTTAT TACAGTATGT    11220

ATATTTATTT TGTTGAAAGA CAATGCTGTT TTAACAAACC GTTTGACGTA TGCTACCAAT    11280

ATATCATTGG TGACTTTTTT TTCATTGTTA TTATCGATGA TACGTGGGTT CTATAAAAAA    11340

GCTATTGTTT CTATTTTGTT TGTGTTTTAT TTTTCTTTTA GTTATTTTAA GTTCACAGCG    11400

ACAGATTTAA GACACTCAGT TGAATCTGCT TATATGCCTT ATAAATCCTT GCTTATAAAC    11460

orf7的终止        orf8的起始

TGAATAAGAC ATTAAGTT AT GAAATTATTG AAAAGCAGAT TTTCTTATTT TGCCACTGAA11520

TTAATAAATA AGTGCGTCCC ATTCTTTTTA TTACCATATG TGTCTTCTGC GGTGGGCGTA    11580

GAAGTTTATG GTAAAATCGA GTTATTTACC ACTAATTATA TAATATTATC TTTCCTTTTT    11640

GCCTTGGGGG TTGAGGGGTG GATGAATGCC CATTACTTTA AAATGGCTGA AAGTGATTTT    11700

ATTACTGTAC TGTCATCATT TTATCTATTA AGTTTTCTGA TTTTTGTTAT TTGTATGGCA    11760

ATATCTCTAC CATATTCATA TTATTGTTCT GCGCTTCTTT TTGTTGGTTA CGTTCAATCG    11820

CTTCTTAATA TTACAACTTT ACATTTGAGA CTAAAGGGTA AATATTTAAA TGCTGGATTT    11880

TTATTATTGT TATCATCAAT TGTTAATGCT GTGATGGTAT ATGCGAGTTT TGATTGGTTT    11940

GGTAAGACTT ATGAGTCGCG TATTAACTCT TTTTTGTTTT CTTCCATTAT AATACTTGTG    12000

TTTATTGTGT TTTTAAGTAT ACGTGATAAG AATATTAAAA TAAAAATTGA TTTTAGCTTT    12060

TTAAATAGAG ACATTTTATT GTTTTGCCTG CCTCTGTGTT TGACTATGAT TATTAATTGG    12120

GTTAAAGGTA ATATTGATAA ATATTTTATT GCTAATCTAC TTGATTTGAA GTCTCTTGGG    12180

ATTTATGCGG TTGCTTATCA GTTGGCTTCA GTTATAAATG TTGTCGGGAT TATTTTGAAC    12240

AGGACCTTAC AGGCTGACCT GCTTAAAAGC ATGGCTGATG GTTTTTATCA AACAAAAAAA    12300

ATAATATTCA CTTTTTTATT TATATTGTGT GTGTTTTTTT TTCTGTATAT AGTAGCTGTG    12360

TATTGTGGCT TTAGTTATGT TTTTTCTATC GACTACTCCT CTTCTCGCAA TATAGCTTTA    12420

CTGTTGATGA TTGGTTTTTT GTTATTATCT TTTTCCTCAT TTCTAATTAA TTTTTTATTA    12480

TTCTACAGGA GGCCAAGGTT GATATTGTTT CAAACCTTTT TAATTACGAT GATACATGTG    12540

ATGCTATCTT TTATTTTGAT TAAAAAATAC GCGCTGCTTG GAGTTTTACT TACACAGTTC    12600

GTTACTTCGT TATTAACCTT TGTATCCACT TTATTAGTAT GCCACATATT AACGAAATCA    12660

         orf8的终止

TCTCAAAAA T GACAGGTTCT TAAATCGAGA GAAGAAGGCA TTTAACATAA TCTAAAATTA  12720

AAGTTGCATA TTATCTCTAA TAAACAATGT TAAAATAACT GAACATCATA GCCGGTATGG    12780

CAAAAATAGG CATGGTTTTG CTCTCAATAA CGGAAATTAT GGGTATTTCG TCTCTATTTT    12840

