CN110709510A - 新型副溶血弧菌噬菌体Vib-PAP-7及其用于抑制副溶血弧菌细菌增殖的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从自然界分离的肌尾噬菌体科噬菌体Vib‑PAP‑7(登录号：KCTC 13247BP)，其具有杀灭副溶血弧菌的能力，并且具有由SEQ ID NO:1表达的基因组，以及使用一种包含肌尾噬菌体科噬菌体Vib‑PAP‑7作为活性成分的组合物来预防或治疗由副溶血弧菌引起的疾病的方法。

Description

新型副溶血弧菌噬菌体Vib-PAP-7及其用于抑制副溶血弧菌 细菌增殖的用途
技术领域
本发明涉及一种从自然界分离的噬菌体，其能够感染副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)从而杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，以及一种使用包含上述噬菌体作为活性成分的组合物来预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的疾病的方法。更具体地，本发明涉及一种从自然界分离的肌尾噬菌体科(Myoviridae)噬菌体Vib-PAP-7(登录号：KCTC 13247BP)，其具有杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的能力，并且具有由SEQ ID NO:1表达的基因组，以及一种使用含有上述噬菌体作为活性成分的组合物来预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的疾病的方法。
背景技术
属于弧菌(Vibrio)属的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是具有周生鞭毛的兼性厌氧菌，并且是革兰氏阴性细菌。副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种海洋生物，其在世界各地的微咸水地区或近岸海水以及海产品中被广泛发现，并且被认为是与海产品摄入量有关的细菌性食物中毒的主要原因。大多数副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是非致病性的，只有表现出溶血现象的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)是致病性的。在血清学上，根据75种类型的荚膜抗原(K)和13种类型的菌体抗原(O)对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行分类，而鞭毛抗原(H)存在于所有副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)细菌中。因此，根据K抗原和O抗原的类型对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的血清型进行分类。
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)由于在各种鱼类和贝类中引起弧菌病而给水产养殖业带来严重的经济损失。特别是，由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染引起的鱼类中的弧菌病的爆发经常发生，导致巨大的经济损失。因此，迫切需要开发适用于预防和进一步治疗副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染的方法。
尽管已经使用多种抗生素来预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的疾病，但是近来对已知抗生素具有抗性的细菌的发病率正在增加，因此迫切需要开发除抗生素之外的其他方法。
最近，使用噬菌体作为对抗感染性细菌性疾病的对策引起了相当多的关注。特别是，这些噬菌体由于对抗生素抗性细菌的强抗菌活性而受到极大关注。噬菌体是能感染细菌的非常小的微生物，其英文“bacteriophage”通常简写为“phage”。一旦噬菌体感染细菌，噬菌体就会在细菌细胞内部增殖。增殖后，噬菌体的后代破坏细菌细胞壁，并从宿主细菌中逃离，这表明噬菌体具有杀灭细菌的能力。噬菌体感染细菌的方式的特征在于其非常高的特异性，因此可能感染特定细菌的噬菌体的类型是有限的。也就是说，某种噬菌体只能感染一种特定的细菌，这表明某种噬菌体只能针对一种特定的细菌提供抗菌作用。由于噬菌体的这种细菌特异性，噬菌体仅对目标细菌产生抗菌作用，而不影响环境中或动物体内中的共生菌。广泛用于细菌治疗的常规抗生素则会附带地影响许多其他种类的细菌。这将引起诸如环境污染和动物正常菌群紊乱的问题。相反，噬菌体的使用不会干扰动物的正常菌群，因为通过使用噬菌体会选择性地杀灭目标细菌。据此，可以安全地利用噬菌体，从而与抗生素相比，大幅度降低使用其所产生的不利影响的可能性。
噬菌体最初是由英国细菌学家Twort在1915年发现的，当时他注意到微球菌(Micrococcus)菌落由于某种未知东西而融化并且变得透明。1917年，法国细菌学家d’Herelle发现痢疾患者粪便滤液中的痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)被某种东西破坏，并进一步研究了这种现象。结果，他独立地鉴定出噬菌体，并将它们命名为噬菌体，其意为“细菌吞噬者”。从那以后，对志贺氏菌(Shigella)、伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhi)和霍乱弧菌(Vibrio cholerae)等病原菌起作用的噬菌体不断被鉴定出来。
由于噬菌体具有杀灭细菌的独特能力，自噬菌体被发现以来就作为对抗细菌感染的潜在有效对策而备受关注，并且对其已进行大量相关研究。然而，自从Fleming发现青霉素后，由于抗生素的广泛传播，只有一些东欧国家和前苏联仍在继续噬菌体的研究。自2000年以来，常规抗生素的局限性由于抗生素抗性细菌的增加而日趋明显，开发噬菌体作为常规抗生素的替代物的可能性凸显出来，于是噬菌体作为抗菌剂再次引起关注。
如上所述，噬菌体往往对目标细菌具有高度特异性。由于噬菌体对细菌的高度特异性，即使是同一物种的细菌，噬菌体也常常只对某些细菌菌株表现出抗菌作用。此外，噬菌体的抗菌强度可能会因目标细菌菌株而异。因此，有必要收集多种噬菌体以便有效控制特定细菌。所以，为了开发用于控制副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的有效的噬菌体利用方法，必须获得对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有抗菌作用的多种噬菌体。此外，需要从所得噬菌体中筛选出在抗菌强度和抗菌谱方面优于其他噬菌体的噬菌体。
发明内容
技术问题
因此，本发明的各发明人致力于开发一种用于使用从自然界分离的噬菌体预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病并且能够杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的组合物，并且进一步创建一种使用该组合物预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病的方法。其结果是，本发明的各发明人从自然界中分离出适合于该目的的噬菌体，并确定了将分离的噬菌体与其他噬菌体区分开的基因组序列。然后，本发明的各发明人开发了一种包含所述噬菌体作为活性成分的组合物，并认定该组合物能够有效地用于预防和治疗由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的疾病，从而完成了本发明。
