CN113166730A - 新型猪链球菌噬菌体str-sup-1及其在抑制猪链球菌细菌增殖方面的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从自然界分离出的长尾噬菌体科噬菌体Str‑SUP‑1(保藏号：KCTC 13514BP)，其特征在于具有杀死猪链球菌的能力，并且具有由SEQ ID NO:1表示的基因组，本发明还涉及一种用于使用包含所述长尾噬菌体科噬菌体Str‑SUP‑1作为活性成分的组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法。

Description

新型猪链球菌噬菌体STR-SUP-1及其在抑制猪链球菌细菌增 殖方面的用途

技术领域

本发明涉及一种从自然界分离出的噬菌体，该噬菌体感染猪链球菌，从而杀死猪链球菌，本发明还涉及一种使用包含上述噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法。更具体地，本发明涉及一种从自然界分离出的长尾噬菌体科噬菌体Str-SUP-1(保藏号：KCTC13514BP)，其具有杀死猪链球菌的能力，并且具有由SEQ IDNO:1表示的基因组，本发明还涉及一种使用包含上述噬菌体作为活性成分的组合物来预防或者治疗由猪链球菌引起的疾病的方法。

背景技术

猪链球菌是一种花生形革兰氏阳性细菌，且已知猪链球菌感染是一种在世界范围内出现的重大动物源性疾病。根据荚膜抗原(Capsular,K)将猪链球菌细菌分为29种血清型。基于全世界猪链球菌细菌的血清型报告，血清型1至9的分布较广，约占其总数的75％，且在大多数国家，已知血清型2是从致病猪体内分离出的最常见的血清型。

同时，感染猪链球菌的猪主要表现出厌食、嗜睡、出疹、发烧和麻痹的症状。特定地，在育肥猪中可出现诸如肺炎等的呼吸道感染，从而给猪养殖业造成严重的经济损失。另外，猪链球菌是导致猪患上脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎和阴道炎的已知主要病原体，并且在世界范围(包括韩国、北美、欧洲等)内已报道了猪链球菌的爆发。因此，急需研发出可用于预防和治疗猪链球菌感染的方法。

虽然已经使用各种抗生素来预防或者治疗由猪链球菌引起的疾病，但是目前，细菌对这种抗生素的耐药性日益增强，因此急需研发出除了抗生素之外的其他方法。

最近，使用噬菌体作为应对感染性细菌疾病的对策引起了广泛关注。尤其是，这些噬菌体由于具有对抗耐抗生素细菌的强抗菌活性而受到极大的关注。噬菌体是感染细菌的很小的微生物。一旦噬菌体感染了细菌，该噬菌体就会在该细菌细胞内增殖。在增殖之后，该噬菌体的后代会破坏该细菌细胞壁并且从该宿主细菌中逸出，这表明该噬菌体具有杀死细菌的能力。该噬菌体感染细菌的方式的特征在于其具有非常高的特异性，因此，感染某种特定细菌的噬菌体类型的范围有限。即，某种噬菌体只能感染某种特定的细菌，这表示某种噬菌体只能针对某种特定细菌产生抗菌作用。由于噬菌体的这种细菌特异性，噬菌体只对目标细菌具有抗菌作用，而不影响环境中或者动物体内的共生细菌。已经被广泛用于细菌治疗的常规抗生素会顺带影响许多其他种类的细菌，这导致诸如污染环境和干扰动物体内正常菌群等问题。对比之下，使用噬菌体不会干扰动物体内的正常菌群，因为目标细菌是通过使用噬菌体来选择性地杀死的。因此，可以安全地利用噬菌体，这样一来，与抗生素相比较，大大减少了使用噬菌体会产生不利影响的可能性。

噬菌体最初由英国细菌学家Twort于1915年发现，当时他注意到微球菌菌落由于未知的某物而被软化并且变得透明。在1917年，法国细菌学家d'Herelle发现痢疾患者粪便滤液中的痢疾志贺氏菌被某物破坏，并且对该现象进行了进一步研究。结果他独立鉴定出了噬菌体，并且将其命名为“噬菌体”，意为“细菌吞噬者”。自此以后，对诸如志贺氏菌、伤寒链球菌和霍乱弧菌等致病菌起作用的噬菌体被不断地鉴定出来。

由于噬菌体杀死细菌的独特能力，噬菌体自被发现以来就作为一种应对细菌感染可能的有效对策引起了关注，并且已经进行了许多与之相关的研究。然而，自弗莱明发现青霉素以来，由于抗生素的普遍传播，有关噬菌体的研究仅在一些东欧国家和前苏联仍继续进行。自2000年以来，由于耐抗生素细菌的增加，常规抗生素的局限性已经变得显而易见，研发噬菌体作为常规抗生素的替代品的可能性已经突显，因此，作为抗菌剂的噬菌体再次引起关注。

如上所述，噬菌体往往对目标细菌具有高度特异性。由于噬菌体对细菌的高度特异性，即使在相同的物种内，噬菌体通常也只对某些细菌菌株表现出抗菌作用。另外，噬菌体的抗菌强度会根据目标菌株而变化。因此，为了有效地控制特定细菌，有必要收集多种有用的噬菌体。因此，为了研发出一种用于控制猪链球菌的有效的噬菌体利用方法，必须获得对猪链球菌表现出抗菌作用的多种噬菌体。此外，需要从所得到的噬菌体中筛选出在抗菌强度和光谱方面优于其他噬菌体的噬菌体。

发明内容

技术问题

因此，本发明的发明人致力于研发一种适用于使用从自然界分离出的并且能够杀死猪链球菌的噬菌体来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的组合物，并且进一步致力于建立一种使用该组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法。其结果是，本发明的发明人从自然界分离出了一种适于该目的的噬菌体，并且确定了将分离出的噬菌体与其他噬菌体区别开来的基因组序列。之后，本发明的发明人研发出一种包含噬菌体作为活性成分的组合物，并且确定了该组合物能够有效地用于预防和治疗由猪链球菌引起的疾病，由此形成本发明。

因此，本发明的一个目的是提供一种从自然界分离出的长尾噬菌体科噬菌体Str-SUP-1(保藏号：KCTC 13514BP)，其具有杀死猪链球菌的能力，并且具有由SEQ ID NO:1表示的基因组。

本发明的另一目的是提供一种适用于预防或者治疗由猪链球菌引起的疾病的组合物，该组合物包含分离出的噬菌体Str-SUP-1(保藏号：KCTC 13514BP)作为活性成分，该分离出的噬菌体Str-SUP-1感染猪链球菌，从而杀死猪链球菌。

