CN1702081A - 对大肠杆菌0108型的0－抗原特异的核苷酸 - Google Patents

对大肠杆菌0108型的0－抗原特异的核苷酸 Download PDF

Info

Publication number
CN1702081A
CN1702081A CN 200410094099 CN200410094099A CN1702081A CN 1702081 A CN1702081 A CN 1702081A CN 200410094099 CN200410094099 CN 200410094099 CN 200410094099 A CN200410094099 A CN 200410094099A CN 1702081 A CN1702081 A CN 1702081A
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
nucleotide
antigen
intestinal bacteria
type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN 200410094099
Other languages
English (en)
Other versions
CN100359016C (zh
Inventor
王磊
刘丹
冯露
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tianjin Biochip Corp
Original Assignee
Tianjin Biochip Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tianjin Biochip Corp filed Critical Tianjin Biochip Corp
Priority to CNB2004100940992A priority Critical patent/CN100359016C/zh
Publication of CN1702081A publication Critical patent/CN1702081A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100359016C publication Critical patent/CN100359016C/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供一种对大肠杆菌O108型(Escherichiacoli O108)的O－抗原特异的核苷酸，它是大肠杆菌型中控制O－抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长21225个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸；还包括源于大肠杆菌O108型的O－抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因的寡核苷酸；本发明通过PCR证实寡核苷酸对大肠杆菌O108型的O－抗原都有高度的特异性；本发明还公开了用本发明的寡核苷酸检测和鉴定大肠杆菌O108型的方法。

