KR101676621B1 - 신규한 락토코커스 가르비에 박테리오파지 Ｌａｃ-ＧＡＰ-1 및 이의 락토코커스 가르비에 균 증식 억제 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 락토코커스 가르비에 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Lac-GAP-1(수탁번호 KCTC 12686BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 락토코커스 가르비에 균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것이다.

Description

신규한 락토코커스 가르비에 박테리오파지 Ｌａｃ-ＧＡＰ-1 및 이의 락토코커스 가르비에 균 증식 억제 용도{Novel Lactococcus garvieae bacteriophage Lac-GAP-1 and its use for preventing proliferation of Lactococcus garvieae}

본 발명은 락토코커스 가르비에 균에 감염하여 락토코커스 가르비에 균을 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리한 박테리오파지 및 이를 유효성분으로 포함한 조성물을 이용한 락토코커스 가르비에 균의 감염을 방지 및 처치하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 락토코커스 가르비에 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Lac-GAP-1(수탁번호 KCTC 12686BP), 및 상기 박테리오파지를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 락토코커스 가르비에 균의 감염 방지 및 감염 후 처치 방법에 관한 것이다.

락토코커스 가르비에(Lactococcus garvieae) 균은 그람양성 구균이며, 협막항원(Capsular, K)의 유무에 따라 2 가지의 혈청형(Serotype)으로 구분될 수 있다. 주로 수생종(Aquatic species)에서 연쇄구균증(Streptococcosis)을 유발하는 원인균으로 알려져 있으며, 드물게 사람 혹은 소, 물소, 돼지, 가금류 등의 여러 동물들에서 심내막염(Endocarditis) 및 유방염(Mastitis)을 유발한다.

락토코커스 가르비에 균을 통해 연쇄구균증에 감염된 어류는 선회운동을 하며 체색흑화, 안구돌출, 아가미뚜껑 출혈, 기저부 출혈, 복부팽만이 관찰된다. 해부소견으로는 간의 퇴색, 소화관의 종대 및 내부 장기 출혈이 관찰되며, 혈액성 복수가 고이고 복강내 출혈이 관찰되기도 한다. 연쇄구균증의 원인은 사육환경의 악화, 부적절한 사육, 및 부적절한 사료 등 여러 가지 요인들이 있을 수 있고, 주로 치어보다는 성어에서 발병률이 높아 경제적인 피해가 다른 세균성 질병에 비해 상대적으로 높게 나타나기 때문에 위험기인 고수온기에 접어들수록 양식 어류의 상태를 유심히 자주 관찰하여 이상 행동 여부를 파악하는 것이 필요하다.

어류 양식 산업은 부족한 식량자원을 손쉽게 얻을 수 있다는 점에서 해마다 급속한 성장을 거듭하고 있다. 그러나 이러한 양식 산업의 성장이 증가 할수록 사료를 통한 주변 환경의 오염 역시 증가하고 있고 특히 사료에 포함되어 있는 많은 양의 항생제가 광범위하게 사용됨으로써 오히려 인류의 건강을 위협하기도 한다. 항생제는 어류 양식 시 사육 위생의 단점으로 인해 야기되는 세균감염을 막기 위해 주로 사용되지만, 제한 없이 광범위하게 사용되는 것이 가장 큰 문제점으로 지적되어 왔다. 또한, 항생제의 오남용으로 인해 어류 병원균의 항생제에 대한 내성 증가와 함께 양식 환경에서 항생제 내성 세균의 출현을 초래하고 세균총의 변화를 야기하는 등의 심각한 문제를 초래할 수도 있다. 우리나라에서는 2011년 7월부터 사료첨가용 항생제 사용을 전면 금지하기로 결정하였으나, 여전히 현장의 많은 양어장에서는 양식장 어류의 질병 증가와 생산성 저하 등의 이유로 항생제를 처방받아 사용하기도 한다. 이에, 세균 감염을 방지할 수 있고 또한 이들의 감염을 효과적으로 처치할 수 있는 방법의 개발이 절실하다 할 수 있다. 최근에는 양식 어류의 질병제어를 위한 수단으로 백신(Vaccine) 개발 등이 본격화 되고 있으나 아직 백신종류가 다양화되지 못해 질병종류가 다양화 되고 혼합질병 발생 증가에 따른 대처를 위해서는 백신과 함께 또 다른 질병제어 수단이 복합적으로 개발되어야 한다.

최근 세균성 질환의 대처 방안으로 박테리오파지(Bacteriophage)의 활용이 크게 주목을 받고 있다. 특히 자연친화적 방식의 선호로 인하여 박테리오파지에 대한 관심은 어느 때보다 높다고 할 수 있다. 박테리오파지는 세균에 감염하는 아주 작은 미생물로서 보통 파지(Phage)라고 줄여서 부르기도 한다. 박테리오파지는 박테리아에 감염(Infection)한 후 박테리아 세포 내부에서 증식을 하고, 증식 후 자손 박테리오파지들이 박테리아 밖으로 나올 때 숙주인 박테리아의 세포벽을 파괴하는 방식으로 박테리아를 사멸시키는 능력을 갖고 있다. 박테리오파지의 박테리아 감염 방식은 매우 특이성이 높아서 특정 박테리아에 감염할 수 있는 박테리오파지의 종류는 일부로 한정된다. 즉, 특정 박테리오파지는 특정 범주의 박테리아에만 감염할 수 있고 이로 인하여 특정 박테리오파지는 특정 박테리아만을 사멸시키며 다른 박테리아에는 영향을 주지 않는다.