因此，本发明的目的之一是提供一种从自然界分离的肌尾噬菌体科(Myoviridae)噬菌体Vib-PAP-7(登录号：KCTC 13247BP)，其具有特异性杀灭副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的能力，并且具有由SEQ.ID.NO:1表达的基因组。
本发明的另一个目的是提供一种适用于预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的疾病的组合物，其包含能感染副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的分离的噬菌体Vib-PAP-7(登录号：KCTC 13247BP)作为活性成分而杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。
本发明的另一个目的是提供一种使用预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的疾病的组合物来预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的疾病的方法，该组合物包含能感染副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的分离的噬菌体Vib-PAP-7(登录号：KCTC 13247BP)作为活性成分而杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。
本发明的另一个目的是提供一种使用所述组合物以预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病的药浴剂(浸渍剂)。
本发明的另一个目的是提供一种使用所述组合物以预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病而有利于养殖的饲料添加剂。
技术方案
本发明提供了一种从自然界分离的肌尾噬菌体科(Myoviridae)噬菌体Vib-PAP-7(登录号：KCTC 13247BP)，其具有特异性杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的能力，并且具有由SEQ.ID.NO:1表达的基因组，以及使用一种包含肌尾噬菌体科(Myoviridae)噬菌体Vib-PAP-7作为活性成分的组合物来预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的疾病的方法。
本发明的发明人分离了噬菌体Vib-PAP-7，然后于2017年4月12日保藏于韩国生物科学与生物技术研究所韩国典型培养物保藏中心(登录号：KCTC 13247BP)。
本发明还提供了适用于预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病的一种药浴剂和一种饲料添加剂，其各自包含噬菌体Vib-PAP-7作为活性成分。
由于本发明的组合物中包含的噬菌体Vib-PAP-7有效地杀灭副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，因此其对由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病的预防(感染的预防)或治疗(感染的治疗)有效。所以，本发明的组合物能够用于预防和治疗由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病。
本文中使用的术语“预防”是指(i)预防副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染；和(ii)抑制由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染引起的疾病的发展。
本文中使用的术语“治疗”是指(i)抑制由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的疾病；和(ii)减轻由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病的病理状况的所有行为。
本文中使用的术语“分离”是指通过应用多种实验技术从自然界分离出噬菌体并且确保将本发明的噬菌体与其他噬菌体区分开的特征的行为，并且还包括使用生物工程技术增殖目标噬菌体以使目标噬菌体具有工业实用性的行为。
包含在本发明组合物中的药学上可接受的载体是通常用于制备药物制剂的载体，其示例包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但不限于此。除了上述成分之外，本发明的组合物可另外包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。
噬菌体Vib-PAP-7作为活性成分包含在本发明的组合物中。所包含的噬菌体Vib-PAP-7的浓度为1×101pfu/ml至1×1030pfu/ml或1×101pfu/g至1×1030pfu/g，优选的浓度为1×104pfu/ml至1×1015pfu/ml或1×104pfu/g至1×1015pfu/g。
本发明的组合物可以按照本发明所属领域的普通技术人员可以轻松执行的方法、使用药学上可接受的载体和/或赋形剂来配制，以将其制成单位剂量形式或将其插入多剂量容器中。此处，其制剂可以油或水溶性介质中的溶液、悬浮液或乳液形式，或者以提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式提供，并且可以另外包含分散剂或稳定剂。
根据其最终用途，本发明的组合物可以制备成药浴剂和饲料添加剂，但不限于此。为了提高其有效性，本发明的组合物中可以进一步包括对其他细菌物种具有抗菌活性的噬菌体。此外，在本发明的组合物中可以进一步包括对抗副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)具有抗菌活性的其他种类的噬菌体。可以适当地将这些噬菌体进行组合以使其抗菌效果最大化，因为它们对抗副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的抗菌活性可能在抗菌强度和抗菌谱方面不同。
有益效果
根据本发明，使用含有噬菌体Vib-PAP-7作为活性成分的组合物来预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病的方法是有利的，因为与基于现有抗生素的常规方法相比，副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)具有非常高的特异性。这意味着本发明的组合物可用于预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病而不影响其他有用的共生菌，并且因使用其而产生的副作用较少。通常，当使用抗生素时，共生菌也会受到损害，最终会削弱动物的免疫力，从而因为使用其而产生各种副作用。同时，对于各种对同一细菌物种表现出抗菌活性的噬菌体，这些噬菌体的抗菌活性在抗菌强度和抗菌谱[就属于副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的各种细菌菌株而言，即指应用于个体细菌菌株的噬菌体的抗菌活性谱。即使是同一物种的细菌，噬菌体通常也仅对其某些细菌菌株有效，因此即使对于同一物种的细菌，噬菌体的抗菌活性也取决于细菌菌株]方面是不同的。因此，本发明可以提供与其他噬菌体提供的作用于副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的抗菌活性不同的对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的抗菌活性。这对工业领域适用性提供了不同影响。