CGACTGTTTA CGTGAAAAGG TGGAAGCAGT TATTGCTGAC AATCCAGCGC AGAAATTTAT    12900

ACTGTGAAAG ATAATCGTTT AATTATTGAA ACTCCTCGTC GCAACCTGTT AATGGTGAAA    12960

GTAGGTGTTG GCACGATACT GCATTGATTC ACAGAAACCA TATCTAGATA ATGTCAGCGC    13020

CAGTGATATA AGACGTTAAT AGGGATGTGG ACAATTTCCT GGACTCTCAG GAGATGAACC    13080

ATGTTTACTT AAGACGAAAA AATTCGCACC ATTGAGCTTT ATTTCAATTA TGGTAACGTG    13140

GGTTGAGCTA TCTTTCGAAA AGAAATCTGC AGTTTTGGAT CAGCAGGGGG TGGCGCAAAA    13200

GAATCCATTC GTAATAGACA CCGTTACTCA GATGTGCAAA AACAGGTTGC CGTTGAACAT    13260

TATCTTAACC ACGACTGCTG TCTGGCATTT ACCGGCAGAA TTCTGGGTTA TCCCTGTACC    13320

GATGTGCTCG CTCGCTGGGT TAATGAACGT TACCCCGACA GACGACGTAT ATTTACCAGT    13380

AAGACCAGTC CGGATACGTT CTTTGAACCA GAAGTCAAAC GTCAAGCTGT CACGGCACTC    13440

TGTACATGAC GAGTATCAGA CAGTGAAGTT GCCAGACGTG TTGGTGCCAG CCGTACTGTA    13500

TTGTATAAAT GGTAAGATGA AATTATCGGT AACAGTGTTT ACCAAATAGC ATAAACATAA    13560

CGAACCTTCT CTGGAGGCAG AACGCGATAC GTTGCGGGAG GATGTCGCCG ACTGAAACAA    13620

GAAATACGTC GCAGAAGATA GAGCTGCATA TTCTGAAAAA GGCGGAGGAA ATCATAAAAA    13680

AAGACCCGGG CATCAGTATC AGTCACCTGA ACAACAGGGA AAAAACAAAG ATCGCTGATG    13740

CCCTGAGACA AACATATCCC CTGACAGAAT TACTGCATGT TCTGGGCCTT GCCCGTAGCA    13800

GTTATTTTTA TCACCGGGCT GCACTGAAAG CTGGTGATAA ATACGCCACG ATACGTACGA    13860

TGCTGACAGA TATCTTTAAC AGTAATTACC AGTGTTATAG CTATCGTCGC CTGCATGCGA    13920

TGCTCAGGCA TGAGGCGGTT TAGCTATCAG AAAAGGTTGT ACGCAGACTT ATGGTGGAGG    13980

AACAGCTTGT CGTCAGCCGT AACCGTCGTC GCTACAGCAC ATATTGCAGA GAAATCGGAC    14040

CGGCTGCTGA TAATTTTATC GCCAGAGATT TTAAGGCGGA GCAAGCTAAA CATAAATGGC    14100

TGACAGATAT CACGGAGTTC CAGTTCCTCA CAGGGAAAAT CAGGCTATCA CTGGTGGTGG    14160

ACTTCTTCGA TGGAAAAGTT GTGAGCAGTT CTCTCAGTGC ACGTCCCGAG GCTGAACTGG    14220

TCAACACCAT AGTGGATAAA GCTGTCGAAA CGTAAAATGC AGGTGAACGA CCGGTGATAT    14280

ACAGTGACAA AGGAGGCATT ATCGCTGGCC AGGCTAGCTG GAAAGAGTGA ATGCAGCAGG    14340

TGTTATTCCC TCAATGTCCC ATAAAGGGTG TCCACACGAC AATGCTGCGT GCGAAGGCTT    14400

TTTCGGCAGA TTGAAAACGA AAATCTATTA TGGGCGTAAA TAATCGGGCA TCAAGCCTGA    14460

TAAATTCAGG CATCATGTGG ATACTTACAT CAGATGGTAT AACGAGCGGC GTATAAAATT    14520