Description

对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸
技术领域
本发明涉及大肠杆菌O108型(Escherichia coli O108)中控制O-抗原合成的基因簇的核苷酸全序列，特别是涉及大肠杆菌O108型中控制O-抗原合成的基因簇中的寡核苷酸，可利用这些对O-抗原特异的寡核苷酸快速、准确地检测人体及环境中的大肠杆菌O108型并鉴定这些致病菌中的O-抗原。
背景技术
O-抗原是革兰氏阴性细菌脂多糖中的O特异性多糖成分，它由许多重复的寡糖单位组成。O-抗原的合成过程研究得较清楚：先由糖基转移酶将核苷二磷酸单糖转移到一个固定在细胞内膜的脂分子上，然后在内膜的内侧合成寡糖单位，O-抗原的寡糖单位再通过转运酶被转移到内膜外侧，而后通过聚合酶聚合成多糖，再被连接到一个糖脂分子上形成脂多糖分子[Whitfield，C.(1995)“Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens”.Trends inMicrobiology.3：178-185；Schnaitman，C.A.and J.D.Klena(1993)“Genetics of lipopolysaccharidebiosynthesis in entericbacteria”.Microbiological Reviews，57(3)：655-682]。编码负责O-抗原合成的所有酶分子的基因一般在染色体上相邻排列，形成一个基因簇[Reeves，P.R.，et al.(1996)“Bacterial polysaccharide synthesis and genenomenclature”Trends in Microbiology，4：495-503]。在志贺氏菌、大肠杆菌和沙门氏菌中，O-抗原基因簇位于galF和gnd基因之间[Lei Wang.et al(2001)“Sequence analysis of four Shigella boydii O-antigen loci：implicationfor Escherichia coli and Shigella relationships”.Infection andImmunity，11：6923-6930；Lei Wang and Peter Reeves(2000)“TheEscherichia coli O111 and Salmonella enterica O35 gene clusters：geneclusters encoding the same colitose-containing O antigen are highlyconserved”.Journal of Bacteriology.182：5256-5261]。O-抗原基因簇含有三类基因：糖合成路径基因，糖基转移酶基因，寡糖单位处理基因，其中糖合成路径基因编码的酶合成O-抗原所需的核苷二磷酸单糖；糖基转移酶基因编码的酶将核苷二磷酸单糖及其它分子转到单糖上从而使单糖聚合成寡糖单位；寡糖单位处理基因包括转运酶基因和聚合酶基因，它们将寡糖单位转移到细菌内膜外侧，再聚合成多糖。糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因只存在于携带这些基因的基因簇里。O-抗原中单糖的不同，单糖间联结键的不同和寡糖单位之间联结键的不同构成了O-抗原的多样性，而单糖的组成、单糖间的联结键及寡糖单位之间的联结键是由O-抗原基因簇中的基因控制着，所以O-抗原基因簇决定了O-抗原的合成，也决定了O-抗原的多样性。
因为O-抗原是极强的抗原，是大肠杆菌重要的致病因素之一，同时它又具有极强的多样性，这启示我们能研究一种快速、准确地检测大肠杆菌及其O-抗原的特异性好、灵敏度高的方法。以表面多糖为目标的血清学免疫反应自上世纪30年代以来一直被用于对细菌的分型和鉴定，是鉴定致病菌的唯一的手段。这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面此法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，所以，现在普遍认为这种传统的血清学检测方法将为现代分子生物学方法取代。1993年，Luk，J.M.C et.al用沙门氏菌(S.enterica)O-抗原基因簇的特异核苷酸序列通过PCR方法鉴定了沙门氏菌的O-抗原[Luk，J.M.C.et.al.(1993)“Selective amplification of abequose andparatose synthase genes(rfb)by polymerase chain reaction for identification ofS.enterica major serogroups(A，B，C2，andD)”，J.Clin.Microbiol.31：2118-2123]。Luk，et.al的方法是将相应于沙门氏菌血清型E1，D1，A，B和C2的O-抗原内的CDP-阿比可糖和CDP-泰威糖的合成基因的核苷酸序列排列后得到对不同血清型的沙门氏菌特异的寡核苷酸。1996年，Paton，A.W et.al用对E.coli O111的O-抗原特异的源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定了一株产毒素的E.coli O111的血清型[“Molecular microbiological investigation of an outbreak ofHemolytic-Uremic Syndrome caused by dry fermented sausage contaminated withShiga-like toxin producing Escherichia coli”.J.Clin.Microbiol.34：1622-1627]，但是后来的研究表明Paton，A.W et.al的用源于wbdI基因的寡核苷酸鉴定E.coli O111的血清型的方法有假阳性结果出现。Bastin D.A.and Reeves，P.R.认为，这是由于wbdI基因是一个推测的糖合成路径基因[Bastin D.A.andReeves，P.R.(1995)Sequence and analysis of the O antigen gene(rfb)cluster of Escherichia coli O111.Gene 164：17-23]，而在其它细菌的O-抗原的结构中也可能有这个糖，所以糖合成路径基因对于O-抗原并不是高度特异的
志贺氏菌有46种血清型，但只有33种不同的O-抗原，大肠杆菌有166种不同的O-抗原[Reeves，P.R(1992)“Variation in O antigens，nichespecific selection and bacterial populations”.FEMSMicrobiol.Lett，100：509-516]，二者亲缘关系非常近，并且有12种是大肠杆菌和志贺氏菌共有的[Ewing，W.H.(1986)“Edwards and Ewing’s identificationof the Enterobacteriaceae”.Elsevier Science Publishers，Amsterdam，TheNetherlands；T.cheasty，et al.(1983)“Antigenic relationships between theenteroinvasive Escherichia coli antigens O28ac，O112ac，O124，O136，O143，O144，O152and and Shigella O antigens”J.clin Microbiol，17(4)：681-684]
发明内容
本发明的目的是提供了一种对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸。它是大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇中的核苷酸，是源于糖基转移酶基因和转运酶基因及聚合酶基因的特异的核苷酸。
本发明的次一目的是提供了大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列。
本发明的另一目的是提供了构成大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的基因：转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；聚合酶基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；糖基转移酶基因，包括orf13、wbuB基因。
本发明的又一目的是提供了寡核苷酸，它们分别源于大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇中编码糖基转移酶的基因包括orf13、wbuB基因；源于编码转运酶的基因即wzx基因或与wzx有相似功能的基因；源于编码聚合酶的基因即wzy基因或与wzy有相似功能的基因；它们是上述基因内的寡核苷酸，长度在10-20nt；它们对大肠杆菌O108型的O-抗原是特异的；尤其是表1中列出的寡核苷酸，它们对大肠杆菌O108型的O-抗原是高度特异的，而且这些寡核苷酸还可重新组合，组合后的寡核苷酸对大肠杆菌O108型的O-抗原也是高度特异的。
本发明的再一目的是提供的上述寡核苷酸可作为引物用于核酸扩增反应，或者作为探针用于杂交反应，或者用于制造基因芯片或微阵列，从而通过这些方法检测和鉴定大肠杆菌O108型的O-抗原及检测和鉴定大肠杆菌O108型。本发明的还一目的是提供了分离大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的全序列的方法。按照本方法操作可以获得其他细菌的O-抗原基因簇的全序列，也可以获得编码其他多糖抗原的细菌的基因簇的全序列。
本发明的目的是由以下技术方案实现的。
本发明对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于：其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长21225个碱基；或者所述具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸，其中包括命名为orf1，orf2，orf3，orf4，orf5，orf6，orf7，orf8，orf9，orf10，wzx，wzy，orf13，fn11，fn12，fn13，wbuB，wbuC的18个基因组成，位于galF基因和gnd基因间。
前述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸，其中所述基因中具有高度特异性的基因是：转运酶基因，其包括wzx基因；聚合酶基因，其包括wzy基因；糖基转移酶基因，其包括orf13、wbuB基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的11613至12815碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的12835至14073碱基的核苷酸；orf13是SEQ ID NO：1中的14124至15224碱基的核苷酸；wbuB是SEQ ID NO：1中的18517至19728碱基的核苷酸。。
前述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸，其中还包括源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf13、wbuB基因以及它们的混合或它们的重组。
前述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其中源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的11775至11792碱基的核苷酸和12638至12655碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的12344至12361碱基的核苷酸和12748至12766碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ IDNO：1中的13194至13213碱基的核苷酸和14012至14029碱基的核苷酸；SEQID NO：1中的13605至13623碱基的核苷酸和13940至13957碱基的核苷酸。
前述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。
前述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O108型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。
前述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。
前述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O108型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O108型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O108型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；
(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O108型的O-抗原的高度特异性；
(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O108，细菌计数后分别将5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O108的灵敏度。
前述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O108型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚。上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O108型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O108型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCAGGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O108型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O108型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center forBiotechnology Information，NCBI)的orffinder发现基因，找到8个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的结构；
(6)特异基因筛选：针对痢大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O108组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O108型的O-抗原都是高度特异的。
(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O108的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取lμ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的11775至11792碱基的核苷酸和12638至12655碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的12344至12361碱基的核苷酸和12748至12766碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的13194至13213碱基的核苷酸和14012至14029碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的13605至13623碱基的核苷酸和13940至13957碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg2+：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O108的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
也就是，本发明的第一个方面，提供了大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的全长核苷酸序列，它的全序列如SEQ ID NO：1所示，全长21225个碱基；或者具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。通过本发明的方法得到了大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示，它包括命名为orf1、orf2、orf3、orf4、orf5、orf6、orf7、orf8、orf9、orf10、wzx、wzy、orf13、fn11、fn12、fn13、wbuB、wbuC的8个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
本发明的第二个方面，提供了大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇中的基因，即转运酶基因(wzx基因或与wzx有相似功能的基因)；聚合酶基因(wzy基因或与wzy有相似功能的基因)；糖基转移酶基因(orf13、wbuB基因)。它们在O-抗原基因簇中的起始位置和终止位置及核苷酸序列都列在表4中；本发明尤其涉及到糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因，因为糖合成路径基因即合成核苷二磷酸单糖的基因现在被预示对较多胞外多糖是常见的、共同的，对细菌的O-抗原并不是很特异的，而本发明涉及到的糖基转移酶基因、转运酶基因和聚合酶基因对大肠杆菌O108型的O-抗原是高度特异的。
本发明的第三个方面，提供了源于大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇中的wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因和糖基转移酶基因，包括orf13、wbuB基因的寡核苷酸，它们是这些基因中的任何一段寡核苷酸。但是，优先被用的是列于表1中的寡核苷酸对，在表1中也列出了这些寡核苷酸对在O-抗原基因簇中的位置及以这些寡核苷酸对为引物所做的PCR反应的产物的大小，这些PCR反应可用表中的退火温度进行。这些引物除在第13组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O108型的O-抗原是高度特异的。
所述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法包括下述步骤：1)基因组的提取；2)PCR扩增大肠杆菌O108型中的O-抗原基因簇；3)构建O-抗原基因簇文库；4)对文库中的克隆测序；5)核苷酸序列的拼接及分析；6)特异基因的筛选；7)引物灵敏度的检测。
本发明的其他方面由于本文的技术的公开，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
如本发明所用，“寡核苷酸”主要指来源于O-抗原基因簇中的编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和编码聚合酶的基因内的一段核苷酸分子，它们在长度上可改变，一般在10到20个核苷酸范围内改变；更确切说这些寡核苷酸是源于wzx基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的11613至12815碱基的核苷酸)；wzy基因(核苷酸位置是从SEQ ID NO：1中的12835至14073碱基的核苷酸)；源于以上基因内的寡核苷酸对大肠杆菌O108型是高度特异的。
此外，有时两个遗传相似的编码不同O-抗原的基因簇通过基因重组或突变产生新的O-抗原，从而产生新的细菌类型，新的突变株。在这种环境中，需要筛选出多对寡核苷酸同重组基因杂交以提高检测的特异性。因此，本发明提供了一整套多对寡核苷酸的混合物，它们源于糖基转移酶基因；源于转运酶和聚合酶基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。这些基因的混合物对一个特殊的细菌多糖抗原来说是特异的，从而使这套寡核苷酸对这个细菌的多糖抗原是特异的。更具体地说，这些寡核苷酸的混合物是源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因中的寡核苷酸的组合。
在另一方面，本发明涉及寡核苷酸的鉴定，它们可以用于检测表达O-抗原的细菌和在诊断中鉴定细菌的O-抗原。
本发明涉及一种检测食品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O108型。可用PCR方法检测，更可将本发明方法中的核苷酸标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
本发明设计者考虑到以下情况：当单个的特异的寡核苷酸检测无效时，寡核苷酸的混合物能与靶区域特异性杂交以检测样品。因此本发明提供了一套寡核苷酸用于本发明所述的检测方法。这里所说的寡核苷酸是指源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶的基因和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的寡核苷酸。这套寡核苷酸对一个特殊的细菌的O-抗原来说是特异的，这一特殊的细菌O-抗原是由大肠杆菌O108型表达的。
另一方面，本发明涉及到一种检测排泄物中的一个或多个细菌多糖抗原的方法，这些抗原可以使样品能与以下至少一个基因的寡核苷酸特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交。这些细菌是大肠杆菌O108型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸分子标记后作为探针通过杂交反应如southern-blot或荧光检测，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
一般一对寡核苷酸可能与同样的基因杂交也可与不同的基因杂交，但它们中必须有一个寡核苷酸能特异性杂交到特殊抗原型的特异序列上，另一个寡核苷酸可杂交于非特异性区域。因此，当特殊的多糖抗原基因簇中的寡核苷酸被重新组合时，至少能选出一对寡核苷酸与多糖抗原基因簇中特异基因混合物杂交，或者选出多对寡核苷酸与特异基因的混合物杂交。甚至即使当一个特殊的基因簇中所有基因都独一无二时，此方法也能应用于识别此基因簇内的基因混合物的核苷酸分子。因此本发明提供了一整套用于检测本发明方法的多对寡核苷酸，在这里多对寡核苷酸是源于编码糖基转移酶的基因、编码转运酶和聚合酶的基因包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因，这套寡核苷酸对一个特殊的细菌多糖来说是特异的，这套寡核苷酸可能是糖合成中必须基因的核苷酸。
另一方面，本发明也涉及到一种检测源于病人的样品中的一个或多个细菌多糖抗原的方法。样品中的一个或多个细菌多糖抗原可以使样品能与以下至少一个基因中的一对寡核苷酸中的一个特异性杂交，这些基因是：(i)编码糖基转移酶的基因(ii)编码转运酶和聚合酶的基因，包括wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因。在条件许可的情况下至少一个寡核苷酸能与样品中的至少一个表达特殊的O-抗原的细菌的一个以上的那样的基因特异性杂交，这些细菌是大肠杆菌O108型。可用本发明中的寡核苷酸作引物通过PCR的方法检测样品，也可将本发明中的寡核苷酸标记后作为探针通过杂交反应，或者通过基因芯片或微阵列检测样品中的抗原及细菌。
更详细地说，以上描述的方法可以理解为当寡核苷酸对被使用时，其中的一个寡核苷酸分子能杂交到一个并不是来源于糖基转移酶基因、wzx基因或与wzx有相似功能的基因、wzy基因或与wzy有相似功能的基因的序列上。此外，当两个寡核苷酸都能杂交上时，它们可能杂交于同一基因也可能杂交到不同基因上。也即，当交叉反应出现问题时，可选择寡核苷酸的混合物来检测混合的基因以提供检测的特异性。
本发明者相信本发明不必限于以上所提的核苷酸序列编码的特定的O-抗原，而且广泛应用于检测所有表达O-抗原和鉴定O-抗原的细菌。而且，由于O-抗原合成和其他多糖抗原(如细菌胞外抗原)合成之间的相似性，本发明的方法和分子也应用于这些其他的多糖抗原。
本发明首次公开了大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的全长序列，而且可从这个未被克隆的全长基因簇的序列中产生重组分子，通过插入表达可产生表达大肠杆菌O108型的O-抗原，并成为有用的疫苗。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件。
实施例1：基因组的提取：
在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O108型，离心收集细胞。用500ul 50mM Tris-HCl(pH8.0)和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟。之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟。加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇抽(25∶24∶1)混合溶液提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，最后将DNA重悬于30ul TE中。基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测。
实施例2：通过PCR扩增大肠杆菌O108型中的O-抗原基因簇：
以大肠杆菌O108型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇。首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物(#1523-ATT GTG GCT GCA GGG ATC AAA GAA AT)，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物(#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCGC)；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环。最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性。合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物。
实施例3：构建O-抗原基因簇文库：
首先是连接产物的获得：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库。反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行。酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应。合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)混合溶液抽提一次，再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中。随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾。此混合物经等体积氯仿∶异戊醇(24∶1)混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul。其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶。最后用1/10体积的3M NaAc(pH5.2)和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物。
其次是感受态细胞的制备：参照Bio-Rad公司提供的方法制备感受态细胞大肠杆菌DH5α。取一环大肠杆菌DH5α单菌落于5ml的LB培养基中，180rpm培养10小时后，取2ml培养物转接到200ml的LB培养基中，37℃250rpm剧烈振荡培养到OD600 0.5左右，然后冰浴冷却20分钟，于4℃ 4000rpm离心15分钟。倾尽上清，用冷的冰预冷的去离子灭菌水200ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。再用冷的冰预冷的去离子灭菌水100ml吹散菌体，于4℃4000rpm离心15分钟。用冷的冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，4℃6000rpm离心10分钟，弃上清，最后沉淀用1ml冰预冷的10％的甘油悬浮细胞，即为感受态细胞。将制得的感受态细胞分装为50ul一管，-70℃保存。
最后是电转化感受态细胞：取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到Bio-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒-6.0毫秒。电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏。然后立即将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上37℃倒置过夜培养，次日得到蓝白菌落。将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到白色克隆群构成了大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇文库。
实施例4：对文库中的克隆测序：
从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段单向进行测序，使序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列。
实施例5：核苷酸序列的拼接及分析：
用英国剑桥MRC(Medical Research Council)分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列(见序列列表)。序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O108型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库。2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率。在得到大肠杆菌O108型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心(The National Center for BiotechnologyInformation，NCBI)的orffinder发现基因，找到8个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的结构，如表3所示。
通过检索和比较，发现orf1编码的蛋白与Vibrio vulnificus CMCP6中编码的nucleoside-diphosphate sugarepimerases有85％的氨基酸序列一致性和91％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf1编码的蛋白与已知的nucleoside-diphosphate sugarepimerases的共有序列的同源性预期值为1.5×e-3。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf1。Orf2编码的蛋白与Vibrio vulnificus CMCP6中编码的aminotransferase有73％的氨基酸序列一致性和87％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf2编码的蛋白与已知的aminotransferase的共有序列的同源性预期值为9.3×e-76。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf2。Orf3编码的蛋白与Vibrioparahaemolyticus中编码的UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase有77％的氨基酸序列一致性和87％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf3编码的蛋白与已知的UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase的共有序列的同源性预期值为3.1×e-93。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf3。Orf4编码的蛋白与Vibrio vulnificusYJ016中编码的NeuB sialic acid synthase有81％的氨基酸序列一致性和92％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf4编码的蛋白与已知的NeuB sialic acid synthase的共有序列的同源性预期值为2.4×e-95。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf4。Orf5编码的蛋白与vibrio vulnificus YJ016中编码的acetyltransferase有47％的氨基酸序列一致性和68％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf5编码的蛋白与已知的acetyltransferase的共有序列的同源性预期值为1.3×e-10。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf5。Orf6编码的蛋白与Vibrio parahaemolyticus中编码的nucleotide transferase有68％的氨基酸序列一致性和80％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf6编码的蛋白与已知的nucleotidetransferase的共有序列的同源性预期值为1.3×e-30。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf6。Orf7编码的蛋白与Vibriovulnificus YJ016中编码的dehydrogenase有51％的氨基酸序列一致性和72％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf7编码的蛋白与已知的dehydrogenase的共有序列的同源性预期值为2.9×e-15。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf7。 Orf8编码的蛋白与Vibrio vulnificus YJ016中编码的CMP-N-acetylneuraminic acidsynthetase有63％的氨基酸序列一致性和73％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf8编码的蛋白与已知的CMP-N-acetylneuraminicacid synthetase的共有序列的同源性预期值为1.6×e-5。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf8。 Orf9编码的蛋白与Vibrio vulnificus YJ016中编码的dehydrogenase有63％的氨基酸序列一致性和78％的相似性，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf9编码的蛋白与已知的dehydrogenase的共有序列的同源性预期值为1.2×e-6。由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf9。Orf10编码的蛋白通过检索比较并未发现其确定的功能，所以我们将这个基因暂命名为orf10。