附图说明
图1是显示噬菌体Vib-PAP-7形态的电子显微照片。
图2是显示噬菌体Vib-PAP-7杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)能力实验的结果的照片。基于平板培养基的中心线，在其左侧仅点上不含噬菌体Vib-PAP-7的缓冲液，并在其右侧点上含有噬菌体Vib-PAP-7的溶液。在右侧观察到的透明区是由于噬菌体Vib-PAP-7的作用而通过裂解目标细菌而形成的噬菌斑。
具体实施方式
通过以下实施例将更好地理解本发明。这些实施例仅是为了举例说明本发明而提出的，而不应解释为限制本发明的范围。
实施例1：能够杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的噬菌体的分离
从自然界收集样品以分离出能够杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的噬菌体。在此，用于噬菌体分离的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)菌株是本发明的发明人先前已经分离并鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。
下面详细描述噬菌体的分离程序。将收集的样品加入到以1/1,000的比例接种副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的LB(Luria-Bertani)培养基(胰蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；氯化钠，10g/L)中，然后在37℃下振荡培养3至4小时。此后，以8,000rpm进行离心分离20分钟，回收上清液。将回收的上清液以1/1,000的比例接种副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，然后在37℃下振荡培养3至4小时。当样品含有噬菌体时，重复上述程序共5次，以充分增加噬菌体的数量(滴度)。重复该程序5次后，将培养液以8,000rpm进行离心分离20分钟。此后，使用0.45μm过滤器过滤回收的上清液。将由此获得的滤液用于典型的斑点测定，以评价其中是否包含能够杀灭副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的噬菌体。
进行斑点测定如下：将LB培养基以1/1,000的比例接种副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)，然后在37℃下振荡培养过夜。将上述制备的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)培养液3ml(OD600为1.5)涂抹在LA(Luria-Bertani琼脂：胰蛋白胨，10g/L；酵母提取物，5g/L；氯化钠，10g/L；琼脂，15g/L)板上。将板放在干净的工作台上约30分钟以干燥涂抹溶液。干燥后，将10μl的制备的滤液点在涂抹有副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的板上，然后放置约30分钟以干燥。干燥后，将经过点样的板在37℃下静置培养一天，然后检查滴加滤液位置处的透明区的形成。在滤液产生透明区的情况下，判断其中包含能够杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的噬菌体。通过上述检查，可以得到含有具有杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的能力的噬菌体的滤液。
从上述确认具有能够杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的噬菌体的滤液中分离出纯噬菌体。使用常规噬菌斑测定法分离纯噬菌体。详细过程如下，使用灭菌的尖端回收在噬菌斑测定过程中形成的噬菌斑，然后将其加入到副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的培养溶液中，在37℃下培养4至5小时。培养后，以8,000rpm进行离心分离20分钟，得到上清液。将副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)培养液以1/50的体积比添加到所得上清液中，然后在37°下培养4至5小时。为了增加噬菌体的数量，重复上述程序至少5次。然后，以8,000rpm进行离心分离20分钟以获得最终的上清液。使用所得最终上清液进一步进行噬菌斑测定。通常，仅重复一次程序无法完成纯噬菌体的分离，所以需要使用如上所形成的所得斑块重复上述程序。在重复该程序至少5次后，获得含有纯噬菌体的溶液。完整地重复分离纯噬菌体的程序，直到产生的噬菌斑在大小和形态上彼此相似。此外，使用电子显微镜确认了纯噬菌体的最终分离。在使用电子显微镜确认纯噬菌体的分离之前，需不断重复上述程序。按照常规方法进行电子显微镜检查。简言之，将含有纯噬菌体的溶液上样到铜网上，然后用2％乙酸铀酰负染色并干燥。然后使用透射电子显微镜观察其形态。分离出的纯噬菌体的电子显微照片显示在图1中。基于形态学特征，证实上述新型噬菌体属于肌尾噬菌体科(Myoviridae)噬菌体。
将上述确认的含有纯噬菌体的溶液进行以下纯化处理。将副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)培养液以基于噬菌体溶液的总体积为1/50的体积比加入到含有纯噬菌体的溶液中，然后进一步培养4至5小时。培养后，以8,000rpm进行离心分离20分钟，得到上清液。重复该程序总共5次，得到含有足够数量噬菌体的溶液。使用0.45μm过滤器过滤通过最终的离心分离所获得的上清液，然后进行常规聚乙二醇(PEG)沉淀过程。具体地，将PEG和NaCl加入到100ml的滤液中直至达到10％的PEG 8000/0.5M的NaCl，然后将其在4℃下放置2至3小时。此后，以8,000rpm进行离心分离30分钟以获得噬菌体沉淀物。将由此得到的噬菌体沉淀物悬浮于5ml缓冲液(10mM Tris-HCl，10mM MgSO4，0.1％明胶，pH 8.0)中。所得材料称为噬菌体悬浮液或噬菌体溶液。
其结果为，收集上述纯化的纯噬菌体，将其命名为噬菌体Vib-PAP-7，然后于2017年4月12日保藏于韩国生物科学与生物技术研究所韩国典型培养物保藏中心(登录号：KCTC13247BP)。
实施例2：噬菌体Vib-PAP-7基因组的分离和序列分析
