CN1563049A

CN1563049A - 对大肠杆菌o88的o－抗原特异的核苷酸

Info

Publication number: CN1563049A
Application number: CN 200410019034
Authority: CN
Inventors: 王磊; 杨静华; 冯露
Original assignee: Tianjin Biochip Corp
Current assignee: Tianjin Biochip Corp
Priority date: 2004-04-19
Filing date: 2004-04-19
Publication date: 2005-01-12
Anticipated expiration: 2024-04-19
Also published as: CN1234860C

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O88(Escherichia coliO88)的O－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌O88中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长16800个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O88的O－抗原基因簇中的寡糖单位处理基因(包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因)的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O88的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定人体及环境中的大肠杆菌O88的方法。

Description

对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸

技术领域

本发明涉及大肠杆菌O88(Escherichia coli O88)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O88中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O88并鉴定这些致病菌中的O-抗原。

背景技术

大肠杆菌O88是致病菌，它属于ETEC(enterotoxigenic Escherichiacoli)，即产肠毒素的大肠杆菌，在苏格兰它曾引起儿童痢疾[E Begaud，DMondet et al(1993)“Molecular characterization of enterotoxigenicEscherichia coli(ETEC)isolated in New Caledonia(value of potentialprotective antigens in oral vaccine candidates)”Res Microbiol，November 1，1993；144(9)：721-8]；此外，从牛和食物中也分离到大肠杆菌O88[PM Molina et al(1993)“Survival in acidic and alcoholic mediumof Shiga toxin-producing Escherichia coli O157：H7 and non-O157：H7isolated in Argentina.)”BMC Microbiol，Aug 2003；3(1)：17]。因此对大肠杆菌O88的检测是重要的，需要一个可以快速、准确地检测大肠杆菌O88的方法。

位于大肠杆菌表面的脂多糖是大肠杆菌致病的诱因，而O-抗原是脂多糖最外层结构，是免疫系统识别的目标和噬菌体吸附的位点。O-抗原的缺失会造成许多病原体的血清敏感，或者严重削弱病原体的毒力[Frank etal(1987)“The function of antibody and complement in the lysis ofbacteria”.Rev Infect Dis 177：1750-1753.Pluschke G et al“Role of thecapsule and the O-antigen in resistance of O18：K1 Escherichia coli tocomplement-mediated king”.J Bacteriol 42：907-913]。大肠杆菌是一个种，种内的菌株一般通过O-抗原和H-抗原(有时通过K-抗原)来鉴定。其中O-抗原具有高度多样性，大肠杆菌有166种不同的O-抗原，O-抗原的变化可能是大肠杆菌的起源和维持其多样性的主要原因[Reeves，P.R(1992)“Variation in antigens，niche specific selection and bacterialpopulations”.FEMS Microbiol.Lett，100：509-516]。

O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过o-抗原转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide Oantigens”.Trends in Microbiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.andJ.D.Klena.(1993)“Genetics of lipopolysaccharide biosynthesis inentericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthes is and genenomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在大肠杆菌、志贺氏菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“The Escherichiacoli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：gene clusters encodingthe same colitose-containing O antigen are highly conserved”.Journal ofBacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。

因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification ofabequose and paratose synthase genes(rfb)by polymerase chain reactionfor identification of S.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecularmicrobiological investigation of an outbreak of Hemolytic-UremicSyndrome caused by dry fermented sausage contaminated with Shiga-liketoxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)“Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111”.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的。大肠杆菌O88的O-抗原的结构已知，如下所示。它是由4个糖组成的重复单位，其中，L6dTal是一个罕见的单糖[A Gamianet al(1994)“Structure of the Escherichia coli O24 and O88 O-specificsialic-acid- containing polysaccharides and linkage of thesestructures to the core region in lipopolysaccharides”.EuropeanJournal of Biochemistry，Vol 225，1211-1220].

→4)αDMan(1→3)α|DMan(1→βDGlcNAc(1→αL6dTal(1→3)

发明内容

本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O88的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于o-抗原转运酶基因、聚合酶基因及糖基转移酶基因的特异的核苷酸。

本发明的一个目的是提供了大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。

本发明的次一目的是提供了构成大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的基因：转运酶基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11基因；糖合成路径基因，包括rmlB、rmlA、rmlC、tll、manB、manC、orf2、orf3基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。

本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O88的O-抗原基因簇中编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因，包括orf8、orf10、orf11基因。它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O88的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的源于编码转运酶的基因和聚合酶的基因的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O88的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O88的O-抗原也是高度特异的。

本发明的另一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法来检测和鉴定大肠杆菌O88的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O88。

本发明的再一目的是提供了分离大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。

本发明的目的是由以下技术方案实现的。

本发明对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQID NO：1所示的分离的核苷酸，全长16800个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1核苷酸。

前述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其由13个基因组成，其由命名为orf1、orf2、rmlB、rmlC、rmlA、tll、wzx、orf8、wzy、orf10、orf11、manC、manB的13个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

前述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特异性的基因包括：转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11基因。其中所述的转运酶基因是SEQ IDNO：1中的6892至8349碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO：1中的9278至10552碱基的核苷酸；所述的orf8基因是SEQ ID NO：1中的8368至9264碱基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO：1中的10549至11604碱基的核苷酸；orf11基因是SEQ ID NO：1中的11605至12714碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因或wzy基因或糖基转移酶基因的寡核苷酸；以及它们的混合或它们的重组。

前述的对大肠杆菌O88的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的7772至7789碱基的核苷酸和8440至8457碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的7819至7836碱基的核苷酸和8228至8245碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的10165至10182碱基的核苷酸和10467至10484碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的9753至9770碱基的核苷酸和10149至10166碱基的核苷酸。

前述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

前述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，而且通过插入表达可提供表达大肠杆菌O88的O-抗原，并成为细菌疫苗。

前述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，可用这些方法检测人体和环境中的细菌。

前述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在LB培养基中培养大肠杆菌O88，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O88中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O88的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；将得到PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；

(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O88的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因设计引物；在每个基因内各设计两对引物，每对引物分布在相应基因内不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O88及其O-抗原都是高度特异的；

(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O88，细菌记数后分别将5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养；从培养好的菌液中取数ml处理后做为PCR模板；用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O88的灵敏度。

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O88，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(2)通过PCR扩增大肠杆菌O88中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O88的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇；首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAAGAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCGCGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的ExpandLong Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟，然后94℃变性10秒，60℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性；合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾，此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O88的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；

(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical ResearchCouncil)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列，序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O88的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率；在得到大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的结构；

(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O88的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，所有引物都在大肠杆菌O88中得到阳性结果，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽然在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O88及其O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O88的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作10⁶和10⁷倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的7772至7789碱基的核苷酸和7819至7836碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的10165至10182碱基的核苷酸和9753至9770碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的10467至10182碱基的核苷酸和10467至10484碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的9753至9770碱基的核苷酸和10149至10166碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O88的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长16800个碱基；或具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的结构，如表3所述，它的13个基因都位于galF基因和gnd基因之间。

本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O88的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11基因；细菌多糖抗原中特殊的糖合成路径基因，包括rmlB、rmlA、rmlC、tll、manB、manC、orf2、orf3基因。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中。本发明尤其涉及到o-抗原转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是特异的，而本发明涉及到的o-抗原转运酶基因、聚合酶基因和糖基转移酶基因对大肠杆菌O88的O-抗原是特异的。

本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O88的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因和wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸和糖基转移酶基因包括orf8、orf10、orf11基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中源于大肠杆菌O88的O-抗原基因簇中的wzy基因或与wzy有相似功能的基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因的寡核苷酸对。在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物只在以大肠杆菌O88为模板进行的PCR扩增中得到预期大小的产物，而在以表2所列的其它菌为模板进行的PCR扩增中都未得到预期大小的产物。更详细地说，以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应在大多数细菌中均未得到任何产物，所以，可以确定这些引物即表1所列的寡核苷酸对大肠杆菌O88及它们的O-抗原是高度特异的。

所述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸的分离和鉴定方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O88中的O-抗原基因簇；3)O-抗原基因簇文库的构建；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析，最终获得O-抗原基因簇的结构；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。

本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

如本发明所述，“寡核苷酸”主要是指来源于O-抗原基因簇中的编码转运酶的基因、编码聚合酶的基因和编码糖基转移酶基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变。尤其是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的6892至8349)，wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1的9278至10552碱基)内的寡核苷酸对大肠杆菌O88都是高度特异的。

此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于转运酶基因、源于聚合酶基因和源于糖基转移酶基因中的寡核苷酸的组合。

在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。

本发明涉及到一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因。(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O88。可用PCR方法检测，更可以将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

本发明者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码转运酶基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸和编码糖基转移酶基因包括orf8、orf10、orf11基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O88表达的。

另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O88。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码转运酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；源于编码糖基转移酶的基因包括orf8、orf10、orf11基因。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。

另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码转运酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因(ii)编码聚合酶的基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因(iii)编码糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O88。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。

更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于wzx基因或与wzx有相似功能的基因及wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因包括orf8、orf10、orf11基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。

本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。

本发明首次公开了大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O88的O-抗原，并成为有用的疫苗。

具体实施方式：

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。

实施例1：基因组的提取。

在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O88，离心收集细胞。用500ul50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提两次，取上清液，再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。

实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O88中的O-抗原基因簇

以大肠杆菌O88的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇上游的galF基因设计上游引物(5’-ATTGTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA ATC-3’)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(5’-TAG TCG CGC TGN GCC TGG ATT AAG TTC GC-3’)。用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，61℃退火30秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环；最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并6管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。

实施例3：构建O-抗原基因簇文库。

首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。

其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃4000rpm离心15分钟。倾尽上清液，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃ 4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清液，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。

最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O88的O-抗原基因簇文库。

实施例4：对文库中的克隆测序。

从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率。剩余20％的序列再通过反向测序及将有些序列测通得到，最后获得O-抗原基因簇的所有序列。

实施例5：核苷酸序列的拼接及分析。

用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O88的基因组作6个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到13个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。