本发明的又一目的是提供一种使用适用于预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法，该组合物包含分离出的噬菌体Str-SUP-1(保藏号：KCTC 13514BP)作为活性成分，该分离出的噬菌体Str-SUP-1感染猪链球菌，从而杀死猪链球菌。

本发明的再一目的是提供一种用于使用所述组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的消毒剂。

本发明的又一目的是提供一种通过使用所述组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病以对养殖管理起作用的饮用水添加剂。

本发明的再一目的是提供一种通过使用所述组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病以对养殖管理起作用的饲料添加剂。

技术解决方案

本发明提供了一种从自然界分离出的长尾噬菌体科噬菌体Str-SUP-1(保藏号：KCTC 13514BP)，其具有特定地杀死猪链球菌的能力，并且具有由SEQ ID NO:1表示的基因组，本发明还涉及一种使用包含该噬菌体作为活性成分的组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法。

本发明的发明人分离出噬菌体Str-SUP-1，然后于2018年4月24日将其保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(保藏号：KCTC 13514BP)。

另外，本发明提供了一种适用于预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的消毒剂、饮用水添加剂和饲料添加剂，该消毒剂、饮用水添加剂和饲料添加剂包含噬菌体Str-SUP-1作为活性成分。

由于本发明的组合物所包含的噬菌体Str-SUP-1能有效地杀死猪链球菌，因此，其在预防(预防感染)或者治疗(治疗感染)由猪链球菌引起的疾病方面是有效的。因此，本发明的组合物能够被用来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病。

本文中使用的“预防”一词是指(i)预防猪链球菌感染和(ii)抑制由猪链球菌感染引起的疾病的发展。

本文中使用的“治疗”一词是指(i)抑制由猪链球菌引起的疾病和(ii)缓解由猪链球菌引起的疾病的病理状况。

本文中使用的“分离”一词是指通过使用各种实验技术来从自然界分离出噬菌体并且取得可以将本发明的噬菌体与其他噬菌体区别开来的特征的行为，并且进一步包括使用生物工程技术来使本发明的噬菌体增殖以使该噬菌体在工业上适用的行为。

本发明的组合物所包括的在药学上可接受的载体是一种通常用于制备药物制剂的载体，并且其示例包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油，但是不限于此。除了上述成分之外，本发明的组合物还可以包括润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂和防腐剂。

本发明的组合物中包含噬菌体Str-SUP-1作为活性成分。以1×101pfu/ml至1×1030pfu/ml或者1×101pfu/g至1×1030pfu/g的浓度，优选地以1×104pfu/ml至1×1015pfu/ml或者1×104pfu/g至1×1015pfu/g的浓度包含噬菌体Str-SUP-1。

可以根据本发明所属领域的技术人员可以容易实施的方法，使用在药学上可接受的载体和/或赋形剂来配制本发明的组合物，以按照单位剂型来制备该组合物或者将该组合物加入到多剂量容器中。此处，可以油或者水介质中的溶液、悬浮液、或者乳剂的形式，或者以提取物、粉剂、颗粒、片剂或者胶囊的形式来提供所述制剂，并且该制剂还可以包含分散剂或者稳定剂。

可以根据其使用目的将本发明的组合物制备为消毒剂或者饮用水添加剂或者饲料添加剂，但是不限于此。为了提高其效力，还可以将对其他细菌物种具有抗菌活性的噬菌体包括在本发明的组合物中。另外，还可以将对猪链球菌具有抗菌活性的其他类型的噬菌体包括在本发明的组合物中。可以适当地组合这些噬菌体以使组合物的抗菌作用最大化，因为这些噬菌体对猪链球菌的相应抗菌活性可能因抗菌强度或者抗菌谱的不同而有所不同。

有益效果

根据本发明，与基于现有抗生素的常规方法相比较，使用包含噬菌体Str-SUP-1作为有效成分的组合物来预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法具有对猪链球菌具有非常高的特异性的优点。这意味着该组合物可以用于预防和治疗由猪链球菌引起的疾病，而不影响其他有用的共生细菌，并且具有较小的由于其用途而导致的副作用。通常，当使用抗生素时，共生细菌也受到损害，最终降低动物的免疫力，因此，使用抗生素会引起各种副作用。同时，对于各种对相同细菌物种表现出抗菌活性的噬菌体而言，该噬菌体的抗菌作用因为抗菌强度或者抗菌谱[即施用于个别细菌菌株的噬菌体的抗菌活性谱，就属于猪链球菌的各种细菌菌株而言，即使在相同的物种内，噬菌体通常也仅对某些细菌菌株起作用，因而，即使对于相同的细菌物种，噬菌体的抗菌活性也取决于细菌菌株]的不同而有所不同。因此，本发明可以针对猪链球菌提供与其他对猪链球菌起作用的噬菌体的抗菌活性有差别的抗菌活性，当将其应用于工业领域时，这一点将在有效性上产生很大的差异。

附图说明

图1是示出了噬菌体Str-SUP-1的形态的电子显微照片。

图2是示出了通过比较噬菌体Str-SUP-1的基因组序列和与其具有相对较高的基因组序列同源性的链球菌噬菌体phi5218的基因组序列在基因特征方面的差异的示意图。

图3是示出了有关噬菌体Str-SUP-1杀死猪链球菌的能力的实验结果的照片。基于平板培养基的中心线，在平板培养基的左侧仅不包含噬菌体Str-SUP-1的缓冲液成斑，而在平板培养基的右侧含有噬菌体Str-SUP-1的溶液成斑。在右侧观察到的洁净区是由于噬菌体Str-SUP-1的作用而通过裂解目标细菌形成的噬斑。

具体实施方式

通过以下示例，将更好地理解本发明，这些示例仅为了说明本发明，而不应该被解释为限制本发明的范围。

示例1：能够杀死猪链球菌的噬菌体的分离

使用从自然界收集的样品来分离出能够杀死猪链球菌的噬菌体。此处，从韩国典型培养物保藏中心(保藏号：KCTC 3557)获得用于噬菌体分离的猪链球菌菌株。

下文中详细描述了分离所述噬菌体的过程。将收集到的样品添加到以1/1,000的比率接种了猪链球菌的THB(Todd Hewitt肉汤)培养基(心脏输注，3.1g/L；蛋白，20g/L；葡萄糖，2g/L；氯化钠，2g/L；磷酸二钠，0.4g/L；碳酸钠，2.5g/L)，然后在37℃下振荡培养3至4小时。在培养完成之后，以8,000rpm进行20分钟离心，并且回收上清液。以1/1000的比率给回收的上清液接种猪链球菌，然后在37℃下振荡培养3至4小时。当样品中包括所述噬菌体时，总共重复上述过程5次以充分增加噬菌体的数量(滴度)。在重复该过程5次之后，以8,000rpm将培养肉汤离心20分钟。在离心之后，使用0.45μm的过滤器对回收的上清液进行过滤。将由此获得的滤液用于典型的斑点测定以便评估其中是否包括能够杀死猪链球菌的噬菌体。