分离噬菌体Vib-PAP-7的基因组如下。从使用与实施例1相同的方法获得的噬菌体悬浮液中分离出基因组。首先，为了消除悬浮液中包含的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的DNA和RNA，将DNase I和RNase A各200U加入到10ml的噬菌体悬浮液中，然后在37℃下放置30分钟。放置30分钟后，为了灭活DNase I和RNase A的活性，向其中加入0.5M的乙二胺四乙酸(EDTA)500μl，然后使所得混合物放置10分钟。此外，将所得混合物在65℃下再放置10分钟，然后向其中加入100μl的蛋白酶K(20mg/ml)以破坏噬菌体的外壁，然后在37℃下反应20分钟。之后，向其中加入500μl的10％十二烷基硫酸钠(SDS)，然后在65℃下反应1小时。反应1小时后，向所得反应溶液中加入10ml的以25:24:1的组分比混合的苯酚：氯仿：异戊醇溶液，然后混合均匀。此外，将所得混合物以13,000rpm进行离心分离15分钟以使各层分离。在分离的层中，选择上层，并以1.5的体积比向其中加入异丙醇，然后以13,000rpm离心分离10分钟以使基因组沉淀。收集沉淀物后，向沉淀物中加入70％乙醇，然后以13,000rpm离心分离10分钟以洗涤沉淀物。回收洗涤的沉淀物，真空干燥，然后溶解在100μl的水中。重复该程序以获得足够量的噬菌体Vib-PAP-7的基因组。
通过使用Macrogen提供的Illumina Mi-Seq设备进行下一代测序分析，确保了由此获得的关于噬菌体Vib-PAP-7的基因组序列的信息。最终分析的噬菌体Vib-PAP-7的基因组具有76,187bp的大小，且整个基因组序列由SEQ.ID.NO:1表达。。
在网上使用BLAST研究上述获得的噬菌体Vib-PAP-7基因组序列与传统上报道的噬菌体基因组序列的同源性(相似性)。基于BLAST的研究结果，发现噬菌体Vib-PAP-7的基因组序列与弧菌(Vibrio)噬菌体SSP002(Genbank登录号JQ692107.1)的序列和vB_VpaS_MAR10(Genbank登录号JX556418.1)的序列具有相对高的同源性(按覆盖率/同一性的顺序分别为96％/97％和67％/79％)。然而，噬菌体Vib-PAP-7基因组上的开放阅读框(ORF)的数量是101，而噬菌体SSP002具有102的开放阅读框，而与其的同源性略低的噬菌体vB-VpaS_MAR10具有104的开放阅读框，据此也评价了这些噬菌体是不同的。
因此，可以得出结论，噬菌体Vib-PAP-7是不同于先前报道的噬菌体的新型噬菌体。此外，由于噬菌体的抗菌强度和抗菌谱通常取决于噬菌体的类型，因此认为噬菌体Vib-PAP-7可提供不同于先前报道的任何其他噬菌体的抗菌活性。
实施例3：噬菌体Vib-PAP-7对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的杀灭能 力的研究
研究了分离出的噬菌体Vib-PAP-7对副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的杀灭能力。为了评价杀灭能力，以关联于实施例1所描述的相同方式使用斑点测定法观察透明区的形成。共有25株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)被用于研究杀灭能力，它们是从菌株库得到的，或是被本发明的发明人分离而得并鉴定为副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)。噬菌体Vib-PAP-7具有杀灭25个作为实验目标的副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)菌株中总共21个菌株的能力。其代表性实验结果示于图2。同时，还测量了噬菌体Vib-PAP-7杀灭迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrioanguillarum)、鱼肠道弧菌(Vibrio ichthyoenteri)、格氏乳球菌(Lactococcusgarvieae)、副乳房链球菌(Streptococcus parauberis)、海豚链球菌(Streptococcusiniae)和杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)的能力。结果表明噬菌体Vib-PAP-7不具有杀灭这些微生物的能力。
因此，可以得出结论，噬菌体Vib-PAP-7具有很高的杀灭副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的能力和针对许多副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的抗菌作用，表明可将噬菌体Vib-PAP-7用作用于预防或治疗由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的疾病的组合物的活性成分。
实施例4：使用噬菌体Vib-PAP-7预防副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感 染的实验
将100μl的噬菌体Vib-PAP-7溶液以1×108pfu/ml水平加入到含有9ml的LB培养基的试管中。向另一个含有9ml的LB培养基的试管中，仅另外加入相同量的LB培养基。然后，将副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)培养液加入每个试管中，使吸光度在600nm处达到约0.5。在加入副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后，将试管转移到37℃下的孵化器中，然后振荡培养，在此期间观察副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的生长。如下表1所示，观察到副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的生长在添加了噬菌体Vib-PAP-7溶液的试管中受到了抑制，而副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的生长在没有添加噬菌体溶液的试管中并未受到抑制。
[表1]
副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的生长抑制
Figure BDA0002259510750000091
上述结果表明，本发明的噬菌体Vib-PAP-7不仅能够抑制副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)的生长，而且能够杀灭副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)。因此，可以得出结论，噬菌体Vib-PAP-7可用作用于预防由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的疾病的组合物的活性成分。
实施例5：使用噬菌体Vib-PAP-7预防由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 引起的疾病的动物实验