通过检索和比较，在orf1的上游发现一段序列与Escherichia coli的转座酶在378个氨基酸中有98％的相同性，98％的相似性；这个转座酶是一个H repeat，所以在orf1的上游的这段序列也是一个H repeat。orf1编码的蛋白与Aeromonas hydrophila的O-acetyl transferase在182个氨基酸中有52％的相同性，74％的相似性，表明orf1也编码O-acetyl transferase，暂命名为orf1。Orf2与Aeromonas hydrophila的acetyl transferase在194个氨基酸中有57％的相同性，74％的相似性，表明orf2也编码acetyltransferase，暂命名为orf2。Orf3编码的蛋白与Shigella boydii的dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱氢酶在357个氨基酸中有80％的相同性，88％的相似性。dTDP-D-葡萄糖-4，6-脱氢酶由rmlB基因编码，高度的相同性表明orf3也是rmlB基因，命名为rmlB。Orf4编码的蛋白与Escherichia coli K12的葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶在291个氨基酸中有82％的相同性，91％的相似性。葡萄糖-1-磷酸胸苷转移酶由rmlA基因编码，高度的相同性表明orf4也是rmlA基因，命名为rmlA。Orf5编码的蛋白与Aeromonas hydrophila的dTDP-6-脱氧-D-葡萄糖3，5-变位酶在183个氨基酸中有70％的相同性，85％的相似性。dTDP-D-葡萄糖4，6-脱氢酶由rmlC基因编码，高度的相同性表明orf5也是rmlC基因，命名为rmlC。Orf6编码的蛋白与Aeromonas hydrophila的dTDP-glucose-4，6-dehydratase在245个氨基酸中有54％的相同性，75％的相似性，在245个氨基酸中有54％的相同性，75％的相似性，而且，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf6编码的蛋白与NAD依赖的脱氢酶和变位酶家族的保守的基序PF01370的E value为2.5×e^-7，这个酶是由tll基因编码，而且，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf6编码的蛋白与NAD依赖的脱氢酶和变位酶家族的保守的基序PF01370的E value为2.5×e^-7，在大肠杆菌O88的O-抗原中有一个非常罕见的糖L6dTal，它的合成途径已经被发现，L6dTal是由rmlB、rmlC、rmlA和tll四个基因编码的蛋白合成，tll编码一个氧化还原酶dTDP-6-deoxy-L-talose：NADP 4-oxidoreductase，我们推测orf6也编码dTDP-6-deoxy-L-talose：NADP 4-oxidoreductase以合成大肠杆菌O88的O-抗原中的L6dTal，因此将orf6命名为tll。blast比较表明orf7与Aeromonas hydrophila的O-抗原转运酶Wzx在486个氨基酸的序列中有40％的相同性，63％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法发现orf7有14个潜在的穿膜区，而且分布均匀，这是Wzx的典型特征，所以可以确定orf7是wzx基因，命名为wzx。Orf8编码的蛋白与Aeromonashydrophila的鼠李糖的糖基转移酶在486个氨基酸中有40％的相同性，63％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf8与糖基转移酶家族1的PF00534的E value为2.3×e^-17，因此推测orf8也是一个糖基转移酶，因为L6dTal和鼠李糖的合成过程很相似，所以推测orf8编码的蛋白是一个L6dTal的转移酶，将orf8基因暂命名为orf8。Orf9与Salmonellaenterica的O-抗原聚合酶在385个氨基酸的序列中有22％的相同性，45％的相似性。并且通过Eisenberg等人的算法[Eisenberg，D，Schwarz，E.et al(1984).Analysis of membrane and surfaceprotein sequences with the hydrophobic moment plot.J.Mol.Biol.179：125-142]发现orf9有10个潜在的穿膜区，它与许多Wzy蛋白有相似的二级结构，有一个大的loop，具有典型的O-抗原聚合酶的特征，所以确定orf9是wzy基因，命名为wzy。Orf10与Pseudomonas syringae pv的糖基转移酶在342个氨基酸中有35％的相同性，56％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf10与脂多糖的转移酶PF00534的E value为2.9×e^-29，因此推测orf10也是一个糖基转移酶，暂命名为orf10。Orf11与Bacteroides thetaiotaomicron的糖基转移酶在369个氨基酸中有47％的相同性，69％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf11与糖基转移酶家族保守基序PF00535的E value为4.2×e^-39，因此推测orf11也是一个糖基转移酶基因，暂命名为orf11。Orf12编码的蛋白与Escherichiacoli K12的manC基因编码的mannose-1-phosphate guanyltransferase在471个氨基酸中有79％的相同性，88％的相似性，高度的相同性表明orf12也是一个manC基因，因此将orf12命名为manC。Orf13编码的蛋白与Escherichia coli的manB基因编码的phosphomannomutase在456个氨基酸中有95％的相同性，97％的相似性，高度的相同性表明orf13也是一个manB基因，因此将orf13命名为manB。

实施例6：特异基因的筛选

针对大肠杆菌O88的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。

在表1中列出了大肠杆菌O88的O抗原基因簇的转运酶基因、聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。

mdh(malate dehydrogenase)基因是存在于所有的大肠杆菌的基因组中且高度保守的一个基因，所以我们根据mdh基因设计了引物(5′-TTC ATC CTA AACTCC TTA TT-3′)和(5′-TAA TCG CAG GGG AAA GCA GG-3′)，然后从166种血清型的大肠杆菌中提取基因组，方法如前所述。用这对引物从166种血清型的大肠杆菌的基因组中PCR以鉴定大肠杆菌并检测其基因组的质量。

表2是用于筛选特异基因的166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共13组。它们的来源都列于表中。

在第5组中含有大肠杆菌O88的基因组DNA作为阳性对照。第13组中是不含有大肠杆菌O88的基因组DNA，作为阴性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性2分钟后，95℃变性15秒，退火温度因引物的不同而不同(参照表1)，退火时间是50秒，72℃延伸2分钟，这样进行30个循环。最后在72℃继续延伸10分钟，反应体系是25ul。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。

对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第5组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带。所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O88及其O-抗原都是高度特异的。

最后，通过PCR从大肠杆菌O88中筛选到对大肠杆菌O88的O-抗原高度特异的基因：wzx、wzy基因。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O88的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O88是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O88，并能鉴定它们的O-抗原。

实施例7：引物灵敏度的检测。

购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O88的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ IDNO：1中的7772至7789碱基的核苷酸和7819至7836碱基的核苷酸，SEQ IDNO：1中的10165至10182碱基的核苷酸和9753至9770碱基的核苷酸，SEQ IDNO：1中的10467至10182碱基的核苷酸和10467至10484碱基的核苷酸，SEQID NO：1中的9753至9770碱基的核苷酸和10149至10166碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg²⁺：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×10³，5×10²，5×10¹，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O88的检测灵敏度均为0.25个菌/g。

表3是大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的结构，共由13个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。

表4是大肠杆菌O88的O-抗原基因簇中的基因的位置表，在表中列出了大肠杆菌O88的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在细菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。

序列列表

SEQ ID NO：1(SEQUENCE LISTING)