박테리오파지는 1915년 영국의 세균학자 Twort가 포도상구균(Micrococcus) 집락이 어떤 것에 의해 투명하게 녹는 현상에 대한 연구를 수행하면서 발견되었다. 또한, 1917년에는 프랑스의 세균학자 d'Herelle이 이질환자 변의 여과액 중에 적리균(Shigella disenteriae)을 녹이는 작용을 가진 것이 있다는 것을 발견하고 이에 대한 연구를 통해 독립적으로 박테리오파지를 발견하였으며, 세균을 잡아먹는다는 뜻에서 박테리오파지라고 명명하였다. 이후 이질균, 장티푸스균, 콜레라균 등 여러 병원성 박테리아에 대한 박테리오파지가 계속적으로 발견되었다.

박테리아를 사멸시킬 수 있는 특별한 능력으로 인하여 박테리오파지는 발견 이후 박테리아 감염에 대응하는 효과적 방안으로 기대를 모았으며 관련하여 많은 연구들이 있었다. 그러나 Flemming에 의해 페니실린이 발견된 이후, 항생제의 보급이 일반화되면서 박테리오파지에 대한 연구는 일부 동유럽 국가들 및 구소련에 한정되어서만 명맥이 유지되었다. 그런데 2000년 이후에 항생제 내성균의 증가로 인하여 기존 항생제의 한계성이 나타나고, 기존 항생제의 대체 물질로의 개발 가능성이 부각되면서 다시 박테리오파지가 항-박테리아제로 주목을 받고 있다.

특히 최근 항생제 사용에 대한 정부 차원의 규제가 전 세계적으로 강화됨에 따라 박테리오파지에 대한 관심이 더욱 높아지고 있으며 산업적 활용 사례도 증가하고 있다.

이에, 본 발명자들은 락토코커스 가르비에 균을 선택적으로 사멸시킬 수 있는 자연으로부터 분리된 박테리오파지를 이용하여 락토코커스 가르비에 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 조성물을 개발하고, 또 이 조성물을 이용하여 락토코커스 가르비에 균의 감염을 방지 또는 처치하는 방법을 개발하고자 노력한 끝에, 이에 적합한 박테리오파지를 자연으로부터 분리하고 이 분리된 박테리오파지를 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있도록 유전체(Genome)의 유전자 서열을 확보한 후 상기 박테리오파지를 유효성분으로 한 조성물을 개발한 다음 이 조성물이 락토코커스 가르비에 균의 감염 방지 및 처치에 효과적으로 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 락토코커스 가르비에 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대(Myoviridae) 박테리오파지 Lac-GAP-1(수탁번호 KCTC 12686BP)을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 락토코커스 가르비에 균에 감염하여 락토코커스 가르비에 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Lac-GAP-1을 유효성분으로 포함하는 락토코커스 가르비에 균의 감염을 방지하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 락토코커스 가르비에 균의 감염 방지 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 락토코커스 가르비에 균에 감염하여 락토코커스 가르비에 균을 사멸시킬 수 있는 분리 박테리오파지 Lac-GAP-1을 유효성분으로 포함하는 락토코커스 가르비에 균의 감염을 처치하는 데에 활용 가능한 조성물 및 이 조성물을 이용한 락토코커스 가르비에 균의 감염 처치 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 락토코커스 가르비에 균 감염 방지 및 처치 목적의 약욕제를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물들을 이용한 락토코커스 가르비에 균 감염 방지 및 처치를 통한 사양 효과 제공 목적의 사료첨가제를 제공하는 것이다.

본 발명은 락토코커스 가르비에 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖는 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리한 미오비리대 박테리오파지 Lac-GAP-1(수탁번호 KCTC 12686BP), 및 이를 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 락토코커스 가르비에 균의 감염 방지 및 처치 방법을 제공한다.

박테리오파지 Lac-GAP-1은 본 발명자들에 의해 분리된 후 2014년 10월 1일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터에 기탁되었다(수탁번호 KCTC 12686BP).

또한, 본 발명은 락토코커스 가르비에 균의 감염을 방지 또는 처치하는 데에 활용될 수 있는 박테리오파지 Lac-GAP-1을 유효성분으로 포함하는 약욕제 및 사료첨가제를 제공한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 박테리오파지 Lac-GAP-1은 락토코커스 가르비에 균을 효과적으로 사멸시키므로 락토코커스 가르비에 균에 의해 유발되는 연쇄구균증의 예방(감염 방지)이나 치료(감염 처치)에 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 조성물은 락토코커스 가르비에 균에 의해 유발되는 연쇄구균증에 대한 예방 및 치료 목적으로 활용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 “처치” 또는 “치료”라는 용어는 (ⅰ) 락토코커스 가르비에 균에 의해 유발된 연쇄구균증의 억제; 및 (ⅱ) 락토코커스 가르비에 균에 의해 유발된 연쇄구균증의 경감을 의미한다.

본 명세서의 “분리” 또는 “분리된”은 자연 상태로부터 여러 실험 기법을 활용하여 박테리오파지를 분리하는 것과 타 박테리오파지와 구별하여 특정 지을 수 있는 특징들을 확보하는 일을 지칭하며, 이에 더하여 생물공학기술로 박테리오파지를 산업적으로 활용할 수 있게끔 증식시키는 것도 포함한다.