如下所示进行斑点测定。以1/1,000的比率接种了猪链球菌的THB培养基，然后在37℃下振荡培养一夜。将如上所述制备的3ml(OD600为1.5)的猪链球菌培养液散开在THA(Todd Hewitt琼脂：心脏输注，3.1g/L；蛋白，20g/L；葡萄糖，2g/L；氯化钠，2g/L；磷酸二钠，0.4g/L；碳酸钠，2.5g/L，琼脂，15g/L)板上。将板放在洁净的工作台上大约30分钟以使散开的溶液干燥。在干燥之后，在散有猪链球菌的板上对如上所述制备的10μl的滤液进行成斑，然后放置大约30分钟进行干燥。干燥之后，在37℃下将经过成斑的板静置培养1天，然后针对在滴有滤液的位置处洁净区的形成进行检查。如滤液产生洁净区，则判断其中包括了能够杀死猪链球菌的噬菌体。通过上述检查，能够获得包含具有杀死猪链球菌的能力的噬菌体的滤液。

从证实具有能够杀死猪链球菌的噬菌体的滤液中分离出纯噬菌体。使用典型的噬斑测定来分离纯噬菌体。具体地，使用无菌吸液头回收在噬斑测定过程中形成的噬斑，将噬斑添加到猪链球菌培养肉汤，然后，在37℃下培养4至5小时。此后，以8,000rpm进行20分钟离心以获得上清液。以1/50的容积比向所获得的上清液添加猪链球菌培养肉汤，然后，在37℃下培养4至5小时。为了增加噬菌体的数量，重复上述过程至少5次，在这之后，以8,000rpm进行20分钟离心以获得最终的上清液。使用由此获得的最终的上清液来再次进行噬斑测定。通常，当上述过程执行了一次时，纯噬菌体的分离并未完成，因此使用如上所述形成的噬斑重复该过程。在重复至少5次之后，获得包含纯噬菌体的溶液。重复分离纯噬菌体的过程直到所产生的噬斑在大小和形态方面都变得彼此大致相似为止。附加地，使用电子显微镜来确认纯噬菌体的最终分离。重复上述过程，直到利用电子显微镜确认分离出了纯噬菌体为止。以典型的方法进行电子显微镜检查。简而言之，将包含纯噬菌体的溶液装载在铜网上，然后用2％的乙酸铀酰进行负染并且干燥。然后，使用透射电子显微镜来观察其形态。在图1中示出了分离出的纯噬菌体的电子显微照片。基于其形态特征，确认如上所分离出的新型噬菌体属于长尾噬菌体科噬菌体。

将包含如上所确认的纯噬菌体的溶液进行以下纯化处理。基于该噬菌体溶液的总容积，以1/50的容积比向包含该纯噬菌体的溶液添加猪链球菌培养肉汤，然后，另外培养4至5小时。此后，以8,000rpm进行20分钟离心以获得上清液。总共重复该过程5次以获得包含足够数量噬菌体的溶液。使用0.45μm的过滤器对从最后一次离心获得的上清液进行过滤，然后进行典型的聚乙二醇(PEG)沉淀处理。具体地，向100ml的滤液添加PEG和NaCl，从而达到10％PEG 8000和0.5M NaCl，然后将其在4℃下静置2至3小时。此后，以8,000rpm进行30分钟离心以获得噬菌体沉淀物。将所得到的噬菌体沉淀物悬浮在5ml的缓冲液(10mM Tris-HCl、10mM MgSO4、0.1％明胶，pH值8.0)中。所得到的材料可以被称为噬菌体悬浮液或者噬菌体溶液。

收集如上所述的纯化的噬菌体，将其命名为噬菌体Str-SUP-1，然后于2018年4月24日将其保藏在韩国生物科学与生物技术研究所的韩国典型培养物保藏中心(保藏号：KCTC 13514BP)。

示例2：对噬菌体Str-SUP-1的基因组的分离和序列分析

噬菌体Str-SUP-1的基因组分离如下。从使用与示例1中所述的相同的方法而获得的噬菌体悬浮液中分离出基因组。首先，为了去除悬浮液中所包括的猪链球菌的DNA和RNA，将200U的DNase I和200U的RNase A添加到10ml的噬菌体悬浮液中，然后将其在37℃下静置30分钟。在将其静置30分钟之后，为了使DNase I和RNase A的活性失活，向其添加500μl的0.5M乙二胺四乙酸(EDTA)，然后将所得到的混合物静置10分钟。另外，再将所得到的混合物在65℃下静置10分钟，然后，向其添加100μl的蛋白酶K(20mg/ml)以破坏该噬菌体的外壁，然后在37℃下反应20分钟。此后，向其添加500μl的10％十二烷基硫酸钠(SDS)，然后在65℃下反应1小时。在发生反应1小时之后，向所得到的反应溶液添加10ml的成分比为25∶24∶1的苯酚、氯仿和异戊醇的混合溶液，然后将其充分混合。然后以13,000rpm将所得到的混合物离心15分钟从而分离混合物的各层。在分离出的各层中，选择上层，以1.5的容积比向其添加异丙醇，并且以13,000rpm将其离心10分钟以使基因组沉淀。在收集沉淀物之后，向该沉淀物添加70％乙醇，并且以13,000rpm将其离心10分钟来洗涤该沉淀物。回收洗涤过的沉淀物，对其进行真空干燥，然后将其溶解在100μl的水中。重复该过程，从而获得噬菌体Str-SUP-1的足够量的基因组。

使用Macrogen公司提供的Illumina Mi-Seq测序仪进行下一代测序分析来获得有关由此获得的噬菌体Str-SUP-1的基因组的序列信息。噬菌体Str-SUP-1最终分析出的基因组大小为33,991bp，并且整个基因组序列由SEQ ID NO:1表示。