<110>天津生物芯片技术有限责任公司

<120>对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>16800

<212>DNA

<213>Escherichia coli

<400>1

ctccatttta tgtgcacgac ctgctattgg tgacaatcca tttgtcgtgg tgctgccaga 60

cgttgtgata gatgacgcca gcgccgaccc gctgcgctac aaccttgctg ccatgattgc 120

gcgcttcaac gaaacgggcc gcagccaggt gctggcaaaa cgtatggcgg gcgatctctc 180

tgaatactcc gtcattcaga ccaaagagcc gctggaccgt gaaggcaaag tcagccgcat 240

tgttgaattt atcgaaaaac cggatcagcc gcagacgctg gactcagaca tcatggccgt 300

tggtcgctat atgctttcag cagatatttg gccggaactt gaacgcactc agcctggtgc 360

atggggacgt attcagctga ctgatgccat cgctgaactg gcgaaaaaac agtccgttga 420

tgccatgctg atgacaggtg acagctacga ctgcggtaaa aaaatgggtt atatgcaggc 480

gtttgtgaag tatggactac gcaacctcaa agaaggggcg aagttccgta aagggattga 540

gaagctgtta agcgaataat gaaaatctga ccggatgtaa cggttgataa gaaaattata 600

acggcagtga agattcgtgg cgaaagtaat ttgttgcgaa tattcctgcc gttgttttat 660

ataaacaatc aggataacaa cgagttagca ataggatttt agtcaaagtt ttccaggatt 720

ttccttgttt ccagagcgga ttggtaagac aattagcgtt tgaatttttc gggtttagcg 780

cgagtgggta acgctcgtca catcgtaggc atgcatgcag tgctctggta gctgtaaagc 840

caggggcggt agcgtgtcta ggggaaggtc atcgcgtgcg ttaagcacaa aaagaaaaaa 900

tgaacgtttg catgtaataa gcataagttt gtgaatagat cagggaaaga tcatcagaag 960

ttcacttttt gtactaaata attcgcattt tatgtttaaa aattgagata ttccttatta 1020

cctaaagctg ttttttattg cttatacatg atcaaatact ccttacataa ttaaggagaa 1080

caaaatggaa cttaaaaagt tgatggaaca tatttctatt atccccgatt acagacaagc 1140

ctggaaagtg gaacataaat tatcggatat tctactgttg actatttgcg ccgttatttc 1200

tggtgcagaa ggttgggaag atatagagga ttttggggaa acacatctcg attttttgaa 1260

gcaatatggt gattttgaaa atggtattcc tgttcacgat accattgcca gagttgtatc 1320

ctgtatcagt cctgcaaaat ttcacgagtg ctttattaac tggatgcgtg actgccattc 1380

ttcagatgat aaagacttca ttgcaattga tggaaaaacg ctccgacact cttattacaa 1440

gagtcgccgc aggggagcga ttcatgtcat tagtgcgttc tcaacaatgc acagtctggt 1500

catcggacag atcaagacgg atgagaaatc taatgagatt acagctatcc cagaacttct 1560

taacatgctg gatattaaag gaaaaatcat cacaactgat gcgatgggtt gccagaaaga 1620

tattgcagag aagatacaaa aacagggagg tgattattta ttcgcggtaa aaggaaacca 1680

ggggcggcta aataaagcct ttgaggaaaa atttccgctg aaagaattaa ataatccaga 1740

gcatgacagt tacgcaatta gtgaaaagcg tcacggcaga gaagaaatcc gtct tcatat 1800

tgtttgcgat gtccctgatg aacttattga tttcacgttt gaatggaaag ggctgaagaa 1860

attatgcgtg gcagtctcct ttcggtccat aatagcagaa caaaagaaag agccagaaat 1920

gacggtcaga tactatatca gttccgctga tttaaccgca gagaagttcg ccacagcaat 1980

ccgaaaccac tggcacgtgg agaataagct gcactggcgt ctggacgtgg taatgaatga 2040

agacgactgc aaaataagaa gaggaaatgc agcagaatta ttttcaggga tacggcacat 2100

tgctattaat attttgacga atgataaggt attcaaggca gggttaagac gtaagatgcg 2160

aaaagcagcc atggacagaa actatctggc gtcagtcctt gcggggagcg ggctttcgta 2220

atcttgcctt aagtagcgta gatttttcca aatcacattg atattacaaa gagtcggtga 2280

cgatatgaag caagctttgt cgagaatgaa aataaaattg ttatcatatt tttataaaag 2340

aaaaaatcgg tctacacaat tcggtcgcta cactgtttta ttctgtcgtg caaatataac 2400

taattctata gtaggtgatt atacgtattt cgcaggcacc gcctccgtta ataattgtga 2460

aattggtaaa tcttgttcta ttgcagaagg cgttaaaata ggccttggaa aacacccagt 2520

tgattttctt tcaacacatc cggtatttta ctcggaaaat acctgcttcc cttatagatt 2580

gaaaaattat agagttaatg aaaaagtgat tgaatcaatc accgaatcag agagagtcat 2640

cataggcaat gatgtttgga ttggcgtaaa tgccatcgta atggatggtg tgacaattgg 2700

tgatggagca gttattggag ctggggcggt tgttaccaaa gatgttcaac cttatactat 2760

cgtaggtggt gttcctgcga gagtcattag gaccagacaa aatataaatt gttcttggtg 2820

ggaatttgat gtagataccc ttgtagattt ttcctcaaat tttaaaaaga ggttgtaatg 2880

tacgagttaa tgttgaaggt caaacgtaaa atagctactc ttctttcttc atttatattt 2940

cgcgtttcat ttaaaaattt cggaacaaaa agtagtattt ttaaacctga tatattacaa 3000

ggggtgaaat atatagaagt tggcgataga gtattaattc aaccgggatt atgggcttta 3060

gcattgaaaa ttgataacaa tgaaccgatc ctgaatatag gaaataacgt ttatattggt 3120

cgcttcttac atattgtaag tgtgcgccgt gtagttatcg aaaaggatgt tctcatcgcc 3180

gataaggtat atatatcaga caaccttcat gagtataaag atattcatat tccagtaagc 3240

cagcagcctg ttgtattcaa aggtgatgtg gttattaagg aaggcgtctg gataggggaa 3300

aatgtttcca tcattggtgc ttgcattggc agaaatagtg tggtagcggc aaactttgta 3360

gtgacgaagg atatacctga ttattctgtt tgtgcaggtg tacctgcaaa agttatcaaa 3420

aaatactgtt tcgaacgaaa tgaatggata agtgtttctt aatgtatacc atttttactt 3480

atttgagata aaaaatgaaa atattagtta ctggtggtgc cgggttcatc ggttcggcat 3540

taacgcgata cattattaac tcaaccaatg actctgttgt gaatgttgat aagttaacct 3600

acgcaggtaa tcttcattct ttaaaggaca ttgataattg cgatcgttat gtttttgttc 3660

atgctgatat ttgcgatgcg aaagcattag acgcaatctt atcaacacat aaacctgatg 3720

cagtaatgca tttggcagca gaaagtcatg ttgaccgttc aatcaccggc cctgctgcgt 3780

ttattgaaac gaatattgtt ggaacatacg ttttgcttga agcagccaga aaatactggc 3840

aaaccctaga gggggaaaag aaacagggat tccgtttcca tcacatttct actgatgaag 3900

tatatggtga tctccctcat ccggatgact gggataataa aaatagtcca ccactgttta 3960

ctgagaatac cgcatatgct cctagcagtc catactctgc ctctaaagca tcaagcgatc 4020

atttggttcg cgcgtggcat cgtacttata atctcccaac tattgtgact aactgttcaa 4080

acaattatgg tccttaccat ttcccagaaa agttaattcc gctggtgatc cttaatgcgt 4140

tgcaagacaa atctttgcca atttatggca aaggcgatca aatccgtgat tggttatacg 4200

ttgaggatca tgctcgcgca ctctataccg ttatcacgaa aggtatcgta ggtgaaactt 4260

acaatatcgg cggttataat gagaaaaaga atattgaagt ggtagagact atttgcgata 4320

tccttgacga aataaagccg aaaaatacct cgtatcgcga acaaatcatt tatgttgccg 4380

atcgcccagg tcacgatcgc cgctatgcca ttgatgccag taaaatcact ctggacctcg 4440

gttggaaacc tcaagagacc tttgaatctg gtattaagaa aactattcat tggtatcttg 4500

ataaccagga gtgggtccag aatgttatga gcggtgccta tcaggactgg attaacaaaa 4560

attacgggca actttaatct tttcaactct gtcataagaa gcattgaaca tgtcaaaaag 4620

aaaaggaatt attttagccg gtggttcggg tactcgcctt taccccgtga cgatggcggt 4680

tagtaaacag ctgctgccaa tctatgataa accgatgatt tattatccat taagcacgtt 4740

gatgcttgcg ggtattcggg atattctcat cattagcaca cctcaggata cccctcgctt 4800

tgagcaatta cttggtaacg gtgaaaaatg ggggctgaac atcgaatata aagtccagga 4860

aagtcctgat ggtcttgccc aggcatttat aattggtgaa gaatttatcg gtaacgattc 4920

ttgtgcttta gtcctcggcg acaatgtttt ctatggtcac gatttgccaa aagaacttga 4980

aatagcaatg aatcaggaaa aaggtgctac ggtctttgcc taccatgtta aagaccctga 5040

acgctatggt gtggtagatt tcgatgagaa tggcaaagcg ctttctttag aagagaaacc 5100

gctgaaacca aaaagtaatt atgctgtgac tgggctctat ttttatgata acgaggtcat 5160

tgagatggct aaacaactga aaccgtcagc tcgcggtgaa ttagaaatca ctgatattaa 5220

tcgcctctac ctggaaaaaa actcgctctc agttgctatt atgggccgtg gctatgcctg 5280

gcttgataca ggtacgcatg agagtcttat tgaggcgggt aactttattc agacgatcga 5340

atcacgtcaa ggactcaaag tttcttgccc ggaagagatt gctctccgta aaggtttcat 5400

tgataagaaa cagcttgcaa aattagccaa agaactcaat aaaaatgatt acggtaaata 5460

tttgcagcat ttagccaaag attaaaaatt aacattaatt agttaacaca tatgaaaatt 5520

atagaaactc ctttgaaaga tgctgttatt atcgagccta aaatttttgg tgacgaacga 5580

ggctattttt ttgaagtcta tcagaaaaaa cgttatcagg aattgggatt cgctctggaa 5640

tttgtacagg ataatcgttc caaatcgact aaaaatgtcc tgcgagggct tcattttcag 5700

aaaacaaagc ctcagggaaa actagtttca gtaacccagg gggctgtttt tgatgttgcc 5760

gttgatctcc gtccagagtc actgacattt ggtcagcatc attcagttat tctatccgaa 5820

gaaaattttc ttcagtttta tattcctcca ggtttcgctc atggtttctg cgtattaagt 5880

gacactgcta gtttccagta caaatgcact gattattatg atccaaccga tgaaagcggt 5940

cttatctgga acgatcccga tctgggcata gaatggcctg tttctcatcc tgtagtttct 6000

gctaaagatt gttttttacc ttcactagca agtatcaaag aacagattct taaaggctgg 6060

aaaaatgtct aagtatacaa ttattggcgg taacggtttt attggttccc atatcgttac 6120

attgctaaaa gaacaagggc ataatgtcgt tgttcccgat cgtaatagct gcaattccct 6180

aaatggtgag ttaggtaaaa ttatttattg tgctggtaat ggtgattgtg cggaaagcta 6240

tttctctgtg ctggaagcaa atacagtttt gttggcaaag ttactgaaga atgcacagtt 6300

tgaaaagctg gtatatattt cctcaactcg agtttatatg aaccaccata gcgcaaatga 6360

aactgatgat ctgctagtaa cagcgggtga taacaggaag ctttttaacc tgaccaaact 6420

ggtggctgag gagctgtgta ttaagagcga acgtgatgtt actgtggttc gaccaagcaa 6480

tgtctatggt ttagctctta atagtaaatt atttcttccg tctattatcc gtcatgccat 6540

taacaatggt gaaatcaaca tgtttgttgc acctgaatat gctaaggact atgtttcagt 6600

caatgatgtt gctaaagcat gtgtgtggct agctgaaaaa caaaacacca acaaagaaat 6660

atataatgtc gcatctggat ttaacgtaac agctaaacaa atcactgatg tcatcgaaaa 6720

agaaacggct tgtaaggtaa actggcatga tggtaatttc cctcgtgaag agtttcctgt 6780

tactaacata aataaattaa ctaatgagat tccggattat aaaccacaac atgtgcttga 6840

tgatttgaaa atgatgatag ctagttataa agaagaactg gcgagataaa tatgagtggt 6900

tttaagcggt tacttaaaaa ctctttgtct aatataataa atggattttc aaatgtaatt 6960

cttggaatag tgatctctcc agttttactg cataatcttt caaaggtaga tttttctatt 7020

tggtccctta caattcaggt tggggttttg atcggtattt ttggcattgg tcttcaggtt 7080

acagtagggc gttttgtcgc ccttcattta aataatcaac agaaacttca aaagacaatg 7140

catcagtcat tgttttttgt gttactgctc agtttggtat gtatgggggg aatattcttt 7200

ttagcaaaat tctttttctc atttttccct gaagtatcag aaaccagtac taatgctaag 7260

cacattctta tattaattgg tggttcattt gttattaata atatgttctc tcccttcgtt 7320

ggctatttta ctggtattga gcgtaatgat ataacagctg gcataaatat attgtttaaa 7380

gtaattctgg gtacgtcgat tctgttgctt gtccaccatg gtcttgaagt tattgcatgg 7440

atttattttg caataaacac ttttaatcaa cttgcttttt atattttata taaattaaaa 7500

aacagaactc aaaaaataaa gttatcacta gataaaaatt tatttcgaac tatagttgtc 7560

ttttttagcg gactcttggt atggaatatt gcccagttct taatttctgg tataggcacc 7620

tttatcgtcg gtaaatattc atttcaggag ctcgctggtt ttgccgtatt aatgacactt 7680

gttaatgctg gtgtgggaat tttgggagca atgatcaatc ctataattca acctatgata 7740

aggatgcaca atctggagaa taaccatcat gttgaacttc tggtcaacaa actgatcttc 7800

attttctcaa tgattgcctt tattggtgtt tttattgcct ggtttgcctc tgtatatatt 7860

cttggcgtct ggttgggata tcagcaagca acaaacctgc acattatgtt ttctttgctg 7920

cttactgctt atcttattag aatgattgca gcgccctatg ggcttatgtt agtcgcttat 7980

ggcaaacaat tgtcaatcgc ttggcttccg gtgctcgaag gggtattgaa ctttgcgtta 8040

tcgattttct ttgtgcgtat atatggtgcc attggaattg cctactcgac gtttatttca 8100

ggcgtattaa tcatggctgt ttacgcttgc aagtatcagg ctgaagctga gtataagtcg 8160

aaactgatat ttacctcgtt tctgataata cctatgatga tagccatttg cctgatcagt 8220

ttggtgatga ctcagtcgga aatcatccat tgtgttattt atggcatcca ggtggctttt 8280

ataatagtat ttattatctt cttaataaaa caagtaaaaa gcatcaagaa tctgttaaat 8340

caatactaat attgctatgg tgaaagtgtg aaaaaagttg gactcgttac tgttttgttc 8400

aattctccag gtgtgcttcc tgaattttat tcgagtgttg aaaaacaaaa ttatcagaac 8460

aagcatcttt atattgtaga taacagcact aatcaggatt cttttaactt aacgcaagaa 8520

attctcttag gaacagacat aaagtatacc tatattaata atgaaggaaa taatgttggg 8580

gttgcacatg ccaataacca aggcattgaa caagctttaa aagatgggtg cgagtatata 8640

ttgctcacta ataatgatct gttttttcaa caggaagata ctatcagcaa aatgattagt 8700

gttgctgagg gacgacaatg taaaattgtt tcacctgtca tattaagtta tccagaaaaa 8760

