KR101592175B1 - 스트렙토코커스 파라우베리스 감염을 방지 및 처치하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 감염하여 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지인 박테리오파지 Str-PAP-1을 유효성분으로 포함한 조성물, 및 본 조성물을 이용한 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 박테리오파지 Str-PAP-1은 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 대한 사멸능을 갖고, 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 감염하여 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 유효성분으로 포함한 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염을 방지하거나 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물 및 이 조성물을 이용한 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 분리된 박테리오파지, 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지 및 감염 후 처치 목적으로 활용될 수 있는 조성물 및 이 조성물을 이용한 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지 및 감염 후 처치 방법에 관한 것이다.
전체 수산업에서 수산 양식산업이 차지하는 비중은 지속적으로 증가하고 있는 실정이다. 전 세계적으로 어획수산물의 양은 정체되거나 점점 감소하는 추세이므로 이에 대한 대처 방안으로 양식수산물에 대한 수요 및 공급은 지속적으로 늘어날 것으로 전망되며, 향후 양식업은 점차 더 중요한 산업으로 자리 잡아 갈 것으로 예상된다.
수산 양식에 있어, 어류질병의 발생은 양식 어류의 누적되는 폐사로 인한 직접적인 경제적 피해 초래와 더불어 수산용 약제의 사용 증가와 관리 비용 증가 등 제반 양식경비를 증가시켜 결과적으로 생산성을 저하시킬 뿐 아니라, 민감한 사회적 문제인 항생제 잔류 문제로부터 자유롭지 못하게 하여 고품질의 안전한 수산물 생산을 어렵게 한다. 이러한 양식 어류의 질병에 대한 예방 및 처치 대책 마련은 비단 우리나라뿐만 아니라 세계 여러 나라에서 주요한 관심사가 되고 있다.
스트렙토코커스 파라우베리스는 양식 어류에서 연쇄구균증(Streptococcosis)을 야기하는 대표적인 원인균으로 잘 알려져 있고, 스트렙토코커스 파라우베리스 외에도 스트렙토코커스 이니에(S. iniae), 스트렙토코커스 디피실리스(S. difficilis), 스트렙토코커스 실로이(S. shiloi), 및 락토코커스 가르비에(Lactococcus garvieae) 등의 다양한 세균들이 연쇄구균증의 원인균으로 보고되고 있다. 그러나, 이중 스트렙토코커스 파라우베리스가 가장 빈번하게 발견되는 연쇄구균증의 원인균으로 알려져 있다.
연쇄구균증에 걸린 해수어의 외부소견으로는 채색흑화, 안구 돌출 및 충혈, 복부 팽만, 탈장 등을 보이며, 내부적으로는 복수가 고이거나 복벽의 출혈, 심장내 농양 등의 소견을 보이게 된다. 또한 특이적으로 어떤 경우에는 별다른 소견 없이 아가미만 부식되는 경우도 가끔 관찰되기도 한다. 연쇄구균증은 주로 치어보다는 성어에서 발병률이 높아 경제적인 피해가 다른 세균성 질병에 비해 상대적으로 높게 나타난다.
연쇄구균증의 원인은 사육환경의 악화, 부적절한 사육, 및 부적절한 사료 등 여러 가지 요인들이 있을 수 있다. 과거에는 주로 고수온기 위주로 발병비율이 높았으나, 최근에는 겨울철에도 발생이 확인되고 있다. 이에 따라 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염에 의한 양식 산업에서의 피해는 상당히 크며, 이의 감염을 방지할 수 있고 또한 이들의 감염을 효과적으로 처치할 수 있는 방법의 개발이 절실하다 할 수 있다.
이러한 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지나 처치 목적으로 다양한 항생제들이 사용되어 왔으나 최근 항생제 내성균의 발생이 증가함에 따라 항생제 외의 다른 방안의 확보가 시급한 실정이다. 최근에는 양식 어류의 질병제어를 위한 수단으로 백신개발 등이 본격화 되고 있으나 아직 백신종류가 다양화되지 못해 질병종류가 다양화 되고 혼합질병 발생 증가에 따른 대처를 위해서는 백신과 함께 또 다른 질병제어 수단이 복합적으로 개발되어야 한다.
최근 세균성 질환의 대처 방안으로 박테리오파지(bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 자연친화적 방식의 선호로 인하여 박테리오파지에 대한 관심은 어느 때보다 높다고 할 수 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 박테리아에 감염(infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아의 세포벽을 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 박테리아에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 박테리아에만 감염할 수 있고 이로 인하여 박테리오파지는 특정 박테리아만을 사멸시키며 다른 박테리아에는 영향을 주지 않는다.
박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구에서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disentriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 박테리아에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.
박테리아를 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후 박테리아 감염에 대응하는 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구가 있었다. 그러나 Flemming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-박테리아제로 주목을 받고 있다.