본 발명의 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로오스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물에는 박테리오파지 Lac-GAP-1이 유효성분으로 포함된다. 이때 포함되는 박테리오파지 Lac-GAP-1은 1× 10¹ pfu/㎖ 내지 1× 10³⁰ pfu/㎖ 또는 1× 10¹ pfu/g 내지 1 × 10³⁰ pfu/g로 포함되며, 바람직하게는 1× 10⁴ pfu/㎖ 내지 1× 10¹⁵ pfu/㎖ 또는 1× 10⁴ pfu/g 내지 1× 10¹⁵ pfu/g로 포함된다.

본 발명의 조성물은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수도 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캡슐제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수도 있다.

본 발명의 조성물은 활용 방식에 따라, 이에 국한되지 않지만, 약욕제 및 사료첨가제로 구현될 수 있다.

본 발명의 박테리오파지 Lac-GAP-1을 유효성분으로 포함하는 조성물을 이용한 락토코커스 가르비에 균의 감염 방지 및 처치 방법은 기존의 항생제 등의 화학물질에 기반을 둔 방식에 비하여 락토코커스 가르비에 균에 대한 특이성이 매우 높다는 장점을 제공할 수 있다. 이는 다른 유용한 상재균에는 영향을 주지 않으면서도 락토코커스 가르비에 균의 감염 방지 또는 처치 목적으로 사용할 수 있음을 의미하며, 이의 사용에 따른 부작용이 매우 적다. 통상적으로 항생제 등의 화학물질을 사용하면 일반 상재균들도 피해를 함께 입게 되어 결과적으로 동물의 면역력 저하 등을 초래하여 다양한 부작용이 나타난다. 한편, 본 발명은 자연계에 이미 존재하는 박테리오파지를 분리하여 조성물의 유효성분으로 사용하기 때문에 매우 자연 친화적이라는 장점 또한 제공할 수 있다.

도 1은 박테리오파지 Lac-GAP-1의 전자현미경 사진이다.
도 2는 박테리오파지 Lac-GAP-1의 락토코커스 가르비에 균에 대한 사멸능을 보여주는 실험 결과이다. 투명한 부분은 박테리아가 용균되어 결과적으로 형성된 용균반이다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이며 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 락토코커스 가르비에 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 분리

락토코커스 가르비에 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지의 선별에는 자연 환경으로부터 확보된 시료들을 이용하였다. 한편, 박테리오파지 분리에 사용된 락토코커스 가르비에 균은 한국생명공학연구원 생물자원센터로부터 분양받아 사용하였다(분양번호 KCTC 5619).

박테리오파지 분리 과정을 상세히 설명하면, 수집된 시료를 락토코커스 가르비에 균을 1/1000 비율로 접종한 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지(카제인 다이제스트, 17 g/L; 소이빈 다이제스트, 3 g/L; 덱스트로스, 2.5 g/L; NaCl, 5 g/L; 디포타슘 포스페이트, 2.5 g/L)에 함께 첨가한 다음 30℃에서 3-4시간동안 진탕배양 하였다. 배양 후, 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수된 상등액에 락토코커스 가르비에 균을 1/1000 비율로 접종한 다음 30℃에서 3-4시간동안 또 다시 진탕배양 하였다. 박테리오파지가 시료에 포함되어 있었을 경우 박테리오파지의 수(Titer)가 증가될 수 있도록 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 5회 반복 후에 배양액을 8,000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 원심분리 후, 회수된 상등액을 0.45 ㎛의 필터를 이용하여 여과를 실시해 주었다. 얻어진 여과액을 사용한 통상의 점적 실험(Spot assay)을 통하여 락토코커스 가르비에 균을 사멸시킬 수 있는 박테리오파지가 있는지를 조사하였다.

상기 점적 실험은 다음과 같이 실시되었다. TSB 배지에 락토코커스 가르비에 균을 1/1000 비율로 접종한 다음 30℃에서 한밤동안 진탕배양 하였다. 이렇게 하여 준비된 락토코커스 가르비에 균의 배양액 3 ㎖(OD₆₀₀이 1.5)을 TSA(Tryptic Soy Agar) 평판배지(카제인 다이제스트, 15 g/L; 소이빈 다이제스트, 5 g/L; NaCl, 5 g/L; 아가, 15 g/L)에 도말(Spreading)하였다. 도말한 평판 배지를 클린벤치(Clean bench)에서 약 30분 정도 방치하여 도말액이 건조되게 하였다. 건조 후 앞에서 준비한 여과액 10 μl를 락토코커스 가르비에 균이 도말된 평판 배지 위에 점적하였다. 이를 30분 정도 방치하여 건조시켰다. 건조 후 점적한 평판 배지를 30℃에서 하루 동안 정치 배양한 다음 여과액이 떨어진 위치에 투명환(Clear zone)이 생성되는가를 조사하였다. 투명환이 생성되는 여과액의 경우가 락토코커스 가르비에 균을 사멸 시킬 수 있는 박테리오파지가 포함되어 있다고 판단할 수 있다. 이러한 조사를 통하여 락토코커스 가르비에 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지를 포함한 여과액을 확보할 수 있었다.