aaagtttggt atgcaggtgc attttttaat aagaaagaag ctacggcacc tcatattttt 8820

gaaggagtca actacaatga tatttgcgct catattccaa aagagtgcga ttacgcacca 8880

acatgttttt tacttgtcca tgcttcggtg tttaccacta taggtatgat ggattctcgt 8940

tactttgctt attacgacga tactgatttt ctctatcgtg caaacatagc cggcactcgg 9000

gtaacaatta ttaatgaacc tctagtgttt cataaagtta gtacttctac cggaggaggg 9060

ttaagtgtat tcggcgcata ttatttaacg aggaaccgta tatttttcgc cagaaaaaat 9120

attgaaacac cttattgtat tattagtatt ttctttacca ttgcgacccg tttggtttat 9180

cctcttttcc acaaaacacc gtataaagta tacaaggctt ttgttaaagg aattatcgac 9240

ggcctaatgt taaaaaataa ataactaagg ggttaaggtg aacgagattt ccagtagcac 9300

acttgtcaat aactataatt tatcgacaac ttttattgtc aagtcacttg ttggattgtt 9360

attaattaat tctcttttta gtggtgttga cttttatcag attggtttga tgaaaggcct 9420

ttccagtatt gctgattttg gcctgaagat tatccttgtg ttcgtattgc tcgtgctttt 9480

caagattcgc agttttaact tggtaaagat attctttttt gcttttatgc ttctcatcgg 9540

tgctgcgctt ggagcattct atcatggtgc tgaatatgat aaaacttttg cgcttttact 9600

aaatatgata ttatggtttg ttatattcag ttatgctaaa gaacttgaac ataactttga 9660

tatatatcgt tttagtgtaa aaatatcaag tttatttctt ggtatcacgt tgatacttta 9720

catcatggca aagtttggtt ttcatgttaa agtattaggt ggagcttggt tatatgatga 9780

gaattttcgc tttgcaggta ctttctctga gccaagttta aatggctatt attatggttt 9840

aatgttcttg atggtcatgc tgtctaatca aaagtacaga ctaattttgg cgtttgtgtt 9900

tgctattact acctatattt caggtgcgaa attttcattc ctaataatac cagtgctcct 9960

tgggctggtt tatttcttca aggtgaaagg cttttataat tatacatacc agctcattcc 10020

gttatctttt attgttcttt ttgttagtct tgcgttcatc tactatgacc tttttgcact 10080

gattgcagct catttgtcaa attctgaaac aatgacttat gttactcgtc ttgggttccc 10140

aattgtcagc atctggcatc ttagtgatta tccattagga agtggagtat atggctttaa 10200

gagcacgcta tcacctttta tacagaacta ctgtcaggct ctttctggtc tggacgtaaa 10260

ttgtaacgag atgaggtcct atatatcctc ggatgatccc agtgcatatg aaagtttcgc 10320

gcctaaagat gttttaagtt tcattatatt aagttttggg cttccgggct tgcttgtgtt 10380

tgtcctgagt atatccttat tatcagctag acttaaggaa aataagaatt actttatcat 10440

tctaatgtat attgtcgcat caatgctctt tacattacct tttagattta ttctttttta 10500

ttctttcttc atgtttcagt gttatattta cagaatgccg agtaataaat gatctatatt 10560

aatgcaagat tcttgactca gcgtaaaacc ggtgtgcagc aatatgcatt agttttatgc 10620

cgggaactcg ttaaacacat tcctgatatc tgttttttga caccgaaaac tgatctcatt 10680

gatgagaatt ggcgggacga gtttaatatc cttcaaatag gaaatcgtaa tggacatttt 10740

tgggaacaaa tcgaactccc tcgttatcta agaagcgttg gtaatccgtt gctgctctgt 10800

tttactggct tatcacctgc tttttataaa aattgttact ttactatcca tgatatgtca 10860

ttgtacgcac atcccaagtg gttccgtttg ttatatcgtg cagtatacaa ggttaactat 10920

gctattcagg caagattcgc tagaggtatc ttcacggtta gtgatttttc gaaatcagag 10980

atagagaaat atctggcggt agactctgac aagatcactg tattacgaaa ttcagtagac 11040

acatctatta atatcaagaa taatattgaa aataaagcgg ttaggcgtaa agagatttta 11100

ttggttggta cctcagaacc tagaaaaaat atagagttta ttattaattc ttttttaaat 11160

tcgcaaatca aaggttataa gctcatcgtt gttggagggt taggagctgc tttctcaaag 11220

gtgacttttt ctcagcatga gaacattata ttctgtggct atctatcaga cgatgactta 11280

gagttaaagt atagacaagc ttcagttttt gtctatcctt cactgtatga aggtttcggc 11340

cttcctccac ttgaagcgat gcaacgtggc tgtcccgtaa tggcttctga ccgcgcaagc 11400

atccctgaag tttgtggtga tgctgcttac tatttcaatc cagaggactc atcagatttt 11460

agtagtaagt tacgtgagct gatcgaaaat tatgatgagc tcagccctgt attgatttgc 11520

aatggatatc gtagactgga acaatttgac gtacgggatg ttgcatcgaa acttatggat 11580

gtcatctctc aaaggaatat ttgaatgaag gttttacaat ttagtaaatt ttatcctcca 11640

gtacacgggg gaattgagca ggttgcattt gatattagcg aaggaattac aaaaagtaat 11700

ggtcagcctg ttgacgttct ctgtgttgat cctattgggg aaagaaaaga cgacggaaag 11760

tttcgttata aggtttaccg ccagaaattg tttgcacagc ttttctcgac accgctatct 11820

ttctccttga ttttacgctg gagagcgatc agaaataact atgatgttat tcacgttcat 11880

cttccaaatc caatggctgt gttggcgctt tttttatttc caccaaaagg aaaaatagtt 11940

ctccactggc acagcgatat tgttaagcaa aaaaaactat tattgctttt tgcgccgttg 12000

caaaaatgga ttttagataa atgtacctgt attatagtta caagtcctgt ttatgggcag 12060

tcttctccaa ctttgcaacc ttatcaggat aaaattgttt gtattcctat tggagttgat 12120

actcatgtta tgccgctaaa tgatgagctt gaaaaaagta taaaaaaacg ctatcaaaat 12180

aaaaagatag ttttttctct tgggcgtctt gtttattaca aaggtatgga atatctgatt 12240

gatgctgcga aggagcttcc tccggattac attgttctta ttggtggaac aggcccacta 12300

attgacacat taaagcaaaa ggttgctaat gatggattgt cagataaagt cgttcttctt 12360

ggtagcatca attattcgga tttagcatcc tattacaaat catgcgacgt tttttgtttg 12420

ccatctattc atgaatctga agcatttggt gtagtccagt tagaggctat gagtttctcc 12480

agaccgcttg tgtcgacaaa tattccccga agtggcgtgg cttgggttaa tcagcataac 12540

gagactggta ttgttgttga gcctaatgat gccaaagcac ttgctaaagg tatagtttct 12600

gttgttcaaa acagtgcaac gtttagtaaa ggcgctaagg ccagatttga taccatgttt 12660

actaaagaat tgatggttaa aaatataatt aatttatatt catctttaaa gtgagtgcaa 12720

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cgacaataca ccgactgcag ggcatcgtgt gtgaaagtcc tgtcgttatt tgtaatgaac 12900

agcaccgctt tattgttgct gagcaacttc gccagatgaa taaactcacc gagaatatta 12960

tcctcgaacc gattggtcgt aatactgctc cggcgatagc gttggctgca ctagccgcaa 13020

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agcttgtgac atttggtata gtcccgaata aagcagagac tggctatggt tacattcgcc 13200

gcggtgtgcc gtgcgatggt gttgaacatg cagatgcatt cgacgtcgcg caattcgttg 13260

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gtgggatgtt cctgttccgc gccgatcgct atcttgagga actaaaaaaa taccgcccgg 13380

atattcttga agcatgcgaa aaggcaatga gtgctgttga gcctgacctt aattttattc 13440

gcgttgatga agatgctttc agggcttgtc ctgatgagtc agttgactat gctgtgatgg 13500

agcagacttc cgatgctgtt gttgtgccaa tggatgcggg ctggagtgat gtcggttcct 13560

ggtcttcgct atgggatatt agccataaga cgccagaggg taatgtcgtc acaggtgatg 13620

tattatcctg caataccaaa aacagcttcc tgtattctga atcagggctt ttgactacag 13680

ttggcgtgaa agatttggtt gttgtgcaga ctaaggatgc tgtattgatt gccaatcgta 13740

acgccgttca ggatgtgaag aaaatagtcg aatcgataaa agctaacggg cgccacgaac 13800

atcatactca tcgcgaagtt tgtcgtccct ggggtaaata tgactcgatt gataccggga 13860

gccgttatca ggttaagcga ttgacggtaa aaccaggtga aagtatctca cttcagatgc 13920

atcaccatcg tgctgagcat tggattgtcg tcgcaggagc tgcacaagta acaattaacg 13980

aacaaactaa actcctcggt gaaaacgagt ctatctatat tcctgttggg tcaacacact 14040

gtctggaaaa tcctggaaag atccctttaa aactgattga gattcgctca ggttcttatc 14100

tgggagagga tgatattgtt cgtctgacaa agaagcgtta caaaatagat gactaataaa 14160

tgaaaaaatt aacctgcttt aaagcctacg atattcgcgg gaaattaggc gaagaactga 14220

atgaagatat tgcctggcgc attggtcgcg cctatggcga atttctcaaa ccgaaaacca 14280

ttgtgttagg cggtgacgtc cgcctcacca gcgaaacctt aaaactggcg ctggcgaaag 14340

gtttacagga tgcgggcgtc gatgtgctgg atatcggtat gtccggcacc gaagagatct 14400

atttcgccac gttccatctc ggcgtggatg gcggcattga agttaccgcc agccataacc 14460

cgatggatta taacggcatg aaactggtgc gcgaaggggc tcgcccgatc agcggtgata 14520

ccggactgcg cgatgtccag cgcctggctg aagccagcga ctttcctccc gtcgatgaaa 14580

ccaaacgcgg tcgctatcag caaatcaacc tgcgtgacgc ttacgttgat cacctgttcg 14640

gttatatcaa tgtcaaaaac ctcacgccgc tcaagctggt gatcaactcc gggaacggcg 14700

cagcgggtcc ggtagttgac gccatcgaag cccgctttaa agccctcggc gcaccagtgg 14760

aattgatcaa agtgcacaac acgccggacg gtaatttccc caacggtatt cctaacccgc 14820

tactgccaga atgccgcgac gacacccgca atgcggtcat caaacacggc gcggatatgg 14880

gcattgcctt tgatggcgat tttgaccgct gcttcctgtt tgacgaaaaa gggcagttta 14940

tcgaaggcta ctacattgtc ggcctgctgg cagaagcgtt cctcgaaaaa aatcccggcg 15000

cgaagatcat ccacgatccg cgtctctcct ggaacaccgt tgatgtggtg acggccacag 15060

gtggcacccc ggtaatgtcg aaaaccggac acgcctttat taaagaacgt atgcgcaagg 15120

aagacgccat ctacggtggc gaaatgagcg cccaccatta cttccgtgat ttcgcttact 15180

gcgacagcgg catgatcccg tggctgctgg tagccgaact ggtgtgtctg aaaggaaaaa 15240

cgctgggcga acttgtgcgt gaccggatgg caacttttcc agcaagtggg gaaattaata 15300

gcacgttgga agatccatta tgtgctatcg cacgggttga aagttattat gcaaataagg 15360

caattgagat cgatcgtaca gatggtataa gtatgacttt taatggatgg cgctttaacc 15420

tacgttcttc taacaccgaa ccggtggtgc ggttgaatgt tgaatcgcgc ggtgatgtgc 15480

cgctgatgga agaaaagaca aaacttatcc ttgcgttatt gaacaagtaa ttcagtaatt 15540

tcatataaat aagttttaaa agacggaaaa gatgagatat tcagtgtggt atagcaaagg 15600

taatgctatt caccatctct atgagtgagt taacatctat accacattta agccgcacac 15660

tcggcggtga ccacccctga caggagtaaa caatgtcaag gcaacagatc ggcgtcgtcg 15720

gtatggcagt gatggggcgc aaccttgcgc tcaacatcga aagccgtggc tataccgtct 15780

ctattttcaa ccgttcccgt gaaaagacgg aagaagtgat tgccgaaaat ccaggcaaga 15840

aactggttcc ttactatacg gtgaaagagt ttgttgaatc tctggaaacg cctcgtcgca 15900

tcctgttaat ggtgaaagca ggtgctggca cggatgctgc tattgattcc ctcaagccat 15960

acctcgataa aggtgacatc atcattgatg gtggtaatac cttcttccag gacaccattc 16020

gccgtaaccg tgagctttct gccgaaggct ttaacttcat cggtaccggt gtttccggtg 16080

gtgaagaggg cgcgctgaaa ggtccttcca tcatgcctgg tgggcagaaa gaagcctatg 16140

aactggttgc accaatcctg accaaaatcg ctgcagtagc tgaagacggg gagccatgcg 16200

ttacctatat tggtgccgat ggtgcaggtc actatgtgaa gatggttcac aacggtattg 16260

aatacggcga tatgcagctg attgctgaag cctattctct gcttaaaggt ggcctgaatc 16320

tctctaacga agaactggca cagaccttta ccgagtggaa taacggtgaa ctgagcagct 16380

acctgatcga catcaccaaa gatatcttca ccaaaaaaga tgaagacggt aactacctgg 16440

ttgatgtgat tctggatgaa gcagcaaaca aaggtaccgg taaatggacc agccagagcg 16500

cgctggatct cggcgaacca ctgtcgctga ttaccgagtc tgtgtttgct cgttatattt 16560

cttctctgaa agatcagcgc cttgccgcgt ctaaagttct ctctggcccg caagctcagc 16620

cagcaggcga caaggctgag tttatcgaga aagttcgtcg tgcgctgtat ctgggcaaaa 16680

tcgtttctta cgctcagggc ttctctcagc tgcgtgctgc gtctgaagag tacaactggg 16740

atctgaacta cggcgaaatc gcgaagattt tccgtgctgg ctgcatcatc cgtgcgcagt 16800

表1 大肠杆菌O88的O抗原基因簇中wzx基因、wzy基因及其中的引物及PCR数据

产生正 PCR的

基基因的正向引物位置反向引物位置 PCR产物确大小退火温

功能

因碱基位置长度电泳带度

的组数 (℃)

wzx O-抗原 6892-8349 7772-7789 8440-8457 686bp 0 58

转运酶

7819-7836 8228-8245 427bp 0 60

wzy O-抗原 9278-10552 10165-10182 10467-10484 320bp 0 61

聚合酶

9753-9770 10149-10166 414bp 0 62

表2 166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源

组号该组中含有的菌株来源

1、野生型大肠杆菌 O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18， IMVS^a

O19ab，O20，O21，O22，O23，O24

2、野生型大肠杆菌 O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35， IMVS^a

O36，O37，O38，O40，O41，O42，O43

3、野生型大肠杆菌 O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56， IMVS^a

O57，O58，O60，O61，O62，O53

4、野生型大肠杆菌 O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78， IMVS^a

O79，O80，O81，O82，O83，O68

5、野生型大肠杆菌 O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99， IMVS^a

O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97，

6、野生型大肠杆菌 O107，O108，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113， IMVS^a