특히 최근 항생제 사용에 대한 정부 차원의 규제가 강화됨에 따라 박테리오파지에 대한 관심이 더욱 높아지고 있다.
이에, 본 발명자들은 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염을 방지 또는 처치하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있도록 유전체(genome)의 유전자 서열을 확보한 후 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음 이 조성물이 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지 및 처치에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 가진 신규 분리된 박테리오파지를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 감염하여 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염을 방지하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 감염하여 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염을 처치하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 처치 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 스트렙토코커스 파라우베리스 균 감염 방지 및 처치 목적의 약욕제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 스트렙토코커스 파라우베리스 균 감염 방지 및 처치 목적의 사료첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명은 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 감염하여 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물, 및 이 조성물을 이용한 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지 및 처치 방법을 제공한다.
본 발명의 조성물의 유효성분으로 포함되는 분리 박테리오파지는 서열번호 1로 표시되는 DNA 형태의 유전체를 가지는 박테리오파지 Str-PAP-1이다. 박테리오파지 Str-PAP-1은 본 발명자들에 의해 분리된 후 2014년 4월 7일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(기탁번호 KCTC 12568BP).
또한, 본 발명은 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 약욕제 및 사료첨가제를 제공한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 Str-PAP-1은 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 효과적으로 사멸시키므로 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 의해 유발되는 연쇄구균증의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 의해 유발되는 연쇄구균증에 대한 예방 및 치료 목적으로 활용될 수 있다. 본 명세서에서의 연쇄구균증이란 스트렙토코커스 파라우베리스 균 감염에 의해 수반되는 증상을 총칭한다.
본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (ⅰ) 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 의해 유발된 연쇄구균증의 억제; 및 (ⅱ) 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 의해 유발된 연쇄구균증의 경감을 의미한다.
본 명세서의 “분리” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있는 특징을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 박테리오파지를 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.
본 발명의 박테리오파지는 박테리오파지 Str-PAP-1과 이의 변형체들(variants)을 포함한다. 본 명세서의 “변형체”란 유전체 서열(genomic sequence)이나 유전정보가 코딩(coding)하고 있는 폴리펩타이드(polypeptide)에서의 작은 변이(minor variation)가 있지만 전반적 유전자형(genotypic) 및 표현형(phenotypic) 특징이 박테리오파지 Str-PAP-1과 같은 박테리오파지들을 의미한다. 상기 변형체에는 다변형성 변형체(polymorphic variants)도 당연히 포함된다. 이러한 변형체들은 박테리오파지 Str-PAP-1과 같은(same) 또는 동등한(equivalent) 생물학적 기능(biological function)을 가지는 것이 바람직하다.
본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 글루코스, 말토덱스트린, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물에는 박테리오파지 Str-PAP-1 또는 이의 변형체들이 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 Str-PAP-1 또는 이의 변형체들은 1× 101 pfu/㎖ 내지 1× 1030 pfu/㎖ 또는 1× 101 pfu/g 내지 1× 1030 pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 104 pfu/㎖ 내지 1× 1015 pfu/㎖ 또는 1× 104 pfu/g 내지 1× 1015 pfu/g로 포함된다.
본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.
본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만, 약욕제 및 사료첨가제로 구현될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 이 조성물을 이용한 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지 및 처치 방법은 기존의 항생제 등의 화학물질에 기반을 둔 방식에 비하여 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지 또는 처치 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다. 통상적으로 항생제 등의 화학물질을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래하여 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 본 발명은 자연계에 이미 존재하는 박테리오파지를 분리하여 조성물의 유효성분으로 사용하기 때문에 매우 자연 친화적이라는 장점 또한 제공할 수 있다.
도 1은 박테리오파지 Str-PAP-1의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Str-PAP-1의 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다.
도 2는 박테리오파지 Str-PAP-1의 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다.
이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리
스트렙토코커스 파라우베리스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 선별에는 자연 환경이나 동물 검체로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 스트렙토코커스 파라우베리스 균은 본 발명자들에 의해 미리 분리되어 스트렙토코커스 파라우베리스 균으로 동정(identification)된 것이다.
박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 수집된 시료를 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 1/1000 비율로 접종한 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L)에 함께 첨가한 다음 30℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 회수하였고, 회수된 상등액은 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 해 주었다. 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(spot assay)을 통하여 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.
상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. TSB 배지에 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 1/1000 비율로 접종한 다음 30℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 배양액 3 ml(OD600이 2.0)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(spreading)하였다. 도말한 평판 배지를 클린벤치(clean bench)에서 약 20분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다.
건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 스트렙토코커스 파라우베리스 균이 도말된 평판 배지 위에 점적하였다. 이를 20분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판 배지를 30℃에서 하루 정치 배양한 다음 여과액이 떨어진 위치에 투명환(clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.