락토코커스 가르비에 균에 대한 사멸능을 가진 박테리오파지의 존재가 확인된 여과액을 이용하여 순수 박테리오파지의 분리를 실시하였다. 순수 박테리오파지의 분리에는 통상의 용균반 분석(Plaque assay)을 이용하였다. 이를 자세히 설명하면, 용균반 분석에서 형성된 용균반 하나를 멸균된 팁을 이용하여 회수한 다음 이를 락토코커스 가르비에 균 배양액에 첨가해 주어 4-5 시간 동안 30℃에서 함께 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액에 50분의 1의 부피로 락토코커스 가르비에 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 30℃에서 4-5 시간 배양해 주었다. 박테리오파지의 수를 증가시키기 위하여 이러한 과정을 최소 5회 이상 실시한 다음 최종적으로 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 얻어진 상등액을 사용하여 다시 용균반 분석을 실시하였다. 통상 순수 박테리오파지의 분리가 상기 과정의 1회로 달성되지 않기 때문에 이때 형성된 용균반을 이용하여 앞 단계를 전체적으로 다시 반복하였다. 이와 같은 과정을 최소 5회 이상 실시하여 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 확보하였다. 통상적으로 순수 박테리오파지의 분리는 형성된 용균반의 크기 및 모양이 모두 유사하게 될 때까지 반복하였다. 그리고 최종적으로는 전자현미경을 통하여 박테리오파지의 순수 분리 여부를 확인하였다. 전자현미경 분석에서 순수 분리가 확인될 때까지 앞에 기술한 과정을 반복하였다. 전자현미경 분석은 통상의 방법에 따라 실시하였다. 이를 간단히 설명하면 다음과 같다. 순수한 박테리오파지를 포함한 용액을 구리 격자(Copper grid)에 묻히고 2% 유라닐 아세테이트(Uranyl acetate)로 역염색법(Negative staining)과 건조를 수행한 후 투과전자현미경을 통하여 그 형태를 촬영하였다. 순수 분리한 박테리오파지의 전자현미경 사진이 도 1에 제시되어 있다. 형태적 특징으로 판단할 때 신규 확보된 박테리오파지는 미오비리대(Myoviridae) 박테리오파지에 속함을 확인할 수 있었다.

이런 방식으로 확인된 순수 박테리오파지를 포함한 용액은 다음의 정제 과정을 거쳤다. 순수 박테리오파지를 포함한 용액 전체 부피의 50분의 1의 부피로 락토코커스 가르비에 균 배양액을 첨가해 준 다음 다시 4-5 시간 배양하였다. 배양 후 8,000 rpm에서 20분간 원심분리하여 상등액을 얻었다. 충분한 수의 박테리오파지가 포함된 액을 얻기 위해 이러한 과정을 총 5회 반복하였다. 최종 원심분리로 얻어진 상등액을 0.45 μm의 필터를 이용하여 여과한 다음 통상의 폴리에틸렌 글리콜(Polyethylene Glycol; PEG) 침전 과정을 실시하였다. 구체적으로, 여과액 100 ㎖에 10% PEG 8000/0.5 M NaCl이 되게 PEG와 NaCl을 첨가한 다음 4℃에서 2-3시간 동안 정치한 후, 8,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 박테리오파지 침전물을 얻었다. 이렇게 얻어진 박테리오파지 침전물을 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO₄, 0.1% Gelatin, pH 8.0) 5 ㎖로 부유시켰다. 이를 박테리오파지 부유액 또는 박테리오파지 액이라 지칭한다.

이렇게 하여 정제된 순수 박테리오파지를 확보할 수 있었고, 이 박테리오파지를 박테리오파지 Lac-GAP-1로 명명한 뒤, 2014년 10월 1일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(수탁번호 KCTC 12686BP)에 기탁하였다.

실시예 2: 박테리오파지 Lac-GAP-1의 유전체 분리 및 서열 분석

박테리오파지 Lac-GAP-1의 유전체를 다음과 같이 분리하였다. 유전체 분리에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 얻어진 박테리오파지 부유액을 이용하였다. 먼저 부유액에 포함되어 있을 수 있는 락토코커스 가르비에 균의 DNA와 RNA를 제거하기 위해, 박테리오파지 부유액 10 ㎖에 DNase I과 RNase A를 각각 200 U씩 첨가한 다음 37℃에서 30분간 방치하였다. 30분 방치 후에 DNase I과 RNase A의 활성을 제거하기 위해, 0.5 M 에틸렌디아민테트라아세트산(Ethylenediaminetetraacetic acid; EDTA) 500 μl를 첨가한 다음 다시 10분간 정치시켰다. 그리고 이를 추가로 10분간 65℃에 정치시킨 다음 박테리오파지 외벽을 와해시키기 위해 proteinase K(20 ㎎/㎖) 100 μl를 첨가한 후 37℃에서 20분간 반응시켰다. 그 후 10% 도데실 황산 나트륨염(Sodium dodecyl sulfate; SDS) 500 μl를 첨가한 다음 다시 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 1 시간 반응 후, 이 반응액에 25:24:1의 구성비를 갖는 페놀(Phenol) : 클로로포름(Chloroform) : 이소아밀알코올(Isoamylalcohol)의 혼합액 10 ㎖을 첨가해 준 후 잘 섞어 주었다. 그리고는 이것을 13,000 rpm에서 15분간 원심분리하여 층이 분리되게 한 다음 분리된 층들 중에서 위층을 취하여 여기에 1.5 부피비의 이소프로필 알코올(Isopropyl alcohol)을 첨가한 다음 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 유전체를 침전시켰다. 침전물을 회수한 후 침전물에 70% 에탄올(Ethanol)을 첨가한 다음 다시 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 침전물의 세척을 실시하였다. 세척된 침전물을 회수하고 진공 건조 시킨 다음 100 μl의 물에 녹였다. 상기 과정을 반복하여 박테리오파지 Lac-GAP-1의 유전체를 다량 확보하였다.