准备每组六十只的幼体海鲈鱼(体重：5g至7g；体长：8cm至10cm)共2组，分别在水箱中养殖，并进行实验14天。控制水箱周围的环境，并且水箱所在的实验室中的温度保持恒定。在从实验第1天开始的整个实验期间，按照典型的喂食方法，向实验组(给予噬菌体的组)中的海鲈鱼喂食以1×108pfu/g含有噬菌体Vib-PAP-7的饲料。相反，向对照组(未给予噬菌体的组)的海鲈鱼喂食除了不按照与实验组相同的方式含有噬菌体Vib-PAP-7以外其他均与实验组相同的饲料。从实验开始后的第7天起算的2天内，以1×108cfu/g的水平向所提供的饲料添加副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)，然后分别每天提供两次，以诱导副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染。从实验开始后的第9天(诱导副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)感染后第2天)开始，每天在所有试验动物中检查弧菌病发病机理。通过测量体变暗指数来检测弧菌病发病机理。使用测量深色(DC)评分的常规方法进行体变暗指数的测量(0：正常；1：轻微变暗；2：强烈变暗)。结果示于下表2中。
[表2]
体变暗指数测量结果(平均)
Figure BDA0002259510750000101
从以上结果可以明显看出，结论是本发明的噬菌体Vib-PAP-7可以非常有效地预防由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病。
实施例6：使用噬菌体Vib-PAP-7治疗由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus) 引起的疾病
评价噬菌体Vib-PAP-7对由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病的治疗作用如下。准备每组六十只的幼体海鲈鱼(体重：5g至7g；体长：8cm至10cm)共2组，分别在水箱中养殖，并进行实验14天。控制水箱周围的环境，并且水箱所在的实验室中的温度保持恒定。从实验开始后第5天开始，按照常规喂养方法，每天两次提供以1×108cfu/g的水平被副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)污染的饲料，持续3天。从提供被副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)污染的饲料的程序的最后一天开始，在两个水槽中均观察到显示出弧菌病临床症状的海鲈鱼实验对象。在提供被副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)污染的饲料三天后的第二天(实验开始后第8天)，按照传统的喂食方法，向实验组(给予噬菌体的组)中的海鲈鱼喂食含有噬菌体Vib-PAP-7(1×108pfu/g)的饲料。相反，向对照组(未给予噬菌体的组)的海鲈鱼喂食除了不按照与实验组相同的方法含有噬菌体Vib-PAP-7以外其他均与实验组相同的饲料。从强制感染副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)后第3天(实验开始后第8天)开始，每天在所有试验动物中检查弧菌病发病机理。如实施例5中那样通过测量体变暗指数来检查由副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)引起的弧菌病发病机理。结果如下表3所示。
[表3]
体变暗指数测量结果(平均)
Figure BDA0002259510750000102
Figure BDA0002259510750000111
从以上结果可以明显看出，结论是本发明的噬菌体Vib-PAP-7可以非常有效地治疗由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的疾病。
实施例7：饲料添加剂和饲料的制备
使用噬菌体Vib-PAP-7溶液制备饲料添加剂，使得每1g的饲料添加剂中包含1×108pfu的噬菌体Vib-PAP-7。制备饲料添加剂的方法如下：将麦芽糖糊精(50％，w/v)加入噬菌体溶液中，然后将得到的混合物冷冻干燥。最后，将干燥的混合物研磨成细粉。在上述制备程序中，干燥步骤可以用在减压下干燥、加热干燥或在室温下干燥来代替。为了制备用于比较的对照，制备不含噬菌体但含有用于制备噬菌体溶液的缓冲液(10mM Tris-HCl，10mMMgSO4，0.1％明胶，pH 8.0)的饲料添加剂。
将由此制备的两种饲料添加剂各自与生鱼基湿颗粒以250的重量比混合，从而制备出两种最终饲料。
实施例8：药浴剂的制备
制备药浴剂的方法如下：使用噬菌体Vib-PAP-7溶液制备药浴剂，使得每1ml的药浴剂中包含1×108pfu的量的噬菌体Vib-PAP-7。在制备药浴剂的方法中，加入噬菌体Vib-PAP-7溶液，使得每ml的用于制备噬菌体溶液的缓冲液中包含1×108pfu的噬菌体Vib-PAP-7，并充分进行混合。为了制备用于比较的对照，用于制备噬菌体溶液的缓冲液用作不含噬菌体的药浴剂。
将两种由此制备的药浴剂以1,000的体积比用水稀释，得到最终的药浴剂。
实施例9：海鲈鱼养殖饲喂效果的确认
使用实施例7和8中制备的饲料和药浴剂研究海鲈鱼养殖饲喂结果的改善。具体来说，研究的焦点在于死亡率。将总共1,000只幼体海鲈鱼分为两组，每组包括500个海鲈鱼(A组：饲料饲喂；B组：用药浴剂处理)，并进行为期4周的实验。每组进一步分为各包括250只海鲈鱼的分组，其中一个分组施用噬菌体Vib-PAP-7(分组-①)，另一个分组不施用噬菌体(分组-②)。在本实验中，目标海鲈鱼是幼体(体重：5g至7g；体长：8cm至10cm)，且幼体海鲈鱼按实验分组分开养殖在不同的水箱中，这些水箱以一定的间隔彼此间隔开。分组的分类和名称如下表4所示。
[表4]
海鲈鱼饲养实验中的分组分类和名称
Figure BDA0002259510750000121
在提供饲料的情况下，根据表4中的分类，按照传统饲养方法提供实施例7中制备的饲料。根据表4中的分类，使用如实施例8中所述制备的药浴剂按照传统处理方法进行使用药浴剂的处理(其中将鱼体浸入药浴剂的稀释溶液中)。结果如表5所示。
[表5]
喂养实验中的海鲈鱼死亡率
组别 死海鲈鱼/实验的总海鲈鱼(数) 死亡率(％)
A-① 7/250 2.8
A-② 43/250 17.2
B-① 11/250 4.4
B-② 56/250 22.4
上述结果表明，提供根据本发明制备的饲料和使用根据本发明制备的药浴剂进行处理可有效地降低海鲈鱼养殖的死亡率。因此，可以得出结论，本发明的组合物可以有效地应用于改善海鲈鱼饲养结果。
虽然已经参考本发明的示例性实施方案具体示出和描述了本发明，但是本领域技术人员将理解，具体描述的仅是优选实施方案，本发明的范围不限于此。因此，本发明的范围旨在由所附权利要求及其等同物限定。
【登录号】
保藏单位名称：KCTC
登录号：KCTC 13247BP
登录日期：20170412
序列表
<110> 尹特荣生物科技株式会社
<120> 新型副溶血弧菌噬菌体Vib-PAP-7及其用于抑制副溶血弧菌细菌增殖的用途
<130> KP090528
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 76187
<212> DNA
<213> Bacteriophage Vib-PAP-7
<400> 1
aagccccacc ccgtctgggc tgggactcca tcggagtgcc ggacggattt tgtctgccac 60
gtgttgggga ccacgaccaa cgaccattta ctaatggacc tcgaccacga ccaccgggac 120
caccggacaa tgaccgttag taaatggacc attggaccga aggggtttgt aaattatcat 180