O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117

7、野生型大肠杆菌 O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O88，O137， IMVS^a

O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140

8、野生型大肠杆菌 O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158， IMVS^a

O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153 b

9、野生型大肠杆菌 O168，O169，O170，O171，O172，O173， c

痢疾志贺氏菌 D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13 d

10、鲍氏志贺氏菌 B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15， d

B16，B17，B18

11、福氏志贺氏菌 F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v：4)，F5(v：7)，F6， d

DS，DR

12、野生型大肠杆菌 O3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，IMVS^a

O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119

13、野生型大肠杆菌去除大肠杆菌O88的第5组菌

为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阴性对照

a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia

b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark

c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS

d.中国预防医学科学院流行病学研究所

表3是大肠杆菌O88的O-抗原基因簇的结构表

galF H repeatorf1orf2 rmlBrmlArmlC tll orf7 orf8 orf9 orf10 orf11 manC manB gnd

1kb

表4是大肠杆菌O88的O-抗原基因簇中的基因的位置表

CTCCATTTTA TGTGCACGAC CTGCTATTGG TGACAATCCA TTTGTCGTGG TGCTGCCAGA 60

CGTTGTGATA GATGACGCCA GCGCCGACCC GCTGCGCTAC AACCTTGCTG CCATGATTGC 120

GCGCTTCAAC GAAACGGGCC GCAGCCAGGT GCTGGCAAAA CGTATGGCGG GCGATCTCTC 180

TGAATACTCC GTCATTCAGA CCAAAGAGCC GCTGGACCGT GAAGGCAAAG TCAGCCGCAT 240

TGTTGAATTT ATCGAAAAAC CGGATCAGCC GCAGACGCTG GACTCAGACA TCATGGCCGT 300

TGGTCGCTAT ATGCTTTCAG CAGATATTTG GCCGGAACTT GAACGCACTC AGCCTGGTGC 360

ATGGGGACGT ATTCAGCTGA CTGATGCCAT CGCTGAACTG GCGAAAAAAC AGTCCGTTGA 420

TGCCATGCTG ATGACAGGTG ACAGCTACGA CTGCGGTAAA AAAATGGGTT ATATGCAGGC 480

GTTTGTGAAG TATGGACTAC GCAACCTCAA AGAAGGGGCG AAGTTCCGTA AAGGGATTGA 540

GAAGCTGTTA AGCGAATAAT GAAAATCTGA CCGGATGTAA CGGTTGATAA GAAAATTATA 600

ACGGCAGTGA AGATTCGTGG CGAAAGTAAT TTGTTGCGAA TATTCCTGCC GTTGTTTTAT 660

ATAAACAATC AGGATAACAA CGAGTTAGCA ATAGGATTTT AGTCAAAGTT TTCCAGGATT 720

TTCCTTGTTT CCAGAGCGGA TTGGTAAGAC AATTAGCGTT TGAATTTTTC GGGTTTAGCG 780

CGAGTGGGTA ACGCTCGTCA CATCGTAGGC ATGCATGCAG TGCTCTGGTA GCTGTAAAGC 840

CAGGGGCGGT AGCGTGTCTA GGGGAAGGTC ATCGCGTGCG TTAAGCACAA AAAGAAAAAA 900

TGAACGTTTG CATGTAATAA GCATAAGTTT GTGAATAGAT CAGGGAAAGA TCATCAGAAG 960

TTCACTTTTT GTACTAAATA ATTCGCATTT TATGTTTAAA AATTGAGATA TTCCTTATTA 1020

CCTAAAGCTG TTTTTTATTG CTTATACATG ATCAAATACT CCTTACATAA TTAAGGAGAA 1080

CAAAATGGAA CTTAAAAAGT TGATGGAACA TATTTCTATT ATCCCCGATT ACAGACAAGC 1140

CTGGAAAGTG GAACATAAAT TATCGGATAT TCTACTGTTG ACTATTTGCG CCGTTATTTC 1200

TGGTGCAGAA GGTTGGGAAG ATATAGAGGA TTTTGGGGAA ACACATCTCG ATTTTTTGAA 1260

GCAATATGGT GATTTTGAAA ATGGTATTCC TGTTCACGAT ACCATTGCCA GAGTTGTATC 1320

CTGTATCAGT CCTGCAAAAT TTCACGAGTG CTTTATTAAC TGGATGCGTG ACTGCCATTC 1380

TTCAGATGAT AAAGACTTCA TTGCAATTGA TGGAAAAACG CTCCGACACT CTTATTACAA 1440

GAGTCGCCGC AGGGGAGCGA TTCATGTCAT TAGTGCGTTC TCAACAATGC ACAGTCTGGT 1500

CATCGGACAG ATCAAGACGG ATGAGAAATC TAATGAGATT ACAGCTATCC CAGAACTTCT 1560

TAACATGCTG GATATTAAAG GAAAAATCAT CACAACTGAT GCGATGGGTT GCCAGAAAGA 1620

TATTGCAGAG AAGATACAAA AACAGGGAGG TGATTATTTA TTCGCGGTAA AAGGAAACCA 1680

GGGGCGGCTA AATAAAGCCT TTGAGGAAAA ATTTCCGCTG AAAGAATTAA ATAATCCAGA 1740

GCATGACAGT TACGCAATTA GTGAAAAGCG TCACGGCAGA GAAGAAATCC GTCTTCATAT 1800

TGTTTGCGAT GTCCCTGATG AACTTATTGA TTTCACGTTT GAATGGAAAG GGCTGAAGAA 1860

ATTATGCGTG GCAGTCTCCT TTCGGTCCAT AATAGCAGAA CAAAAGAAAG AGCCAGAAAT 1920

GACGGTCAGA TACTATATCA GTTCCGCTGA TTTAACCGCA GAGAAGTTCG CCACAGCAAT 1980

CCGAAACCAC TGGCACGTGG AGAATAAGCT GCACTGGCGT CTGGACGTGG TAATGAATGA 2040

AGACGACTGC AAAATAAGAA GAGGAAATGC AGCAGAATTA TTTTCAGGGA TACGGCACAT 2100

TGCTATTAAT ATTTTGACGA ATGATAAGGT ATTCAAGGCA GGGTTAAGAC GTAAGATGCG 2160

AAAAGCAGCC ATGGACAGAA ACTATCTGGC GTCAGTCCTT GCGGGGAGCG GGCTTTCGTA 2220

ATCTTGCCTT AAGTAGCGTA GATTTTTCCA AATCACATTG ATATTACAAA GAGTCGGTGA 2280

Orf1的起始

CGAT ATGAAG CAAGCTTTGT CGAGAATGAA AATAAAATTG TTATCATATT TTTATAAAAG 2340

AAAAAATCGG TCTACACAAT TCGGTCGCTA CACTGTTTTA TTCTGTCGTG CAAATATAAC 2400

TAATTCTATA GTAGGTGATT ATACGTATTT CGCAGGCACC GCCTCCGTTA ATAATTGTGA 2460

AATTGGTAAA TCTTGTTCTA TTGCAGAAGG CGTTAAAATA GGCCTTGGAA AACACCCAGT 2520

TGATTTTCTT TCAACACATC CGGTATTTTA CTCGGAAAAT ACCTGCTTCC CTTATAGATT 2580

GAAAAATTAT AGAGTTAATG AAAAAGTGAT TGAATCAATC ACCGAATCAG AGAGAGTCAT 2640

CATAGGCAAT GATGTTTGGA TTGGCGTAAA TGCCATCGTA ATGGATGGTG TGACAATTGG 2700

TGATGGAGCA GTTATTGGAG CTGGGGCGGT TGTTACCAAA GATGTTCAAC CTTATACTAT 2760

CGTAGGTGGT GTTCCTGCGA GAGTCATTAG GACCAGACAA AATATAAATT GTTCTTGGTG 2820

Orf1的终止Orf2的起始

GGAATTTGAT GTAGATACCC TTGTAGATTT TTCCTCAAAT TTTAAAAAGA GGTTG TAATG 2880

TACGAGTTAA TGTTGAAGGT CAAACGTAAA ATAGCTACTC TTCTTTCTTC ATTTATATTT 2940

CGCGTTTCAT TTAAAAATTT CGGAACAAAA AGTAGTATTT TTAAACCTGA TATATTACAA 3000

GGGGTGAAAT ATATAGAAGT TGGCGATAGA GTATTAATTC AACCGGGATT ATGGGCTTTA 3060

GCATTGAAAA TTGATAACAA TGAACCGATC CTGAATATAG GAAATAACGT TTATATTGGT 3120

CGCTTCTTAC ATATTGTAAG TGTGCGCCGT GTAGTTATCG AAAAGGATGT TCTCATCGCC 3180

GATAAGGTAT ATATATCAGA CAACCTTCAT GAGTATAAAG ATATTCATAT TCCAGTAAGC 3240

CAGCAGCCTG TTGTATTCAA AGGTGATGTG GTTATTAAGG AAGGCGTCTG GATAGGGGAA 3300

AATGTTTCCA TCATTGGTGC TTGCATTGGC AGAAATAGTG TGGTAGCGGC AAACTTTGTA 3360

GTGACGAAGG ATATACCTGA TTATTCTGTT TGTGCAGGTG TACCTGCAAA AGTTATCAAA 3420

Orf2的终止

AAATACTGTT TCGAACGAAA TGAATGGATA AGTGTTTCT T AATGTATACC ATTTTTACTT 3480

Orf3的起始

ATTTGAGATA AAAA ATGAAA ATATTAGTTA CTGGTGGTGC CGGGTTCATC GGTTCGGCAT 3540

TAACGCGATA CATTATTAAC TCAACCAATG ACTCTGTTGT GAATGTTGAT AAGTTAACCT 3600

ACGCAGGTAA TCTTCATTCT TTAAAGGACA TTGATAATTG CGATCGTTAT GTTTTTGTTC 3660

ATGCTGATAT TTGCGATGCG AAAGCATTAG ACGCAATCTT ATCAACACAT AAACCTGATG 3720

CAGTAATGCA TTTGGCAGCA GAAAGTCATG TTGACCGTTC AATCACCGGC CCTGCTGCGT 3780

TTATTGAAAC GAATATTGTT GGAACATACG TTTTGCTTGA AGCAGCCAGA AAATACTGGC 3840

AAACCCTAGA GGGGGAAAAG AAACAGGGAT TCCGTTTCCA TCACATTTCT ACTGATGAAG 3900

TATATGGTGA TCTCCCTCAT CCGGATGACT GGGATAATAA AAATAGTCCA CCACTGTTTA 3960

CTGAGAATAC CGCATATGCT CCTAGCAGTC CATACTCTGC CTCTAAAGCA TCAAGCGATC 4020

ATTTGGTTCG CGCGTGGCAT CGTACTTATA ATCTCCCAAC TATTGTGACT AACTGTTCAA 4080

ACAATTATGG TCCTTACCAT TTCCCAGAAA AGTTAATTCC GCTGGTGATC CTTAATGCGT 4140

TGCAAGACAA ATCTTTGCCA ATTTATGGCA AAGGCGATCA AATCCGTGAT TGGTTATACG 4200

TTGAGGATCA TGCTCGCGCA CTCTATACCG TTATCACGAA AGGTATCGTA GGTGAAACTT 4260

ACAATATCGG CGGTTATAAT GAGAAAAAGA ATATTGAAGT GGTAGAGACT ATTTGCGATA 4320