이렇게 얻어진 유전체를 이용하여 서울대학교 농생명과학공동기기원(National Instrumentation Center for Environmental Management)에서 illumina Mi-Seq 기기를 이용하여 차세대 염기서열 분석(Next generation sequencing analysis)을 통하여 박테리오파지 Lac-GAP-1의 유전체 서열분석을 실시하였다. 최종적으로 분석된 박테리오파지 Lac-GAP-1 유전체는 34,587 bp의 크기를 가지며, 전체 유전체 서열은 서열번호 1로 제시되어 있다.

확보된 박테리오파지 Lac-GAP-1의 유전체 서열을 기반으로 Web상의 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)를 이용하여 기존 알려진 박테리오파지 유전체 서열과의 상동성(Similarity)을 조사해 보았다. BLAST 조사 결과, 50% 이상의 상동성을 가진 박테리오파지 서열은 확인할 수 없었다.

이러한 사실에 근거하여 박테리오파지 Lac-GAP-1은 기존에 보고된 바 없는 신규한 박테리오파지라고 판단할 수 있었다.

실시예 3: 박테리오파지 Lac-GAP-1의 락토코커스 가르비에 균에 대한 사멸능 조사

분리된 박테리오파지 Lac-GAP-1의 락토코커스 가르비에 균에 대한 사멸능을 조사하였다. 사멸능 조사에는 실시예 1에서와 같은 방법으로 점적 실험을 통하여 투명환 생성 여부를 조사하였다. 사멸능 조사에 사용되어진 락토코커스 가르비에 균은 본 발명자들에 의해 분리되어 락토코커스 가르비에 균으로 동정된 것들로 총 9종이었다. 박테리오파지 Lac-GAP-1은 실험에 대상이 된 락토코커스 가르비에 균 중 7종에 대하여 사멸능을 갖고 있었다. 대표적 실험 결과가 도 2에 제시되어 있다. 한편, 박테리오파지 Lac-GAP-1의 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 안길라룸(Vibrio anguillarum), 비브리오 익티오엔테리(Vibrio ichthyoenteri), 스트렙토코커스 파라우베리스(Streptococcus parauberis) 및 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae)에 대한 사멸능 조사도 실시하였는데, 결과로 박테리오파지 Lac-GAP-1은 이들 균종들에 대해서는 사멸능을 갖고 있지 않았다.

이상의 결과로 박테리오파지 Lac-GAP-1은 락토코커스 가르비에 균에 대하여 특이적인 사멸능을 가지며, 다수의 락토코커스 가르비에 균에 대하여 항균 효과를 발휘할 수 있음을 확인할 수 있었다. 이는 박테리오파지 Lac-GAP-1이 락토코커스 가르비에 균의 감염 방지 및 처치 목적의 조성물의 유효성분으로 활용 가능함을 의미한다.

실시예 4: 박테리오파지 Lac-GAP-1의 락토코커스 가르비에 균의 감염 예방에 대한 실험예

9 ㎖의 TSB 배지를 담은 하나의 튜브에 1× 10⁸ pfu/㎖ 수준의 박테리오파지 Lac-GAP-1 액 100 μl를 넣어주고, 다른 하나의 9 ㎖의 TSB 배지를 담은 튜브에는 동량의 TSB 배지만을 추가로 첨가하였다. 그 다음에 각 튜브에 600 nm에서 흡광도가 0.5 정도가 되도록 락토코커스 가르비에 균의 배양액을 넣어 주었다. 락토코커스 가르비에 균을 첨가한 후 튜브들을 30℃의 배양기에 옮겨 진탕배양하면서 락토코커스 가르비에 균의 성장 상태를 관찰하였다. 표 1에 제시된 바와 같이, 박테리오파지 Lac-GAP-1 액을 첨가해 준 튜브에서는 락토코커스 가르비에 균의 성장 억제가 관찰된 반면에 박테리오파지 액을 첨가하지 않은 튜브에서는 락토코커스 가르비에 균의 성장 억제가 관찰되지 않았다.

락토코커스 가르비에 균의 성장 억제

구분	OD600 흡광도 값
	배양 0분	배양후 60분	배양후 120분
박테리오파지 액 미첨가	0.50	1.01	1.60
박테리오파지 액 첨가	0.50	0.38	0.21

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Lac-GAP-1이 락토코커스 가르비에 균의 성장을 저해할 뿐만 아니라 사멸까지 시키는 능력이 있음을 확인할 수 있었고, 이로부터 박테리오파지 Lac-GAP-1이 락토코커스 가르비에 균의 감염을 방지하는 목적의 조성물의 유효성분으로 활용될 수 있다고 결론지을 수 있었다.