ATTGCTGGTG CAGTCAGCTC AGAAATGTAC CGTCAACAAT GTGGCGGGCA TAATAAAGCA    14580

GTTCAGGAAA TCGTCCTCAT CTAAAAAATT GATTGAACAT ATTTCTATTA ACACATCAGC    14640

CGGGAAAGTG GAACATAAGT TGTCTAAAAT TCTACTGTTG ACAATTTTCG CCGTCATTTT    14700

GGGTGCAGAA GGCTGGGAAG ATATAGAGTA TTTTGGGGAA ACACCTCTTG ATTTTTTGAA    14760

GCAATATGGT GATTTTGAAA ATGGTATTAC TGTTCACGAT ACCATTGCCA GAGTGTATCC    14820

TGTATCAGTC CTGCAAAATT TCACGAGTGC TTTATTAACT GGATGCGTGA CTACCATTCT    14880

TCAGATGATA AAGACGTCAT CGCAATTGAT GGAAAAACAC TCCGGTATTC TTATGACAAG    14940

AGTCGCCGCA AGGGAGCGAT TCATGTTATT AGTGTGTTCT CAACAATGCA CAGTCTGGTC    15000

ATCGGACAGG TTAAAACGGA TAAGAAATCC AATGAGATTA CTGCTATCCC TGCTCTTCTT    15060

AATATGCTGG TTATTAAAGG AAAAATTATC ACATCAGATA CGATGGGTTG CCAGAAAGAT    15120

ATTGCAGAGA AGATACAAGA ATAGGGAGAT GATTATTTAT TCTTTGCAAA CAGAAATCAG    15180

GGTTGGCCTA ATAAAAATTT TGAGGGGAAA TTTTCACTGA AAGAATTAAA TCATCCAGAT    15240

CATGACAGTT ACGCAATTAG TGAAAAGAGT CACGGTAGAG AAGAAATCAA TCTTCAGATT    15300

GTTTGCGAAG TCCGTGATGA ACTTATTGAT TTTACGTTTG AATGGAAAGG ACTGAAAAAA    15360

TTATGTGTAG CAGTTTTCTT TCGGTCAATA AGTGCAAAAC AAAATAAAGA GCCAGAAATG    15420

ACGGTCAGAT ATTATATTAG TTCTGCTGAT TTAACCGCAG AGAAGTTCGC CATAGCGCTC    15480

CGAAATCACT AGCTCGTGGA GAATAAGTTG CACTGGTGTC TGGACGTGGT AATGAATGAA    15540

GACGATTGCA AAATAAGAAG AGGAAACGCA GCAGAATTAT TTTCAGGGAT ACGGCACATC    15600

GCTATTAATA TTTTGACGAA TGATAAGGTA TTCAAGGCAG GGTTAAGACG TAAGATGCGA    15660

AAAGCAACCA TGGACAGAAA CTACCTAGCG TCAGTCCTTG CGGGGAAAGG GCTTTCGTTA    15720

TCTTGCCCTG ATTATATCCC CTCTCTGAAA GATCCACGTG TCGTGACCAT CCAAAGTGAA    15780

GGTTAGTCTG CAAGTAAAAC TAGGGTATGA TAAAGCTAGG ATCAATGAGT AAGTTTGTCG    15840

TGCGCTGTCG TATCTGATTT TAAATATTTT TTACACCTAA ATTTTTTCTC AGTTACGTGC    15900

TGGTTTTTAG GAGTGCAACT GGATCCTGAA CCACGGTGAA ATCGTAAAGA AATAATTTTG    15960

ATTTTTTTAT AGAGACTATT ACTTAGTTCA GTTTTATTTG ATAAAATTAA TTAATTGAAA    16020

AGTAGTGAGA TGTTTTTGTG AGCGGGGCTA TTTTTTAGAT ATTTGTTTAC TGTGACAATG    16080

AACTGATTTG ACACAGTGCA TGTTGCTATT AGCCATTGCC TGCTCCTCAC TAGCCCATTT    16140

AGTATCGTGA ATACAAATGA AGTAGTGGGG AATCCATTAA CACATATATG CCATTTATCA    16200