Orf11和orf12是大肠杆菌O108中仅有的两个编码存在跨膜片段的蛋白的基因。Orf11编码的蛋白与Salmonella enterica的O-抗原转移酶有23％的序列一致性，44％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有11个均匀的跨膜片段，这是Wzx蛋白的典型特征。所以命名orf11为wzx。Orf12编码的蛋白与Salmonella enterica的O-抗原聚合酶有22％的一致性，46％的相似性，通过HMMTOP2.0程序分析蛋白的拓扑结构发现其含有9个跨膜片段，并且有一个大的胞质内亲水环(loop)，这是Wzy蛋白的典型特征。所以命名orf12为wzy。
Orf13、orf17两个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶分别有24％、33％的序列一致性和42％、84％的序列相似性。通过对Pfam中糖基转移酶基序数据库的搜索，这两个基因编码的蛋白与已知的糖基转移酶家族1的共有序列的同源性预期值为2.8×e-5、1.6×e-4，因此我们推测这两个基因编码糖基转移酶，而且由于每个糖基转移酶特异性催化形成一种二糖键，因此我们推测大肠杆菌O108的O-抗原的寡糖单位可能由三个单糖组成。由于orf13这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf13。而orf17这个基因编码的蛋白与Escherichia coli中编码的wbuB L-fucosaminetransferase有72％的氨基酸序列一致性和84％的相似性，因此我们将这个基因暂命名为wbuB。
Orf14，15，16编码的蛋白与Escherichia coliO-抗原基因簇中fnl1，2，3基因编码的蛋白有很高的氨基酸序列一致性(72％-89％)，通过对Pfam蛋白基序数据库的搜索，发现orf14，15，16编码的蛋白与已知的Fnl1，2，3蛋白的共有序列的同源性预期值非常高，因此我们将这三个基因暂命名为fnl1，2，3。Orf18编码的蛋白与Escherichia coli(AAN60465)O-抗原基因簇中编码的WbuC蛋白有68％的氨基酸序列一致性和87％的相似性，由于这个基因的确切功能还不能确定，因此我们将这个基因暂命名为orf18。
实施例6：特异基因的筛选。
针对大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物，在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O108组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O108型的O-抗原都是高度特异的；这些基因在核苷酸序列中的位置见表1。
实施例7：引物灵敏度的检测。
购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用。将10μl大肠杆菌O108的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PCR模板。用4对寡核苷酸对，SEQ ID NO：1中的11775至11792碱基的核苷酸和12638至12655碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的12344至12361碱基的核苷酸和12748至12766碱基的核苷酸；SEQ IDNO：1中的13194至13213碱基的核苷酸和14012至14029碱基的核苷酸；SEQID NO：1中的13605至13623碱基的核苷酸和13940至13957碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg2+：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μl，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环。反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性。参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果。参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果。说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O108的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
通过对O抗原基因簇的克隆和在减毒的疫苗菌株中的表达，可以组建重组疫苗。O抗原为最主要的革兰氏阴性菌的表面抗原，可以引起强烈的免疫反应，是制造重组疫苗的最好的靶分子之一。在1993年Viret实验室成功的将志贺氏菌Sonnei的O抗原基因簇在一株沙门氏菌Tyziai疫苗菌中表达，动物实验证明可以引起兔子的免疫反应(Molecular Microbiology1993，7：239-252)。中国军事医学科学院的小组也在从事与Viret实验室类似的工作。王磊实验室在1999年成功的将大肠杆菌O111的O抗原基因簇在沙门氏菌疫苗STM-1中表达，并证明组建成的菌株可以引起小鼠的血液和体液反应(Microbial Pathogenesis 1999，27：55-59)。所以本发明O108的O抗原特异基因序列可以应用于组建重组疫苗。
当分子探针核苷酸序列与靶DNA序列同源性大于85％时，可以准确的将目的序列杂交出来。在低严谨性的Southern杂交中要求两者的同源性大于65％(《分子克隆实验指南》第三版，第509页，低严谨性杂交)。本发明中的特异核苷酸序列在Genebank中的同源性搜索显示没有同源性大于65％的其他基因存在。所以在杂交实验中，本发明中的特异核苷酸序列作为分子探针将只能对目的细菌得出阳性结果。Southern杂交法对于分子探针的长度并没有严格要求，本发明中的特异核苷酸序列中从20bp或以上的寡核苷酸到整个序列都可以在杂交中应用。在一项Southern实验中，利用沙门氏菌的相关特异基因(1000bp以上)做分子探针，成功的分辨出该细菌(Liu D，Verma NK，RomanaLK，Reeves PR.，1991 Relationships among the rfb regions of Salmonellaserovars A，B，and D.J Bacteriol.173(15)：4814-4819.)，很多本领域的实验都表明1000-2000bp左右的基因序列可以用做分子探针。基因芯片与Southern杂交法的原理一样，在选用分子探针的要求上也相似，所以本发明中的特异核苷酸序列以及其中的寡核苷酸片段都可以在杂交反应中作为分子探针检测该目的细菌，包括Southern、基因芯片等多种杂交的常规方法。
根据本发明的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸序列(SEQ IDNO：1所示)，构造特异核酸探针，将其固定到芯片的载体上制成生物芯片，将要检测的样品适当处理后，与生物芯片进行杂交反应，然后利用生物芯片信号分析设备就可以得到样品中相应的细菌情况。这种大肠杆菌O抗原鉴定的DNA芯片将可以直接用于临床和其它检验场所(如食品加工和生产行业，畜牧兽医行业海关检疫等的微生物检验)。这种芯片只需要扩大产量，在完全相同的条件下就可以产业化。
表1列出了大肠杆菌O108型的O抗原基因簇中寡糖单位处理基因及基因内的引物及PCR数据。在表中列出了大肠杆菌O108型的O抗原基因簇的转运酶基因和聚合酶基因及它们的相应的功能和大小。在每个基因内，我们各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方以确保其特异性。在表中还列出了每个引物在SEQ ID NO：1中的位置和大小。以每对引物用表中所列的相应的退火温度以表2中的所有菌的基因组为模板进行PCR，得到了相应的PCR产物，其大小也列于表中。
表2是用于筛选特异基因的166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源，为了检测的方便，我们将它们每12-19个菌分为一组，总共12组，它们的来源都列于表中。
在第13组中含有大肠杆菌O108型的基因组DNA作为阳性对照。以每组菌做模板，用表1中的每对引物按如下条件做PCR：在95℃预变性5分钟后，95℃变性30秒，退火时间是30秒，温度见表1，72℃延伸2分钟，这样进行25个循环。最后在72℃继续延伸5分钟，反应体系是25ul。模板为1∶20稀释，取1μl。反应完毕后，取10ulPCR产物通过0.8％琼脂糖凝胶电泳检测扩增出的片段。
对于wzx、wzy基因，每个基因都有两对引物被检测，每对引物除了在第13组中做PCR后得到了预期大小的正确的一条带外，在其他组中都没有扩增到任何大小正确的带，也就是说，在大多数组中没有得到任何PCR产物带，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O108型及其O-抗原是高度特异的。
最后，通过PCR从大肠杆菌O108型中筛选到对大肠杆菌O108型的O-抗原高度特异的基因：转移酶基因(wzx基因)和转运酶基因(wzy基因)。而这些基因内的任何一段10-20nt的寡核苷酸对大肠杆菌O108型的O-抗原是特异的，尤其是上述每个基因中的引物即寡核苷酸对经PCR检测后证实对大肠杆菌O108型是高度特异的。所有的这些寡核苷酸都可用于快速准确地检测人体和环境中的大肠杆菌O108型，并能鉴定它们的O-抗原。
表3是大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的结构表，在表中列出了大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的结构，共由12个基因组成，每个基因用方框表示，并在方框内写入基因的名称，数字表示的是O-抗原基因簇中的开放阅读框(orf)的顺序。在O-抗原基因簇的两端是galF基因和gnd基因，它们不属于O-抗原基因簇，我们只是用它们的一段序列设计引物来扩增O-抗原基因簇的全长序列。
表4是大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇中的基因的位置图，在图中列出了大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇中的所有开放阅读框在全序列中的准确位置，在每个开放阅读框的起始密码子和终止密码子的下面划线。在大肠杆菌中开放阅读框的起始密码子有两个：ATG和GTG。
SEQ ID NO：1序列(SEQUENCE LISTING)
<110>天津生物芯片技术有限责任公司
<120>对大肠杆菌O108型的O抗原特异的核苷酸
<130>对大肠杆菌O108型的O抗原特异的核苷酸
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>21225
<212>DNA
<213>Escherichia coli
<400>1
attgtggctg cagggatcaa agaaatcctc ctggtaactc acgcgtccaa gaacgcggtc    60
gaaaaccact tcgacacctc ttatgaatta gaatctctcc ttgagcagcg cgtgaagcgt    120
caactactgg cggaagtaca gtccatttgc ccgccgggag tgaccattat gaacgtgcgt    180
cagggcgaac ctttaggttt gggccactcc attttatgtg cacgacccgc cattggtgac    240
aattcatttg tcgtggtgct gccagacgt tgtgatcgatg acgccagcgc cgacccgctg    300
cgctacaacc ttgcggccat gattgcgcgc ttcaacgaaa cgggccgcag ccaggtgctg    360
gcaaaacgta tgccaggtga cctctctgaa tactccgtca ttcagaccaa agagccgctg    420
gaccgcgaag gtaaagtcag ccgcattgtt gaatttatcg aaaaaccgga tcagccgcag    480
acgctggact cagacatcat ggccgttggt cgctatgtgc tttctgccga tatttggccg    540
gaacttgaac gcactcagcc aggtgcatgg ggacgtatcc aactgacaga tgccattgcc    600
gaactggcga aaaaacagtc tgttgatgca atgctgatga ctggtgacag ctacgactgc    660
ggtaaaaaaa tgggctatat gcaggcgttc gtgaagtatg gattgcgtaa cctgaaagaa    720
gggccgaaat tccagaaaag cattgaaaaa ttgcttagtg agtaagacca caaattagcc    780
agtttgattg actaaaaatc tataaacagc agttaacatt cgaggcagtg atgccggtaa    840
gaaaagaatg tttctgccgt ttttgctgaa aggtgtttgt tttcattgag ttagctacaa    900
aattttgaac tggattttgt agtatttctt cttgtttccg acaccgaatg gtaagacaat    960
tagtgtttga gtttagaggc tttgcgactg aaagcagagt tcaacacgtc tatgaaagtt    1020
cgcagtgcac tggtagctgt taagccaggg gcggtagcgt atcaattttc tggcttgatg    1080
ctaattaaaa ccgaaggttt cccccggttt tttaagaatg tcaatatata tgaaacgatt    1140
gcagccacga aatttttttt gactgaagcc gttttgacct gaatataatg agtaacaaac    1200
tggatctcga aatgtataat atcctccaat tgattgggcg taataaagaa ttattcagtg    1260
atgatgtttc tgaaaatgaa aaagaattaa aaaaaatcgt ttccgaatca cgcttccttg    1320
tacttggcgg tgctggctct attggtcagg ctgttgtaaa agaaatattt aaacgcaatc    1380
ctcagaaact gcatgttgtc gatattagcg aaaacaacat ggttgagttg gttcgtgata    1440
tacgcagttc cttcggttat attgctggtg atttccagac gttcgcgctt gatatcggct    1500
ctgtagaata cgacgctttt atcaaagctg acggtaaata tgattacgtt ctgaatttat    1560
ctgccctgaa acatgttcgc agtgagaaag atccgtttac cctgatgcgc atgattgaag    1620
tcaatattct caatactgac aaaaccattg agcagtctat tgctgctggc gttaagaaat    1680
tcttctgcgt atcgaccgac aaggccgcga atccggtaaa tatgatgggc gcttctaagc    1740
gtattatgga aatgttcctg atgcgtaaaa gtgaacaaat cgccatctct actgcacgtt    1800
tcgcgaacgt agccttttct gatggctccc ttctgcatgg gttcaatcaa cgcctccaca    1860
agcagcaacc cctggttgca ccgaatgata tcaagcgtta tttcgtcacc cctcaggaat    1920
caggtgagct ctgtctgatg tcatgtattt ttggtgataa tcgtgacatc ttcttcccga    1980
aactgagtga agcattacac ctcatttctt ttgccgatat tgcggttctc taccttaagc    2040
aacgtggtta tgagcctcat ctttgtgaaa ccgaagacga agctcgtgag cttgctaaaa    2100
ccctgccagc acaaggtaaa tggccatgtt tgtttacctc aagtgatacg acaggtgaga    2160
aagatttcga ggagttcttc accgataatg aaacgcttga tatggagcgt tttaacaatc    2220
tgggcattat caagaatgaa cctttatatg accctgcgct tctggcccac tttgaagaac    2280
gtatcgaaga gatgaaagca tctctggaat ggaataaaga cgatattgta aaactgtttt    2340
ttgaaatgat ccctgacttc agacataaag aaacaggtaa atacctcgac agcaaaatgt    2400
aagcaaggca tccccgaatg aatatcaaat caattatcga atttgttcgc gacgtataca    2460
aaacggatga atttattcct ttgcatgcgc cagtgtttaa tggcaacgaa aaaaaatatg    2520
ttctggatac tctggacagt actttcgtgt cgagcgtcgg taaatatgtc gatgatttcg    2580
aacgtaaaat ggaatcttac accggaacgg cgagagcggt tgcaacggtt aacggaacag    2640
ccgcgttaag cgcagcgtta tacctggcag gtgttaagcg aggtgatctt gttatcactc    2700
aggcactgac cttcattgca acctgcaatg cgctttatca tctgggagct gagccggtgt    2760
ttaccgatgt ctctccggtg agtatggggc tgtgcccggt cgcacttgat aattggttat    2820
ctgaaaatac cgagctgaca gaaaaaggat gtgtgcaccg taaaacacgg caggttgtac    2880
gtgctgtggt gcctatgcat acctttggtc atccggttga gctggatgag cttattaccg    2940
tttgccagaa gtggcacatc gttcttgttg aagatgcggc tgaaagtctg ggctctttct    3000
acaagggtaa acacaccggt acgctcggtg actatggagc gttaagcttt aacggcaata    3060
aaattattac gaccggtggt ggcggaatgg tcctctgtcg ctcgtcagaa gcgggtgttc    3120
gtgcgaaaca tgtcactacg acagcaaaag taccgcatcc ctacgagttt tatcatgatg    3180
aaccaggttt caactatcgt atgccaaacc tcaacgctgc gcttgggtgt gggcagatgg    3240
aacgccttga ttcgttcctg aaacaaaaac gtgagttggc tcagcgctat gaggcatttt    3300
ttgccgggtc agagttcagg ttcgtgaaag aacctgaata tgctcagtca aacttctggc    3360
tgaatgccat catttgtgaa aacatggatg cccgtgatgc aatgctggta caaatgaatg    3420
aagccaaagt aatggttcgc ccaatctgga aattgatgca ccgtctgcca atgtttgaac    3480
atgcaatgcg tgatgatctc aagaactctg aacagattga agctcgcctg atcaacatac    3540
ctagctctcc aatggagtaa tggtaatggg gtcagcaaaa cgtaaagttg cggtatttac    3600
cggcacgcga gctgaatatg gcttgctcta ctggctgttg aaagatatcc aggatgacaa    3660
agagctggaa cttcagcttc tcgttagtgg tatgcatctc tcgcccgagt ttggaaatac    3720
ctggcagcag attgagaaag acggtttttc aattgatgag aagattgata tattgctttc    3780
ttcggatacg gcagtaggga ctgcaaaaag catggggctg gggatattgg gttttgctga    3840
tgccctgaac agattaaagc cggatatttt agtgatactc ggggaccgtt ttgaagctct    3900
tgcagcggca cagacggcga tgattctccg tattcccatt ctgcatctac atggtgggga    3960
aattacggag ggtgcctacg acgatgcgat cagacacgcg attactaaac tgagttattt    4020
acatggaact tcaacagagg cctatcggaa tcgtgttatc cagctagggg aagatccttc    4080
tcgcgtagtc aatgttggcg caattgggct ggatcatctc aagcgcggac aatttatgtc    4140
tgttgaggaa ttaggtgtct cgctgaaatt cccgcttaga aaaccattct tactggtgac    4200
gtatcatcct gtcactctgg gtgacgagcc tgcagaagca agttttaacg cgttgttagc    4260
ggcgcttgat gagtacccgg agtatcaggt catcctgacc tatcccaacg cagatgatgg    4320
tggcagaaag atcattccct tgctcgaagc ctatgctgcc agacaacccg agcgtgtgct    4380
ggcgattcct tctttaggac aggtgcgcta tctcagtgct gtgaagtatg cagcggcagt    4440
ggtaggtaat tcctccagcg ggattattga agttcctgcg tttgatgttc ctaccgttaa    4500
cattggcgaa aggcaaaaag gccggttggc tgcccgaagc gtgttgaatt gccctgcaac    4560
gacggagtcg attgcgaagg cattaagaat tgcggttacg cgcagttata aaaaccgcga    4620
tgaagacatt gcgaatcctt atggccaggg tgatgcaagt tcgaaaatca ttgagatgat    4680
taagtccatg cattttgttc ccggcaagac gttctacgac atcaagtgaa actatatgac    4740
gcttatcatt gctgaagccg gtgttaatca caacggcgac gaaaaactgg cttttgaact    4800
tgttgatgct gcttataagg ccggggctga tattgttaag ttccagacgt ttaaagcgaa    4860
aaacctggtg accgaacagg caaagcaagc cgattatcag gtggcgaata ctcaacgaca    4920
ggaatcgcaa ctagcgatgc taagccgtct tgaactgtca tgggaagcgc atcatgcatt    4980
ggttaagcat tgtgaagcat tggggataga atttctttcc acggcctttg attcagaaag    5040
ccttgatttc ctggtgaatg atcttggaat caaacgcttg aaattgcctt ctggtgagct    5100
caccaatgca ccgttggttc tggaacatgc cagaacaggt tgcgatatta ttgtttcaac    5160
ggggatggcc actctttctg aaatagaagc tgctttgggt gttatcgcat tcggatatat    5220
cagttcaaag gatgaaaaac cttgtatcga agcctttgaa agagcctatg caacacgtga    5280
aggtcagaag ttgctgaaag agaaagtgac aattcttcac tgtacgactg aatatcctgc    5340
gccaatgggt gaaattaact tgagagcaat ggattcctta cgagaagctt ttgaccttcc    5400
tgtgggctat tccgatcaca gcgaggggat agctatccct gtagcagccg ttgccagagg    5460
ggctgtgatt attgagaaac atttcacgct agataaaaat atggaaggtc cggatcataa    5520
agcttcactt gaacctgatg aactggccgc aatggtaaaa gcgatcaggc aaatagaaat    5580
agcgctagga aataaggtca aagcaccaac cgtttcagaa attaaaaaca agtcggttgc    5640
gagaaaaagt ctggtggctg cgcagaaaat tcgagcgggg gaaactttta ccgcgtcgaa    5700
tgttacaatc aagagacctg gaaacgggat gtcgccttat agctactggg atatcctgga    5760
aaaaatatca acaaaagaat atttgccggg agatctgatt attgaatagc aaacctgttg    5820
ttcttattgg tggtggcggc catgccagtg tcctactgga cattctgaat tcaaatatgc    5880
gggaagttat cgctgttgtg agtccgcatg atgtccccgc aagaacgatt ttttctggaa    5940
tcaaagtatt ccgcactgat gacgatattt ttcagtactc aaataaagac attgaattag    6000
ttaatggcat cggtatggtt ccgcgatctt cggtaagaaa gaatgttacg gaatcctatc    6060
ttcgccatgg atatcaattt gccagtgtaa ttgctaaaga tgcattaatt tccgcacatg    6120
cccatattat gaacggggcc caagttctgt caggaacgat agtcaatcct ggggtagtaa    6180
ttggtagcca ttcaataatt aatacccgtg cgattattga acatgactgc cagataggaa    6240
atcacagctt tattggaccc ggtgcggtgt tgtgcgggca ggttaaaacg ggggaatcag    6300
tttttgtggg ggcaggttcc acaataatcc ctgggatgat actaggcagt aattcaatgg    6360
tgggtgctgg cgcagtatta gtgcagtcgt tagataatgg gcaagtttgc tatccggcaa    6420
gatcggttat caaatagtgt cttacaaaag gtaattcatg atgcagcatt ggaaaaatgt    6480
gctgatccga ccggacagct cactgcgtga agcgctcgaa attattaacc gtgaagctct    6540
acgtatcgcg ttagttgttg ataatgaaaa taatttatta ggtgtcatca ctgatggaga    6600
catcagaagg ggattgctga ataatctgga tctctcggct aaaacttcac aggtcatgaa    6660
tactcagcca gtcacagcga ccagtagtgt ttcttcagcc gagttaaaca cgctgatgaa    6720
agtaaaaggg attttgtctg ttcctatcct tcgcgatggt aaagtaatcg gtctggagac    6780
tatccagtca gtaaataata agaaaaaata tcctaaccct gtgtttatca tggctggcgg    6840
atttggaaca agattaaaac cattaacgga ttcctgccca aagcccatgc tttgtatcgg    6900
tggtaagcca atattagaaa ccgtaattcg cagttttgtt aaagctgggt ttaataattt    6960
ctatatctcg actcactata tgcctgagat tatcaaagaa catttcggtg atggtgagcg    7020
gtttgattca aaaatccgct atgtacatga agaaaaaccg ctgggcactg gcggtgcttt    7080
aggtttgtta cctgaagatt tatcggatga acatcctctc atcatgataa atggcgacgt    7140
cttgaccaat gttgattacg agcgtttgat taaattccac atagaaagca aagctgacgc    7200
aactatgtgt gtacgcgaat atgattatca aattccctat ggcgtcataa aaggggatgg    7260
aaataaaatc atctcgatgg aagagaagcc tgtacaccga tttttcgtca atgcagggat    7320
ctatgttgtg tcaccacaaa tcttcaaagc agtgcctaaa aatcatcgta ttgatatgcc    7380
aactcttctt gaagagcata tggataataa tgaaaacatc cttatgttcc ctatacatga    7440
gtactggttg gatatcggta gaatggatga cttcaaaagg gcgcaggtag attactttac    7500
actaggtttt gactaatgaa agcagttgcg gtgattggat taggtaatat tgcagacaga    7560
catcgtcgca atctcaaaaa agtttatccc ggtatcaaag tttatgcgat gtcagcctct    7620
ggacgcaaaa ttcatggtga aataagtgat tgtgatcagg tagtaaatat catagatgaa    7680
ctcttagata ttgttgatat ggctattata gcatctccag caacgttaca cgctggacat    7740
gccataccat ttattaaagc cggtatacct gttctaattg agaaacctgt tacggtatcg    7800