스트렙토코커스 파라우베리스 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 blade를 이용하여 회수한 다음 이를 파지 완충액(phage buffer; 10 mM Tris-HCl (pH7.5), 10 mM MgSO4, NaCl 4 g/L)에 첨가해 주어 4 시간 동안 방치하였다. 방치 후 5,000 rpm에서 5분간 원심분리 하여 상등액을 얻었고, 회수된 상등액은 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 해 주었다. 얻어진 상등액은 다시 용균반 분석에 사용하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회로 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 조사에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 기술한 과정을 반복하였다. 전자현미경 조사는 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(copper grid)에 묻히고 2% 우라닐 아세테이트(uranyl acetate)로 역염색법(negative staining)과 건조를 수행한 후 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 촬영하였다.
이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액 전체 부피의 10분의 1의 부피로 스트렙토코커스 파라우베리스 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 4-5 시간 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음 통상의 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ml에 최종농도가 10% PEG 8000/1 M NaCl이 되도록 PEG와 NaCl을 첨가한 다음 4℃에서 한밤동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ml로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.
이렇게 하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Str-PAP-1로 명명한 뒤, 2014년 4월 7일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(기탁번호 KCTC 12568BP)에 기탁하였다. 박테리오파지 Str-PAP-1의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때 Siphoviridae 박테리오파지라고 확인하였다.
실시예 2: 박테리오파지 Str-PAP-1의 유전체 분리 및 서열 분석
박테리오파지 Str-PAP-1의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ml에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/ml) 100 μl를 첨가한 후 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(phenol) : 클로로포름(chloroform) : 이소아밀알코올(isoamylalcohol)의 혼합액 10 ml를 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 층이 분리되게 한 다음 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 이소프로판 알코올(isopropyl alcohol)을 첨가한 다음 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(ethanol)을 첨가한 다음 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리 하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 다량의 박테리오파지 Str-PAP-1의 유전체를 확보하였다.
이렇게 얻어진 유전체를 이용하여 서울대학교 농생명과학공동기기원(National Instrumentation Center for Environmental Management)에서 차세대 염기서열 분석(Next Generation Sequencing; NGS) 방법을 통하여 박테리오파지 Str-PAP-1의 유전체 서열분석을 실시하였다. 이를 간략히 설명하면, 슬라이드 위에 DNA 단편을 고정시킨 후에 브릿지 증폭을 통해 최대 1,000 분자까지 증폭시켜 같은 서열의 DNA 단편 집단(cluster)을 형성시킨 다음 이 클러스터를 주형으로 네 종류의 형광 표식 염기를 사용한 일 염기 합성반응인 SBS(Sequence by Synthesis)를 수행한다. 이 방법의 특징은 DNA 서열을 다른 기법들처럼 용액 안에서 증폭시키는 것이 아니라 판 위에 고정시킨 후에 판 위에서 구부러지면서 증폭되어 서열집단을 형성한다. 그렇게 형성된 클러스터는 집단 별로 sequencing이 이루어져 각 read의 염기서열 정보로 전환되고 분석과정에 넘어간다. 확보된 유전자 서열을 이용하여 일반적인 방법으로 콘티그(contig) 지도를 제작하였으며 프라이머 워킹(primer walking)을 통해 최종 36,595bp의 크기의 전체 유전자 서열을 분석할 수 있었다. 최종적으로 확인된 박테리오파지 Str-PAP-1의 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.
확보된 박테리오파지 Str-PAP-1의 유전체 서열을 기반으로 Web상의 BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 이용하여 기존에 알려진 박테리오파지 유전자 서열과의 상동성(similarity)을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 박테리오파지 Str-PAP-1의 유전체 서열은 락토코커스(Lactococcus) 박테리오파지 phi31의 서열(GenBank Accession No. AJ292531.2)에서만 아주 낮은 정도의 상동성을 보였고(1%), 이를 통해 Str-PAP-1은 기존에 알려진 박테리오파지와는 분명한 차이가 있는 것으로 분석되었다.
이러한 결과로부터 박테리오파지 Str-PAP-1은 기존에 보고된 박테리오파지들과는 다른 신규한 박테리오파지라 결론지을 수 있었다.
실시예 3: 박테리오파지 Str-PAP-1의 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 대한 사멸능 조사
분리된 박테리오파지 Str-PAP-1의 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 스트렙토코커스 파라우베리스 균들은 본 발명자들에 분리되어 스트렙토코커스 파라우베리스 균으로 동정된 것들로 총 55종이었다. 박테리오파지 Str-PAP-1은 실험에 사용된 스트렙토코커스 파라우베리스 균들 중 35 균주에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 Str-PAP-1의 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 안길라룸(Vibrio anguillarum), 비브리오 익티오엔테리(Vibrio ichthyoenteri), 락토코커스 가르비에(Lactococcus garvieae) 및 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 Str-PAP-1은 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.