gggggtgtcg tatagttcgt ggaccaattt tttccgggac cagttttgaa gtttttacta 240
aaacggagga ccagatgacc agaccgaaga ggagattgat tgtagtcgag gaccgatgct 300
tccggggaca tgcccccatt cgaattgtgc ggggctctgc gaaggcttcc gtatgctatc 360
aatgtcatcg tatgcaaaga aagcacgcac gcatggtagc acgctgccac aacccaaagg 420
acccaaggta caagaactac ggagggcgcg ggatcagcgt atgcccagaa tggcgtaact 480
catttactaa atggtatgag gacttcggct acctcgtaga tgggaatgac ctgactatgg 540
accgtaggga taacgatggg gattacgagc cggggaatat gcgtgcagcc actacccaag 600
agcaaaaccg caatcagcga agaagtgttt tactaacgta cgatggggag acgctgaatc 660
aacaggtgtg ggcagatagg ttcggctttc ataaatccag tatacagcga cgccttggtg 720
ggaagtaccg gaatgatatg gaatgggtac tctttggcgt acgcactact attactaaaa 780
cggaggtgct gattactaag gacaggaagc ggttgaactt gcgtgcttgg tgtagatcgc 840
tgggtttctc actacgcaca gtagaggacc gggtatacaa gttcggctgg agttatgcgc 900
aggcactcgg ctttgcctcc cggaagggaa aacttagacc accgcctaca aaggattagt 960
aaataacagt tgcagttagt aacactgtgg catatactct ttatacacca actaactaag 1020
aaggattagt aaaatgaagg acttcaatat gagcgaggag cttactcgcg tacaggctgg 1080
ctggtatgag cagtctaagg acgccgtgta caacttgaag gatgttacta aagcactcac 1140
agacggcaag tcgctaaagc attgtaagcg catggtggaa gacatccccg gtattggtct 1200
ctcccaacgt acgcaggaat atttgcaggt ggctttgaac tgtaaacgca tggagaactt 1260
tagtaaatgc ttgttcaagg cttatcaaat tcaaacgcgt aatgcagcaa gtctgaagaa 1320
ggactcgtag aatggttaaa ccgacacacc gcacactggt agtaacttct aagggtcgtg 1380
taccatacga tgagaagcat tactaccaca ctggcaaaaa gggagaggat gttacgttag 1440
taaacgagcg taacttcaaa acggtacagg gacagcgatt cgaccttgta cttttcgttg 1500
gcaacatatc cggggaagtt cgtacgaagt tcgctgggtt ggttggagat tattaaaatg 1560
aaacgcaagt acttcgacga agctttacca tcgttctttg tgttcgggga gcacgctaac 1620
ggtacggtgg acctatcgtg cggtgagttt gatgtagtaa catactgccc tacagaaatg 1680
gcagaagccg tcatcgctta ctacgacagc ctgctgctta agctgcatga gtgggtggtc 1740
gatcaggaga aaccctcgga agccctcgac aaactctgtg acgctttcca agatgttcac 1800
gcggggcacc attacatagg cgacttcggg gctgtgatgt tactaaaact gctatgggaa 1860
gcgtacacca aggtagcgcc aatcgtccag ccgagattct tacgtagcgt gtacggtgta 1920
gagtggaccc cctcactggt gcaagcgaac ttactaacgc aacgtgggta caccccttac 1980
tgtgggggtc gtgactgcaa gtcggtccct cgaacagcgt tccgggagga gcagttccgc 2040
tgccctagct gcggttggga gtcgaacttt gaccctgagt tcattgctgg gtacaagtac 2100
gtgtgggact tgccgggagt tgactgcgag atgctagacg agttccgtgc aatactacca 2160
ctatcactac acttcgtaat ggtagacgcg gacatgagat acgcggggcg cattgatgat 2220
gagtaggaag cgtttacctt tagtaaaacg tacaagcgta cattgggctc agctcaccgg 2280
gattgtcata atggacccgg atggatggga ccgccagaac ttcgaataca gctggtatga 2340
agagaccatt accattctgg agttctggga tcgcgtgtac aactcaacaa cactcatgaa 2400
attggagaat tagtaaaatg gcaaatacta tcgacctacg cggtaacgaa cagagcgtta 2460
cccgtgaaga tgcggaagcg tatgcagcag ctttgggatg cactgcaatg tacttcgggt 2520
tcgatccaga gcctaaagac gtggacccgg ctatggctgt aaagttcgga ccgggaaacc 2580
cattctttac taaggatatg gagaagttct tgggaccgga tgggagtcag ttcttttaca 2640
acacggcgat gtatcaatgc cgtaagacgt ggagccttcg tgcttaccac ggagcacgca 2700
gcgtggagaa gcttcttgtt aatcttagta aaggttctcc gctatcggtt atggcagcat 2760
acgttgactg cacgcgtatg ctaggtctgt gtgaggaagc ccagatgagt gtattcatag 2820
cacgccagct ttgcatctgc aatcgtgacc gtaagcacgt ggaagaatgc ttactgaaag 2880
cacaggagca ccagatgtcg tacatcgaac acctaaaagc gaaagcttcc ttgatggagg 2940
attagtaaaa tggaaagttc atttggttgg aaccgcgtat tactcgtagg cgggacaaac 3000