在网络上使用BLAST调查了如上所获得的噬菌体Str-SUP-1基因组序列与先前报道的噬菌体基因组序列的同源性(相似性)。基于BLAST调查的结果，噬菌体Str-SUP-1的基因组序列被发现与链球菌噬菌体phi5218(GenBank保藏号：KC348600.1)的序列具有相对较高的同源性，已确认(身份：99％)。然而，噬菌体Str-SUP-1具有长尾噬菌体科的形态特征，而链球菌噬菌体phi5218具有短尾噬菌体科的形态特征，他们之间存在明显的形态差异。此外，噬菌体Str-SUP-1基因组的开放阅读框(ORF)的数量为56，而我们发现链球菌噬菌体phi5218具有64个开放阅读框，基于此，这两个噬菌体也被评估为在基因上不同。这两个噬菌体之间的形态特征和基因特征的差异可以表明，在两个噬菌体之间以各种方式表达的各种特征存在外部差异和功能差异。而且，这两个噬菌体之间的差异还暗示着两个噬菌体的工业适用性存在差异。同时，在图2中示意性地示出了通过比较这两个噬菌体的基因组序列观察到的基因特征的差异。

因此，可以得出以下结论：噬菌体Str-SUP-1是与先前报道的噬菌体不同的新型噬菌体。此外，由于噬菌体的抗菌强度和抗菌谱通常根据噬菌体的类型而变化，因此，认为噬菌体Str-SUP-1可以提供与任何其他先前报道的噬菌体的抗菌活性不同的抗菌活性。

示例3：对噬菌体Str-SUP-1对猪链球菌的杀伤能力的评估

对分离出的噬菌体Str-SUP-1对猪链球菌的杀伤能力进行了评估。为了对其杀伤能力进行评估，以与示例1中所述的相同的方式使用斑点测定来观察洁净区的形成。使用本发明的发明人分离出的并且鉴定为猪链球菌的总共10个菌株，或者从KCTC或者韩国兽医培养物保藏中心获得的总共10个菌株作为用于对杀伤能力进行评估的猪链球菌菌株。噬菌体Str-SUP-1具有总共杀死10个猪链球菌菌株中的8个菌株(包括KCTC 3557)的能力，达到了实验目标。在图3中示出了有代表性的实验结果。同时，还检查了噬菌体Str-SUP-1杀死支气管败血波氏杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌、缓症链球菌、乳房链球菌和铜绿假单胞菌的能力。结果，噬菌体Str-SUP-1不具有杀死这些微生物的能力。

因此，可以得出以下结论：噬菌体Str-SUP-1具有很强的杀死猪链球菌的能力，并且会对许多猪链球菌菌株表现出抗菌作用，这表明噬菌体Str-SUP-1可以用作用于预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的组合物的活性成分。

示例4：使用噬菌体Str-SUP-1来预防猪链球菌感染的实验

向包含9ml THB培养基的试管中添加100μl的浓度为1×10⁸pfu/ml的噬菌体Str-SUP-1溶液。向另一根包含9mlTHB培养基的试管中仅另外添加相同量的THB培养基。然后，向每根试管添加猪链球菌培养肉汤，使得在600nm处的吸光度达到大约0.5。在添加猪链球菌之后，将试管转移到在37℃下的培养箱，然后进行振荡培养，在此期间，观察猪链球菌的生长状态。如下面的表1中示出的，观察到：在添加了噬菌体Str-SUP-1溶液的试管中，猪链球菌的生长受到抑制，而在未添加噬菌体溶液的试管中，猪链球菌的生长未受到抑制。

【表1】

对猪链球菌的生长抑制

上述结果表明：本发明的噬菌体Str-SUP-1不仅抑制猪链球菌的生长，而且具有杀死猪链球菌的能力。因此，得出以下结论：噬菌体Str-SUP-1可以用作用于预防由猪链球菌引起的疾病的组合物中的活性成分。

示例5：使用噬菌体Str-SUP-1来预防由猪链球菌引起的疾病的动物试验

使用断奶仔猪评估噬菌体Str-SUP-1对由猪链球菌引起的疾病的预防作用。将十头25日龄的断奶仔猪总共分为2组(每组5头猪)，并在实验养猪室(1.1m×1.0m)中将其分开喂养，进行14天的实验。使用加热器控制周围环境，并且使得养猪室中的温度和湿度保持恒定，并且每天对养猪室地板进行洗涤。自实验开始到实验结束，以典型的饲养方式来向实验组(给予了包含该噬菌体的饲料)中的猪提供包含1×10⁸pfu/g噬菌体Str-SUP-1的饲料。为了与之进行比较，从实验开始到实验结束，以相同的饲养方式来向对照组(给予了不包含该噬菌体的饲料)中的猪提供具有相同组合物但不包含噬菌体Str-SUP-1的饲料。从实验开始之后的第7天起持续2天，另外在饲料中添加1×10⁸cfu/g的猪链球菌，每天向实验组(给予了包含该噬菌体的饲料)和对照组(给予了不包含该噬菌体的饲料)中的所有猪提供两次饲料，从而造成感染猪链球菌。从用包含猪链球菌的饲料进行饲养之日起(从实验开始之后的第7天起)，每天对所有试验动物的鼻分泌物中检测到的猪链球菌的水平进行检查。

对鼻分泌物(鼻拭子)中的猪链球菌的检测进行如下。将鼻分泌样品散开在血琼脂平板上，然后在37℃下培养18至24小时。在所得菌落中，分离出推测为猪链球菌的菌落。将由此选择的菌落用作样品，并对其进行猪链球菌特异性的聚合酶链反应(PCR)，从而最终确认对应菌落是否为猪链球菌。下表2中示出了细菌检测的结果。

【表2】

猪链球菌的检测结果(平均值)

从上述结果可见，可以确认本发明的噬菌体Str-SUP-1在预防由猪链球菌引起的疾病方面非常有效。

示例6：使用噬菌体Str-SUP-1治疗由猪链球菌引起的疾病

评估噬菌体Str-SUP-1对由猪链球菌引起的疾病的治疗效果如下。将八头25日龄的断奶仔猪总共分为2组，并在实验养猪室(1.1m×1.0m)中将其分开喂养，进行14天的实验。使用加热器控制周围环境，使养猪室中的温度和湿度保持恒定，并且每天对养猪室地板进行洗涤。从实验开始之后的第4天，将5ml的猪链球菌溶液(10⁹cfu/ml)喷射到所有猪的鼻腔中。用于鼻腔给药的猪链球菌溶液制备如下。在使用THB培养基在37℃下将猪链球菌细菌培养18小时之后，分离其细胞，然后使其悬浮在生理盐水(pH值7.2)中以将细胞浓度调节至10⁹cfu/ml。从强迫感染猪链球菌的第二天起，以与猪链球菌溶液的给药方式相同的方式每天对实验组(给予了该噬菌体溶液的组)中的猪进行两次10⁹pfu的噬菌体Str-SUP-1的鼻内给药。对照组(未进行该噬菌体溶液给药的组)中的猪不进行任何治疗。以相同方式向对照组和实验组提供饲料和饮用水。从强迫感染猪链球菌之后的第3天起(从实验开始的第7天起)，检查所有试验动物的由猪链球菌细菌引起的萎缩性鼻炎的发展状况。通过测量鼻分泌物的量来进行由猪链球菌细菌引起的萎缩性鼻炎的调查。根据试验员的观察，通过将正常水平标记为“0”，将略微较高的水平标记为“1”且将严重水平标记为“2”来指示鼻分泌物的量。在下表3中示出了其结果。