이상의 결과로 박테리오파지 Str-PAP-1은 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지 및 처치 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 확인할 수 있었다.
실시예 4: 박테리오파지 Str-PAP-1의 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 예방에 대한 실험예
9 ml의 TSB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 109 pfu/ml 수준의 박테리오파지 Str-PAP-1 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ml의 TSB 배지를 담은 튜브에는 동량의 TSB 배지만을 첨가하였다. 그 다음으로 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 0.5 정도가 되도록 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 배양액을 넣어 주었다. 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 첨가한 후 튜브들을 30℃의 배양기에 옮겨 진탕배양 하면서 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 Str-PAP-1 액을 첨가해 준 튜브에서는 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.
구분 | OD600 흡광도 값 | ||
배양 0분 | 배양후 15분 | 배양후 60분 | |
박테리오파지 액 미첨가 | 0.5 | 0.62 | 0.94 |
박테리오파지 액 첨가 | 0.5 | 0.60 | 0.32 |
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Str-PAP-1이 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 Str-PAP-1이 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염을 방지하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.
실시예 5: 박테리오파지 Str-PAP-1을 이용한 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 질환 처치예
박테리오파지 Str-PAP-1의 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 의한 질환이 유발된 넙치에서의 처치 효과를 조사하였다. 생후 4개월의 넙치 치어(체장 6~9 cm) 10마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 수조에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 수조의 주위환경은 통제하였고, 수조가 있는 실험실의 온도와 습도는 일정하게 유지시켰다. 실험 개시일로부터 7일째 되는 날에 모든 넙치들에게 스트렙토코커스 파라우베리스 균 액 (100 μl)을 복강투여 하였다. 투여한 스트렙토코커스 파라우베리스 균 액은 다음과 같이 준비한 것이다. 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 TSB 배지를 이용하여 30℃에서 18시간 배양한 후 균체만을 회수한 후 이를 생리식염수(pH 7.2)로 1× 108 CFU/ml이 되게끔 조정하였다. 스트렙토코커스 파라우베리스 균 투여 다음날부터 실험군(박테리오파지 액 투여군)의 넙치들에게는 매일 1회씩 1× 108 PFU/ml의 박테리오파지 Str-PAP-1 (100 μl)을 스트렙토코커스 파라우베리스 균 액 투여와 같은 방식으로 복강투여 하였다. 대조군(박테리오파지 액 미투여군)의 넙치들은 어떠한 처치도 하지 않았다. 사료는 대조군과 실험군 모두 동일하게 급이 하였다. 스트렙토코커스 파라우베리스 균 투여 후부터는 매일 모든 시험동물들을 대상으로 연쇄구균증 발생 상태를 조사하였다. 연쇄구균증 발생 상태 조사는 체색흑화지수를 측정 방식으로 실시하였다. 체색흑화지수 측정은 통상 사용되는 Dark Coloration(DC) score(정상: 0, 연한 흑화: 1, 진한 흑화: 2)를 측정하는 방식으로 실시하였다. 그 결과는 표 2와 같았다.
스트렙토코커스 파라우베리스 균 투여 후 경과 일 |
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
대조군 (박테리오파지 액 미투여) | 1.0 | 1.5 | 1.5 | 1.25 | 1.1 | 1.25 | 1.25 |
실험군 (박테리오파지 액 투여) | 1.0 | 0.5 | 0.25 | 0.25 | 0.1 | 0 | 0 |
이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Str-PAP-1이 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 원인으로 하는 감염 질환의 처치에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 사료첨가제 및 사료의 제조
박테리오파지 Str-PAP-1 액을 이용하여 사료 첨가제 1 g당 1× 109 pfu의 박테리오파지 Str-PAP-1이 포함되도록 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 방법은 박테리오파지 액에 중량비로 40%인 말토덱스트란과 중량비로 10%인 트리할로오즈를 첨가한 다음에 잘 녹인 후에 동결건조시켜 제조하였다. 최종적으로 고운 가루 형태로 분쇄하였다. 상기 제조 과정 중의 건조 과정에는 감압 건조, 가온 건조, 상온 건조도 대체 가능하다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료첨가제도 박테리오파지 액 대신에 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액(buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO4, 0.1% Gelatin, pH 8.0)을 사용하는 방식으로 제조하였다.
이렇게 제조된 2종의 사료첨가제 각각을 중량비로 250배의 양어용 생사료와 혼합하여 최종 2종의 사료를 제조하였다.
실시예 7: 약욕제의 제조
박테리오파지 Str-PAP-1 액을 이용하여 약욕제 1 ml당 1× 109 pfu의 박테리오파지 Str-PAP-1이 포함되도록 약욕제를 제조하였다. 약욕제의 제조 방법은 박테리오파지 액 제조 시에 사용하는 완충액 1 ml당 1× 109 pfu의 박테리오파지 Str-PAP-1이 포함되도록 상기 박테리오파지 Str-PAP-1 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 약욕제로는 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액 자체를 그대로 사용하였다.