TCCTTGACGA AATAAAGCCG AAAAATACCT CGTATCGCGA ACAAATCATT TATGTTGCCG 4380

ATCGCCCAGG TCACGATCGC CGCTATGCCA TTGATGCCAG TAAAATCACT CTGGACCTCG 4440

GTTGGAAACC TCAAGAGACC TTTGAATCTG GTATTAAGAA AACTATTCAT TGGTATCTTG 4500

ATAACCAGGA GTGGGTCCAG AATGTTATGA GCGGTGCCTA TCAGGACTGG ATTAACAAAA 4560

Orf3的终止 Orf4的起始

ATTACGGGCA ACTT TAATCT TTTCAACTCT GTCATAAGAA GCATTGAAC A TGTCAAAAAG4620

AAAAGGAATT ATTTTAGCCG GTGGTTCGGG TACTCGCCTT TACCCCGTGA CGATGGCGGT 4680

TAGTAAACAG CTGCTGCCAA TCTATGATAA ACCGATGATT TATTATCCAT TAAGCACGTT 4740

GATGCTTGCG GGTATTCGGG ATATTCTCAT CATTAGCACA CCTCAGGATA CCCCTCGCTT 4800

TGAGCAATTA CTTGGTAACG GTGAAAAATG GGGGCTGAAC ATCGAATATA AAGTCCAGGA 4860

AAGTCCTGAT GGTCTTGCCC AGGCATTTAT AATTGGTGAA GAATTTATCG GTAACGATTC 4920

TTGTGCTTTA GTCCTCGGCG ACAATGTTTT CTATGGTCAC GATTTGCCAA AAGAACTTGA 4980

AATAGCAATG AATCAGGAAA AAGGTGCTAC GGTCTTTGCC TACCATGTTA AAGACCCTGA 5040

ACGCTATGGT GTGGTAGATT TCGATGAGAA TGGCAAAGCG CTTTCTTTAG AAGAGAAACC 5100

GCTGAAACCA AAAAGTAATT ATGCTGTGAC TGGGCTCTAT TTTTATGATA ACGAGGTCAT 5160

TGAGATGGCT AAACAACTGA AACCGTCAGC TCGCGGTGAA TTAGAAATCA CTGATATTAA 5220

TCGCCTCTAC CTGGAAAAAA ACTCGCTCTC AGTTGCTATT ATGGGCCGTG GCTATGCCTG 5280

GCTTGATACA GGTACGCATG AGAGTCTTAT TGAGGCGGGT AACTTTATTC AGACGATCGA 5340

ATCACGTCAA GGACTCAAAG TTTCTTGCCC GGAAGAGATT GCTCTCCGTA AAGGTTTCAT 5400

TGATAAGAAA CAGCTTGCAA AATTAGCCAA AGAACTCAAT AAAAATGATT ACGGTAAATA 5460

Orf4的终止 Orf5的起始

TTTGCAGCAT TTAGCCAAAG AT TAAAAATT AACATTAATT AGTTAACACA T ATGAAAATT5520

ATAGAAACTC CTTTGAAAGA TGCTGTTATT ATCGAGCCTA AAATTTTTGG TGACGAACGA 5580

GGCTATTTTT TTGAAGTCTA TCAGAAAAAA CGTTATCAGG AATTGGGATT CGCTCTGGAA 5640

TTTGTACAGG ATAATCGTTC CAAATCGACT AAAAATGTCC TGCGAGGGCT TCATTTTCAG 5700

AAAACAAAGC CTCAGGGAAA ACTAGTTTCA GTAACCCAGG GGGCTGTTTT TGATGTTGCC 5760

GTTGATCTCC GTCCAGAGTC ACTGACATTT GGTCAGCATC ATTCAGTTAT TCTATCCGAA 5820

GAAAATTTTC TTCAGTTTTA TATTCCTCCA GGTTTCGCTC ATGGTTTCTG CGTATTAAGT 5880

GACACTGCTA GTTTCCAGTA CAAATGCACT GATTATTATG ATCCAACCGA TGAAAGCGGT 5940

CTTATCTGGA ACGATCCCGA TCTGGGCATA GAATGGCCTG TTTCTCATCC TGTAGTTTCT 6000

GCTAAAGATT GTTTTTTACC TTCACTAGCA AGTATCAAAG AACAGATTCT TAAAGGCTGG 6060

Orf6的起始Orf5的终止

AAAA ATGTC T AAGTATACAA TTATTGGCGG TAACGGTTTT ATTGGTTCCC ATATCGTTAC6120

ATTGCTAAAA GAACAAGGGC ATAATGTCGT TGTTCCCGAT CGTAATAGCT GCAATTCCCT 6180

AAATGGTGAG TTAGGTAAAA TTATTTATTG TGCTGGTAAT GGTGATTGTG CGGAAAGCTA 6240

TTTCTCTGTG CTGGAAGCAA ATACAGTTTT GTTGGCAAAG TTACTGAAGA ATGCACAGTT 6300

TGAAAAGCTG GTATATATTT CCTCAACTCG AGTTTATATG AACCACCATA GCGCAAATGA 6360

AACTGATGAT CTGCTAGTAA CAGCGGGTGA TAACAGGAAG CTTTTTAACC TGACCAAACT 6420

GGTGGCTGAG GAGCTGTGTA TTAAGAGCGA ACGTGATGTT ACTGTGGTTC GACCAAGCAA 6480

TGTCTATGGT TTAGCTCTTA ATAGTAAATT ATTTCTTCCG TCTATTATCC GTCATGCCAT 6540

TAACAATGGT GAAATCAACA TGTTTGTTGC ACCTGAATAT GCTAAGGACT ATGTTTCAGT 6600

CAATGATGTT GCTAAAGCAT GTGTGTGGCT AGCTGAAAAA CAAAACACCA ACAAAGAAAT 6660

ATATAATGTC GCATCTGGAT TTAACGTAAC AGCTAAACAA ATCACTGATG TCATCGAAAA 6720

AGAAACGGCT TGTAAGGTAA ACTGGCATGA TGGTAATTTC CCTCGTGAAG AGTTTCCTGT 6780

TACTAACATA AATAAATTAA CTAATGAGAT TCCGGATTAT AAACCACAAC ATGTGCTTGA 6840

Orf6的终止Orf7的起始

TGATTTGAAA ATGATGATAG CTAGTTATAA AGAAGAACTG GCGAGA TAAA T ATGAGTGGT6900

TTTAAGCGGT TACTTAAAAA CTCTTTGTCT AATATAATAA ATGGATTTTC AAATGTAATT 6960

CTTGGAATAG TGATCTCTCC AGTTTTACTG CATAATCTTT CAAAGGTAGA TTTTTCTATT 7020

TGGTCCCTTA CAATTCAGGT TGGGGTTTTG ATCGGTATTT TTGGCATTGG TCTTCAGGTT 7080

ACAGTAGGGC GTTTTGTCGC CCTTCATTTA AATAATCAAC AGAAACTTCA AAAGACAATG 7140

CATCAGTCAT TGTTTTTTGT GTTACTGCTC AGTTTGGTAT GTATGGGGGG AATATTCTTT 7200

TTAGCAAAAT TCTTTTTCTC ATTTTTCCCT GAAGTATCAG AAACCAGTAC TAATGCTAAG 7260

CACATTCTTA TATTAATTGG TGGTTCATTT GTTATTAATA ATATGTTCTC TCCCTTCGTT 7320

GGCTATTTTA CTGGTATTGA GCGTAATGAT ATAACAGCTG GCATAAATAT ATTGTTTAAA 7380

GTAATTCTGG GTACGTCGAT TCTGTTGCTT GTCCACCATG GTCTTGAAGT TATTGCATGG 7440

ATTTATTTTG CAATAAACAC TTTTAATCAA CTTGCTTTTT ATATTTTATA TAAATTAAAA 7500

AACAGAACTC AAAAAATAAA GTTATCACTA GATAAAAATT TATTTCGAAC TATAGTTGTC 7560

TTTTTTAGCG GACTCTTGGT ATGGAATATT GCCCAGTTCT TAATTTCTGG TATAGGCACC 7620

TTTATCGTCG GTAAATATTC ATTTCAGGAG CTCGCTGGTT TTGCCGTATT AATGACACTT 7680

GTTAATGCTG GTGTGGGAAT TTTGGGAGCA ATGATCAATC CTATAATTCA ACCTATGATA 7740

AGGATGCACA ATCTGGAGAA TAACCATCAT GTTGAACTTC TGGTCAACAA ACTGATCTTC 7800

ATTTTCTCAA TGATTGCCTT TATTGGTGTT TTTATTGCCT GGTTTGCCTC TGTATATATT 7860

CTTGGCGTCT GGTTGGGATA TCAGCAAGCA ACAAACCTGC ACATTATGTT TTCTTTGCTG 7920

CTTACTGCTT ATCTTATTAG AATGATTGCA GCGCCCTATG GGCTTATGTT AGTCGCTTAT 7980

GGCAAACAAT TGTCAATCGC TTGGCTTCCG GTGCTCGAAG GGGTATTGAA CTTTGCGTTA 8040

TCGATTTTCT TTGTGCGTAT ATATGGTGCC ATTGGAATTG CCTACTCGAC GTTTATTTCA 8100

GGCGTATTAA TCATGGCTGT TTACGCTTGC AAGTATCAGG CTGAAGCTGA GTATAAGTCG 8160

AAACTGATAT TTACCTCGTT TCTGATAATA CCTATGATGA TAGCCATTTG CCTGATCAGT 8220

TTGGTGATGA CTCAGTCGGA AATCATCCAT TGTGTTATTT ATGGCATCCA GGTGGCTTTT 8280

ATAATAGTAT TTATTATCTT CTTAATAAAA CAAGTAAAAA GCATCAAGAA TCTGTTAAAT 8340

Orf7的终止 Orf8的起始

CAATAC TAAT ATTGCTATGG TGAAA GTGTG AAAAAAGTTG GACTCGTTAC TGTTTTGTTC8400

AATTCTCCAG GTGTGCTTCC TGAATTTTAT TCGAGTGTTG AAAAACAAAA TTATCAGAAC 8460

AAGCATCTTT ATATTGTAGA TAACAGCACT AATCAGGATT CTTTTAACTT AACGCAAGAA 8520

ATTCTCTTAG GAACAGACAT AAAGTATACC TATATTAATA ATGAAGGAAA TAATGTTGGG 8580

GTTGCACATG CCAATAACCA AGGCATTGAA CAAGCTTTAA AAGATGGGTG CGAGTATATA 8640

TTGCTCACTA ATAATGATCT GTTTTTTCAA CAGGAAGATA CTATCAGCAA AATGATTAGT 8700

GTTGCTGAGG GACGACAATG TAAAATTGTT TCACCTGTCA TATTAAGTTA TCCAGAAAAA 8760

AAAGTTTGGT ATGCAGGTGC ATTTTTTAAT AAGAAAGAAG CTACGGCACC TCATATTTTT 8820

GAAGGAGTCA ACTACAATGA TATTTGCGCT CATATTCCAA AAGAGTGCGA TTACGCACCA 8880

ACATGTTTTT TACTTGTCCA TGCTTCGGTG TTTACCACTA TAGGTATGAT GGATTCTCGT 8940

TACTTTGCTT ATTACGACGA TACTGATTTT CTCTATCGTG CAAACATAGC CGGCACTCGG 9000

GTAACAATTA TTAATGAACC TCTAGTGTTT CATAAAGTTA GTACTTCTAC CGGAGGAGGG 9060

TTAAGTGTAT TCGGCGCATA TTATTTAACG AGGAACCGTA TATTTTTCGC CAGAAAAAAT 9120

ATTGAAACAC CTTATTGTAT TATTAGTATT TTCTTTACCA TTGCGACCCG TTTGGTTTAT 9180

CCTCTTTTCC ACAAAACACC GTATAAAGTA TACAAGGCTT TTGTTAAAGG AATTATCGAC 9240

Orf8的终止 Orf9的起始

GGCCTAATGT TAAAAAATAA A TAACTAAGG GGTTAAG GTG AACGAGATTT CCAGTAGCAC9300

ACTTGTCAAT AACTATAATT TATCGACAAC TTTTATTGTC AAGTCACTTG TTGGATTGTT 9360

ATTAATTAAT TCTCTTTTTA GTGGTGTTGA CTTTTATCAG ATTGGTTTGA TGAAAGGCCT 9420

TTCCAGTATT GCTGATTTTG GCCTGAAGAT TATCCTTGTG TTCGTATTGC TCGTGCTTTT 9480

CAAGATTCGC AGTTTTAACT TGGTAAAGAT ATTCTTTTTT GCTTTTATGC TTCTCATCGG 9540