【表3】

鼻分泌物的调查结果(平均值)

从上述结果可见，可以确认本发明的噬菌体Str-SUP-1在治疗由猪链球菌引起的疾病方面非常有效。

示例7：制备饲料添加剂和饲料

使用噬菌体Str-SUP-1溶液来制备饲料添加剂，使得每克饲料添加剂包含数量为1×10⁸pfu的噬菌体Str-SUP-1。按照以下方式来制备饲料添加剂：向该噬菌体溶液添加麦芽糊精(50％，w/v)，然后将其冻干并最终粉碎成细粉。在上述制备过程中，可以将干燥处理替换为减压干燥、加热干燥或者是室温干燥。为了制备用于比较的对照，不使用该噬菌体溶液，而是使用用于制备该噬菌体溶液的缓冲液(10mM Tris-HCl、10mM MgSO4、0.1％明胶，pH值8.0)来制备不包含该噬菌体的饲料添加剂。

以1,000的重量比将由此制备的两种饲料添加剂分别与猪饲料混合，从而最终制备两种饲料。

示例8：制备饮用水添加剂和消毒剂

以相同方式制备饮用水添加剂和消毒剂，这是因为它们仅在用途上不同，但在剂型上相同。使用噬菌体Str-SUP-1溶液来制备饮用水添加剂(或者消毒剂)。在制备饮用水添加剂(或者消毒剂)的方法中，添加噬菌体Str-SUP-1溶液，使得用于制备该噬菌体溶液的每毫升缓冲液包含数量为1x10⁹pfu的噬菌体Str-SUP-1，并且充分地予以混合。为了制备用于比较的对照，原样使用用于制备该噬菌体溶液的缓冲液作为不包含该噬菌体的饮用水添加剂(或者消毒剂)。

以1,000的容积比用水来稀释由此制备的两种饮用水添加剂(或者消毒剂)，从而获得最终的饮用水或者消毒剂。

示例9：确认猪养殖的饲养效果

评估了使用示例7和8中制备的饲料、饮用水和消毒剂是否对猪养殖起作用。特定地，本评估将重点放在测量增重的程度上。将总共六十头25日龄的断奶仔猪分为三组，每组包括20头猪(A组：用饲料进行饲养，B组：用饮用水进行饲养，C组：用消毒剂进行治疗)，进行四个星期的实验。将每一组再分成各包括10头猪的子组，并且将子组分类为施用噬菌体Str-SUP-1的子组(子组-①)和不施用噬菌体的子组(子组-②)。在本实验中，在单独子组中分开喂养断奶仔猪。如下表4所示对子组进行分类和命名。

【表4】

猪养殖实验中的子组分类和表达

就提供饲料而言，如表4中所示，以典型的饲养方式提供在示例7中制备的饲料，且如表4中所示，以典型的饲养方式提供在示例8中制备的饮用水。就消毒而言，消毒与常规消毒交替进行，每周3次。在喷洒本发明的消毒剂的当日不进行使用典型消毒剂的消毒。基于实验结果，与未添加噬菌体Str-SUP-1的组相比，添加了噬菌体Str-SUP-1的组的增重程度明显更好(表5)。作为参考，也如示例5中所示调查了试验动物的鼻分泌物中的猪链球菌细菌的分离率。在未施用噬菌体Str-SUP-1的组中的一些动物的鼻分泌物中检测到猪链球菌细菌。另一方面，在施用了噬菌体Str-SUP-1的组中的所有动物中，在试验周期期间未检测到猪链球菌细菌。

【表5】

猪养殖实验的结果

上述结果表明，用根据本发明制备的饲料和饮用水进行饲养以及使用根据本发明的消毒剂对于猪养殖是有效的。因此，可得出结论，本发明的组合物在用于喂养猪时是有效的。

虽然已经参照本发明的示例性实施例明确示出和描述了本发明，但是本领域的技术人员应了解，具体描述仅是优选实施例，并且本发明的范围不限于此。因此，本发明的范围应由所附权利要求书及其等效物限定。

[保藏号]

保藏机构名称：KCTC

保藏号：KCTC 13514BP

保藏日期：20180424

国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约

依据细则7.1发布的

原始保藏收据

国际表

保藏人名称：iNtRON生物技术有限公司

地址：137 Sagimakgol-ro,Jungwon-gu,Seongnam-si,Gyeonggi-do,Republic ofKorea(邮编13202)

序列表

<110> iNtRON Biotechnology, Co. Ltd.