acgtctgatg cagaggcatt actggatgca tcaatgcgtt ttaattcggt agtcgctgtt    7860
gggtattgtt tgcgctattt gccctctgcg ctttcgttaa aaagagtttt agaagagaag    7920
aaagcaggca gaatatttaa cgcctttatc gagatcggac agtatctccc ggactggcgt    7980
gttagtaaaa actataaaga aagtgtctca gctaataaag ctttgggtgg tggggctctc    8040
ctggagttaa gccatgaatt ggattataca cgctggcttt ttggcgagct agatgttctc    8100
catgctacag tccgaaattc cggtgtgctt gatatcgatg ttgaagatat agcagatatt    8160
attgctattt caaaagatga aatcgttgtc aatattcatt tggattttct acagaaaaaa    8220
gcgttcagga aatgtagttt cttaggtaca gatggacggg tagaatggga tttgatcaat    8280
aatcaagtga aattaattaa taaatcagat gagtgtttga tttataatga accgcaatac    8340
gataaaaaca ccatgtattt ggatatgttg aaagattttg ataactatat acatgggcgc    8400
gagaatcaat gcatcaaatt gactgatgca gttaaaacca tcgcattagt taatcggata    8460
aaaaagttgg cagaataaaa tgaaaaatta tgcttttata tttgctcgcg gaggctctaa    8520
aggcctgcca gggaagaaca taaaagagtt atgtggaaag cctttattac actatgcaat    8580
cgagattgca caactgtccc catcaattga taaagtattt gtctccacag atgacgcaga    8640
cattaaacaa aaagcattag aattaaaaga tgttgttgtc attgacagac ctgatgaact    8700
ttctggtgat aaaagtcctg agtggtttgc gtggcgccat gctattgagt gggtaactga    8760
gcattacggg gcatttggac aatttgtcag ccttcccgcc acgagtccat tgcgagaagt    8820
gcaggatgtt gaacgtgcca ttgctaaacg catgcaaaca gatgcagata tctgtatcgc    8880
agtaacgcca gcatcacgta gtccatattt taatatggtc aaaatcaaca gcaatggctt    8940
gaatgagtta gtaattagcc cagaaagggg atgtctcaag acgtcaggac tgtcctgatg    9000
tgttcgatat tactaccgtc gtttatgtct caactcccga atttattctg aataatattg    9060
gattgttttc agggaatgtt acttcggttg aagttccgaa ggaaagagct gttgatatcg    9120
atgatattta tgattttctt atggctgaaa ccattctaac gatgaaaaag gaatgtaatt    9180
aaaatgatac tggaaaataa aaatattgtc atttttggtt ctggtggtct gcttggcgca    9240
tgcctgacga aggcatgcct tgcaaatggt tcaaaggtta ttgctgtcga tcttgatata    9300
aaccatataa agaataaatt aagtgcacaa ggtgtagcaa catctggcat gaacataacc    9360
tacgctgagg ttgatgtcac caatgaacaa tctgtcactg atttttttaa ctgccttgag    9420
gacattgatg gaattgtcaa tgcaacctat cccaggaata aaacgtatgg tcgtaagtta    9480
ttcgatgtaa cgcttgccag cttcaatgaa aacttatcgc ttcacttggg tagctccttc    9540
ctgattagcc aacaagctgc acagtttttt atgcgacaaa aaaagccagt ttcgatggtt    9600
aatatatcat ccatttacgg tgtaattgct cctaaattca atatttatga caatactcaa    9660
atgacaatgc ctgtagaata tgcggcaatc aagtcagcat tattacattt gaataagtat    9720
attgtagcgt atgtcaataa tagtgacttc cgcattaatt cagtaagccc cggtggaatt    9780
tttgacaacc aaccagctga attttgtgag gcatatagaa aaaacactca tggaactgga    9840
atgctggatg ttaatgaaat gacgggatcc attgttttct tgctgtcaga tcaatcaaga    9900
tatgttacag gtcagaacat tatcgttgat gatggtttct cactttagtt tttatcattt    9960
attgaatgaa tattaagttt gaaatgttga tttttacatt tgcattttgg aaatgaagag    10020
gtagttaaat ttaatgttat caaaaataaa aacgatactt cgctatctca aaccctatca    10080
gcgagatgaa attgaaaata agtttgtaga attgaacagc gggttatgga agtcagagaa    10140
atcaactaga attcaaacta atagaaaaaa agaatattgt ctggttgagg gtatcattgc    10200
atgtcctgca agtattatgg ataaggcaag aatagcaaag gcaatacagc aagaaacagg    10260
agtccaacct gttgtatata ttgaggcttt aattttacag gtagcaatgc cagtcatatt    10320
tataatcttt caatataatc atttttattg ctggtggcgt ggactcttcc atcctaaggt    10380
gtttgtaccc gctgtcattg caacacttaa agccatgtca ggatcgaggt ctgcaaaatc    10440
tttgatcaat ctaaactatc gcggcgttga gattggtgat ctcatttacg atactctcat    10500
tcgattcaga cctaacgaat atactgttaa aaaaattgag gttaaacatt taagattgat    10560
attcagatca tttctaacat ttcataacaa tgagttaatg ttggaaaaat ataatccgaa    10620
atatcttgta actagccata atgtctatgc tgaatttggc atgttgcctc gtcaaattag    10680
acatcacaat aacggcatag tattccttaa agatatatat gcctataaat gttatggacc    10740
tgcaataaat attaaagaac acttcctgaa accaacgcaa gaagcatttt tgcagaacct    10800
tcatgcaatt gattttgttg acagagcgta taaatatttc tatgacagat tagaaggtaa    10860
cgttgatcaa atagatgtaa aaaatgctta tcaaaataag aaaaaatata gtattgaaca    10920
gttaaaatct atttacccta aagttgatat tcgtaaaaaa aatgttgttg tcatgtcaca    10980
tgcgttctct gactcacctc atgttggtga ggggttacta tttaatgact attatgattt    11040
cttggaaaaa acgctaattc gcctcaataa aaatcgaaat attaactgtt ttgtaaaagc    11100
tcatccaagt tcgtacatgt ggaatgaaaa gggaggagtt gagagcttaa ttgaggctaa    11160
tcaactggat aatatttata tgatgccggt tgatttgaat actaattcta ttgcagattt    11220
tgcagacagc attgttacgg caaaagggac ggcaggactg gaattttcat gccttgggat    11280
tcctgcagta actgctggaa aaggatacta tgccggtttt ggtattaccc ttgaacctga    11340
atctgttcaa tcttattaca atattttaga ttcgatctcg gggttagcaa aactggatga    11400
tgaagttcgt aaacgggcat tagtattgct ttatatggta tcgttgagcc ggagacattc    11460
tgatatttta cctaagcaac acatcatgcc acatgaaaat tataatgatg tctacctgag    11520
taaatatcaa gaaattatcg ctaatatcga aaataatata cctatgcgtg atggctttta    11580
tgaagaggta attcaggacg tggtgaaaaa ccatgattaa aaaagggtta atatatatat    11640
tgataaatta tgctattcaa tttctcaata tattccttag tctagtcatg atgaaatatc    11700
tcacaacagc tcagctaggt gatcttactc ttgctagaac ctggcagcaa tttgtggact    11760
attcacactt tggtgcacga ttttccttag atcgatttat tccactaaaa aaggaaagag    11820
aaaaaaaatt attagttaca actgtattgt taacgaatat tattggggcg ttaacaattt    11880
tgttggtggc tttatttttt aaccattcta atttgacagt tattatactc accttgtgtg    11940
gagtatttat atcgataagt aatattatta aagcatacta tcgggcgaca aaccggattg    12000
acgaaatgct ttggctagtt ttatattcac agttctttcc tgtgcttatt ccactagtgt    12060
tgtatatcat aacgcacaat tttgatgttt atatttactc gagtttaggt tgctatgctt    12120
tagctattat aagactgtat agagtggaaa agggactaaa aaagttcctg atccctaagt    12180
tgttgttaac aagattaaag ttcttgttta aaccatcggc tttgttattc cttaatgcaa    12240
tatttacctt tttatatctt gtcatggacc gtttttttat tgatgattcc ggtggtcgtg    12300
agcaactagg taattatagc gttatcatat tcgcatttag tgccctaatg ataattccct    12360
cgacctgtgc ggagttgctt tttgtcaaag ttattaggca gtgtagtcaa agtggtaagc    12420
gtttgtttgt taaagagagt cttattatgc ttgtagtaac attgtcgggc gtaattattg    12480
caaacgttgt tatgaaattt tttatagaaa atttcactaa gtatggaaac ctcgtttctg    12540
aattacatat ggcaacactt gctgttatcc cctttgcatt tactgcaata tattaccatg    12600
taatgaatgg attagatttg cgcaaacaaa tggtgtgtgt cagtggtgtt gtttgtctca    12660
ttttgatgtc atattattgc atcccagtat tcgccaatgt gaaatttgag ctagaagact    12720
atctatatgg aaaattggct acaggatggt tagtgttact tggttattgt tatttcattt    12780
cgcgcgcaaa gcatctcgcg tataataata agtaaattcg cggtagagcc cattatgatc    12840
tcaattgcat tctttataat agctttgatc ttatattctt taattgtttt aaaaacaaaa    12900
gatattattc atcctcttgg aattggtatt gttttttggt acttctcagc ttccctgtct    12960
acggttgata ttctgtatga ccatcaattg caatcagaat taagtctgga aacactaagt    13020
gctattttac ttgctggtgt tttctttgtt gccccatttg tattttcaaa aaagatagat    13080
aaaaataatt ttagttttca gcgttttgac tttaacttat tttatcgcgt attttttaat    13140
tttattgtag ctttatcagt cgttgctttc tttatgcgct ttggagtgat gctcactaat    13200
ccaccacttc tgtctggtgc aggaagtgat ttaaaatcat tagttccaaa tgcgcctccg    13260
ttgttgaatt tcatagatgt atcaatgcct tacatagcac ttgctgctct atttgaactt    13320
aagtactcat atcgacaagg gcgtgtgaga aagtatttcc ttctatccta tgtttttttc    13380
agtattgtag ttgcattggt ttatgaggta tcaaggggag aatttttagt attcatgtta    13440
ggtgccatct atatttttct gattccacgt aaaattacgc tagggttcaa acaactaatg    13500
atggttatgc taccgatggc attgcttttg tatatcggtg caatgcggat ttcagaaaca    13560
agtcgcgcct ctactcaatt tggtgatggg atggcaaatt cgctttttag ccagatttac    13620
acctatgttg caatgaattt tcagaatctg aatttattaa ttaactcatc attcgaaccc    13680
acatatatat ggggtggtct taagtttatt cttaagccgt tctttggtac ctattacgat    13740
agtaactcca tggggttcac tgactatgag gttggttttt tcaatgcaaa aacatttata    13800
tactatttct ataatgatct aggattagct ggtgtaatac tctattcatt tattattggc    13860
ttattgcttc aaattatcta caataaaaca tccagcaata ttaaatattg tctgttacag    13920
gcgtgtttta tgaaagcgat cgtgtttatg ctgtttggaa actatttctt tggggaattt    13980
gtcttaatca ttccatactt aattgtgttg ttccttttgc tgctcattag aaaagtcgag    14040
cctcgaagga tagaaaatac acctaaaaaa taatcctttt tcgacgaaga tgtctatagc    14100
agttaaaata agggaagata ttgatgagtt tgctgattaa tgcatctaat ctgtatgtgg    14160
gtggtggtgt tcaggttgct gtatctgtat tagaagagtt aactaaaggt gggcaacatt    14220
tcattgcagc agtttcacct gtagttgcga aacaactctc aggagaaaca ctatcaagat    14280
gcaaaattat cagaaaaaca ccatcaaatg tgttcaatgt tgaatcaaga cgagatttag    14340
atcagctcgt tgctgaaaat aaaattacga aagtctttac gatatttggc ccaagttact    14400
ggagcccgaa gaatgttaag catgccgttg gattcgcgtt gccatggctg atttatgatg    14460
tgagccaagt atttccgaag ttaagttttc gtgaaaaggt aaaaaagata cttttactgc    14520
gcctacaacc ttatttttat aaaaaaaatg cagatcttat gtttgttgaa actgatgatg    14580
ctaaaaataa acttgtggaa caatatcatt ttaaggacag tcatgtcgtc actgttccta    14640
atacaatcaa tgcgattttg cagaatgagg atttatacga taatagtatc ttagaagatt    14700
taccggagag gaatgtgggg gacatttacc ttctgacaat ttcacatgat tatcctcaca    14760
caaacctaac cgtgataccc aagctaattg agttattgcc agataattac aagttcattg    14820
ttacgttaag ttcttcgatg gcggatattc ccgaacggta tagccatcgt gtaattaatg    14880
ttgggccagt ttccattaat caatgtccag cattatatca ttattgtgat gcactatttt    14940
tgccaacgtt actggagtgc ttcagtgcca gttatgtaga agccatgtat ttcaaaaaaa    15000
tgatcttcac gtctgaccta ccatttgctc atacagtgtg tgacgacagc gcaatatatt    15060
ttgatcctta tgatgccaat gatatttgtg acaaaatcat ttctggagtt gaaggcgtac    15120
acgataaagt gataaagcaa gaaaaggccg acttaatttt tagcaagctt ccaacggcta    15180
aagaaagggc cttaatgtac atgcgcagca ttgataagtt ataagatttc ttaagaggta    15240
ttaaatgttt tcagataaag ttcttttgat tacaggcgga acaggttcct ttggaaatgc    15300
agttttaaat cgttttctgg aaactgatat taaagaaatt cgcattttct cgcgcgatga    15360
aaaaaagcaa gatgatatgc gcaagaaata caatagtgag aagcttaagt tttacatagg    15420
cgatgtcagg gattatcgca gtgtactcaa tgccagccgt ggcgttgatt ttatctacca    15480
tgctgccgcc cttaaacaag tgccatcatg tgaattccat ccaatggaag cggttaagac    15540
taacgtgctc ggcaccgaaa acgttctcga agctgcaatt gcaaacgaag taaaacgcgt    15600
tgtgtgttta agtactgata aagcggttta tccaatcaat gccatgggta tctctaaggc    15660
gatgatggag aaagtcatgg tcgctaaatc ccgaaatgta aacagcaata aaacggtgat    15720
ttgtggtact cgctatggca acgttatggc atctcgtggt tcggtgattc cgctgtttgt    15780
tgatctgatc aaagcaggta aagcgctgac tgtcactgat ccaaacatga ctcgtttcat    15840
gatgaccctt gaggatgctg tcgatctggt gctttatgca tttgagcacg gtaataatgg    15900
cgacattttt gtacaaaaag cgcctgcagc tacgattgaa acattagcaa ttgctctgaa    15960
agagcttctg aatgtcgagc accatcctgt caatgtcatt ggtacccgcc atggagaaaa    16020
gctctatgaa gcgctgctga gccgtgaaga gatgattgcg gccatcgata tgggtgatta    16080
ctatcgcgta ccacctgatt tgcgtgacct taactacgga aaatatgtag aacaaggtga    16140
cagccgtatc tccgttgttg aagattataa ctcccataat acacagcgac tggatgtaga    16200
agggatgaaa acgctgcttc ttaagttgcc gtttattcgc gcactgcgtg ctggtgaaaa    16260
ttacgatctg gacgcctgac atgaaaatcc tgattactgg agctgatggc tttatcggac    16320
gtaacttgtg cttacgcctt caggaagcag ggtatgttga ccttgttaag attgaccgtg    16380
actcaagtgc ggccgagctt gaaattggcc tgcaagatgc ggatttcatt tatcaccttg    16440
cgggtatcaa tcgacctaaa aatgtcgaag agtttgtcga agggaattgc aattttactc    16500
agcagattgt ggattctctg ttagcgaaga acaaaagcat acctattatg atcagttctt    16560
cgatccaggc tgaactggat aatgcgtatg gtcagagtaa ggctgcagct gaaaaacaaa    16620
ttgagcgtta tgcagcagaa agtggtgcag catattatat ctatcggtac ccaaatgttt    16680
ttggtaaatg gtgtaaaccg aactataact cgttcgtggc taccttctgc cataacattg    16740
ccaacaatat tgacataacc atcaatgacc cttcggcacc ggttaatctg gtttatatcg    16800
atgacgtttg cacacatgcg ataaaacttc tcacaggaga ggttcatagc ggatataaag    16860
gcgttgtgcc ggtttactca acgacagttg gtgaggtggc ggaattactt tatcgtttca    16920
aggagagtcg ttctacgctt gtcacagaag ctgtggggac gggaatgacc cgagcgctat    16980
attcgacgtg gttaagttac ttaccagccg aaaagtttgc ttatacggtg ccgtcctatg    17040
gtgatgcccg cgggatcttt tgtgagatgt taaaaacgcc ttcagcgggg cagttttcat    17100
ttttcacagc gcatcccggt ataacgcgtg gtgggcatta tcatcacacc aaaaatgaga    17160
agttcctggt catccgtgga caggcgtgct tcaaattcga acatgtgatt accggtgaac    17220
gttatgaact gaatgtttca tccgatgatt tccaaaaaat cgttgaaaca gtacccggct    17280
ggacccatga cgtcacgaat gttggcaatg atgaattaat agttatgctc tgggcaaacg    17340
aaattttcaa tcgtgatgag cctgatacta ttgcgagacc tctgtaatga aaaaattaaa    17400
aattatgtct gtggttggga cacgtcctga aatcatccgt ttatcacgtg ttttggtcaa    17460
acttgacgaa cattgtgagc atattcttgt ccatactggg caaaattatg attatgagtt    17520
gaacgaagta ttctttaacg atcttggtgt ccgtaagcca gattatttct taaacgctgc    17580
agggaaaaat gcggcggaaa ccattggtca ggttatcatc aaagttgatg aagtattaga    17640
aacegaaaaa cctgaagcaa tgctggtgct gggcgatacc aactcatgta tttctgccat    17700
tcctgccaag cgtcgtaaag tgcctatctt ccatatggaa gctggcaacc gttgtttcga    17760
tcagcgtgta cccgaagaaa ctaaccgacg aattgttgat catacggctg acatcaatat    17820
gacctacagc gatattgcgc gtgaatatct cctggctgaa ggtatcccgg cggatcggat    17880
cattaaaacc ggcagcccta tgtttgaagt gctttcgtac tatatgcctc aaattgatgg    17940
ttcggatgtg ttgtcacgtc taaatttgcg ccctggtgaa ttctttgtcg ttagcgcaca    18000
ccgtgaagag aatgtcgatt ctccgaagca actcatcaag cttgcgacca ttctaaatac    18060
cattgccgaa aaatatgatc tgccagtcat tgtatccaca catccgcgga cacgtaatcg    18120
tattaatgag caagggattg aattccaccc aaatattaat ctgctgaaac cgttaggttt    18180
ccatgattac aatcacctgc aaaagaattc acgtgctgtg ttgtcagaca gcggcacaat    18240
tactgaagag tcatccatca tgaattttcc tgctgtaaac atccgggaag cacatgaacg    18300
tccggagggc tttgaggaag catccgtcat gatggtggga ctggagtgtg aacgcgtgct    18360
tcaggcgctt gaaattttgt cgacacaacc tcgcggggag acccgtctct tacggcaggt    18420
tagtgattac agtatgccaa atgtgtcgga taaggtcgtc agaatcgttc actcttatac    18480
agattacgtc aagagagtcg tctggaaaga atattgatga aacttgcttt aatcatagat    18540
gattacctgc ccaatagtac ccgtgttggt gcaaaaatgt ttcatgagtt agctcaggaa    18600
tttattcgcc gtggccatga tgttacggta attactcctg atacaagcct gcaagaagag    18660
gtgtcgtttg acagctttca gggtgtcaaa acatggcgtt ttaaaagtgg tccgctcaag    18720
gatgtaagta aagttcagcg agccatcaat gaaacacttt tgtcttggcg ggcctggaaa    18780
tctattaaaa gccggataga agaagaaact ttcgatggtg tggtttatta ctcaccgtct    18840
attttttggg ggcatttagt taagaagatt aaagcccgct gccaatgtcc ggcttattta    18900
atattgagag atatgtttcc tcaatgggta attgatgctg gaatgctaaa agagggatcc    18960
ccaattgaac gttattttcg tctctttgaa agatcatctt atcgtcaggc aaaccgtatt    19020
ggactcatgt ctgataaaaa ccttgatgtt tttcgggtga caaacaaggg ctatccttgc    19080
gaagttctac gtaactgggc atctctcacg ccgacggtat tatccccaga atatgtgcca    19140
ctgcgtaagc gcctcggtct agaggataaa gtgattttct tctatggagg aaatatcggg    19200
catgcacagg atatggcaaa tcttatgcgt cttgcccgaa gtatggcaga gcatccacaa    19260
gctcatttcc tgttcattgg ccagggtgat gaagtggaat taattaactc tctggctact    19320
gagtgggcat tgtcgaattt cacgtatctg gcttcggtga atcaggaaga atttaagttc    19380
atcttatcgg aaatggatat aggcctgttt tctctttctg ccaaacactc ttctcacaat    19440
tttccgggta agttgttagg ttacatggtt cagtctctac ctatattagg tagcgtgaat    19500
gctggaaatg atctgctcga catcgtcaat caaaataacg caggattaat ccatatcaat    19560
ggagaggatg acaagcttta ccattctgcg ctgttaatgc tttatgacat tgatgcgcgc    19620
cagcgatttg gtctgggcgc gaacaagttg ttaaaagagc agttctccgt tgagtctgcg    19680
gcgcggacga tagaaatgag gctggaggca tgcaatgcga ttaattgata atgaccagct    19740
tgaggcatta tacgaacaag cagagcaatc cgagcgcctg cgttcccatc ttttgatgca    19800
tagttcgcat caggataagg tgcaacgact actcattgcc ctggtcagta gtagctatgt    19860
agaacctcat ttccatgaac ttcctcatca gtgggaaatg tttatcgtca tgcagggcca    19920
gcttcaggtt tgtttgcatg gcaaagatgg agaagtcgtt aagcaattta ttgtcggaga    19980
aaatacagaa attaacattg tggagttttc tccgggagac atacacagtg tcaaatgctt    20040
gtctcctcgt gctctcatga tggaggtgaa agagggacca tttgaccctt cctttgctaa    20100
agcatttgtt taataccatc gtgaatcaca tcttacgcta tccacctggc ttcatcctga    20160
gttaacatca gcaatacatt caagccgtgc ataaatcgcg gtgaccaccc tctgacagga    20220
gtaaacaatg tcaaagcaac agatcggcgt cgtcggtatg gcagtgatgg ggcgcaacct    20280