gcgggcacgt tcatgggcgt gcttcgtgac cagcaggtgc tacgtatgga gaagaaagac 3060
cccaacgtac aacgccttgg aacacacgtc ctacaacgtg agcaagcccc ggatgaaaca 3120
ttcgataccg aggagtacgt agccacagac cacgccttac gagggactac gatcttcgta 3180
ctgcgaggaa tggctggtgc agacatcccc tgcgagatgt tgaagatcat cgctaagctg 3240
gatagtaaga ttggtgagct aaattctagg atggagcttg ctaatatagc cgcgatgaac 3300
gttgctcact acgtgaagag agaccaataa tatgcgtatg accactatag cgtgtgcggt 3360
taagatacac taccgtgtcc cggtattgcc ggagatgccg atccttatcg ggaataccag 3420
agcattcgtg cagggtcgtg ctgctggtag tgggtttagt aaccgcgtcc actacgacgt 3480
gtccatgccc aagtttgtac gctcagctgc tacgcaagca ttcggacgcc ttgaccgcga 3540
gtttaaggaa gccacaatag atcttacgga ttatcaacat gcttggctgg aggtgagccc 3600
caaatgagcg tagaagctgt tttcgagcag gacatgcagt tagaccctga tatacgcaat 3660
agcaacgttg caggggcttt ctgcgtggct aaagcgaacc tttgcaacgc ctgtcagtgg 3720
gacggtacta tcgacgctac tatgatggtc ctgttattca tgggcgttac taatttcgac 3780
gacgatctga taaagcgttc tgtcgagctg ggctacttta gcatcaaact catgggtatg 3840
gttgacccta tccgtgtgaa ccggggcgat gtgctcgtcc gatcatctac gagcttcgtg 3900
gtggtcacta acgaagagta caatcgcatt tttactaata tactgctata ggaggacact 3960
atggctccct tcttcgtttt cgcacagaca gcaaacacga tggttaatac atgccgtcgt 4020
ctgggcatct caccaacaga accacgcctt atccgtgagc cggagaactt aaagggtgtg 4080
agctttccca aggtgggtgc taaatacatc atcttcgtct gcggcgagac tgtaccactc 4140
tggctgcacc aatttgctgt gttaaataac gtattgctgc ttggcatgga caagcacgtg 4200
atcgagtact accgtaagca cgacttccga gcggaagact acaacgcgta ccaataatag 4260
accgtatagt ttactgcaac atccatttta ctaaaattaa aggagctgac aatggactca 4320
cgttacacat ttatcgacct agttaaagac gtattcgcgg cacttaaacg cgctaaagcc 4380
aacggtgtta ctttcaaagg gcaatctccg tccgctgtag cggctgacat ggcgaagtac 4440
gacgctgacc tagagagtgc cccggtagaa gacttggaaa aggctgtggg gcttgtgcag 4500
agcattgacg gcacgtttaa gtctggtatc gaagagaagc tagactcaat cctagcgccg 4560
tcggctgtgg tcatgggctg cgacttcgac gacctgctag aagatacgga agtggcttac 4620
tgcgtcgatg caaacctaga cctgctgacg gttggtgcgt acaatgccaa aggcggttgc 4680
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cgtactggtg atgatattac taaaactgtt ctggaccgca aagcggctaa gaaccaagtt 4800
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tagagtacat cggcggtaac gctgataagg tgattgagtt cgttaagaac tgcaccggga 4920
acactccgac gtttaaagag cctgacgtgt tggagtaccc agttatcggt ggtacgcagc 4980
tgatcaccgt tggcagttgg ttggtgtggg ataccactaa actgcactgc atggatgaag 5040
tttactttag caagaacttc acgatcatct gggaacatcc acagcagcct gtcccggtgg 5100
acgagccaga aggtcgtgca ataggctcat acgcgatcaa ccactcgact atcgctgaag 5160
acttggactt ctaccaccac aacgagtttg gcacgcgtaa ggtacgctgt atcaagtcga 5220
actacggtgc tgaaggtcat ccaatctacg gcttactaac tctagtttgg ctagacggtg 5280
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acctcggcgc ggtagaagct gctaagcagg gacatcgcgt gtgtcgtaag ggttggaacg 5400
gcgctgacat gtgcctagtg tacgtaccag cggcagacat cccaacgaag ggaacaggtc 5460
ttaccccgtt cttcggtgat accatgccca tgcgtgctca ctggttacta aaaaccgcca 5520
caggcgatgt agccagctgg tccccatcga cgtcggatag tctagcgacg gactgggaaa 5580
tctactcacc agaataattt tactaaaatg tattgactat aagaaacagg gggaatatac 5640
ttctccctgt tgtcgttttt actaaaccaa aaaaggagtc caacatggat aacgttatgc 5700
cacaccctat gccaatcact taccgccgtc ctgagaaaca gcgccacgcg gtacagctta 5760
ctaagaacaa cgtgggaacg gtaatccaag ccttagtcca ccttgatgtt ctggaaaacc 5820