<120> 新型猪链球菌噬菌体STR-SUP-1及其在抑制猪链球菌细菌增殖方面的用途

<130> KP090584

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 33991

<212> DNA

<213> Bacteriophage Str-SUP-1

<400> 1

taattgattg tagaataaaa aaaagcccta cgctcaaatt ttggttgagg agagcgtaag 60

gcggatcatg tatagtaaaa acctgcttta cagtaggtct ctttactata cccattttaa 120

caaaaaatga ggggaatgac aatgaaaatt aaaccatata taaaaaacgg gaaaacgtat 180

tacaaattcg tactatatgt tggtgtagtt aacggaaaac gaaaatacat taagcgtgcc 240

aactttaaaa caaaggccga tgccagagca gcaatacttt ctttgcaaga agaaattgac 300

cgacctgtag gagatatgac cttccaagag ctgacagaga aatggctaaa aatctacgaa 360

aatgaagtcg cagaaagcac ctatatcaaa acaagtagga acatcaaaca ccacatcact 420

ccaactatcg gacacaggag gatttctgag attacagccc tggagctaca aagccataca 480

cagcaatggt gttccaaatt aaaatacggt aggaagatat taggcttagt caaaacgata 540

tatcgttatg cagtacgtat gggcttcatt gccattagtc cagcagaccg ctgggttgaa 600

aatactattt tacattgccc cacacttctg tggtctggcc atttttacga accttaatcg 660

gcatccaacg acgaatacct gtgctagctg aaatccaact aatccatacg tagccgttat 720

aatcaacacg gacacggtca taagtcactg actctccttt gtagtacatg ccttgtgtac 780

gaccgtttaa gttcggctca ttgcggaaat agatgtcttc tgtggcagta aacacacccg 840

tttccgcata ttcacgggca ccagtgttaa cactagccgt tctaggttgg gtagttgcta 900

ctttaggggc tggctgtggt gctactgctt tgccttgcaa ttgcaataga taagcctgta 960

ctttaccttt aaaaccgtcc cagttgccat tatccaagat gcggtgtggg caatatttgc 1020

cagaccaatc ttgatgtttg cggatgcggt caatgcccca gcctaactga tgcaagataa 1080

tcgctgctaa tttagctccg ttatcctcag cttttgcata tttaggatgt cccggagtca 1140

gactataaca aatctcaatg ccgattgatt tacgattacc tgtcccattt gtgccgtctc 1200

cacaatgcca ggcattacga ttgtgcggaa tggcttggat ggcctgctca tcatccaccg 1260

cccaatgata agatacttcg ttccagttgc cattcatgta actgatttcc gctaaagcag 1320

acgcattgtt tgcggtattg tggatggtca accattgagg gaccatagcg tttggacact 1380

taatgccata cttagtagca ggcacgggca tttgaatcat tttaagtcct agattactca 1440

tgttctactc ctttccgtcc aaatcatcta tttctggaaa ttcgtgatcg gcgatatttt 1500

tttgatagag ttcgtcgttg aactcgatta cttcgtcaaa ttgcatgatt agtcctcctt 1560

ttcaaaatta aatgcaatat tcccctcgcc caaatctact ttcatttctt cgggctggat 1620

agtcccagta gaaattttgc tggcatcaag ggctttaggt tcgcttttaa ctaatttttc 1680

aagcgctaaa atcacattag caaatatact tgtatcgcct tttgctttac cgtagttttc 1740

taccaagctc ttaaatgtca aaataagata cccaacgtaa attgtgtaaa gaaatgccac 1800

acccgtctgc tcaggcaaaa gcaccgacat tggaattaag actgtaagca agataatccc 1860

catcatcttg cgaataagac cgttgatgcc aatttttgac ttgtactcaa tgtcaggatt 1920

aatcatagca gcaaaggtac ccgacagaaa atcaacgatt tccatgacta cgattaaact 1980

aagcaaaaag aggacaagac cgtcctccgt tgcaataagt tcgcgtagga aatcaaacat 2040

tcctgcagga tgcggtggca ttttagataa catcataacc attctttacg cctccgctcc 2100

tgctgtcggg tctgtccagt ctggatttcc gttttcatca aatttcataa tccaatactc 2160

ttcgttgagc atgtcagcaa tattaattgt cgcagcggta ccaccccact gattaaatgc 2220

ccaaatcgtt tccacgtcga caaacttgcg acgaccgttt acgattgctg gacgtttctg 2280

cacgtcacgg tacatataga agtcttgtgt cgctgactta caacggataa attcaccatt 2340

ctctttcatg tagtgaagcg cagtcgcaag gtcaaatggt tgtgttgttt cttccaaatt 2400

aagcaatgtg ttatctgtag tttgagtcat gattattctc cttcgatgat ttcgtccgct 2460

ggtttagtag cttcgtccag ttgctgagtc aaatctgcaa tctctgcttg cagttgcgtg 2520

ataatctgct gtgcttctgt cagctgtaca gctaacagat tcttagttgt catctcctct 2580

gacaattttg ccacgaggtc gttattagtc aagcgtagag cttgcgtgat ttggtcttgg 2640

ttcatgttgt ctcctatcca atattatacg tattatattc gttgataacc gatctgcgca 2700

tagccatatc atcaggattc catccggtac cattccaatg tagccaacac ctccacagag 2760

cacggattga attgataaca tcgactagtt cataagaggt agacaatttt gtggctgtaa 2820

tcgttatacc gttaccatta aaaccatggc cgagataaat tttatctcca taaatttctg 2880

tttggtccgt tgtatcatta gaacgaaaaa tccgaatacc tgcaaatcga ccggtgtttt 2940

gagatttgac cccctcattg tgcgaggtga cacctaatcc gacatatgtc cctcctgccg 3000

tagcgttgtt aaaatgcaag aagcctgtaa catcgccaac cttacgaata agggcattgc 3060

ctgaactatt gaattcaatg gtcgcactgg aattaaaggc aagtttagca ttattgagat 3120

cgaattctgc agcaccattt gtcgctttaa gtacacctcc tacaatttga ccggcagaca 3180

tagttactgc ttgaacactc gtgataaagg cactttgagc aaacaactgc ttaaacaaag 3240

cctcgtttgc tgtcatcttg ttgacaaaag cttggtcaaa taccatgtga ctgcccgtga 3300

tgctattggt agcaatccta gccgacgcta gatagcctgt tgtgattttg cctgcgtcca 3360

aattgccgat catcgcgttc ttgattacgc cgttatcaat caaagtctga cccgtgatat 3420

gcgtcagtcg accatcgatt ctattagtac cattagccag taaattgatt tggttaagaa 3480

ctgtaccagc actagtcaga tttttaatag cgtacgaatt attaagctga ctaacctgtg 3540

tagctgtacc gctaatctta tccttgacct cggtcatgaa caagctgtca gccatgacca 3600

tacgagcaac tctgtccttg atgccagctt ccgttgagcc aatgatacgc tcatagagct 3660

gtgaggtctc ctgcacccgc tgaaacgcaa cttggctagc cttactgtca acagaggtct 3720

gcatcgtcgc aaaacggcca tcaaccgtag tacgatactc agcgattttg gtctctgtgt 3780