                                                        orf9的起始

AGTTGAGTTG CTATATACAT AAAAAAATCA CTTTTACTAT AAGAGCGCTA TAAA ATGAAA  16260

AAAATCACTT TTGTTATTGC TGATATTACT TTTGTTGGAG GTATTGAAAG AGTAAATACA    16320

TTACTTGCGA ATAAATTTTT TAGCGAAGGA TATAATGTAG AAATCATATC CCTCTACAAT    16380

ACCAATAAAA AGGTTAATTA TGAGCTTAAT AATTGCATTA AAGTTAATTT TGTGAAAGAT    16440

AATTCCTACT CAGGTGCACC AGGAAGTTTT GGGCGGCTAA AGCAACACAT CAGTTCACAG    16500

TTTGCGTTAT TTAAGGCCAT TAAAAATTCA AATGCTGATT TTTATATCGT TAATTCATTT    16560

CCAATGGCTT TTTTGTCATT TTTCAATGTC TTTTCAAATA AAAAATATGT TGTTATTGAA    16620

CATGTGCACT ATGACTATTA CGGGGTAGCC ATCAAGTTTT TTAGAAACTT ATTATATAAG    16680

TTTTATTACA AAGTGGTTTG TGTTAATGAA AGTGACTTGA GTAAATTTTC CAAACATTTA    16740

AACAATGCTG TTAAAATCAA TAACCCGCTG AGTTTTTCAT CTTCAGAAAT AACCTGTTTG    16800

AGCGAAAAGA AAATTATAGC GGTAGGCCGG CTTGAGTATC AAAAGGGATT TGATATATTA    16860

ATAGATATTT TTGCGAGAGT TAATAAGGAA CATCCTGGCT GGGAACTTCA TATATATGGC    16920

GTCGGAACTT GTGAAGAGTT TCTTAGAGAT AAAATAAATC AGTATAAACT AAATAATATA    16980

AAGTTAATGG GCTGTGTTGA TAACATACAG TTATATTATC CTAAATATTC TGTTTTCGTA    17040

TTTTCATCAA GGTTCGAAGG CTTCGGAATG GTTTTATTAG AAGCTATGGA GTGTGGTTTG    17100

CCATGTATTT CATTTGATTG TCCTACTGGT CCATCTGAAA TACTAGGGAA TGGACAGTAT    17160

GGCATCTTGG TTGAGAATGG GAATGTTACT AAATTTAGTG CGGAATTAGC TGATCTAATG    17220

TCCGATAAAG AAAAGAAAAT TAAACTTTCA AATATATCAA AAACTCGTGC AAAAGAATTT    17280

                                             orf9的终止

CATATAGACA AGATTTTTAG TGAATGGAGA AAATTAATTA AT TAGTACGC ATAGTATGTA  17340

ACTGAAAATA TCGTACAAAT GATTTTTATC AGAAGATTAC ATGCTCAATT AATATAATTA    17400

AGTAAGTTAC AAATCTCTGA CAGGAGTAAA CAATGTCAAA GCAACAGATC GGCGTAGTTG    17460

GTATGGCAGT GATGGGGCGT AACCTTGCGC TCAACATCGA AAGCCGTGGT TATACCGTCT    17520

CTATTTTCAA CCGTTCCCGC GAAAAGACGG AAGAAGTGAT TGCCGAAAAT CCAGGCAAGA    17580

AACTGGTTCC TTATTATACG GTGAAAGAGT TTGTTGAATC TCTGGAAATG CCTCGTCGTA    17640

TCCTGTTAAT GGTGAAAGCA GGTGCAGGCA CTGATTCTGC TATTGATTCC CTCAAGCCAT    17700

ACCTCGATAA AGGTGACATC ATCATTGATG GTGGTAATAC CTTCTTCCAG GACACCATTC    17760