이렇게 제조된 2종의 약욕제는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 약욕제로 사용하였다.
실시예 8: 넙치 사육에서의 사양 효과 확인
실시예 6 및 실시예 7에서 제조한 사료와 약욕제를 이용하여 넙치 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 20 마리의 넙치를 10 마리씩 한 그룹으로 총 2개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 약욕제로 처치한 그룹-B)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 5마리로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 Str-PAP-1이 적용된 소그룹 (소그룹-①) 및 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹 (소그룹-②)으로 나누었다. 본 시험에 대상이 된 넙치는 생후 4개월의 넙치 치어였으며, 각 시험 소그룹의 넙치는 일정 간격을 두고 위치한 격리된 각각의 수조에서 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 3과 같이 구분되고 지칭되었다.
적용 | 소그룹 구분 및 표시 | |
박테리오파지 Str-PAP-1 적용 | 박테리오파지가 적용되지 않음 | |
사료로 급이한 그룹 | A-① | A-② |
약욕제로 처치한 그룹 | B-① | B-② |
사료 급이의 경우에는 실시예 6에서 제조한 사료를 표 3의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이 하였으며, 약욕제 처치의 경우에는 실시예 7에서 제조한 약욕제를 표 3의 구분에 따라 통상적인 약욕제 처치 방식에 따라 처치하였다. 시험 결과가 표 4에 제시되어 있다.
그룹 | 폐사율(%) |
A-① | 0 |
A-② | 20 |
B-① | 0 |
B-② | 40 |
이상의 결과로 본 발명에 따라 제조된 사료의 급이와 본 발명에 따른 약욕제 처치가 넙치 사육에서의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 조성물의 적용이 넙치의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
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<213> Bacteriophage Str-PAP-1
<400> 1
atatttatat atttattatt attattaatt aatagaatat agagttaact attaacctta 60
acttgtctaa ttactgatat ataagatttt taaacagtta agggttatca tttttcactt 120
aactaaacta ttaaccatta accttgatat aacatgtaac tggctttttc ggatcgtttt 180
cattgtgcca tgaaaaaact cctaattctg ttggtgtatc tacgctaggc ataaatccaa 240
ttggtttagc aactttcttt tcccactctc ctgttaaaaa tgtaggcaat tgcttttcaa 300
acttaaattt atttaacgct acaatcccag aatctttgca ccatgcttta tacaaccacc 360
acagaaattt actaggtagt ctctttgatt caaatttagg aaaccattca ttgacgaatg 420
ctttaactgt gtcatttgat tctttaaatt cttctaactg tactttagtt gctgatggtt 480
cattaaactt attaaaattg atttcaagag ctttttttaa aacatactct ctaacatctt 540
ccctataaat atagtcatct ttaatcgccc aattatcttc tttaggtgaa aatgtttttc 600
taaaaggtat aattgtaaat cgtcgataag taccgtttga tttattcttg aatcgaggca 660
attcatttgt tgattgaatg actgtttttc taaagatagt tgtataaggt tgtttattct 720
tctcctctac taatactggt tcaccagtaa cgaccgaatt gaagttagat gattcgtcta 780
catatatacc agcttgcaca tcgtcaccga taattactgt tttaccttca atcattgata 840
aggcgaatcg ttctgaaaat tggttaagct ttaatgttgc aatgtttttt aaaccaatta 900
cattagttat aagttgctga acagtacctt taccgtcgtt tccttcacca acaaaccaaa 960
ttgatttgcg gtaagaataa tttccattta atgatgctga tatgacttgc catagtaaat 1020
caactaattc ttcgtcattt tccattaagt ctaataacca actatcgaca tcccaaccat 1080
ttatatttgg cgacttagcg aatgcatcgt attctgtcgc aattgtcgaa aatgccacaa 1140
attgatgagt aaaacctaaa agtttttgtt cttttttgtc atagataccg tttttcacta 1200
agataaaccg ttttggattt ttaaaatcac caattgaaaa attagaggag aatccatcat 1260
atttatgaat cctattattt gaagaaagca taaataagac atttttagct ttttgttcgt 1320
taaaggtagg ttctaacaac ctaattactt tataggcaaa tgatgggtct ttgtgataat 1380
atccgttatc aggatcataa acggcaaccc tcccattgga taatgtgata atgtaaagta 1440
ggtattccat accttgagat actgctaatt catttaatgt tgttcgtttt gtatcttttt 1500
cttgcgcagt cccatcttca tttacttttg agttagcttt ttcaagccat ctatcgcgaa 1560
aattttttgc gcctaatttg atttctttcc aatcgttagg cctttgctca tatatatcga 1620
ttattttatt ttcatattct gctttaatag cttgtatatt aactgccact tcttctatca 1680
agctcctttc tcaacatgct ctcatatgtt gcatcaactt cgttttctgg caatggattt 1740
ggtgtgtaat gattagcaag caatgccaac ttatatactg cttcttcgtc aacacctctg 1800
agcaatagtc cgcctattag acttgcaagt gaattgtttc taccaccagc atcccctaga 1860