tgcgctcaac atcgaaagcc gtggttatac cgtctctatt ttcaaccgtt cccgtgaaaa    20340
gacggaagaa gtgattgccg aaaatccagg caagaaactg gttccttact atacggtgaa    20400
agagtttgtt gaatctcttg aaacgcctcg tcgcatcctg ttaatggtga aagcaggtgc    20460
agggacggat gctgctattg attccctcaa gccatacctc gataaaggtg acatcatcat    20520
tgatggtggt aacaccttct tccaggacac cattcgtcgt aaccgtgagc tttctgccga    20580
aggttttaac tttatcggta ccggtgtttc cggtggtgaa gagggcgcgc tgaaaggtcc    20640
ttccattatg cctggcggcc agaaagaagc ctatgaactg gttgctccga tcctgaccaa    20700
aatcgccgcc gttgctgaag atggcgaacc gtgcgttaca tatattggtg ccgatggtgc    20760
gggtcactat gcgaaaatgg ttcacaacgg tattgaatac ggtgatatgc aactgattgc    20820
tgaagcctat tctctgctta aaggtggtct gaacctcacc aacgaagaac tggcgcagac    20880
ctttaccgag tggaataacg gtgaactgag cagctacctg atcgacatca ccaaagatat    20940
cttcaccaaa aaagatgaag acggtaacta cctggttgat gtgatcctgg atgaagcggc    21000
taacaaaggt accggtaaat ggaccagcca gagcgcactg gatctaggcg aaccgctgtc    21060
gctgattacc gagtctgtgt ttgcacgtta tatcccttct ctgaaagatc agcgcgttgc    21120
cgcatctaaa gttctctctg gcccgcaagc gcagccagca ggcgacaaag gtgagttcat    21180
cgaaaaagtt cgccgtgcgt tgtatctggg caaaatcgtt tctta                    21225
表1大肠杆菌O108型的O抗原基因簇中的糖基转移酶基因和寡糖单位处理基因及其中的 引物及PCR数据
基因 功能   基因的碱基位置 正向引物 反向引物     PCR产物的长度   产生正确大小电泳带的组数    PCR的退火温度(℃)
    wzx     转运酶   11613-12815     11775-11792     12638-12655     8816p   0*    52
    12344-12361     12748-12766     423bp   0*    52
    wzy     聚合酶   12835-14073     13194-13213     14012-14029     836bp   0*    52
    13605-13623     13940-13957     353bp   0*    52
*只在大肠杆菌O108型中得到正确的一条带
表2  166株大肠杆菌和43株志贺氏菌及它们的来源
组号                      该组中含有的菌株   来源
1、野生型大肠杆菌2、野生型大肠杆菌3、野生型大肠杆菌4、野生型大肠杆菌5、野生型大肠杆菌6、野生型大肠杆菌 O1，O2，O5，O7，O8，O9，O12，O13，O14，O15，O16，O17，O18，O19ab，O20，O21，O22，O23，O24O4，O10，O25，O26，O27，O28，O29，O30，O32，O33，O34，O35，O36，O37，O3 8，O40，O41，O42，O43O6，O44，O45，O46，O48，O49，O50，O51，O52，O54，O55，O56，O57，O58，O60，O61，O62，O53O63，O65，O66，O69，O70，O71，O74，O75，O76，O77，O78，O79，O80，O81，O82，O83，O68O84，O85，O86，O87，O88，O89，O90，O91，O92，O98，O99，O101，O102，O103，O104，O105，O106，O97O107，O109，O110，O111，O112ab，O112ac，O113，O115，O116，O118，O120，O123，O125，O126，O128，O117   IMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSaIMVSa
7、野生型大肠杆菌8、野生型大肠杆菌9、野生型大肠杆菌痢疾志贺氏菌10、鲍氏志贺氏菌11、福氏志贺氏菌12、野生型大肠杆菌13、第6组菌株加上大肠杆菌标准菌株 O129，O130，O131，O132，O133，O134，O135，O136，O137，O138，O139，O141，O142，O143，O144，O145，O140O146，O147，O148，O150，O152，O154，O156，O157，O158，O159，O160，O161，O163，O164，O165，O166，O153O168，O169，O170，O171，O172，O173，D1，D2，D3，D4，D5，D6，D7，D8，D9，D10，D11，D12，D13B1，B2，B3，B4，B6，B7，B8，B9，B10，B11，B12，B13，B14，B15，B16，B17，B18F1a，F1b，F2a，F2b，F3，F4a，F4b，F5(v∶4)，F5(v∶7)，F6，DS，DRO3，O11，O39，O59，O64，O73，O96，O95，O100，O114，O151，O155，O124，O167，O162，O121，O127，O149，O119O108     IMVSaIMVSabcdddIMVSaIMVSa
为了检测的方便，每12-19个菌分为一组，总共12组，第13组作为阳性对照
a.Institude of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia
b.Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark
c.O172和O173来自于Statens Serum Institut，Copenhagen，Denmark，其余来自于IMVS
d.中国预防医学科学院流行病学研究所
表3大肠杆菌O108型O抗原基因结构
E.coli O108 gene cluster
#orf  galF  orf1   orf2 orf3 orf4 orf5 orf6 orf7 orf8 orf9 orf10 wzx  wzy  orf13 fn11 fn12 fn13 wbuB  wbuC  gnd
G+C％51.9   41.8   47.0 48.4 44.4 44.0 40.4 38.1 42.6 37.8 34.5 33.6 33.6  37.3 43.9  44.5  44.3 43.2 43.6 49.6
表4大肠杆菌O108型O抗原基因簇基因位置
ATTGTGGCTG CAGGGATCAA AGAAATCCTC CTGGTAACTC ACGCGTCCAA GAACGCGGTC    60
GAAAACCACT TCGACACCTC TTATGAATTA GAATCTCTCC TTGAGCAGCG CGTGAAGCGT    120
CAACTACTGG CGGAAGTACA GTCCATTTGC CCGCCGGGAG TGACCATTAT GAACGTGCGT    180
CAGGGCGAAC CTTTAGGTTT GGGCCACTCC ATTTTATGTG CACGACCCGC CATTGGTGAC    240
AATTCATTTG TCGTGGTGCT GCCAGACGTT GTGATCGATG ACGCCAGCGC CGACCCGCTG    300
CGCTACAACC TTGCGGCCAT GATTGCGCGC TTCAACGAAA CGGGCCGCAG CCAGGTGCTG    360
GCAAAACGTA TGCCAGGTGA CCTCTCTGAA TACTCCGTCA TTCAGACCAA AGAGCCGCTG    420
GACCGCGAAG GTAAAGTCAG CCGCATTGTT GAATTTATCG AAAAACCGGA TCAGCCGCAG    480
ACGCTGGACT CAGACATCAT GGCCGTTGGT CGCTATGTGC TTTCTGCCGA TATTTGGCCG    540
GAACTTGAAC GCACTCAGCC AGGTGCATGG GGACGTATCC AACTGACAGA TGCCATTGCC    600
GAACTGGCGA AAAAACAGTC TGTTGATGCA ATGCTGATGA CTGGTGACAG CTACGACTGC    660
GGTAAAAAAA TGGGCTATAT GCAGGCGTTC GTGAAGTATG GATTGCGTAA CCTGAAAGAA    720
GGGCCGAAAT TCCAGAAAAG CATTGAAAAA TTGCTTAGTG AGTAAGACCA CAAATTAGCC    780
AGTTTGATTG ACTAAAAATC TATAAACAGC AGTTAACATT CGAGGCAGTG ATGCCGGTAA    840
GAAAAGAATG TTTCTGCCGT TTTTGCTGAA AGGTGTTTGT TTTCATTGAG TTAGCTACAA    900
AATTTTGAAC TGGATTTTGT AGTATTTCTT CTTGTTTCCG ACACCGAATG GTAAGACAAT    960
TAGTGTTTGA GTTTAGAGGC TTTGCGACTG AAAGCAGAGT TCAACACGTC TATGAAAGTT    1020
CGCAGTGCAC TGGTAGCTGT TAAGCCAGGG GCGGTAGCGT ATCAATTTTC TGGCTTGATG    1080
CTAATTAAAA CCGAAGGTTT CCCCCGGTTT TTTAAGAATG TCAATATATA TGAAACGATT    1140
                                                 orf1的起始
GCAGCCACGA AATTTTTTTT GACTGAAGCC GTTTTGACCT GAATATA ATG1 AGTAACAAAC 1200
TGGATCTCGA AATGTATAAT ATCCTCCAAT TGATTGGGCG TAATAAAGAA TTATTCAGTG    1260
ATGATGTTTC TGAAAATGAA AAAGAATTAA AAAAAATCGT TTCCGAATCA CGCTTCCTTG    1320
TACTTGGCGG TGCTGGCTCT ATTGGTCAGG CTGTTGTAAA AGAAATATTT AAACGCAATC    1380
CTCAGAAACT GCATGTTGTC GATATTAGCG AAAACAACAT GGTTGAGTTG GTTCGTGATA    1440
TACGCAGTTC CTTCGGTTAT ATTGCTGGTG ATTTCCAGAC GTTCGCGCTT GATATCGGCT    1500
CTGTAGAATA CGACGCTTTT ATCAAAGCTG ACGGTAAATA TGATTACGTT CTGAATTTAT    1560
CTGCCCTGAA ACATGTTCGC AGTGAGAAAG ATCCGTTTAC CCTGATGCGC ATGATTGAAG    1620
TCAATATTCT CAATACTGAC AAAACCATTG AGCAGTCTAT TGCTGCTGGC GTTAAGAAAT    1680
TCTTCTGCGT ATCGACCGAC AAGGCCGCGA ATCCGGTAAA TATGATGGGC GCTTCTAAGC    1740
GTATTATGGA AATGTTCCTG ATGCGTAAAA GTGAACAAAT CGCCATCTCT ACTGCACGTT    1800
TCGCGAACGT AGCCTTTTCT GATGGCTCCC TTCTGCATGG GTTCAATCAA CGCCTCCACA    1860
AGCAGCAACC CCTGGTTGCA CCGAATGATA TCAAGCGTTA TTTCGTCACC CCTCAGGAAT    1920
CAGGTGAGCT CTGTCTGATG TCATGTATTT TTGGTGATAA TCGTGACATC TTCTTCCCGA    1980
AACTGAGTGA AGCATTACAC CTCATTTCTT TTGCCGATAT TGCGGTTCTC TACCTTAAGC    2040
AACGTGGTTA TGAGCCTCAT CTTTGTGAAA CCGAAGACGA AGCTCGTGAG CTTGCTAAAA    2100
CCCTGCCAGC ACAAGGTAAA TGGCCATGTT TGTTTACCTC AAGTGATACG ACAGGTGAGA    2160
AAGATTTCGA GGAGTTCTTC ACCGATAATG AAACGCTTGA TATGGAGCGT TTTAACAATC    2220
TGGGCATTAT CAAGAATGAA CCTTTATATG ACCCTGCGCT TCTGGCCCAC TTTGAAGAAC    2280
GTATCGAAGA GATGAAAGCA TCTCTGGAAT GGAATAAAGA CGATATTGTA AAACTGTTTT    2340
                                                         orf1的终止
TTGAAATGAT CCCTGACTTC AGACATAAAG AAACAGGTAA ATACCTCGAC AGCAAAATG T  2400
             orf2的起始
AAGCAAGGCA TCCCCGA ATG AATATCAAAT CAATTATCGA ATTTGTTCGC GACGTATACA2460
AAACGGATGA ATTTATTCCT TTGCATGCGC CAGTGTTTAA TGGCAACGAA AAAAAATATG    2520
TTCTGGATAC TCTGGACAGT ACTTTCGTGT CGAGCGTCGG TAAATATGTC GATGATTTCG    2580
AACGTAAAAT GGAATCTTAC ACCGGAACGG CGAGAGCGGT TGCAACGGTT AACGGAACAG    2640
CCGCGTTAAG CGCAGCGTTA TACCTGGCAG GTGTTAAGCG AGGTGATCTT GTTATCACTC    2700
AGGCACTGAC CTTCATTGCA ACCTGCAATG CGCTTTATCA TCTGGGAGCT GAGCCGGTGT    2760
TTACCGATGT CTCTCCGGTG AGTATGGGGC TGTGCCCGGT CGCACTTGAT AATTGGTTAT    2820
CTGAAAATAC CGAGCTGACA GAAAAAGGAT GTGTGCACCG TAAAACACGG CAGGTTGTAC    2880
GTGCTGTGGT GCCTATGCAT ACCTTTGGTC ATCCGGTTGA GCTGGATGAG CTTATTACCG    2940
TTTGCCAGAA GTGGCACATC GTTCTTGTTG AAGATGCGGC TGAAAGTCTG GGCTCTTTCT    3000
ACAAGGGTAA ACACACCGGT ACGCTCGGTG ACTATGGAGC GTTAAGCTTT AACGGCAATA    3060
AAATTATTAC GACCGGTGGT GGCGGAATGG TCCTCTGTCG CTCGTCAGAA GCGGGTGTTC    3120
GTGCGAAACA TGTCACTACG ACAGCAAAAG TACCGCATCC CTACGAGTTT TATCATGATG    3180
AACCAGGTTT CAACTATCGT ATGCCAAACC TCAACGCTGC GCTTGGGTGT GGGCAGATGG    3240
AACGCCTTGA TTCGTTCCTG AAACAAAAAC GTGAGTTGGC TCAGCGCTAT GAGGCATTTT    3300
TTGCCGGGTC AGAGTTCAGG TTCGTGAAAG AACCTGAATA TGCTCAGTCA AACTTCTGGC    3360
TGAATGCCAT CATTTGTGAA AACATGGATG CCCGTGATGC AATGCTGGTA CAAATGAATG    3420
AAGCCAAAGT AATGGTTCGC CCAATCTGGA AATTGATGCA CCGTCTGCCA ATGTTTGAAC    3480
ATGCAATGCG TGATGATCTC AAGAACTCTG AACAGATTGA AGCTCGCCTG ATCAACATAC    3540
            orf2的终止orf3的起始
CTAGCTCTCC AATGGAG TAA TGGTAATGGG GTCAGCAAAA CGTAAAGTTG CGGTATTTAC  3600
CGGCACGCGA GCTGAATATG GCTTGCTCTA CTGGCTGTTG AAAGATATCC AGGATGACAA    3660
AGAGCTGGAA CTTCAGCTTC TCGTTAGTGG TATGCATCTC TCGCCCGAGT TTGGAAATAC    3720
CTGGCAGCAG ATTGAGAAAG ACGGTTTTTC AATTGATGAG AAGATTGATA TATTGCTTTC    3780
TTCGGATACG GCAGTAGGGA CTGCAAAAAG CATGGGGCTG GGGATATTGG GTTTTGCTGA    3840
TGCCCTGAAC AGATTAAAGC CGGATATTTT AGTGATACTC GGGGACCGTT TTGAAGCTCT    3900
TGCAGCGGCA CAGACGGCGA TGATTCTCCG TATTCCCATT CTGCATCTAC ATGGTGGGGA    3960
AATTACGGAG GGTGCCTACG ACGATGCGAT CAGACACGCG ATTACTAAAC TGAGTTATTT    4020
ACATGGAACT TCAACAGAGG CCTATCGGAA TCGTGTTATC CAGCTAGGGG AAGATCCTTC    4080
TCGCGTAGTC AATGTTGGCG CAATTGGGCT GGATCATCTC AAGCGCGGAC AATTTATGTC    4140
TGTTGAGGAA TTAGGTGTCT CGCTGAAATT CCCGCTTAGA AAACCATTCT TACTGGTGAC    4200
GTATCATCCT GTCACTCTGG GTGACGAGCC TGCAGAAGCA AGTTTTAACG CGTTGTTAGC    4260
GGCGCTTGAT GAGTACCCGG AGTATCAGGT CATCCTGACC TATCCCAACG CAGATGATGG    4320
TGGCAGAAAG ATCATTCCCT TGCTCGAAGC CTATGCTGCC AGACAACCCG AGCGTGTGCT    4380
GGCGATTCCT TCTTTAGGAC AGGTGCGCTA TCTCAGTGCT GTGAAGTATG CAGCGGCAGT    4440
GGTAGGTAAT TCCTCCAGCG GGATTATTGA AGTTCCTGCG TTTGATGTTC CTACCGTTAA    4500
CATTGGCGAA AGGCAAAAAG GCCGGTTGGC TGCCCGAAGC GTGTTGAATT GCCCTGCAAC    4560
GACGGAGTCG ATTGCGAAGG CATTAAGAAT TGCGGTTACG CGCAGTTATA AAAACCGCGA    4620
TGAAGACATT GCGAATCCTT ATGGCCAGGG TGATGCAAGT TCGAAAATCA TTGAGATGAT    4680
                                             orf3的终止orf4的起始
TAAGTCCATG CATTTTGTTC CCGGCAAGAC GTTCTACGAC ATCAAG TGAA ACTAT ATGAC4740
GCTTATCATT GCTGAAGCCG GTGTTAATCA CAACGGCGAC GAAAAACTGG CTTTTGAACT    4800
TGTTGATGCT GCTTATAAGG CCGGGGCTGA TATTGTTAAG TTCCAGACGT TTAAAGCGAA    4860
AAACCTGGTG ACCGAACAGG CAAAGCAAGC CGATTATCAG GTGGCGAATA CTCAACGACA    4920
GGAATCGCAA CTAGCGATGC TAAGCCGTCT TGAACTGTCA TGGGAAGCGC ATCATGCATT    4980
GGTTAAGCAT TGTGAAGCAT TGGGGATAGA ATTTCTTTCC ACGGCCTTTG ATTCAGAAAG    5040
CCTTGATTTC CTGGTGAATG ATCTTGGAAT CAAACGCTTG AAATTGCCTT CTGGTGAGCT    5100
CACCAATGCA CCGTTGGTTC TGGAACATGC CAGAACAGGT TGCGATATTA TTGTTTCAAC    5160
GGGGATGGCC ACTCTTTCTG AAATAGAAGC TGCTTTGGGT GTTATCGCAT TCGGATATAT    5220
CAGTTCAAAG GATGAAAAAC CTTGTATCGA AGCCTTTGAA AGAGCCTATG CAACACGTGA    5280
AGGTCAGAAG TTGCTGAAAG AGAAAGTGAC AATTCTTCAC TGTACGACTG AATATCCTGC    5340
GCCAATGGGT GAAATTAACT TGAGAGCAAT GGATTCCTTA CGAGAAGCTT TTGACCTTCC    5400
TGTGGGCTAT TCCGATCACA GCGAGGGGAT AGCTATCCCT GTAGCAGCCG TTGCCAGAGG    5460
GGCTGTGATT ATTGAGAAAC ATTTCACGCT AGATAAAAAT ATGGAAGGTC CGGATCATAA    5520
AGCTTCACTT GAACCTGATG AACTGGCCGC AATGGTAAAA GCGATCAGGC AAATAGAAAT    5580
AGCGCTAGGA AATAAGGTCA AAGCACCAAC CGTTTCAGAA ATTAAAAACA AGTCGGTTGC    5640
GAGAAAAAGT CTGGTGGCTG CGCAGAAAAT TCGAGCGGGG GAAACTTTTA CCGCGTCGAA    5700
TGTTACAATC AAGAGACCTG GAAACGGGAT GTCGCCTTAT AGCTACTGGG ATATCCTGGA    5760
                                              orf4的终止
AAAAATATCA ACAAAAGAAT ATTTGCCGGG AGATCTGATT ATTGAA TAGC AAACCTGTTG  5820
                                                        orf5的起始
TTCTTATTGG TGGTGGCGGC CATGCCAGTG TCCTACTGGA CATTCTGAAT TCAAAT ATGC  5880
GGGAAGTTAT CGCTGTTGTG AGTCCGCATG ATGTCCCCGC AAGAACGATT TTTTCTGGAA    5940
TCAAAGTATT CCGCACTGAT GACGATATTT TTCAGTACTC AAATAAAGAC ATTGAATTAG    6000
TTAATGGCAT CGGTATGGTT CCGCGATCTT CGGTAAGAAA GAATGTTACG GAATCCTATC    6060
TTCGCCATGG ATATCAATTT GCCAGTGTAA TTGCTAAAGA TGCATTAATT TCCGCACATG    6120
CCCATATTAT GAACGGGGCC CAAGTTCTGT CAGGAACGAT AGTCAATCCT GGGGTAGTAA    6180
TTGGTAGCCA TTCAATAATT AATACCCGTG CGATTATTGA ACATGACTGC CAGATAGGAA    6240
ATCACAGCTT TATTGGACCC GGTGCGGTGT TGTGCGGGCA GGTTAAAACG GGGGAATCAG    6300
TTTTTGTGGG GGCAGGTTCC ACAATAATCC CTGGGATGAT ACTAGGCAGT AATTCAATGG    6360
TGGGTGCTGG CGCAGTATTA GTGCAGTCGT TAGATAATGG GCAAGTTTGC TATCCGGCAA    6420
            orf5的终止orf6的起始
GATCGGTTAT CAAA TAGTGT CTTACAAAAG GTAATTC ATG ATGCAGCATT GGAAAAATGT6480
GCTGATCCGA CCGGACAGCT CACTGCGTGA AGCGCTCGAA ATTATTAACC GTGAAGCTCT    6540
ACGTATCGCG TTAGTTGTTG ATAATGAAAA TAATTTATTA GGTGTCATCA CTGATGGAGA    6600
CATCAGAAGG GGATTGCTGA ATAATCTGGA TCTCTCGGCT AAAACTTCAC AGGTCATGAA    6660
TACTCAGCCA GTCACAGCGA CCAGTAGTGT TTCTTCAGCC GAGTTAAACA CGCTGATGAA    6720
AGTAAAAGGG ATTTTGTCTG TTCCTATCCT TCGCGATGGT AAAGTAATCG GTCTGGAGAC    6780
TATCCAGTCA GTAAATAATA AGAAAAAATA TCCTAACCCT GTGTTTATCA TGGCTGGCGG    6840
ATTTGGAACA AGATTAAAAC CATTAACGGA TTCCTGCCCA AAGCCCATGC TTTGTATCGG    6900
TGGTAAGCCA ATATTAGAAA CCGTAATTCG CAGTTTTGTT AAAGCTGGGT TTAATAATTT    6960
CTATATCTCG ACTCACTATA TGCCTGAGAT TATCAAAGAA CATTTCGGTG ATGGTGAGCG    7020
GTTTGATTCA AAAATCCGCT ATGTACATGA AGAAAAACCG CTGGGCACTG GCGGTGCTTT    7080
AGGTTTGTTA CCTGAAGATT TATCGGATGA ACATCCTCTC ATCATGATAA ATGGCGACGT    7140
CTTGACCAAT GTTGATTACG AGCGTTTGAT TAAATTCCAC ATAGAAAGCA AAGCTGACGC    7200
AACTATGTGT GTACGCGAAT ATGATTATCA AATTCCCTAT GGCGTCATAA AAGGGGATGG    7260
AAATAAAATC ATCTCGATGG AAGAGAAGCC TGTACACCGA TTTTTCGTCA ATGCAGGGAT    7320
CTATGTTGTG TCACCACAAA TCTTCAAAGC AGTGCCTAAA AATCATCGTA TTGATATGCC    7380
AACTCTTCTT GAAGAGCATA TGGATAATAA TGAAAACATC CTTATGTTCC CTATACATGA    7440
GTACTGGTTG GATATCGGTA GAATGGATGA CTTCAAAAGG GCGCAGGTAG ATTACTTTAC    7500
       orf6的终止orf7的起始
ACTAGGTTTT GAC TAATGAA AGCAGTTGCG GTGATTGGAT TAGGTAATAT TGCAGACAGA  7560
CATCGTCGCA ATCTCAAAAA AGTTTATCCC GGTATCAAAG TTTATGCGAT GTCAGCCTCT    7620
GGACGCAAAA TTCATGGTGA AATAAGTGAT TGTGATCAGG TAGTAAATAT CATAGATGAA    7680
CTCTTAGATA TTGTTGATAT GGCTATTATA GCATCTCCAG CAACGTTACA CGCTGGACAT    7740
GCCATACCAT TTATTAAAGC CGGTATACCT GTTCTAATTG AGAAACCTGT TACGGTATCG    7800
ACGTCTGATG CAGAGGCATT ACTGGATGCA TCAATGCGTT TTAATTCGGT AGTCGCTGTT    7860
GGGTATTGTT TGCGCTATTT GCCCTCTGCG CTTTCGTTAA AAAGAGTTTT AGAAGAGAAG    7920
AAAGCAGGCA GAATATTTAA CGCCTTTATC GAGATCGGAC AGTATCTCCC GGACTGGCGT    7980
GTTAGTAAAA ACTATAAAGA AAGTGTCTCA GCTAATAAAG CTTTGGGTGG TGGGGCTCTC    8040
CTGGAGTTAA GCCATGAATT GGATTATACA CGCTGGCTTT TTGGCGAGCT AGATGTTCTC    8100
CATGCTACAG TCCGAAATTC CGGTGTGCTT GATATCGATG TTGAAGATAT AGCAGATATT    8160
ATTGCTATTT CAAAAGATGA AATCGTTGTC AATATTCATT TGGATTTTCT ACAGAAAAAA    8220
GCGTTCAGGA AATGTAGTTT CTTAGGTACA GATGGACGGG TAGAATGGGA TTTGATCAAT    8280
AATCAAGTGA AATTAATTAA TAAATCAGAT GAGTGTTTGA TTTATAATGA ACCGCAATAC    8340
GATAAAAACA CCATGTATTT GGATATGTTG AAAGATTTTG ATAACTATAT ACATGGGCGC    8400
GAGAATCAAT GCATCAAATT GACTGATGCA GTTAAAACCA TCGCATTAGT TAATCGGATA    8460
           orf7的终止orf8的起始
AAAAAGTTGG CAGAA TAAA A TGAAAAATTA TGCTTTTATA TTTGCTCGCG GAGGCTCTAA8520
AGGCCTGCCA GGGAAGAACA TAAAAGAGTT ATGTGGAAAG CCTTTATTAC ACTATGCAAT    8580
CGAGATTGCA CAACTGTCCC CATCAATTGA TAAAGTATTT GTCTCCACAG ATGACGCAGA    8640
CATTAAACAA AAAGCATTAG AATTAAAAGA TGTTGTTGTC ATTGACAGAC CTGATGAACT    8700
TTCTGGTGAT AAAAGTCCTG AGTGGTTTGC GTGGCGCCAT GCTATTGAGT GGGTAACTGA    8760
GCATTACGGG GCATTTGGAC AATTTGTCAG CCTTCCCGCC ACGAGTCCAT TGCGAGAAGT    8820
GCAGGATGTT GAACGTGCCA TTGCTAAACG CATGCAAACA GATGCAGATA TCTGTATCGC    8880
AGTAACGCCA GCATCACGTA GTCCATATTT TAATATGGTC AAAATCAACA GCAATGGCTT    8940
                                                       orf8的终止
GAATGAGTTA GTAATTAGCC CAGAAAGGGG ATGTCTCAAG ACGTCAGGAC TGTCC TGATG  9000
TGTTCGATAT TACTACCGTC GTTTATGTCT CAACTCCCGA ATTTATTCTG AATAATATTG    9060
GATTGTTTTC AGGGAATGTT ACTTCGGTTG AAGTTCCGAA GGAAAGAGCT GTTGATATCG    9120
ATGATATTTA TGATTTTCTT ATGGCTGAAA CCATTCTAAC GATGAAAAAG GAATGTAATT    9180
orf9的起始
AAA ATGATAC TGGAAAATAA AAATATTGTC ATTTTTGGTT CTGGTGGTCT GCTTGGCGCA  9240
TGCCTGACGA AGGCATGCCT TGCAAATGGT TCAAAGGTTA TTGCTGTCGA TCTTGATATA    9300
AACCATATAA AGAATAAATT AAGTGCACAA GGTGTAGCAA CATCTGGCAT GAACATAACC    9360
TACGCTGAGG TTGATGTCAC CAATGAACAA TCTGTCACTG ATTTTTTTAA CTGCCTTGAG    9420
GACATTGATG GAATTGTCAA TGCAACCTAT CCCAGGAATA AAACGTATGG TCGTAAGTTA    9480
TTCGATGTAA CGCTTGCCAG CTTCAATGAA AACTTATCGC TTCACTTGGG TAGCTCCTTC    9540
CTGATTAGCC AACAAGCTGC ACAGTTTTTT ATGCGACAAA AAAAGCCAGT TTCGATGGTT    9600