실시예 5: 박테리오파지 Lac-GAP-1을 이용한 락토코커스 가르비에 균의 감염 질환 처치예

락토코커스 가르비에 균에 의해 연쇄구균증이 유발된 넙치에서의 박테리오파지 Lac-GAP-1의 처치 효과를 조사하였다. 생후 4개월의 넙치 치어(체장 6~9 cm) 10마리를 한 그룹으로 하여 총 두 그룹으로 나눈 후 수조에서 분리 사육하면서 14일간 실험을 실시하였다. 수조의 주위환경은 통제하였고, 수조가 있는 실험실의 온도는 일정하게 유지시켰다. 실험 개시일로부터 5일째 되는 날부터 3일간 1× 10⁸ cfu/g 수준으로 락토코커스 가르비에 균을 포함하고 있는 사료를 하루 2회씩 통상적인 사료 급이 방식으로 급이하였다. 락토코커스 가르비에 균을 포함하고 있는 사료 급이 마지막 날부터 연쇄구균증의 임상증상을 보이는 개체가 두 수조 모두에서 확인되었다. 3일간의 락토코커스 가르비에 균을 포함하고 있는 사료 급이 시행 다음날 (시험 개시일로부터 8일째가 되는 날)부터 실험군(박테리오파지 투여군)의 넙치들에게는 1× 10⁸ pfu/g의 박테리오파지 Lac-GAP-1를 포함하고 있는 사료를 통상적인 사료 급이 방식에 따라 급이하였다. 반면에 대조군(박테리오파지 미투여군)의 넙치들에게는 박테리오파지 Lac-GAP-1이 포함되지 않은 동일 조성의 사료를 동일한 방식으로 급이하였다. 시험 개시일로부터 8일째가 되는 날부터는 매일 모든 시험동물들을 대상으로 연쇄구균증 발생 상태를 조사하였다. 연쇄구균증 발생 상태 조사는 체색 흑화지수를 측정하는 방식으로 실시하였다. 체색 흑화지수 측정은 통상 사용되는 Dark Coloration(DC) score(정상: 0, 연한 흑화: 1, 진한 흑화: 2)를 측정하는 방식으로 실시하였다. 그 결과는 표 2와 같았다.

체색 흑화지수 측정 결과 (평균치)

날짜	D8	D9	D10	D11	D12	D13	D14
대조군(박테리오파지 미투여)	1.0	1.3	1.4	1.5	1.3	1.2	1.2
실험군(박테리오파지 투여)	1.0	0.7	0.3	0.2	0.2	0.1	0

이 결과로부터 본 발명의 박테리오파지 Lac-GAP-1이 락토코커스 가르비에 균을 원인으로 하는 감염 질환의 처치에도 매우 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 6: 사료첨가제 및 사료의 제조

박테리오파지 Lac-GAP-1 액을 이용하여 사료첨가제 1 g당 1× 10⁸ pfu의 박테리오파지 Lac-GAP-1이 포함되도록 사료첨가제를 제조하였다. 사료첨가제의 제조 방법은 박테리오파지 액에 말토덱스트린을 첨가(40%, w/v)하고 여기에 전체 10%가 되게 트리할로오즈를 첨가한 다음에 동결건조시켜 제조하였다. 최종적으로 고운 가루 형태로 분쇄하였다. 상기 제조 과정 중의 건조 과정에는 감압 건조, 가온 건조, 상온 건조도 대체 가능하다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 사료첨가제도 박테리오파지 액 대신에 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액(Buffer; 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgSO₄, 0.1% Gelatin, pH 8.0)을 사용하는 방식으로 제조하였다.

이렇게 제조된 2종의 사료첨가제 각각을 중량비로 250배의 양어용 생사료와 혼합하여 최종 2종의 사료를 제조하였다.

실시예 7: 약욕제의 제조

박테리오파지 Lac-GAP-1 액을 이용하여 약욕제 1 ㎖당 1× 10⁸ pfu의 박테리오파지 Lac-GAP-1이 포함되도록 약욕제를 제조하였다. 약욕제의 제조 방법은 박테리오파지 액 제조 시에 사용하는 완충액 1 ㎖당 1× 10⁸ pfu의 박테리오파지 Lac-GAP-1이 포함되도록 상기 박테리오파지 Lac-GAP-1 액을 첨가하여 잘 혼합해 주는 방식으로 제조하였다. 대조 실험을 위해, 박테리오파지가 포함되지 않은 약욕제로는 박테리오파지 액의 제조 시에 사용한 완충액 자체를 그대로 사용하였다.

이렇게 제조된 2종의 약욕제는 부피비로 1,000배의 물로 희석하여 최종적인 약욕제로 사용하였다.

실시예 8: 넙치 사육에서의 사양 효과 확인

실시예 6 및 실시예 7에서 제조한 사료와 약욕제를 이용하여 넙치 사육 시의 사양 결과 개선 여부에 대하여 조사해 보았다. 특히 본 조사는 폐사율 관점에서 실시되었다. 총 400 마리의 넙치를 200 마리씩 한 그룹으로 총 2개 그룹(사료로 급이한 그룹-A; 약욕제로 처치한 그룹-B)으로 나누어 4주간 시험을 실시하였다. 각 그룹은 다시 100마리로 구성되는 소그룹으로 나누어지며 각 소그룹은 박테리오파지 Lac-GAP-1이 적용된 소그룹(소그룹-①) 및 박테리오파지가 적용되지 않은 소그룹(소그룹-②)으로 나누었다. 본 시험에 대상이 된 넙치는 생후 4개월의 넙치 치어였으며, 각 시험 소그룹의 넙치는 일정 간격을 두고 위치한 격리된 각각의 수조에서 사육되었다. 각 소그룹은 다음의 표 3과 같이 구분되고 지칭되었다.

넙치 사양 시험에서의 소그룹 구분 및 표시

적용	소그룹 구분 및 표시
	박테리오파지 Lac-GAP-1 적용	박테리오파지가 적용되지 않음
사료로 급이한 그룹	A-①	A-②
약욕제로 처치한 그룹	B-①	B-②

사료 급이의 경우에는 실시예 6에서 설명한 사료 제조 방식에 따라 제조한 사료를 표 3의 구분에 따라 통상적인 사료 급이 방식을 따라 급이 하였으며, 약욕제 처치의 경우에는 실시예 7에서 설명한 약욕제 제조 방식에 따라 제조한 약욕제를 표 3의 구분에 따라 통상적인 약욕제 처치 방식에 따라 처치하였다. 시험 결과가 표 4에 제시되어 있다.