ccaaagacaa ttttttcaaa taatttagca gtctgactac tgtatccact attaccttta 1920
ctactgaaat cccttgcaac cgtttttctt gtatgaccaa tcaattcaat caattcaatt 1980
ggcgattctg cgaattttcc gccttcaagt gaattttctt tatcccatac ataactgcca 2040
ttcgtagtgt tagatggcgc aactaagaca taattgttgt cattagcttt gatatcgaca 2100
ccgtctaaga aaccaacact ctggttaatt gatacacctt taggtttctt aagaaaaata 2160
tgtctacccc cagtaggggt gatggcttga gttgtttctg gaataaggtc tttaccttcc 2220
caattattaa aactttcaaa gccatcaata tcaccatgaa catctatgtc aattacaaag 2280
aagttatctg tccttactgc aatatttgca tcaggatttt ctttccataa taatttgatt 2340
tcatgttcag taaacgattt atttttaaat tttgttagtg gtcgtttact ttttttatca 2400
attggaatga cagaaaatcc gttcttctga taatgcagtg cataatctac cattcctgta 2460
atcatattag aatggtaagc catcttcgat tgatttttga ttaggaatct tgtcagctaa 2520
ttgtgatgat tccattgact taatgttcaa tcgattcgtt actttacctt gatattcatt 2580
atcttcattt ttaactgtta cttttaatgc tttcccgcga atctgatcta agaaatcttt 2640
ttctgattca attactgctg atggtggaaa ttcaattgct ttagcatatt gttgtaaacg 2700
gaactctaat ggcttacctt ctgcttttga ataccagatg cggtcgaaaa ttaattgatt 2760
gtgaaattct tgtttgaaat catcacggat ctttaggcgg atatctaaga agtctgatcc 2820
gtttggtgtt gctgactgtt cagcagtatc tacaaatact tcataagttc cgtctgtgat 2880
tgatgcgaat ttttttgctt ttgaataatc tactgtgaat aatgacataa ttttatctcc 2940
aaatttcttt ttcttgttgt ttatagtaaa cccacccttt tttgtaattg tggataagtg 3000
cgaacgcttg taattctggt aatgtttgac attgtcgcca attcttaccg tattttttaa 3060
ctttagaaaa aactgcatag tctcttggac tcatttctac attttttccg tttaattcaa 3120
tctcgatgat ttcatcaact ctgactagtt caccgttaac ttttttcatt tctacctttt 3180
taggctctgg tttcaattcc tcaccacagt atggacagca cccatttact atatctgttg 3240
agaagaaagc accataacat ttaggacatt ctcttgtagc tggtgaatcg tctttatctt 3300
ttgatttttt ctttttacct tcaagaatcc aattcctatc ttgattaggg aaaccgtgga 3360
ttttccaatt accgacgtga tcaattaaga tagcttcctt cccatctctt ggattcaatg 3420
cgcgcattgc gaattgtaag tacaatgaca atgaggttgt aggtcgtaac ataatgcata 3480
catcaacatt tggtaagtct attccctctg taaaaaggtt tacattcacc attattagta 3540
agtccccatt tctaaagtct ttcatagctt tatctctaat ttctttaggt gtactaccat 3600
gtattacagc tgatgaataa cctctctcag aaaatactgt tgctatttct gttgctttta 3660
ctacagaact tgcataaacg attgcttgtt tccctttagc taaatcctca taatgtgtga 3720
catagtcacc gttaaccatt ttccagctat ctaatgattc atcaattgat ttaactgtgt 3780
aatcaccgtg tgatttttta agtttttctt tatcaatcaa ttcaagtgaa taatatcgat 3840
attttgaaat attgccttgg tcttgcaacc attttatgga tttacctacg actaaatcat 3900
cagccatatc tttaaaccca gaaccatcta gcctaattgg cgtacctgta aaaaataaat 3960
gataagcttt atcaaagtaa ttcaatattt tttgatactg ttttgctttg atatgatgcg 4020
cttcatccac taaaatgatt tctggtggtg gtaggttttc taattttcta actagacttc 4080
ctacagttcc tattgttaat aagtctgtat taacaccatt acgattaaaa gtttctttaa 4140
cttgatcgtt tatttcttta cgatgactga aaaataatac atgattccct ttgtctgtag 4200
cacctttagc aatatgagcc attacaactg tcttaccgct tcgaggaggt gactgaacca 4260
ttatgcgacg attaccattt agaattgatt gccctatgtt agctactaat tcttcttgat 4320
aatctcttaa attaattatt taaatcacct cacttgctta ggggtttcga tgattttctt 4380
aatatcccaa cctctattta atcgagtatt gaaagtcgag taagaaagac caattatttt 4440
agaccattga gccattgtat gagtctcccc ttcgtaggtt aaaaatctgt ttctagttgt 4500
gttgttgttt tgaacaactc gatcaaccca tctacagttt tctggggcat aatcactaga 4560
aacattaatt ctatctaaag ttaattcact actatatcca tgttctattg accaagatct 4620
aaaaaccaaa taattatgtt tccaatcttc gcatacgcta atgccttttc caccataata 4680
tttgtagttc ttagcattag tatcacggca tctttgattc atagctatcc atatactata 4740
aaggcgttct ttttttgcaa atccatgctt cattcacttt cacctccaaa attaaacaaa 4800