aggcctgttg gtcttcaggg gctggtgacc agtcggtatg caatgtgcca tattcaacct 3840

taatcttcgt ttttaagtct gttccaatag ctaaattaga gtaccctatt ccgtacctca 3900

aagtgataaa agctactcct gatagctggg acggagttag actaaattta ttagtaaaat 3960

gtcccgtgaa tgtttttagc gtattagaat ttgaatcaaa ataggatacg taatttttgg 4020

taaacctatc attagttatt tggacaagga ttgagcgacc aggtattact gggattttta 4080

tcccataaac cgggcgatag ggattagggt gagcgacagc atgaccgaca aaggcatcga 4140

ctccagtggt tctgaaggaa atctcaccag tagaaacatt ttgattgaag ttcgtaagtt 4200

gcgtcgttgt aatttgagaa ttagctgaca aagcatatat gttacttcca ccaacttgca 4260

aactttcaaa ccgctgtgtc acacccctag catcctcctc gtatttagcc ttagccacat 4320

agccgtccgt gactgccgta cgcagagcag ttacttgcct tgctgtctcg tctcgactag 4380

cggtaaagta ctgactagct cgtgtgcctt cagcgttctt atagctttcc aagctctcta 4440

gtcgagtatc gattgcagtt gcagtttgct gagcgtaggc cttagcatct acagctttac 4500

cgtctactgt ttcaatccgt ctagatagct ccgcgctgtt ttcagacgcg ttgcggatat 4560

acgttccaac ctcagagcgt agcgtttcaa ctttaccttc ggtatcctca acagctggac 4620

ctgtgtccat tggtttggtt ccccgagata attcaacttt tctaaaggac actgagccta 4680

tttcgctata gcctaaaata attctccgat gtccaaagtc agagtttggt ttaactgtgc 4740

cagtaacaga gtatctgacc cattcagatg tggcagatat tacatttctg ctgcctccta 4800

aatgggttac aaccccgttg taattcgaca gtccattatc cctaagttcc aaccaaaatt 4860

tcggacttcc tgaattagct ttgacctcga cagataatgt ataagtttct ccgacttcta 4920

attctaagag agcagtcgag tccttctttc caccaagtct accaccactc tccgagtgaa 4980

tttgtaattg gtgccacgta ttagtagtag ttgtgagcgt atagataccg ttatctgtac 5040

ttctatcggt atctgaggaa tcaccttgcg aatactccca caaaccacga ctaaaatcgt 5100

agtcctctgc atagtttcta gcaccaaccc tcagattctc gaaccgctcc gtcacaccat 5160

cgattccact ctgcaagtca gcagtcttac gattgatatt gtcaatctga cctgtctgcg 5220

tgttgacagt ctgcgtcaga gcttcgtatt gcgtcctcgt ttggctcaga gtgtcttcta 5280

cggtctttgt ccgactggta acactcgtga tgtcgccagt agccttagaa actgttttag 5340

agagttctga gacggtcatc ttagtgctat tagcggtgat ttcaacactt gctactcgat 5400

tggtcaattc cgtctgtgtt tgtgcctgag caagtatagt ttgcgcctga gacataacat 5460

ttgtccgaat tgtaccaata gaccgctcta attcgagcgc tttggtatta gcttgaccaa 5520

tggattgatt aaatgcgttt cgtacccgca ttaaatctgt tacagtttgt tcagctattt 5580

ctttagccga agtagcctta gctaatacat ctgctatttg acggtcttgg gcttgctggg 5640

caagttgata ttgacggtcc gattcggcga gctgtccatc tatctgttgc ttgatgttat 5700

ctgcatgggc ttctgcttct gcttttgact gctcgatgct gtcgttgatt tcctcgactc 5760

gcttttcaaa ttcagtgtcg aaatggcggt tagcattatc aatttccttc tgcagtttct 5820

gttcaaagga tgctgacaat ctaccggatg ctttgtcaac actgccagcg accatgcttg 5880

cgaccgtcga gccaaatgtc tgcgatacct taccaaatcc tatggatttc aatcgcttgg 5940

acatcggtgc aaaatggtag cttgtgattt tcaaacgcaa gtccacatca aatctctcat 6000

ggaatacact tactgtgtcg aacatcttaa cagatacatc agacttgcct ttgacatcca 6060

gattgataga gttttctacc aaatcacaaa gagttgagcc aaaatacctc tgcccataag 6120

ctaaaagact tgcttcatcg gttacatctt ggtcattgac ctcaatatct gcttcgaaga 6180

tttgacgata ttgcccaatc aacggactgt ccactgtcac agcgattaca cggtcttcct 6240

caccctcaga ctgtccttgg attgtctttt tgaggtgcaa acgtgtcttt aaattgttaa 6300

tgttttcaga ttcttcgtag ctactgagat tctttttgta cataaacagc gactcattct 6360

caataccgcc gttttttaac aatttaactt ggtacttgtc acgcaccaag tcgccacccc 6420

actgaccgac aatagagtgt ttttctttta ccaaagcatc cattacagat acattggact 6480

cattaaacgt atgacggtct aaaatgtcac taaaaaacgt aaatggacag ttccgcttga 6540

tactaccagc taaggcagtc atagccgtct gcccaggtac cctgtcaacc gagatagagt 6600

tgatagagta gtaattcaat agagttgcaa cctgcttagc atagacctgc acatagccgt 6660

tggctttctt tacttcaaaa atgaaaaact cttgctcgcc gtgcagatca tcggccagca 6720

gaaagacttc ccttttgagt agtttccact tcccatcagt caatggaaat ttaaaagaaa 6780

gctggtaggt actattggct tcctgcacga tgtcatcatc ataagcaaga ttgagcggga 6840

tgttcccgtc tttaagatag atcaaacctt gtacctccaa ttccctttga tagtaatttt 6900

tgtgactgtt ccacttgttg aaataccgct tcttccgaca gggatttcaa aaaacggacc 6960

acgcttgcga atggtattct tcacagcacc attcttgtca tagatatttt gtcgcttatg 7020

ccgacagtcg atggtcgcac gagtatttag ttccagttcc atgacctgct gaccaatagt 7080

caaggtcacc cgtcccgaac cctctatgat gatgatgggc tcagaataga ccgtacctgg 7140

attttgaata gaaccagatg aagccaaaac gacatcgccc ggatttttga tatagcgaaa 7200

cggatgcatg gacacagtaa tttctacctt ccaacgatgt ggaccaagtg gcacgtagct 7260

actagatacc aaatcacagt agaaaaggct atccctcaga tagccgaatt ccaccgtatt 7320

attttccgac tgaaaaacct caatcagtcg catagcatct gccaaatgtc gtagcgtgat 7380

gataaatgtc ctgttgtatc catcatacgc accctcgctg acatgtaatt gaccattggc 7440

accgaagacc tcgacttgtt ctgaccgttc aaccgaagtt tgtgctttgc caaagtcaag 7500

aacgtggcaa tctgccaagg tcgaagtatc taagccgttg acgattatat agttcattag 7560

ataccctccc ttgccataat ggcaccttga tgcatgtagc tattttgtgc cattttctca 7620