넙치 사양 시험에서의 폐사율

그룹	폐사율(%)
A-①	5
A-②	22
B-①	9
B-②	24

이상의 결과로 본 발명에 따라 제조된 사료의 급이와 본 발명에 따른 약욕제 처치가 넙치 사육에서의 폐사율 감소에 효과가 있음을 확인할 수 있었다. 이로부터 본 발명의 조성물의 적용이 넙치의 사양 결과 개선에 효과적이라는 결론을 내릴 수 있었다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

한국생명공학연구원 KCTC12686BP 20141001

SEQUENCE LISTING <110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd. <120> Novel Lactococcus garvieae bacteriophage Lac-GAP-1 and its use for preventing proliferation of Lactococcus garvieae <130> KP090379 <160> 1 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 34587 <212> DNA <213> Bacteriophage Lac-GAP-1 <400> 1 gaaagccaaa gggactaggt tacctgtgat agactggtta ggcgtgaagt acggagtaac 60 ccagagggag ggggatatgc ccccatagtt tctctcctaa gctctttaaa ttatttttaa 120 taatatttat cataaataat ttaagataca taagaagacc aatcacggct ctgtggcaaa 180 ttacgattac ctaatacctt tggttcttct tgcttcacat tgaatagctt gtcagacttc 240 tgacggttgc aagtccagtg agcaagctgt aagttatcca tcgctgaagg atgaccacct 300 ttgttaattg gaatgatgtg gtcaacaact ggactcaatg gatcaggagc tttcaatctc 360 ttatcgattg gcttgccaca tattccacaa gtgttctgtg tctttaaaag aatctttcta 420 ttcttatcaa aggctacacg atgcgcacca gtacggtcag cacgtaatgc tatgggaggt 480 cacctcactt tctccacaca aaaagccaac agaatatatc cgctggcttt atttgtttta 540 tttgatgata ctataataca acatttatct tgtcagtttt cgcccaaaag gtgacaaatt 600 accagaagcc gtcacatatc tcatcatact tctcaagtat tgctcttctc 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cgtagccttt aggtactaaa aatgtaagtg 23220 taccagttgt atattttcca ttattatgtt cagtagcttt gatttctcca tcaataatca 23280 cttcccaaaa cacattaggg tcatcagaaa atataatact ttgtaactgc ttagagcttg 23340 ttatttttcc tacaattcgt ttagttgcta tcaagtcttt tagtaaagta aagtcaattt 23400 ctattttttt tgatgaaagg ttagaactaa tcaggttaga tccatctcca accttatttt 23460 ctgtaacgtt tgtcattcct gtagatatac cacgtcgaac atcgtttatt atcatgtaat 23520 ccatcaattc aacgttattt aattttatcg agttatattc cattgattaa acacgtgccc 23580 cttctagcat ttttgcgata tctccaagtt tggcttgttc attgctcata tctttagcaa 23640 ctgctgcagc aaaagttttt ccatttattg ttaaatagat aggtctatca ttcaactttt 23700 caaccgaatt aatcacctta agaagtaaat tattggtttg agtaccactg ttactatttg 23760 gtatgttgtt tgcagaaagt aatgtataag tttgtaagtc aatatttttt tcaagtaaag 23820 cactattatc aaattcggta gagactggta atgttactcc tgtgcctacc aaactttgaa 23880 gattatctgc tacaccagaa atattttttt gaactgattt aaagttttcc atcaagctat 23940 cattgaatcc actcataata gcttgaccag ctggaatcag tagttttcta tcataactaa 24000 ttggtccttt gtgctcttta 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tgtaattgca ggtactaatg cagatataat agcttgaatt ccactaaaat 24900 caagttttga aattccagaa gagatagtgt caatcatcgg ttgtactgca actgatatcg 24960 cttcaaaaag tgatggtagc tgtccgaaag caacacttaa agtggaaatt actggcatta 25020 cagcagaaat gacattagaa aataattgtg gtaatttact aaatactccc ataatttgag 25080 tactgattgg tccaattgaa gatagcaaac tgtcaaaaac tggttttaaa cctgagacaa 25140 tagtttgaaa acttccttgt aggggtgata atatcgagct gaactttgca gtaaagtcag 25200 agaacccact cccgattcca tttcctaatt gtgaagaaag ttcttttccg gctgcactca 25260 caaacgtcga aattgctcct ggtaaagcct taaaaatatt tcctaccatc ggaatgaagt 25320 tcttgaataa gaatgttgat gtcgttgaca ccaacgcatt caatggccct tgcaaatcac 25380 ggcctagtga taagttcccc aaaacattag acattgcagc tttcattgaa tcaaatgacc 25440 cactaaatgt tgttgatgct tctttcgcag ttgtacctgt aatgtccatt tctgtttgga 25500 ttgcatgaat cgcttgtgtg atatctgaga agtttgaaat atcatacttt tgaccagtca 25560 gcttttgagc atcagtcaag agtcgttgca tttcttcttt cgtaccacca tatccaagtt 25620 ttaagttatc aagcatggta tagttctgct tggcaaaacc ttgataagca ttttgaatat 25680 ctccaatatt tgtacccatt ttattggcat tatcagacat atcaacaatt gcttggtttg 25740 acaaatctgc cgctttagct gtatctccat tcaatgattt aatcattgat gcagaaaaac 25800 ctgttacggt ttccatatat gcattcgcag acataccagc cgttttataa ccttctgttg 25860 catatttttt tactttatct gcattatctt taaatagagt ttcgacccca cctaatgatt 25920 gttgtaaatc agctccttca gaaagtgatg aagaaattaa tttaccaagt gctgctcctg 25980 ttgctaccac accagctatt gcggcgacct ttaaggcaga accaattttt aaccctgcac 26040 tattccctgc cgactcagct tctgggtcta atatcccaga cattgaacct gatattcctt 26100 tggcagatgg cataatttgc acataagctt gtcctaattc tgttgccatt aacttcctcc 26160 tcctttttga aatagttgct gacgatattt ttcaaaatcc tcaccagaat gaaatcggat 26220 ttttctatca gttttttctt ttggtttatt gatgatatcg gtaacaagtt ttggcctatt 26280 tttacctttc tgaccatctt ctgttttaaa ccataaagac atacttaaac ggtcttgaat 26340 cccagctaaa agaagtgtat taattgggaa cttttgtcca ctcatcttca tttttatcct 26400 agattcttca ttcaaaccta tagaaaaaac agctatcttt agaggagata gctgtttgta 26460 atcgtaaata tgataaattt ctgcaaggtc gcacattagc gcttcttcat 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tgttgctttc caagtttcca ttggctccgc 33180 atcatcactc aatccagtta catatttttg agggaaagaa taaaactcag cagttacatc 33240 agctctttca agtgttcgtt ttgcattgct ttgccaatac attcctgaac gtgtaatacg 33300 agaacgacca aaaggacgaa ctgcatcagg acggtgaatg ataggcacta acagtggatg 33360 acctgttgga tttgcaatcg aaatattatt acgtgaatca cgataataat aatctgttct 33420 atcaggcaag aaatgagctt caagaacaac attattgttt tcatctcgtt ctaaaactgc 33480 atatccctct gtcagtaatc cagtaattgg gtcaatgatt cctgttgcat tgatagcttc 33540 aataacttga agtcgtactg catcattttc acctttagaa atataagtaa agctacatga 33600 tgcaataagt gatgacaaaa cagcactatc aaaaaatata tcaggattat tttcctcaaa 33660 aatttcattt actgtaaagt catcattttc aaattctcga aaaacaagac ggtctgcaag 33720 actatcaact ccttttgcac accaccctaa tattgaacga tattgttggc ttaatgcttg 33780 tggaattgta atccctttga atctatcaac atatttcatc gcatattgct catagcgcat 33840 ttctgctctt cgtttatgaa cagatagctt aaatctcagg tatccaatac ctttttcagt 33900 caattttttg ctcctttctc tcgtctttaa gatattgaac aattctcata tatcttttcc 33960 gactaaaaac attactattt ttataccaaa caaaaaagtc atcattcctt ttactagaat 34020 tacaacttct acaagccgga actacatttc cataagaata tgcgccacca tcaattaatg 34080 ggacgacatg ttcatgatgt aaatgctcgc cataaatttc tagagacttt ttttcaggca 34140 taccacagta agcacagctg caacaaaaaa atgacttaat ttcaagccat tctttttctg 34200 tcaaggtact ttcagagcca tatttcaaag ttctagactt tgcacaagtc attcgtcgtc 34260 ttgtaggatt atttttacac caatcttttt ctgactgacg acacttacct ttattttcgt 34320 tgtaataacc taattgccgt tctttgattt tatctgcatt tttttcataa tatctctttt 34380 tctgctctaa aatcttttct tttttcgcct catatcttgc tttatcttta gcttttcggc 34440 agactttaca tcgcccttca aatccacctt ttctcttaaa atttttagga aaattatgtt 34500 catctagctc tttttcttgc ttacagatgc tacaaattct tttcattatt atctcctttt 34560 tctcgctcaa gaaaaaatat gtacagt 34587