AATATATCAT CCATTTACGG TGTAATTGCT CCTAAATTCA ATATTTATGA CAATACTCAA    9660
ATGACAATGC CTGTAGAATA TGCGGCAATC AAGTCAGCAT TATTACATTT GAATAAGTAT    9720
ATTGTAGCGT ATGTCAATAA TAGTGACTTC CGCATTAATT CAGTAAGCCC CGGTGGAATT    9780
TTTGACAACC AACCAGCTGA ATTTTGTGAG GCATATAGAA AAAACACTCA TGGAACTGGA    9840
ATGCTGGATG TTAATGAAAT GACGGGATCC ATTGTTTTCT TGCTGTCAGA TCAATCAAGA    9900
                                             orf9的终止
TATGTTACAG GTCAGAACAT TATCGTTGAT GATGGTTTCT CACTT TAGTT TTTATCATTT  9960
ATTGAATGAA TATTAAGTTT GAAATGTTGA TTTTTACATT TGCATTTTGG AAATGAAGAG    10020
          orf10的起始
GTAGTTAAAT TTA ATGTTAT CAAAAATAAA AACGATACTT CGCTATCTCA AACCCTATCA  10080
GCGAGATGAA ATTGAAAATA AGTTTGTAGA ATTGAACAGC GGGTTATGGA AGTCAGAGAA    10140
ATCAACTAGA ATTCAAACTA ATAGAAAAAA AGAATATTGT CTGGTTGAGG GTATCATTGC    10200
ATGTCCTGCA AGTATTATGG ATAAGGCAAG AATAGCAAAG GCAATACAGC AAGAAACAGG    10260
AGTCCAACCT GTTGTATATA TTGAGGCTTT AATTTTACAG GTAGCAATGC CAGTCATATT    10320
TATAATCTTT CAATATAATC ATTTTTATTG CTGGTGGCGT GGACTCTTCC ATCCTAAGGT    10380
GTTTGTACCC GCTGTCATTG CAACACTTAA AGCCATGTCA GGATCGAGGT CTGCAAAATC    10440
TTTGATCAAT CTAAACTATC GCGGCGTTGA GATTGGTGAT CTCATTTACG ATACTCTCAT    10500
TCGATTCAGA CCTAACGAAT ATACTGTTAA AAAAATTGAG GTTAAACATT TAAGATTGAT    10560
ATTCAGATCA TTTCTAACAT TTCATAACAA TGAGTTAATG TTGGAAAAAT ATAATCCGAA    10620
ATATCTTGTA ACTAGCCATA ATGTCTATGC TGAATTTGGC ATGTTGCCTC GTCAAATTAG    10680
ACATCACAAT AACGGCATAG TATTCCTTAA AGATATATAT GCCTATAAAT GTTATGGACC    10740
TGCAATAAAT ATTAAAGAAC ACTTCCTGAA ACCAACGCAA GAAGCATTTT TGCAGAACCT    10800
TCATGCAATT GATTTTGTTG ACAGAGCGTA TAAATATTTC TATGACAGAT TAGAAGGTAA    10860
CGTTGATCAA ATAGATGTAA AAAATGCTTA TCAAAATAAG AAAAAATATA GTATTGAACA    10920
GTTAAAATCT ATTTACCCTA AAGTTGATAT TCGTAAAAAA AATGTTGTTG TCATGTCACA    10980
TGCGTTCTCT GACTCACCTC ATGTTGGTGA GGGGTTACTA TTTAATGACT ATTATGATTT    11040
CTTGGAAAAA ACGCTAATTC GCCTCAATAA AAATCGAAAT ATTAACTGTT TTGTAAAAGC    11100
TCATCCAAGT TCGTACATGT GGAATGAAAA GGGAGGAGTT GAGAGCTTAA TTGAGGCTAA    11160
TCAACTGGAT AATATTTATA TGATGCCGGT TGATTTGAAT ACTAATTCTA TTGCAGATTT    11220
TGCAGACAGC ATTGTTACGG CAAAAGGGAC GGCAGGACTG GAATTTTCAT GCCTTGGGAT    11280
TCCTGCAGTA ACTGCTGGAA AAGGATACTA TGCCGGTTTT GGTATTACCC TTGAACCTGA    11340
ATCTGTTCAA TCTTATTACA ATATTTTAGA TTCGATCTCG GGGTTAGCAA AACTGGATGA    11400
TGAAGTTCGT AAACGGGCAT TAGTATTGCT TTATATGGTA TCGTTGAGCC GGAGACATTC    11460
TGATATTTTA CCTAAGCAAC ACATCATGCC ACATGAAAAT TATAATGATG TCTACCTGAG    11520
TAAATATCAA GAAATTATCG CTAATATCGA AAATAATATA CCTATGCGTG ATGGCTTTTA    11580
                               wzx的起始orf10的终止
TGAAGAGGTA ATTCAGGACG TGGTGAAAAA CC ATGAT TAA AAAAGGGTTA ATATATATAT11640
TGATAAATTA TGCTATTCAA TTTCTCAATA TATTCCTTAG TCTAGTCATG ATGAAATATC    11700
TCACAACAGC TCAGCTAGGT GATCTTACTC TTGCTAGAAC CTGGCAGCAA TTTGTGGACT    11760
ATTCACACTT TGGTGCACGA TTTTCCTTAG ATCGATTTAT TCCACTAAAA AAGGAAAGAG    11820
AAAAAAAATT ATTAGTTACA ACTGTATTGT TAACGAATAT TATTGGGGCG TTAACAATTT    11880
TGTTGGTGGC TTTATTTTTT AACCATTCTA ATTTGACAGT TATTATACTC ACCTTGTGTG    11940
GAGTATTTAT ATCGATAAGT AATATTATTA AAGCATACTA TCGGGCGACA AACCGGATTG    12000
ACGAAATGCT TTGGCTAGTT TTATATTCAC AGTTCTTTCC TGTGCTTATT CCACTAGTGT    12060
TGTATATCAT AACGCACAAT TTTGATGTTT ATATTTACTC GAGTTTAGGT TGCTATGCTT    12120
TAGCTATTAT AAGACTGTAT AGAGTGGAAA AGGGACTAAA AAAGTTCCTG ATCCCTAAGT    12180
TGTTGTTAAC AAGATTAAAG TTCTTGTTTA AACCATCGGC TTTGTTATTC CTTAATGCAA    12240
TATTTACCTT TTTATATCTT GTCATGGACC GTTTTTTTAT TGATGATTCC GGTGGTCGTG    12300
AGCAACTAGG TAATTATAGC GTTATCATAT TCGCATTTAG TGCCCTAATG ATAATTCCCT    12360
CGACCTGTGC GGAGTTGCTT TTTGTCAAAG TTATTAGGCA GTGTAGTCAA AGTGGTAAGC    12420
GTTTGTTTGT TAAAGAGAGT CTTATTATGC TTGTAGTAAC ATTGTCGGGC GTAATTATTG    12480
CAAACGTTGT TATGAAATTT TTTATAGAAA ATTTCACTAA GTATGGAAAC CTCGTTTCTG    12540
AATTACATAT GGCAACACTT GCTGTTATCC CCTTTGCATT TACTGCAATA TATTACCATG    12600
TAATGAATGG ATTAGATTTG CGCAAACAAA TGGTGTGTGT CAGTGGTGTT GTTTGTCTCA    12660
TTTTGATGTC ATATTATTGC ATCCCAGTAT TCGCCAATGT GAAATTTGAG CTAGAAGACT    12720
ATCTATATGG AAAATTGGCT ACAGGATGGT TAGTGTTACT TGGTTATTGT TATTTCATTT    12780
                                 wzx的终止wzy的起始
CGCGCGCAAA GCATCTCGCG TATAATAATA AG TAAATTCG CGGTAGAGCC CATT ATGATC12840
TCAATTGCAT TCTTTATAAT AGCTTTGATC TTATATTCTT TAATTGTTTT AAAAACAAAA    12900
GATATTATTC ATCCTCTTGG AATTGGTATT GTTTTTTGGT ACTTCTCAGC TTCCCTGTCT    12960
ACGGTTGATA TTCTGTATGA CCATCAATTG CAATCAGAAT TAAGTCTGGA AACACTAAGT    13020
GCTATTTTAC TTGCTGGTGT TTTCTTTGTT GCCCCATTTG TATTTTCAAA AAAGATAGAT    13080
AAAAATAATT TTAGTTTTCA GCGTTTTGAC TTTAACTTAT TTTATCGCGT ATTTTTTAAT    13140
TTTATTGTAG CTTTATCAGT CGTTGCTTTC TTTATGCGCT TTGGAGTGAT GCTCACTAAT    13200
CCACCACTTC TGTCTGGTGC AGGAAGTGAT TTAAAATCAT TAGTTCCAAA TGCGCCTCCG    13260
TTGTTGAATT TCATAGATGT ATCAATGCCT TACATAGCAC TTGCTGCTCT ATTTGAACTT    13320
AAGTACTCAT ATCGACAAGG GCGTGTGAGA AAGTATTTCC TTCTATCCTA TGTTTTTTTC    13380
AGTATTGTAG TTGCATTGGT TTATGAGGTA TCAAGGGGAG AATTTTTAGT ATTCATGTTA    13440
GGTGCCATCT ATATTTTTCT GATTCCACGT AAAATTACGC TAGGGTTCAA ACAACTAATG    13500
ATGGTTATGC TACCGATGGC ATTGCTTTTG TATATCGGTG CAATGCGGAT TTCAGAAACA    13560
AGTCGCGCCT CTACTCAATT TGGTGATGGG ATGGCAAATT CGCTTTTTAG CCAGATTTAC    13620
ACCTATGTTG CAATGAATTT TCAGAATCTG AATTTATTAA TTAACTCATC ATTCGAACCC    13680
ACATATATAT GGGGTGGTCT TAAGTTTATT CTTAAGCCGT TCTTTGGTAC CTATTACGAT    13740
AGTAACTCCA TGGGGTTCAC TGACTATGAG GTTGGTTTTT TCAATGCAAA AACATTTATA    13800
TACTATTTCT ATAATGATCT AGGATTAGCT GGTGTAATAC TCTATTCATT TATTATTGGC    13860
TTATTGCTTC AAATTATCTA CAATAAAACA TCCAGCAATA TTAAATATTG TCTGTTACAG    13920
GCGTGTTTTA TGAAAGCGAT CGTGTTTATG CTGTTTGGAA ACTATTTCTT TGGGGAATTT    13980
GTCTTAATCA TTCCATACTT AATTGTGTTG TTCCTTTTGC TGCTCATTAG AAAAGTCGAG    14040
                                 wzy的终止
CCTCGAAGGA TAGAAAATAC ACCTAAAAAA  TAATCCTTTT TCGACGAAGA TGTCTATAGC  14100
                       orf13的起始
AGTTAAAATA AGGGAAGATA TTG ATGAGTT TGCTGATTAA TGCATCTAAT CTGTATGTGG  14160
GTGGTGGTGT TCAGGTTGCT GTATCTGTAT TAGAAGAGTT AACTAAAGGT GGGCAACATT    14220
TCATTGCAGC AGTTTCACCT GTAGTTGCGA AACAACTCTC AGGAGAAACA CTATCAAGAT    14280
GCAAAATTAT CAGAAAAACA CCATCAAATG TGTTCAATGT TGAATCAAGA CGAGATTTAG    14340
ATCAGCTCGT TGCTGAAAAT AAAATTACGA AAGTCTTTAC GATATTTGGC CCAAGTTACT    14400
GGAGCCCGAA GAATGTTAAG CATGCCGTTG GATTCGCGTT GCCATGGCTG ATTTATGATG    14460
TGAGCCAAGT ATTTCCGAAG TTAAGTTTTC GTGAAAAGGT AAAAAAGATA CTTTTACTGC    14520
GCCTACAACC TTATTTTTAT AAAAAAAATG CAGATCTTAT GTTTGTTGAA ACTGATGATG    14580
CTAAAAATAA ACTTGTGGAA CAATATCATT TTAAGGACAG TCATGTCGTC ACTGTTCCTA    14640
ATACAATCAA TGCGATTTTG CAGAATGAGG ATTTATACGA TAATAGTATC TTAGAAGATT    14700
TACCGGAGAG GAATGTGGGG GACATTTACC TTCTGACAAT TTCACATGAT TATCCTCACA    14760
CAAACCTAAC CGTGATACCC AAGCTAATTG AGTTATTGCC AGATAATTAC AAGTTCATTG    14820
TTACGTTAAG TTCTTCGATG GCGGATATTC CCGAACGGTA TAGCCATCGT GTAATTAATG    14880
TTGGGCCAGT TTCCATTAAT CAATGTCCAG CATTATATCA TTATTGTGAT GCACTATTTT    14940
TGCCAACGTT ACTGGAGTGC TTCAGTGCCA GTTATGTAGA AGCCATGTAT TTCAAAAAAA    15000
TGATCTTCAC GTCTGACCTA CCATTTGCTC ATACAGTGTG TGACGACAGC GCAATATATT    15060
TTGATCCTTA TGATGCCAAT GATATTTGTG ACAAAATCAT TTCTGGAGTT GAAGGCGTAC    15120
ACGATAAAGT GATAAAGCAA GAAAAGGCCG ACTTAATTTT TAGCAAGCTT CCAACGGCTA    15180
                                          orf13的终止
AAGAAAGGGC CTTAATGTAC ATGCGCAGCA TTGATAAGTT A TAAGATTTC TTAAGAGGTA  15240
fnl1的起始
TTAA ATGTTT TCAGATAAAG TTCTTTTGAT TACAGGCGGA ACAGGTTCCT TTGGAAATGC  15300
AGTTTTAAAT CGTTTTCTGG AAACTGATAT TAAAGAAATT CGCATTTTCT CGCGCGATGA    15360
AAAAAAGCAA GATGATATGC GCAAGAAATA CAATAGTGAG AAGCTTAAGT TTTACATAGG    15420
CGATGTCAGG GATTATCGCA GTGTACTCAA TGCCAGCCGT GGCGTTGATT TTATCTACCA    15480
TGCTGCCGCC CTTAAACAAG TGCCATCATG TGAATTCCAT CCAATGGAAG CGGTTAAGAC    15540
TAACGTGCTC GGCACCGAAA ACGTTCTCGA AGCTGCAATT GCAAACGAAG TAAAACGCGT    15600
TGTGTGTTTA AGTACTGATA AAGCGGTTTA TCCAATCAAT GCCATGGGTA TCTCTAAGGC    15660
GATGATGGAG AAAGTCATGG TCGCTAAATC CCGAAATGTA AACAGCAATA AAACGGTGAT    15720
TTGTGGTACT CGCTATGGCA ACGTTATGGC ATCTCGTGGT TCGGTGATTC CGCTGTTTGT    15780
TGATCTGATC AAAGCAGGTA AAGCGCTGAC TGTCACTGAT CCAAACATGA CTCGTTTCAT    15840
GATGACCCTT GAGGATGCTG TCGATCTGGT GCTTTATGCA TTTGAGCACG GTAATAATGG    15900
CGACATTTTT GTACAAAAAG CGCCTGCAGC TACGATTGAA ACATTAGCAA TTGCTCTGAA    15960
AGAGCTTCTG AATGTCGAGC ACCATCCTGT CAATGTCATT GGTACCCGCC ATGGAGAAAA    16020
GCTCTATGAA GCGCTGCTGA GCCGTGAAGA GATGATTGCG GCCATCGATA TGGGTGATTA    16080
CTATCGCGTA CCACCTGATT TGCGTGACCT TAACTACGGA AAATATGTAG AACAAGGTGA    16140
CAGCCGTATC TCCGTTGTTG AAGATTATAA CTCCCATAAT ACACAGCGAC TGGATGTAGA    16200
AGGGATGAAA ACGCTGCTTC TTAAGTTGCC GTTTATTCGC GCACTGCGTG CTGGTGAAAA    16260
            fnl1的终止fnl2的起始
TTACGATCTG GACGCC TGAC  ATGAAAATCC TGATTACTGG AGCTGATGGC TTTATCGGAC16320
GTAACTTGTG CTTACGCCTT CAGGAAGCAG GGTATGTTGA CCTTGTTAAG ATTGACCGTG    16380
ACTCAAGTGC GGCCGAGCTT GAAATTGGCC TGCAAGATGC GGATTTCATT TATCACCTTG    16440
CGGGTATCAA TCGACCTAAA AATGTCGAAG AGTTTGTCGA AGGGAATTGC AATTTTACTC    16500
AGCAGATTGT GGATTCTCTG TTAGCGAAGA ACAAAAGCAT ACCTATTATG ATCAGTTCTT    16560
CGATCCAGGC TGAACTGGAT AATGCGTATG GTCAGAGTAA GGCTGCAGCT GAAAAACAAA    16620
TTGAGCGTTA TGCAGCAGAA AGTGGTGCAG CATATTATAT CTATCGGTAC CCAAATGTTT    16680
TTGGTAAATG GTGTAAACCG AACTATAACT CGTTCGTGGC TACCTTCTGC CATAACATTG    16740
CCAACAATAT TGACATAACC ATCAATGACC CTTCGGCACC GGTTAATCTG GTTTATATCG    16800
ATGACGTTTG CACACATGCG ATAAAACTTC TCACAGGAGA GGTTCATAGC GGATATAAAG    16860
GCGTTGTGCC GGTTTACTCA ACGACAGTTG GTGAGGTGGC GGAATTACTT TATCGTTTCA    16920
AGGAGAGTCG TTCTACGCTT GTCACAGAAG CTGTGGGGAC GGGAATGACC CGAGCGCTAT    16980
ATTCGACGTG GTTAAGTTAC TTACCAGCCG AAAAGTTTGC TTATACGGTG CCGTCCTATG    17040
GTGATGCCCG CGGGATCTTT TGTGAGATGT TAAAAACGCC TTCAGCGGGG CAGTTTTCAT    17100
TTTTCACAGC GCATCCCGGT ATAACGCGTG GTGGGCATTA TCATCACACC AAAAATGAGA    17160
AGTTCCTGGT CATCCGTGGA CAGGCGTGCT TCAAATTCGA ACATGTGATT ACCGGTGAAC    17220
GTTATGAACT GAATGTTTCA TCCGATGATT TCCAAAAAAT CGTTGAAACA GTACCCGGCT    17280
GGACCCATGA CGTCACGAAT GTTGGCAATG ATGAATTAAT AGTTATGCTC TGGGCAAACG    17340
                                         fnl2的终止fnl3的起始
AAATTTTCAA TCGTGATGAG CCTGATACTA TTGCGAGACC TCTG TAATGA AAAAATTAAA  17400
AATTATGTCT GTGGTTGGGA CACGTCCTGA AATCATCCGT TTATCACGTG TTTTGGTCAA    17460
ACTTGACGAA CATTGTGAGC ATATTCTTGT CCATACTGGG CAAAATTATG ATTATGAGTT    17520
GAACGAAGTA TTCTTTAACG ATCTTGGTGT CCGTAAGCCA GATTATTTCT TAAACGCTGC    17580
AGGGAAAAAT GCGGCGGAAA CCATTGGTCA GGTTATCATC AAAGTTGATG AAGTATTAGA    17640
AACCGAAAAA CCTGAAGCAA TGCTGGTGCT GGGCGATACC AACTCATGTA TTTCTGCCAT    17700
TCCTGCCAAG CGTCGTAAAG TGCCTATCTT CCATATGGAA GCTGGCAACC GTTGTTTCGA    17760
TCAGCGTGTA CCCGAAGAAA CTAACCGACG AATTGTTGAT CATACGGCTG ACATCAATAT    17820
GACCTACAGC GATATTGCGC GTGAATATCT CCTGGCTGAA GGTATCCCGG CGGATCGGAT    17880
CATTAAAACC GGCAGCCCTA TGTTTGAAGT GCTTTCGTAC TATATGCCTC AAATTGATGG    17940
TTCGGATGTG TTGTCACGTC TAAATTTGCG CCCTGGTGAA TTCTTTGTCG TTAGCGCACA    18000
CCGTGAAGAG AATGTCGATT CTCCGAAGCA ACTCATCAAG CTTGCGACCA TTCTAAATAC    18060
CATTGCCGAA AAATATGATC TGCCAGTCAT TGTATCCACA CATCCGCGGA CACGTAATCG    18120
TATTAATGAG CAAGGGATTG AATTCCACCC AAATATTAAT CTGCTGAAAC CGTTAGGTTT    18180
CCATGATTAC AATCACCTGC AAAAGAATTC ACGTGCTGTG TTGTCAGACA GCGGCACAAT    18240
TACTGAAGAG TCATCCATCA TGAATTTTCC TGCTGTAAAC ATCCGGGAAG CACATGAACG    18300
TCCGGAGGGC TTTGAGGAAG CATCCGTCAT GATGGTGGGA CTGGAGTGTG AACGCGTGCT    18360
TCAGGCGCTT GAAATTTTGT CGACACAACC TCGCGGGGAG ACCCGTCTCT TACGGCAGGT    18420
TAGTGATTAC AGTATGCCAA ATGTGTCGGA TAAGGTCGTC AGAATCGTTC ACTCTTATAC    18480
                              fnl3的终止wbuB的起始
AGATTACGTC AAGAGAGTCG TCTGGAAAGA ATAT TGATGA AACTTGCTTT AATCATAGAT  18540
GATTACCTGC CCAATAGTAC CCGTGTTGGT GCAAAAATGT TTCATGAGTT AGCTCAGGAA    18600
TTTATTCGCC GTGGCCATGA TGTTACGGTA ATTACTCCTG ATACAAGCCT GCAAGAAGAG    18660
GTGTCGTTTG ACAGCTTTCA GGGTGTCAAA ACATGGCGTT TTAAAAGTGG TCCGCTCAAG    18720
GATGTAAGTA AAGTTCAGCG AGCCATCAAT GAAACACTTT TGTCTTGGCG GGCCTGGAAA    18780
TCTATTAAAA GCCGGATAGA AGAAGAAACT TTCGATGGTG TGGTTTATTA CTCACCGTCT    18840
ATTTTTTGGG GGCATTTAGT TAAGAAGATT AAAGCCCGCT GCCAATGTCC GGCTTATTTA    18900
ATATTGAGAG ATATGTTTCC TCAATGGGTA ATTGATGCTG GAATGCTAAA AGAGGGATCC    18960
CCAATTGAAC GTTATTTTCG TCTCTTTGAA AGATCATCTT ATCGTCAGGC AAACCGTATT    19020
GGACTCATGT CTGATAAAAA CCTTGATGTT TTTCGGGTGA CAAACAAGGG CTATCCTTGC    19080
GAAGTTCTAC GTAACTGGGC ATCTCTCACG CCGACGGTAT TATCCCCAGA ATATGTGCCA    19140
CTGCGTAAGC GCCTCGGTCT AGAGGATAAA GTGATTTTCT TCTATGGAGG AAATATCGGG    19200
CATGCACAGG ATATGGCAAA TCTTATGCGT CTTGCCCGAA GTATGGCAGA GCATCCACAA    19260
GCTCATTTCC TGTTCATTGG CCAGGGTGAT GAAGTGGAAT TAATTAACTC TCTGGCTACT    19320
GAGTGGGCAT TGTCGAATTT CACGTATCTG GCTTCGGTGA ATCAGGAAGA ATTTAAGTTC    19380
ATCTTATCGG AAATGGATAT AGGCCTGTTT TCTCTTTCTG CCAAACACTC TTCTCACAAT    19440
TTTCCGGGTA AGTTGTTAGG TTACATGGTT CAGTCTCTAC CTATATTAGG TAGCGTGAAT    19500
GCTGGAAATG ATCTGCTCGA CATCGTCAAT CAAAATAACG CAGGATTAAT CCATATCAAT    19560
GGAGAGGATG ACAAGCTTTA CCATTCTGCG CTGTTAATGC TTTATGACAT TGATGCGCGC    19620
CAGCGATTTG GTCTGGGCGC GAACAAGTTG TTAAAAGAGC AGTTCTCCGT TGAGTCTGCG    19680
                                 wbuc的起始     wbuB的终止
GCGCGGACGA TAGAAATGAG GCTGGAGGCA TGCA ATGCGA TTAAT TGATA ATGACCAGCT19740
TGAGGCATTA TACGAACAAG CAGAGCAATC CGAGCGCCTG CGTTCCCATC TTTTGATGCA    19800
TAGTTCGCAT CAGGATAAGG TGCAACGACT ACTCATTGCC CTGGTCAGTA GTAGCTATGT    19860
AGAACCTCAT TTCCATGAAC TTCCTCATCA GTGGGAAATG TTTATCGTCA TGCAGGGCCA    19920
GCTTCAGGTT TGTTTGCATG GCAAAGATGG AGAAGTCGTT AAGCAATTTA TTGTCGGAGA    19980
AAATACAGAA ATTAACATTG TGGAGTTTTC TCCGGGAGAC ATACACAGTG TCAAATGCTT    20040
GTCTCCTCGT GCTCTCATGA TGGAGGTGAA AGAGGGACCA TTTGACCCTT CCTTTGCTAA    20100
        wbuc的终止
AGCATTTGTT  TAATACCATC GTGAATCACA TCTTACGCTA TCCACCTGGC TTCATCCTGA  20160
GTTAACATCA GCAATACATT CAAGCCGTGC ATAAATCGCG GTGACCACCC TCTGACAGGA    20220
GTAAACAATG TCAAAGCAAC AGATCGGCGT CGTCGGTATG GCAGTGATGG GGCGCAACCT    20280
TGCGCTCAAC ATCGAAAGCC GTGGTTATAC CGTCTCTATT TTCAACCGTT CCCGTGAAAA    20340
GACGGAAGAA GTGATTGCCG AAAATCCAGG CAAGAAACTG GTTCCTTACT ATACGGTGAA    20400
AGAGTTTGTT GAATCTCTTG AAACGCCTCG TCGCATCCTG TTAATGGTGA AAGCAGGTGC    20460
AGGGACGGAT GCTGCTATTG ATTCCCTCAA GCCATACCTC GATAAAGGTG ACATCATCAT    20520
TGATGGTGGT AACACCTTCT TCCAGGACAC CATTCGTCGT AACCGTGAGC TTTCTGCCGA    20580
AGGTTTTAAC TTTATCGGTA CCGGTGTTTC CGGTGGTGAA GAGGGCGCGC TGAAAGGTCC    20640
TTCCATTATG CCTGGCGGCC AGAAAGAAGC CTATGAACTG GTTGCTCCGA TCCTGACCAA    20700
AATCGCCGCC GTTGCTGAAG ATGGCGAACC GTGCGTTACA TATATTGGTG CCGATGGTGC    20760
GGGTCACTAT GCGAAAATGG TTCACAACGG TATTGAATAC GGTGATATGC AACTGATTGC    20820
TGAAGCCTAT TCTCTGCTTA AAGGTGGTCT GAACCTCACC AACGAAGAAC TGGCGCAGAC    20880
CTTTACCGAG TGGAATAACG GTGAACTGAG CAGCTACCTG ATCGACATCA CCAAAGATAT    20940
CTTCACCAAA AAAGATGAAG ACGGTAACTA CCTGGTTGAT GTGATCCTGG ATGAAGCGGC    21000
TAACAAAGGT ACCGGTAAAT GGACCAGCCA GAGCGCACTG GATCTAGGCG AACCGCTGTC    21060
GCTGATTACC GAGTCTGTGT TTGCACGTTA TATCCCTTCT CTGAAAGATC AGCGCGTTGC    21120
CGCATCTAAA GTTCTCTCTG GCCCGCAAGC GCAGCCAGCA GGCGACAAAG GTGAGTTCAT    21180
CGAAAAAGTT CGCCGTGCGT TGTATCTGGG CAAAATCGTT TCTTA                    21225
本发明的有益效果是：本发明的目的是寻找并应用该细菌的特异分子标识物(分子探针)，即特异核苷酸序列，因此本发明的技术方案具有独特性，其与常规研究方法的不同之处是，寻找到具有特异性的核苷酸序列，并通过可靠的实验数据确保分子标识物的特异性，即可利用本领域技术人员公知的成熟技术(如PCR或基因芯片等)，应用该标识物检测细菌的技术，使所有本领域技术人员都可以根据本发明提供的技术内容，很容易的实现本发明的目的并取得预期的使用效果。本发明中已经提供的实验数据，充分证明了该核苷酸序列的特异性，并可以应用于该细菌的检测，应用本发明的现代分子生物学细菌鉴定方法相对于传统的血清学免疫反应，具有快速、准确、低成本的优势。本发明测序并用生物信息学软件推测各个基因的功能，是为了寻找特异性核苷酸，细菌中有一些特定功能的基因是高度特异的，利用以上方法推测出这些特定功能的基因以及它们的位置，然后利用实验进行证明，将推测出的这些基因的功能，作为一种路标去更好更快的寻找到特异性核苷酸，这样，可以减少研究实验的盲目性，加快实验的进度，降低实验经费。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (10)