tagtaatggg tgaggagact accgatccgg gctttggtcg ccgcgaacgt gtcactaaac 5880
cctgcatcac attcacccct aagaaggcgt tttacaagca gttcccggac cgctacaaca 5940
gtatcgacga tggtgaggta gcgatctttg aagacgagta cctagtcttg tttggtaacg 6000
gtgatttcca agtcatgtcg gcacaagagt ttgaagccac ttacaagtgg ggtcaggacg 6060
agcctgcgcc gctatcaccg tgtgcggctc cagcgcaaga tgacttagcg tctattgccg 6120
gggaccgcga gttctctgag cctcgtgtag ctgctctgga gccagaggtg gctattgctg 6180
tggaagagga gatggaagac cttgccgagc ccattgaaga gccagaagag tacggcatcg 6240
aagagcgaga ggagtctcct cgtgcaaagc gtatggctaa gcgtaatcgt cgtgactagc 6300
attgctagta cgtttttact aatctaataa tcaggagaag agttatggac tctactttac 6360
taacagtaac accgaacaag cccttccgtg ccgtgcagta caacggtagt aactgggcgc 6420
aggtacgtca gtttgctgct aagtttgcta acgtagaaat cgcgatgaac ttgaaagccg 6480
acagcccact acttgcgcac cttggcacag gcaatatact catccctaaa gggaactacg 6540
tagttgcttg gggcaagtgg gacctgcgca cgtattcgcc ggaagagttt actaaagtgt 6600
ttgcgggcat tccgtcagga cgtgaccaac tacttgaggt cgagatggac aatgaccgta 6660
tcgtgatgtc tattggtgtg gaatccatgc gcatgagcat cgagtcgggt caggcagact 6720
tcagcgtagg cggcgcagtc cacgttgcag acgtagacat ctttgggcac gagctgatca 6780
gctacttgaa agctgaagct gaagacggtg gtactccagt tcatcgcatg atcgatagcg 6840
tagcgttgga agcgctagag catggtgctc acggtatcat cgagttggac gaagaagact 6900
tagagcgaga catctaatgg gcgtagtaac tgtacagcgg accaatccga tcatcgcgct 6960
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caccgtaacg atgcagtatg acaatttact aaaaattgaa tccgactgct tcctatcatg 7080
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cggagacttc ttcccggatg ccttccgcgt tatcgagaac ggaccgctgt ttggtaagaa 7200
ggtggtcatc tccggtactt tcggcaaggt aactcgccac gctgtaaaag acctcctatc 7260
tgctcgcgga gctaaggtgt tcggcagtgt gaacaagttc accgacatat tggtgtgtgg 7320
caaggactca ggctctaagc ttaccaaggc taaagagctg ggaatccgaa tcatctacga 7380
gtcggagatt ctggaactac tctagcactt ttactaaaag cctcctaacg ggggcttttt 7440
tgtgtctgaa gcattgacat gtgaaacagt gggagtatac ttattagtaa aaccaacgag 7500
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atcattatct ttcttactaa tacttttatc atttttgcct atattcccca tctactgaag 75540
agtaaaaaga tagtaagcat tatatcaata gttaagcggt cattttgcgc cgtagaatcg 75600
ccgtattgag ccgtttatca atatacgggt atcattgccc tatttgagcg ccgcgcacgt 75660
cttacaacgc catacagcaa aacaatacac gtacaccatt atgcgccatt ttactaatat 75720
tgctgtacgt tcaatctata cccgcacgat tcccctatat acggaaatac acataaacgg 75780
cggttttccc tatatactag aaacattcac tatatacaat actatcatta acgccacgtt 75840
tacccggacc gattgaccgg gaccaaccga ccaacacgca aacgcaatga tacaactatc 75900
aatagactat tgagcattgc atcattaccc attccctatt gagcaatcgc attataaaca 75960
aatctattag taaacaattc tatcagttgc gcaattgata atagtgtcat tgagtaatct 76020
gtcagttgcg caattgagta atctatcaat aagggggtcc gaacccccca ccccccggca 76080
catattcgac gcttatcccc ggcacatatt cgacgcttat ccccggcaca tattcgacgc 76140
ttatccccgg cacatattcg acgcttatcc ccggcacata ttcgacg 76187

Claims (5)

1.一种从自然界分离的肌尾噬菌体科噬菌体Vib-PAP-7(登录号：KCTC 13247BP)，其具有杀灭副溶血弧菌的能力，并且其包括由SEQ.ID.NO:1表达的基因组。
2.一种用于预防或治疗由副溶血弧菌引起的疾病的组合物，其包括：如权利要求1所述的噬菌体Vib-PAP-7(登录号：KCTC 13247BP)作为活性成分。
3.如权利要求2所述的组合物，其中所述组合物用于制备饲料添加剂或药浴剂。
4.一种用于预防或治疗由副溶血弧菌引起的疾病的方法，所述方法包括：
向除人类以外的动物施用如权利要求2或3所述的包括所述噬菌体Vib-PAP-7(登录号：KCTC13247BP)作为活性成分的组合物。
5.如权利要求4所述的方法，其中将所述组合物施用给除人类以外的动物用作饲料添加剂或药浴剂。
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