Claims (5)

1. 락토코커스 가르비에 균을 특이적으로 사멸시킬 수 있는 능력을 갖고 서열번호 1로 표시되는 유전체를 갖는 것을 특징으로 하는 자연으로부터 분리된 미오비리대 박테리오파지 Lac-GAP-1(수탁번호 KCTC 12686BP).
2. 제1항의 박테리오파지 Lac-GAP-1(수탁번호 KCTC 12686BP)을 유효성분으로 포함하는 락토코커스 가르비에 균의 감염 방지 및 락토코커스 가르비에 균의 감염 치료용 조성물.
3. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 약욕제 또는 사료첨가제 제조 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 락토코커스 가르비에 균의 감염 방지 및 락토코커스 가르비에 균의 감염 치료용 조성물.
4. 제2항 또는 제3항에 의한 박테리오파지 Lac-GAP-1(수탁번호 KCTC 12686BP)을 유효성분으로 포함하는 조성물을 사람을 제외한 동물에 투여하는 단계를 포함하는, 락토코커스 가르비에 균에 의한 감염을 방지 또는 락토코커스 가르비에 균의 감염을 치료하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 조성물이 약욕제 또는 사료첨가제 용도로 사람을 제외한 동물에 투여되는 것을 특징으로 하는 락토코커스 가르비에 균에 의한 감염을 방지 또는 락토코커스 가르비에 균의 감염을 치료하는 방법.

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