1、一种对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于：其是如SEQ ID NO：1所示的分离的核苷酸，全长21225个碱基；或者所述具有一个或多个插入、缺失或取代的碱基，同时保持所述分离的核苷酸功能的SEQ ID NO：1的核苷酸。
2、按照权利要求1所述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于：其包括命名为orf1、orf2、orf3、orf4、orf5、orf6、orf7、orf8、orf9、orf10、wzx、wzy、orf13、fn11、fn12、fn13、wbuB、wbuC的18个基因组成，都位于galF基因和gnd基因之间。
3、按照权利要求2所述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，所述基因中具有高度特异性的基因是：转运酶基因，其包括wzx基因；聚合酶基因，其包括wzy基因；糖基转移酶基因，其包括orf13、wbuB基因；其中所述的基因：wzx是SEQ ID NO：1中的11613至12815碱基的核苷酸；wzy是SEQ ID NO：1中的12835至14073碱基的核苷酸；orf13是SEQ IDNO：1中的14124至15224碱基的核苷酸；wbuB是SEQ ID NO：1中的18517至19728碱基的核苷酸。
4、按照权利要求1或2所述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于：其还包括源于所述的wzx基因、wzy基因或糖基转移酶基因orf13、wbuB基因以及它们的混合或它们的重组。
5、按照权利要求4所述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸，其特征在于，其中源于wzx基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的11775至11792碱基的核苷酸和12638至12655碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的12344至12361碱基的核苷酸和12748至12766碱基的核苷酸；源于wzy基因的寡核苷酸对是：SEQ ID NO：1中的13194至13213碱基的核苷酸和14012至14029碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的13605至13623碱基的核苷酸和13940至13957碱基的核苷酸。
6、权利要求1所述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸在检测表达O-抗原的细菌、鉴定细菌的O-抗原和细菌的其它多糖抗原中的应用。
7、权利要求1所述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸的重组分子，在通过插入表达而提供表达大肠杆菌O108型的O-抗原，以及制备细菌疫苗中的应用。
8、按照权利要求1所述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸的应用，其特征在于，它作为引物用于PCR、作为探针用于杂交反应与荧光检测、或者用于制造基因芯片或微阵列，供检测细菌的应用。
9、权利要求1所述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在培养基中培养大肠杆菌O108型，离心收集细胞；得到的基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O108型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O108型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，将得到的PCR产物，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并该long PCR产物，并用DNA纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：将Long PCR纯化产物应用鸟枪法构建O-抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的克隆用实验室常用的DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：应用生物信息学软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；
(6)特异基因的筛选：针对大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，确定wzx、wzy基因对大肠杆菌O108型的O-抗原的高度特异性；
(7)引物灵敏度的检测：培养大肠杆菌O108，细菌计数后分别将5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌加入到一定量的某种待检测物中，混入细菌的待检测物作为检测用样品，将样品加入LB培养基，取一些与样品混合过的LB培养基过滤，将过滤液进行培养，从培养好的菌液中取数毫升处理后作为PCR模板用寡核苷酸进行PCR反应，检测其对大肠杆菌O108的灵敏度。
10、根据权利要求9所述的对大肠杆菌O108型的O-抗原特异的核苷酸的分离方法，其特征在于，其包括下述步骤：
(1)基因组的提取：在5mL的LB培养基中37℃过夜培养大肠杆菌O108型，离心收集细胞；用pH值为8.0的500ul 50mM Tris-HCl和10ul 0.4M EDTA重悬细胞，37℃温育20分钟，然后加入10ul 10mg/ml的溶菌酶继续保温20分钟；之后加入3ul 20mg/ml的蛋白酶K、15ul 10％SDS，50℃温育2小时，再加入3ul 10mg/ml的RNase，65℃温育30分钟，加等体积酚抽提混合物，取上清再用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇混合溶液抽提两次，取上清再用等体积的乙醚抽提以除去残余的酚，酚∶氯仿∶异戊醇的混合体积比例为25∶24∶1；上清用2倍体积乙醇沉淀DNA，用玻璃丝卷出DNA并用70％乙醇洗DNA，将DNA重悬于30ul TE中；基因组DNA通过0.4％的琼脂糖凝胶电泳检测；
(2)通过PCR扩增大肠杆菌O108型中的O-抗原基因簇：以大肠杆菌O108型的基因组为模板通过Long PCR扩增其O-抗原基因簇，首先根据经常发现于O-抗原基因簇启动子区的galF序列设计上游引物为#1523-ATT GTG GCT GCAGGG ATC AAA GAA AT，再根据O-抗原基因簇下游的gnd基因设计下游引物为#1524-TAG TCG CGT GNG CCT GGA TTA AGT TCG C；用Boehringer Mannheim公司的Expand Long Template PCR方法扩增O-抗原基因簇，PCR反应程序如下：在94℃预变性2分钟；然后94℃变性10秒，60℃退火15秒，68℃延伸15分钟，这样进行30个循环，最后，在68℃继续延伸7分钟，得到PCR产物，用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物的大小及其特异性，合并5管long PCR产物，并用Promega公司的Wizard PCR Preps纯化试剂盒纯化PCR产物；
(3)构建O-抗原基因簇文库：用被修改的Novagen DNaseI shot gun法构建O-抗原基因簇文库，反应体系是300ng PCR纯化产物，0.9ul 0.1M MnCl2，1ul 1∶2000稀释的1mg/ml的DNaseI，反应在室温中进行，酶切10分钟使DNA片段大小集中在1.5kb-3kb之间，而后加入2ul 0.1M EDTA终止反应；合并4管同样的反应体系，用等体积的酚抽提一次，用等体积的酚∶氯仿∶异戊醇的混合溶液抽提一次，酚∶氯仿∶异戊醇的混合体积比例为25∶24∶1再用等体积的乙醚抽提一次后，用2.5倍体积的无水乙醇沉淀DNA，并用70％乙醇洗沉淀，最后重悬于18ul水中，随后在此混合物中加入2.5ul dNTP(1mMdCTP，1mMdGTP，1mMdTTP，10mMdATP)，1.25ul 100mM DTT和5单位的T4DNA聚合酶，11℃30分钟，将酶切产物补成平端，75℃终止反应后，加入5单位的Tth DNA聚合酶及其相应的缓冲液并将体系扩大为80ul，70℃反应20分钟，使DNA的3’端加dA尾；此混合物经等体积氯仿∶异戊醇的混合溶液抽提和等体积乙醚抽提后与Promega公司的3×10-3的pGEM-T-Easy载体于16℃连接10小时，总体积为90ul，氯仿∶异戊醇的混合体积比例为24∶1；其中有9ul的10×buffer和25单位的T4DNA连接酶，最后用1/10体积的pH值为5.2的3M NaAc和2倍体积的无水乙醇沉淀连接混合物，再用70％乙醇洗沉淀，干燥后溶于30ul水中得到连接产物；用BiO-Rad公司的电转化感受态细胞的制备方法制备感受态大肠杆菌DH5α细胞，取2-3ul连接产物与50ul感受态大肠杆菌DH5α混合后，转到BiO-Rad公司的0.2cm的电击杯中电击，电压为2.5千伏，时间为5.0毫秒至6.0毫秒，电击后立即在杯中加入1ml的SOC培养基使菌复苏，然后将菌涂在含有氨苄青霉素、X-Gal和IPTG的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，次日得到蓝白菌落，将得到的白色菌落即白色克隆转到含有氨苄青霉素的LB固体培养基上培养，同时从每个克隆中提取质粒，并用EcoRI酶切鉴定其中的插入片段的大小，得到的白色克隆群构成了大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇文库；
(4)对文库中的克隆测序：从文库中挑选插入片段在1kb以上的96个克隆用本实验室ABI3730型DNA自动测序仪对克隆中的插入片段进行测序，序列达到100％的覆盖率，从而获得O-抗原基因簇的所有序列；
(5)核苷酸序列的拼接及分析：用英国剑桥MRC分子生物学实验室出版的Staden package软件包的Pregap4和Gap4软件拼接和编辑所有的序列，从而得到大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的核苷酸全长序列；序列的质量主要由两个方面来保证：1)对大肠杆菌O108型的基因组作5个Long PCR反应，然后混合这些产物以产生文库，2)对每个碱基，保证3个以上高质量的覆盖率，在得到大肠杆菌O108型O-抗原基因簇的核苷酸序列后，用美国国家生物技术信息学中心的orffinder发现基因，找到18个开放的阅读框，用blast系列软件与GenBank中的基因比较以发现这些开放的阅读框的功能并确定它们是什么基因，再用英国sanger中心的Artemis软件完成基因注释，用Clustral W软件做DNA和蛋白质序列间的精确比对，最后得到大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇的结构；
(6)特异基因筛选：针对大肠杆菌O108型的O-抗原基因簇中的wzx、wzy基因设计引物；在每个基因内各设计了两对引物，每对引物分布在相应基因内的不同地方，以确保其特异性；用这些引物以166株大肠杆菌和43株志贺氏菌的基因组为模板进行PCR，除在含大肠杆菌O108组中得到了预期大小的一条带外，在其他组中都没有扩增到预期片段大小的正确产物，所以wzx、wzy基因对大肠杆菌O108型的O-抗原都是高度特异的。
(7)引物灵敏度的检测：购买市场上的生猪肉馅，搅拌均匀，分成20g一份，存在-40℃冰箱中备用；将10μl大肠杆菌O108的冻存菌液接种到有20ml LB培养基的三角瓶中，于37℃，200转/分，培养12小时至饱和，取少量培养好的菌液作106和107倍的稀释，其余的菌液放于4℃的冰箱中备用，取50μl稀释菌液涂布LB琼脂平板，37度，培养12h，对所涂平板计数，计算原液中活菌浓度。在5份生猪肉馅中分别掺入5×103，5×102，5×101，5个和0个活菌，搅拌均匀，加入200ml LB培养基，经6层纱布过滤，过滤液于37℃，200转/分，培养12h。从培养好的菌液中取3ml菌液于6,000g离心5分钟，去上清，加100μl MQ超纯水吹开沉淀并混匀，放入100度沸水中煮15分钟，裂解液于12,000g离心8分钟，取1μ上清做为PGR模板；用4对寡核苷酸对SEQ ID NO：1中的11775至11792碱基的核苷酸和12638至12655碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的12344至12361碱基的核苷酸和12748至12766碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的13194至13213碱基的核苷酸和14012至14029碱基的核苷酸；SEQ ID NO：1中的13605至13623碱基的核苷酸和13940至13957碱基的核苷酸，进行PCR反应，PCR反应体系如下：MQ：15.7μl，Mg2+：2.5μl，Buffer：2.5μl，dNTP：1μ1，Taq酶：0.3μl，P1：1μl，P2：1μl，模板DNA：1μl。PCR反应条件为：95℃：5′，95℃：30″，56℃：45″，72℃：1′，72℃：5′，共30个循环；反应结束后，取10μl反应产物电泳，若有与预期大小相符的扩增带，则结果为阳性，若没有，则结果为阴性；参入了5×103，5×102，5×101，和5个活菌的每份猪肉馅均在4对引物的PCR反应中得到阳性结果；参入0个活菌的猪肉馅在4对引物的PCR反应中得到阴性结果；说明使用上述方法时，这4对引物对猪肉馅中的大肠杆菌O108的检测灵敏度均为0.25个菌/g。
CNB2004100940992A 2004-12-30 2004-12-30 对大肠杆菌ｏ108型的ｏ-抗原特异的核苷酸 Expired - Fee Related CN100359016C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2004100940992A CN100359016C (zh) 2004-12-30 2004-12-30 对大肠杆菌ｏ108型的ｏ-抗原特异的核苷酸