tcttcaatct tacaagcggt tcttccgtcc aatcgattct tggcataagt gccttcacta 4860
ccttcaagaa ttaatccacg agaacctgtt tttgcattga ctatgatgcg accgacaaca 4920
tcggtcaaac ctaataactg gtctaaaaca gaatctctaa tacgtggtac atattgagtg 4980
ataatttgtc ctgtttctag attcaggtct tgtgtagctt cccaagcggt tacgtagatg 5040
ttgattggtt ttaaatagat agttgttaac actcttaaga agtaattagt ccattgattg 5100
taatgttgca attcgttgct gataccattt ttagacttac gaccttgttc gataaaccag 5160
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tcaacttctt ttaaaaaggt attgatgtca tctgacggat gctctctgtc aaatgatatt 5280
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gaattatcaa gtgataatac taatgtattt ccttttaact gtttgataag tgacgtctta 5400
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tattctctaa ctatcaatat gattcctttc tttatagtcg ttaacaacaa tatcgatatt 5940
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attttgtttt ctcaattgat acaatacaat ttgcatttgt cccaaattat tctcctttct 7440
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agtcagagct acacacaaag cgcctatttg caaaattaaa tccatacagc ctcctttcta 9780
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aacatcattg ataatacgat ttgcaataaa gatattccca gccttaccga agtgctgatt 9900
accattattt aaatgtaatt cgggatgctc cgtaactgtt aaatcagaaa gattaataac 9960
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aaatgcataa ccatttgtac cgcccggggc aaactgactt gtcagaagaa tctttttagc 11040
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aattgaactg attcgtgcat ttgtagaatc aatatctgca tcattagatg taatttgtgc 11340
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gcctcttgct tggatgattt ctgcatggtc agttaaagcg tttgagtaga tagaagccat 11460
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agcctcaata gaaattaaac aacttctgtc agatgggaaa atgtagttgt caattttaat 11640
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tgatactaaa gttgttgatt gataaacgat attgttatca tcgcaaagtg taattgttgc 11760
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tcattaactg tgctttgata tattgaacca atcggataaa acgtatctaa catgccagcg 12060
tttctatccg tccatatata atcatcgtaa ttggttgatt ggattgtccc agtataggtt 12120
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ctagttgacc agtaagtcct ttgatttgtt ggtcttttga tttgagttct gttttgagtt 32580
ggttattacg ttgttttaat tgattatttt ctttattaac aatactgcaa gcgagcataa 32640
tgccaataag aagtcctaat aaaataaggt tgagccacaa caaaaaatca ttcttcattc 32700
ttccacgctt tctagtaagt cactgttttg ataaataaag ctatacccaa atactttatt 32760
acgtctgcct gcaaggcatt cagaaatatt tccattagac ttcatattta aaaaatattg 32820
agcgtctttt atacttttga attttccgtc ttttaacatt agtattggtt ttttgttctt 32880
atctgctttt tttgatactg ctactacttc tttatccatc actctttaac ccatttcaac 32940
acaacgtctc cttctttttc atacgtatct acccatcgct gctcaccatc ggaaaagata 33000
cataacctta acggataacc catttcatca aattggatta catttgaacg tatttttatt 33060
ctcggtatat ccttcttttt gaagaacatc attccacttc ctccaaaaat tctaaatagc 33120
gtgggtcaat agctttaact tctgctcgtg tgaatttggt tttgtcaaat tcatcataag 33180
tgtttgatag aaaatgtgtt ccatctcttt tgtcaatatt taaatatcca ttctcaccac 33240
tcattaaatg tacataatac aaaggctctt ccacttccca tttaccatca aggatggctt 33300
ggtttacttt tagttttaat tcgctagtgt taaatattct gtttaattca ccatctgaat 33360
tatataaaag ctttattaca ttttgtttta aatcatcatc attaatcgta aatttcttta 33420
ataattcatt ttcttctctt gttaacttaa tcatttaaaa cctctatatc gtatctattc 33480
ttattagaaa agttcagtaa taaatctaca atttctccgt gagccattac ccaaaaatca 33540
tcatttctgt atttgatttc ataaacgtca taatcattcc atttacaatc agtgattttt 33600
acaatgtcac cgtctttgat ttcttgatta tttatatctt taaaaatcat ttaatcaccc 33660