GTCGTAACCG TGAGCTTTCT GCCGAAGGCT TTAACTTTAT CGGTACCGGT GTCTCCGGTG    17820

GTGAAGAAGG TGCGCTGAAA GGTCCTTCCA TTATGCCTGG TGGGCAGAAA GAAGCCTATG    17880

AACTTGTTGC GCCGATCCTG ACTAAAATTG CCGCAGTGGC TGAAGACGGT GAGCCATGCG    17940

TTACCTATAT TGGTGCCGAT GGCGCAGGTC ACTATGTGAA GATGGTTCAT AACGGTATTG    18000

AATACGGCGA TATGCAGCTG ATTGCTGAAG CCTATTCTCT GCTTAAAGGT GGTCTGAACC    18060

TCACCAACGA AGAACTTGCG CAGACCTTTA CCGAGTGGAA TAACGGTGAA CTAAGCAGCT    18120

ACCTGATCGA CATTACCAAA GACATATTCA CTAAAAAAGA TGAAAACGGT AACTACCTGG    18180

TTGATGTGAT CCTGGATGAA GCGGCTAACA AAGGTACCGG TAAATGGACC AGCCAGAGCG    18240

CGCTGGATCT CGGCGAACCG CTGTCGCTGA TTACTGAGTC TGTGTTTGCA CGTTATATCT    18300

CTTCTCTGAA AAATCAGCGC GTTGCCGCGT CTAAAGTTCT CTCTGGTCCG CAAGCGCAGC    18360

CAGCGGGCGA TAAAGCTGAG TTTATCGAGA AAGTTCGTCG AGCTCTGTAT TTGGGCAAAA    18420

TCGTTTCTTA CGCTCAGGGC TTCTCTCAGC TGCGTGCGGC GTCTGAAGAG TACAACTGGG    18480

AGCTGAACTA CGGCGAAATC GCGAAGATTT TCCGTGCTGG CTGCATTATC CGTGCGCAGT    18540

TCCTGCAGAA AATTACCGAT GCCTATGCCG AAAATCCGCA GATCACTAAC CTGCTGCTGG    18600

CTCCGTACTT CAAGCAAATT GCCGATGACT ATCAGCAGGC GCTGCGCGAT GTCGTCGCTT    18660

ATGCAGTACA GAACGGTATC CCGGTTCCTA CATTCGCTGC TGCGGTTGCC TATTATGACA    18720

GCTACCGTGC CGCTGTTCTG CCTGCGAACT TAATCCAGGC CCAGCGTGAC TA            18772

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (4)

1、一种对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于：其wzx序列为SEQ ID NO：1中的11479至12672碱基的核苷酸或wzy序列为SEQ IDNO：1中的10411至11463碱基的核苷酸或者具有上述序列插入、缺失或取代一个或多个核苷酸，但保持wzx、wzy核苷酸特异性检测大肠杆菌O24型的O-抗原功能寡核苷酸。

2、一种对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的寡核苷酸，其特征在于，其为源于wzy基因的寡核苷酸对：SEQ ID NO：1中的10527至10542碱基的核苷酸和10829至10844碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的10872至10887碱基的核苷酸和11393至11408碱基的核苷酸；或源于wzx基因的寡核苷酸对：SEQ IDNO：1中的11931至11948碱基的核苷酸和12264至12276碱基的核苷酸，SEQID NO：1中的11572至11587碱基的核苷酸和12193至12209碱基的核苷酸。

3、权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的寡核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原中的应用。

4、按照权利要求1、2之任意一项所述的对大肠杆菌O24型的O-抗原特异的寡核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测体外及环境中的细菌。