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2004100940992A CN100359016C (zh) 2004-12-30 2004-12-30 对大肠杆菌ｏ108型的ｏ-抗原特异的核苷酸

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1702081A true CN1702081A (zh) 2005-11-30
CN100359016C CN100359016C (zh) 2008-01-02

Family

ID=35632061

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2004100940992A Expired - Fee Related CN100359016C (zh) 2004-12-30 2004-12-30 对大肠杆菌ｏ108型的ｏ-抗原特异的核苷酸

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN100359016C (zh)

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1252268C (zh) * 2003-04-15 2006-04-19 南开大学 对大肠杆菌o107型的o－抗原特异的核苷酸

Also Published As

Publication number Publication date
CN100359016C (zh) 2008-01-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1261569C (zh) 对大肠杆菌o145型的o－抗原特异的核苷酸
CN1252269C (zh) 对大肠杆菌o58和痢疾志贺氏菌5型的o－抗原特异的核苷酸
CN1249238C (zh) 对大肠杆菌o123型的o－抗原特异的核苷酸
CN1256434C (zh) 对大肠杆菌o66型的o－抗原特异的核苷酸
CN1234862C (zh) 对大肠杆菌o100型的o－抗原特异的核苷酸
CN1271207C (zh) 对痢疾志贺氏菌10型的o－抗原特异的核苷酸
CN1234859C (zh) 对大肠杆菌o61的0－抗原特异的核苷酸
CN1256437C (zh) 对鲍氏志贺氏菌12型的o－抗原特异的核苷酸
CN1256438C (zh) 对鲍氏志贺氏菌b18型的o－抗原特异的核苷酸
CN1313613C (zh) 对大肠杆菌o18型的o－抗原特异的核苷酸
CN100345968C (zh) 对大肠杆菌o15型的o－抗原特异的核苷酸
CN1256429C (zh) 对大肠杆菌o24型的o－抗原特异的核苷酸
CN1234864C (zh) 对大肠杆菌o164的o－抗原特异的核苷酸
CN1249228C (zh) 对大肠杆菌o125型的o－抗原特异的核苷酸
CN1234866C (zh) 对鲍氏志贺氏菌17型的o－抗原特异的核苷酸
CN1702081A (zh) 对大肠杆菌0108型的0－抗原特异的核苷酸
CN1563049A (zh) 对大肠杆菌o88的o－抗原特异的核苷酸
CN1570114A (zh) 对大肠杆菌o167型和鲍氏志贺氏菌3型的o－抗原特异的核苷酸
CN1583779A (zh) 对大肠杆菌o86型的o－抗原特异的核苷酸
CN1563058A (zh) 对大肠杆菌o161的o－抗原特异的核苷酸
CN1660877A (zh) 对大肠杆菌o177型的o－抗原特异的核苷酸
CN1702080A (zh) 对大肠杆菌084型的0－抗原特异的核苷酸
CN1563038A (zh) 对大肠杆菌29型的o－抗原特异的核苷酸
CN1702082A (zh) 对大肠杆菌085型的0－抗原特异的核苷酸
CN1702078A (zh) 对大肠杆菌011型的0－抗原特异的核苷酸

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20080102

Termination date: 20101230