cacacatcat taatattagt attactgtta aaatcgcaaa gattgccagt agtaaataaa 33720
ttaaaatcat tcttctaccc cttaatttct actaaatggc tatcacaatc ctctgtgtaa 33780
gaaatcaatt gaatagcttt acgtgaatta atccaaccgt ttttatcttc gtagtcatct 33840
gtttttttga ctgttccgaa ttgacgtaaa ataacaccat tttcgtctac ttctttttca 33900
aatgtatgcc tgtgccctgt gtgaacttct cttacttttg ttgtaaagaa aatatcttca 33960
aattcagtcg caaatttcat tggaagttct tttaatttaa cggtatgacc gtgcgataac 34020
atcactccta taggtcctac cttataagcc attctccatc tattatgatt gtttagctta 34080
acatctggat acttagccat tagatactca ttaaatacat attcaagctc tgaatgattg 34140
ccaatagcat attcaaacct aacttcattt gagttactca aggcagtcgt tataatctca 34200
ttgaaaaaag ttttagcatc ttgtacagct tgtggcatat tgactgtttc taattgtgtg 34260
cctcttaccg tagaagatga tgtcataaat gcactatgga ataagtctcc tagttgctcg 34320
ataacaattg tattaaaccc atttcgaata aactctttaa ttttttcagt tttaacttct 34380
aagtgttcaa ttttagtaac cccaaaatgt aagtcggcaa gcgggataat taagatatct 34440
tttccgctat ttaatttaac tggttttatt ggttttactt taccagccaa taaatcagtt 34500
aatttatttg ttgacatttt agttcttggt cttactgtga tagttgattg ataattataa 34560
aatgcactac cttcaagagg cgttgtccat tcatttgatt taccagaaac gatttcccag 34620
tcatctggat caaaaccatg taaggataat agttgctctt cagttaaaag ttgaccttcg 34680
cttaacttta attttattga gtgtgtgagt gattttttcc cattcctatg catgtcatat 34740
tgactaagtg tcttgtggct acctttaatc cgtttaaatt ctgcatacca gtctgaattt 34800
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ttatttaact ctttagtcct attttcccaa ctcaaatcaa agtagtttct taaaatgtaa 34920
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aaggcaatag ttagccatgt ctttaagagt gtctgatttg ctttctaata cttgattttt 35040
attcttggta agattaacca accgttggta cttatcgctt atacggacga ttccagccac 35100
ctctccgaac tgttcaagcg attcttcaaa ggaactccca taatctgcat tcttcttcaa 35160
aaacgtttga aaattttcgt catatacttt ttgcattgct tctgcgttta tcttatccat 35220
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ctctgtattc cccataaggc gaaacagggg tccaatccca tccgtgcgca cagtcgaagc 35340
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cgtggcactc gatttcattt tcgtctatta gaccgactat attttcagga acttctacat 35460
atccacataa atgccatcct tgtatcatta cgatgactgc attataacca tcaataacta 35520
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ttaacctgct ttcttccaaa gccatttttt taagtatctc tctatatctc tgtcttgata 35880
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tgacctgctt ttgataaacc aactctgatt tgattttgga ttgtgtgttc ttgtgtcatg 36480
ttcctcctaa aagttaatgg tactattaac cacctataaa gtcagtcata ccaagtgatt 36540
agaccattat ttttaaaaaa agttaaaggt taatagtctt tttatactta tatat 36595
Claims (7)
- 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 사멸시킬 수 있고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 가지며 자연으로부터 분리된 박테리오파지 Str-PAP-1.
- 제1항에 있어서, 상기 박테리오파지 Str-PAP-1은 기탁번호 KCTC 12568BP인 것을 특징으로 하는 박테리오파지 Str-PAP-1.
- 스트렙토코커스 파라우베리스 균을 사멸시킬 수 있고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 가지며 자연으로부터 분리된 박테리오파지 Str-PAP-1을 유효성분으로 포함하는 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 박테리오파지 Str-PAP-1은 기탁번호 KCTC 12568BP인 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 상기 조성물은 사료첨가제 또는 약욕제인 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지 및 처치용 조성물.
- 제3항 또는 제4항에 의한 스트렙토코커스 파라우베리스 균의 감염 방지 및 처치용 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 의한 감염을 방지 또는 처치하는 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 조성물이 사료첨가제 또는 약욕제 형태로 사람을 제외한 동물에 투여되는 것을 특징으로 하는 스트렙토코커스 파라우베리스 균에 의한 감염을 방지 또는 처치하는 방법.
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