TGCTGCGCTT GGAGCATTCT ATCATGGTGC TGAATATGAT AAAACTTTTG CGCTTTTACT 9600

AAATATGATA TTATGGTTTG TTATATTCAG TTATGCTAAA GAACTTGAAC ATAACTTTGA 9660

TATATATCGT TTTAGTGTAA AAATATCAAG TTTATTTCTT GGTATCACGT TGATACTTTA 9720

CATCATGGCA AAGTTTGGTT TTCATGTTAA AGTATTAGGT GGAGCTTGGT TATATGATGA 9780

GAATTTTCGC TTTGCAGGTA CTTTCTCTGA GCCAAGTTTA AATGGCTATT ATTATGGTTT 9840

AATGTTCTTG ATGGTCATGC TGTCTAATCA AAAGTACAGA CTAATTTTGG CGTTTGTGTT 9900

TGCTATTACT ACCTATATTT CAGGTGCGAA ATTTTCATTC CTAATAATAC CAGTGCTCCT 9960

TGGGCTGGTT TATTTCTTCA AGGTGAAAGG CTTTTATAAT TATACATACC AGCTCATTCC 10020

GTTATCTTTT ATTGTTCTTT TTGTTAGTCT TGCGTTCATC TACTATGACC TTTTTGCACT 10080

GATTGCAGCT CATTTGTCAA ATTCTGAAAC AATGACTTAT GTTACTCGTC TTGGGTTCCC 10140

AATTGTCAGC ATCTGGCATC TTAGTGATTA TCCATTAGGA AGTGGAGTAT ATGGCTTTAA 10200

GAGCACGCTA TCACCTTTTA TACAGAACTA CTGTCAGGCT CTTTCTGGTC TGGACGTAAA 10260

TTGTAACGAG ATGAGGTCCT ATATATCCTC GGATGATCCC AGTGCATATG AAAGTTTCGC 10320

GCCTAAAGAT GTTTTAAGTT TCATTATATT AAGTTTTGGG CTTCCGGGCT TGCTTGTGTT 10380

TGTCCTGAGT ATATCCTTAT TATCAGCTAG ACTTAAGGAA AATAAGAATT ACTTTATCAT 10440

TCTAATGTAT ATTGTCGCAT CAATGCTCTT TACATTACCT TTTAGATTTA TTCTTTTTTA 10500

Orf10的起始Orf9的终止

TTCTTTCTTC ATGTTTCAGT GTTATATTTA CAGAATGCCG AGTAATAA AT GATCTATATT 10560

AATGCAAGAT TCTTGACTCA GCGTAAAACC GGTGTGCAGC AATATGCATT AGTTTTATGC 10620

CGGGAACTCG TTAAACACAT TCCTGATATC TGTTTTTTGA CACCGAAAAC TGATCTCATT 10680

GATGAGAATT GGCGGGACGA GTTTAATATC CTTCAAATAG GAAATCGTAA TGGACATTTT 10740

TGGGAACAAA TCGAACTCCC TCGTTATCTA AGAAGCGTTG GTAATCCGTT GCTGCTCTGT 10800

TTTACTGGCT TATCACCTGC TTTTTATAAA AATTGTTACT TTACTATCCA TGATATGTCA 10860

TTGTACGCAC ATCCCAAGTG GTTCCGTTTG TTATATCGTG CAGTATACAA GGTTAACTAT 10920

GCTATTCAGG CAAGATTCGC TAGAGGTATC TTCACGGTTA GTGATTTTTC GAAATCAGAG 10980

ATAGAGAAAT ATCTGGCGGT AGACTCTGAC AAGATCACTG TATTACGAAA TTCAGTAGAC 11040

ACATCTATTA ATATCAAGAA TAATATTGAA AATAAAGCGG TTAGGCGTAA AGAGATTTTA 11100

TTGGTTGGTA CCTCAGAACC TAGAAAAAAT ATAGAGTTTA TTATTAATTC TTTTTTAAAT 11160

TCGCAAATCA AAGGTTATAA GCTCATCGTT GTTGGAGGGT TAGGAGCTGC TTTCTCAAAG 11220

GTGACTTTTT CTCAGCATGA GAACATTATA TTCTGTGGCT ATCTATCAGA CGATGACTTA 11280

GAGTTAAAGT ATAGACAAGC TTCAGTTTTT GTCTATCCTT CACTGTATGA AGGTTTCGGC 11340

CTTCCTCCAC TTGAAGCGAT GCAACGTGGC TGTCCCGTAA TGGCTTCTGA CCGCGCAAGC 11400

ATCCCTGAAG TTTGTGGTGA TGCTGCTTAC TATTTCAATC CAGAGGACTC ATCAGATTTT 11460

AGTAGTAAGT TACGTGAGCT GATCGAAAAT TATGATGAGC TCAGCCCTGT ATTGATTTGC 11520

AATGGATATC GTAGACTGGA ACAATTTGAC GTACGGGATG TTGCATCGAA ACTTATGGAT 11580

Orf10的终止Orf11的起始

GTCATCTCTC AAAGGAATAT T TGAATGAAG GTTTTACAAT TTAGTAAATT TTATCCTCCA 11640

GTACACGGGG GAATTGAGCA GGTTGCATTT GATATTAGCG AAGGAATTAC AAAAAGTAAT 11700

GGTCAGCCTG TTGACGTTCT CTGTGTTGAT CCTATTGGGG AAAGAAAAGA CGACGGAAAG 11760

TTTCGTTATA AGGTTTACCG CCAGAAATTG TTTGCACAGC TTTTCTCGAC ACCGCTATCT 11820

TTCTCCTTGA TTTTACGCTG GAGAGCGATC AGAAATAACT ATGATGTTAT TCACGTTCAT 11880

CTTCCAAATC CAATGGCTGT GTTGGCGCTT TTTTTATTTC CACCAAAAGG AAAAATAGTT 11940

CTCCACTGGC ACAGCGATAT TGTTAAGCAA AAAAAACTAT TATTGCTTTT TGCGCCGTTG 12000

CAAAAATGGA TTTTAGATAA ATGTACCTGT ATTATAGTTA CAAGTCCTGT TTATGGGCAG 12060

TCTTCTCCAA CTTTGCAACC TTATCAGGAT AAAATTGTTT GTATTCCTAT TGGAGTTGAT 12120

ACTCATGTTA TGCCGCTAAA TGATGAGCTT GAAAAAAGTA TAAAAAAACG CTATCAAAAT 12180

AAAAAGATAG TTTTTTCTCT TGGGCGTCTT GTTTATTACA AAGGTATGGA ATATCTGATT 12240

GATGCTGCGA AGGAGCTTCC TCCGGATTAC ATTGTTCTTA TTGGTGGAAC AGGCCCACTA 12300

ATTGACACAT TAAAGCAAAA GGTTGCTAAT GATGGATTGT CAGATAAAGT CGTTCTTCTT 12360

GGTAGCATCA ATTATTCGGA TTTAGCATCC TATTACAAAT CATGCGACGT TTTTTGTTTG 12420

CCATCTATTC ATGAATCTGA AGCATTTGGT GTAGTCCAGT TAGAGGCTAT GAGTTTCTCC 12480

AGACCGCTTG TGTCGACAAA TATTCCCCGA AGTGGCGTGG CTTGGGTTAA TCAGCATAAC 12540

GAGACTGGTA TTGTTGTTGA GCCTAATGAT GCCAAAGCAC TTGCTAAAGG TATAGTTTCT 12600

GTTGTTCAAA ACAGTGCAAC GTTTAGTAAA GGCGCTAAGG CCAGATTTGA TACCATGTTT 12660

Orf11的终止

ACTAAAGAAT TGATGGTTAA AAATATAATT AATTTATATT CATCTTTAAA G TGAGTGCAA 12720

Orf12的起始

TT ATGCCATT ATTTCCTGTT GTTATGGTCG GAGGCTCTGC TAGTCGTTTA TGGCCGCTTT 12780

CTCGTGTTCT CTATCCAAGA CAATTTCTTT GTCTGGAAGG TGAACTGACT ATGTTACAAG 12840

CGACAATACA CCGACTGCAG GGCATCGTGT GTGAAAGTCC TGTCGTTATT TGTAATGAAC 12900

AGCACCGCTT TATTGTTGCT GAGCAACTTC GCCAGATGAA TAAACTCACC GAGAATATTA 12960

TCCTCGAACC GATTGGTCGT AATACTGCTC CGGCGATAGC GTTGGCTGCA CTAGCCGCAA 13020

CTCGTGCCCA GCCCGAAGGT AAGGCGCTCA TGCTGGTTCT TGCCGCCGAC CACGTCATAA 13080

AAAATGAAGA AGCATTCCGT GATTCCGTTC GTAAGGCGCT TCCTTATGCT GAAAATGGAA 13140

AGCTTGTGAC ATTTGGTATA GTCCCGAATA AAGCAGAGAC TGGCTATGGT TACATTCGCC 13200

GCGGTGTGCC GTGCGATGGT GTTGAACATG CAGATGCATT CGACGTCGCG CAATTCGTTG 13260

AGAAACCTAA TCTTGAAACG GCTGAAGCCT ACGTTTCCTG CGGTGAATAC TACTGGAATA 13320

GTGGGATGTT CCTGTTCCGC GCCGATCGCT ATCTTGAGGA ACTAAAAAAA TACCGCCCGG 13380

ATATTCTTGA AGCATGCGAA AAGGCAATGA GTGCTGTTGA GCCTGACCTT AATTTTATTC 13440

GCGTTGATGA AGATGCTTTC AGGGCTTGTC CTGATGAGTC AGTTGACTAT GCTGTGATGG 13500

AGCAGACTTC CGATGCTGTT GTTGTGCCAA TGGATGCGGG CTGGAGTGAT GTCGGTTCCT 13560

GGTCTTCGCT ATGGGATATT AGCCATAAGA CGCCAGAGGG TAATGTCGTC ACAGGTGATG 13620

TATTATCCTG CAATACCAAA AACAGCTTCC TGTATTCTGA ATCAGGGCTT TTGACTACAG 13680

TTGGCGTGAA AGATTTGGTT GTTGTGCAGA CTAAGGATGC TGTATTGATT GCCAATCGTA 13740

ACGCCGTTCA GGATGTGAAG AAAATAGTCG AATCGATAAA AGCTAACGGG CGCCACGAAC 13800

ATCATACTCA TCGCGAAGTT TGTCGTCCCT GGGGTAAATA TGACTCGATT GATACCGGGA 13860

GCCGTTATCA GGTTAAGCGA TTGACGGTAA AACCAGGTGA AAGTATCTCA CTTCAGATGC 13920

ATCACCATCG TGCTGAGCAT TGGATTGTCG TCGCAGGAGC TGCACAAGTA ACAATTAACG 13980

AACAAACTAA ACTCCTCGGT GAAAACGAGT CTATCTATAT TCCTGTTGGG TCAACACACT 14040

GTCTGGAAAA TCCTGGAAAG ATCCCTTTAA AACTGATTGA GATTCGCTCA GGTTCTTATC 14100

Orf12的终止

TGGGAGAGGA TGATATTGTT CGTCTGACAA AGAAGCGTTA CAAAATAGAT GAC TAATAA A14160

Orf13的起始

TGAAAAAATT AACCTGCTTT AAAGCCTACG ATATTCGCGG GAAATTAGGC GAAGAACTGA 14220

ATGAAGATAT TGCCTGGCGC ATTGGTCGCG CCTATGGCGA ATTTCTCAAA CCGAAAACCA 14280

TTGTGTTAGG CGGTGACGTC CGCCTCACCA GCGAAACCTT AAA CTGGCG CTGGCGAAAG 14340

GTTTACAGGA TGCGGGCGTC GATGTGCTGG ATATCGGTAT GTCCGGCACC GAAGAGATCT 14400

ATTTCGCCAC GTTCCATCTC GGCGTGGATG GCGGCATTGA AGTTACCGCC AGCCATAACC 14460

CGATGGATTA TAACGGCATG AAACTGGTGC GCGAAGGGGC TCGCCCGATC AGCGGTGATA 14520

CCGGACTGCG CGATGTCCAG CGCCTGGCTG AAGCCAGCGA CTTTCCTCCC GTCGATGAAA 14580

CCAAACGCGG TCGCTATCAG CAAATCAACC TGCGTGACGC TTACGTTGAT CACCTGTTCG 14640

GTTATATCAA TGTCAAAAAC CTCACGCCGC TCAAGCTGGT GATCAACTCC GGGAACGGCG 14700

CAGCGGGTCC GGTAGTTGAC GCCATCGAAG CCCGCTTTAA AGCCCTCGGC GCACCAGTGG 14760

AATTGATCAA AGTGCACAAC ACGCCGGACG GTAATTTCCC CAACGGTATT CCTAACCCGC 14820

TACTGCCAGA ATGCCGCGAC GACACCCGCA ATGCGGTCAT CAAACACGGC GCGGATATGG 14880

GCATTGCCTT TGATGGCGAT TTTGACCGCT GCTTCCTGTT TGACGAAAAA GGGCAGTTTA 14940

TCGAAGGCTA CTACATTGTC GGCCTGCTGG CAGAAGCGTT CCTCGAAAAA AATCCCGGCG 15000

CGAAGATCAT CCACGATCCG CGTCTCTCCT GGAACACCGT TGATGTGGTG ACGGCCACAG 15060

GTGGCACCCC GGTAATGTCG AAAACCGGAC ACGCCTTTAT TAAAGAACGT ATGCGCAAGG 15120

AAGACGCCAT CTACGGTGGC GAAATGAGCG CCCACCATTA CTTCCGTGAT TTCGCTTACT 15180

GCGACAGCGG CATGATCCCG TGGCTGCTGG TAGCCGAACT GGTGTGTCTG AAAGGAAAAA 15240

CGCTGGGCGA ACTTGTGCGT GACCGGATGG CAACTTTTCC AGCAAGTGGG GAAATTAATA 15300

GCACGTTGGA AGATCCATTA TGTGCTATCG CACGGGTTGA AAGTTATTAT GCAAATAAGG 15360

CAATTGAGAT CGATCGTACA GATGGTATAA GTATGACTTT TAATGGATGG CGCTTTAACC 15420

TACGTTCTTC TAACACCGAA CCGGTGGTGC GGTTGAATGT TGAATCGCGC GGTGATGTGC 15480

Orf13的终止

CGCTGATGGA AGAAAAGACA AAACTTATCC TTGCGTTATT GAACAAG TAA TTCAGTAATT 15540

TCATATAAAT AAGTTTTAAA AGACGGAAAA GATGAGATAT TCAGTGTGGT ATAGCAAAGG 15600

TAATGCTATT CACCATCTCT ATGAGTGAGT TAACATCTAT ACCACATTTA AGCCGCACAC 15660

TCGGCGGTGA CCACCCCTGA CAGGAGTAAA CAATGTCAAG GCAACAGATC GGCGTCGTCG 15720

GTATGGCAGT GATGGGGCGC AACCTTGCGC TCAACATCGA AAGCCGTGGC TATACCGTCT 15780

CTATTTTCAA CCGTTCCCGT GAAAAGACGG AAGAAGTGAT TGCCGAAAAT CCAGGCAAGA 15840

AACTGGTTCC TTACTATACG GTGAAAGAGT TTGTTGAATC TCTGGAAACG CCTCGTCGCA 15900

TCCTGTTAAT GGTGAAAGCA GGTGCTGGCA CGGATGCTGC TATTGATTCC CTCAAGCCAT 15960

ACCTCGATAA AGGTGACATC ATCATTGATG GTGGTAATAC CTTCTTCCAG GACACCATTC 16020

GCCGTAACCG TGAGCTTTCT GCCGAAGGCT TTAACTTCAT CGGTACCGGT GTTTCCGGTG 16080

GTGAAGAGGG CGCGCTGAAA GGTCCTTCCA TCATGCCTGG TGGGCAGAAA GAAGCCTATG 16140

AACTGGTTGC ACCAATCCTG ACCAAAATCG CTGCAGTAGC TGAAGACGGG GAGCCATGCG 16200

TTACCTATAT TGGTGCCGAT GGTGCAGGTC ACTATGTGAA GATGGTTCAC AACGGTATTG 16260

AATACGGCGA TATGCAGCTG ATTGCTGAAG CCTATTCTCT GCTTAAAGGT GGCCTGAATC 16320

TCTCTAACGA AGAACTGGCA CAGACCTTTA CCGAGTGGAA TAACGGTGAA CTGAGCAGCT 16380

ACCTGATCGA CATCACCAAA GATATCTTCA CCAAAAAAGA TGAAGACGGT AACTACCTGG 16440

TTGATGTGAT TCTGGATGAA GCAGCAAACA AAGGTACCGG TAAATGGACC AGCCAGAGCG 16500

CGCTGGATCT CGGCGAACCA CTGTCGCTGA TTACCGAGTC TGTGTTTGCT CGTTATATTT 16560

CTTCTCTGAA AGATCAGCGC CTTGCCGCGT CTAAAGTTCT CTCTGGCCCG CAAGCTCAGC 16620

CAGCAGGCGA CAAGGCTGAG TTTATCGAGA AAGTTCGTCG TGCGCTGTAT CTGGGCAAAA 16680

TCGTTTCTTA CGCTCAGGGC TTCTCTCAGC TGCGTGCTGC GTCTGAAGAG TACAACTGGG 16740

ATCTGAACTA CGGCGAAATC GCGAAGATTT TCCGTGCTGG CTGCATCATC CGTGCGCAGT 16800

以上仅是本发明较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡依本发明技术实质对以上实施例作修改、等同变化与修饰，均属本发明技术方案的范围内。

Claims

1、一种对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长16800个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。

2、按照权利要求1所述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其由命名为orf1、orf2、rmlB、rmlC、rmlA、tll、wzx、orf8、wzy、orf10、orf11、manC、manB的13个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。

3、按照权利要求2所述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述具有高度特异性的基因包括：转运酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因，包括wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf8、orf10、orf11基因；其中所述的转运酶基因是SEQ ID NO：1中的6892至8349碱基的核苷酸；所述的聚合酶基因是SEQ ID NO：1中的9278至10552碱基的核苷酸；所述的orf8基因是SEQID NO：1中的8368至9264碱基的核苷酸；orf10基因是SEQ ID NO：1中的10549至11604碱基的核苷酸；orf11基因是SEQ ID NO：1中的11605至12714碱基的核苷酸。

4、按照权利要求1或2所述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其还包括源于所述的wzx基因或wzy基因中的寡核苷酸或糖基转移酶基因，以及它们的混合或它们的重组。

5、按照权利要求4所述的对大肠杆菌O88的O-抗原高度特异的核苷酸，其特征在于，所述的源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的7772至7789碱基的核苷酸和8440至8457碱基的核苷酸，SEQ ID NO：I中的7819至7836碱基的核苷酸和8228至8245碱基的核苷酸；所述的源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的10165至10182碱基的核苷酸和10467至10484碱基的核苷酸，SEQ ID NO：1中的9753至9770碱基的核苷酸和10149至10166碱基的核苷酸。

6、权利要求1所述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、在诊断中鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原的应用。

7、权利要求1所述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O88的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。

8、权利要求1所述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，检测细菌。

9、权利要求1所述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

10、权利要求1所述的对大肠杆菌O88的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，包括下述步骤：

(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O88，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清液，再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)的溶液抽提两次，取上清液再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清液用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中，基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；

(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库；反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1MMnCl₂，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行；酶切10分钟使DNA片段大小集中在1kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(2 5∶24∶1)溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中；随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃反应30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3′端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10^-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接24小时，总体积为90ul，其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶；最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用Bio-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O88的O-抗原基因簇文库；

(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1000bp以上的100个克隆由上海生物工程有限公司用ABI377型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到80％的覆盖率，再通过将相联系的序列进行反向测序及测通得到剩余20％的序列，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。

(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O88的O-抗原基因簇中wzx和wzy基因设计引物；在每个基因内各设计两对引物，每对引物分布在相应基因内不同地方以确保其特异性；用这些引物以166种血清型的大肠杆菌和43株志贺氏菌基因组为模板进行PCR，所有引物在大肠杆菌O88中得到阳性结果，在其他组中没有扩增到任何大小正确的带，也就是，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，虽在少数组中得到PCR产物带，但其大小不符合预期大小，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O88及其O-抗原都是高度特异的。

(7)引物灵敏度的检测：将大肠杆菌O88的冻存菌液接种到有LB培养基的三角瓶中，30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时至饱和，取培养好的菌液稀释，取稀释菌液涂布LB琼脂平板，30℃至40℃，培养数小时计数，计算原液中活菌浓度；在5份重量均为20g的生猪肉馅中分别掺入5×10³，5×10²，5×10¹，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入LB培养基，过滤，过滤液于30℃-40℃培养，180至250转/分，培养数小时；从培养好的菌液中取数ml于6,000g离心数分钟，去上清，加MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100℃沸水中煮数分钟，裂解液于12,000g离心数分钟，取上清做为PCR模板；用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O88的灵敏度。