ccgtccaaat agaccgccaa ctctttatca accaaagcag acaagaagcg ctcgatattg 7680

gtcagacgag atgccaaact atttccacca tcacttctag ccaaatcgcc agtagaagac 7740

agcaagtttc gacgcacatc aaccgatgca cttgaagtca tatcataggc caaagattga 7800

ttttcaaaag gcttggcaat cgctccagcc atgccagata ccgttcccat gacatcccta 7860

aaaccaactt tcaagttcgt atttaagcct tgcatgatag caagaccagc aggtttcaaa 7920

agtactcggt cataagagat aggccccttg ttttcagcaa tccaatcagc aatacctccg 7980

acaaaacttg ttacttctcc ccacatggag cgtaatccgt caacgaaacc gcttaaaatt 8040

gcagcaccag catcaaatag gtcgatgtcc tcaacaccgc ctagcaactt agcaccaata 8100

tcgagtgctg cttgaccaac attccctaaa atgctcagaa ttccactgat tagagttgtt 8160

aaaatttcca caccagcaga caatatatct ggtaatttcg ataaaagcat cgataaaaac 8220

tctcccgcaa gctctaacgc tgtggaagtg agttggggta attcttgaac taatccattc 8280

acaatattga cgacaaattc aacacccatc cgtaaaatat ctggaagatt ttgtgtcaaa 8340

aaatctataa acattccgac caattcaatc gctgcactac cgatttcagg caaacgctca 8400

acaatgccct gcaccaaatt aacaagaatt tcggaacctt tttccaacat ttgaggcaac 8460

gagccttgaa taacttccgt aaaagaccta aaaatttcct gcgccgataa cagcaagttt 8520

ggaatattta agataattcc atcaatgaga tttaaaagca agtcagaacc cgcttgtaac 8580

atcgtaggta aaaagttcgc aaatgcaaca acaagatcaa gaaaaatata gctaaatgtt 8640

atcaacaggt ctggaatagc actgataatc ccttgtccga gattagaaag taattctacg 8700

cctgtttgca taagtgttgg aaactcttcg ataaaccact gacgaacgtt cgctgtcaga 8760

cctgtaacca acatttcaaa ctctggtaac cctgtctcaa ctccaatcac aagaccagac 8820

aacagtgcct ttccttgctc caaaatcaga ggcattgcct cagcgataaa cgttccaatt 8880

gcagatggca gacctttgaa gatattacca accatgggaa agaaatttcc aaataagaaa 8940

ttagaagtcg tcgttgccaa ggcttgtaat tgtggagcta tattctcgcc caaggacaag 9000

cctgccagtg tattttccca actcgctttc atagcagcta aggaccctga ataagtattc 9060

tgagcttcgg cagctgcaac tccagctatc cccatgcttt cttgcacaag gtggatagct 9120

tcgacaacat ccgcatagtt gctgatgtca aatttacgcc ccatcgcaga cggcaaacct 9180

tcagcagtct tcaataatcg ttccatttct gactttgtgc caccgaagcc gagcttaaga 9240

ttatccagca tagcatagtt tccgcgagaa agactttgat aagtctgttg tatgacgcca 9300

atatccgttc ccattttcgc agcgttgtct gtcatgtcca tgatagcttt gttagccatg 9360

ttaatcgctt tggtcgaatc accaccaagt gattgtttta agctcgcacc catggataca 9420

gcttgctctg cgtatgtatt tgcagaaaca cctgccttgt aagcttcttg cgcaaacctc 9480

ttagcagatt cttgtgcacc atcatagata gtatccagac caccgaaaga ttgttgcaaa 9540

tcagcaccag cactcaaagc agaaccaatt attttcccga ttcctgcagc cgcaagtgca 9600

ccgcttaaag cagagacgag cgaggctcca aggcttgacc cagctgacct accagcgcta 9660

tcaacttcac cacccaataa ttttgatatt gaaccgctaa tgccttttgc ggacgggact 9720

atctgcacat aagcagaacc taaatcagtc gccatgctcc tcacctccaa tctctatttc 9780

tagcgcacgc atagcacgtt caaactcctc accagaagaa aagacacgtt cctcacgttc 9840

cactttcgac ccttccaagg cttgagtgac agagtttgga cgattccgtc cagcctgccc 9900

gtccttagtt ttagcccaaa agagcaaacg aaccgtatca tagatacctg caagcagcag 9960

agtatccaag tcttccttct gaccagacaa gaccttctta atccgtgatt tttcacttaa 10020

cccgcaagca aaaacagcta cccgagttat aggtagctgt cgataatcat atatgccata 10080

ggtttcagcc aaatcacaga caagagcatc ctcatctact gcgatcattc tggcgaggat 10140

tgcgagtttt ttaagtcttt gacttgttca aagacatcct tgatttcagc accaagagca 10200

gaaataggca ccagcccttt ttctgtacgg acatgctcct tgagtttctt cgcttcgtca 10260

ccgagcaaca aattgacaat ccgaatcatg gcaccactgt ctccagattc ttcagcagcg 10320

attgcctcga aaagctcata gttttccaaa cggtcttggt cgatgctaag cactagacct 10380

gtactagttt ttacttcaaa cattcaaacc tccttacgat gacgatggcg agcttgttcc 10440

tgttgactcg ctagctccct taatgtactc atagtgtgta ttgcccttgt tatctggcag 10500

agcttggata gtcgtttcat acccagccaa atcactatca gcgtaggtaa tctccccgac 10560

ttccagcacc ttagcattcg ggataacaat ccgcttcttc gcaccatttt tcagcaacat 10620

gtcaaccacc aatggatgca caggcaattc cttagagttg acctctaccg tgatgccagt 10680

tgcaagttct cctgtcacat tttcagggcc gtagacctct ttcaagacat ccacgttcaa 10740

gacttcaatc agcgtaaatg taaatttgtc tgattttcct gtctgtggag tgtcgaccac 10800

atcgccgccc catgctttca gttcttccga ttcacgagtg tcctcgttgg tcaacccatc 10860

ctctgaaatg tagcctaagt ttttaaaagc cgtgtttagc ttagtagtcg cattggtcgg 10920

caagctcgtt ccgattggag ctgaggaaat agctcctgca atgtctggct ttgctgacga 10980

cacaagtttt gcatctgcca ttcaattttc tccttttcaa aaataaataa aatcaaccac 11040

cgcttgatag cgatagcgtt tagtttccgt atctgtaaaa ttatagtccg agttcaattc 11100

aaccctgctg ataaacggca attctaccat cttctcaaca gcttgtttga cctcttcatt 11160

caaaatggca gcttcttcca aagactgccc ataagattgt atcgccaaag tcgcttgatt 11220

cagatggttc tttttgccac cgctcgtttt ctcaaaaatc acaaaacgct caggcatttc 11280

cttctgatgt tccgtataga caggcacaga aagatgctcg gttaaaaagt tcaacgtgat 11340

gacttcaatc atgacttcac cgccttcagc aaggtattgt gcttcttgtt atcccgttta 11400

gcttgatagc tatcagcata gaccatagcg ttggcacgag tcttaccgac atagatatcc 11460

gattcatacc catcgcctgc acggtctcgg atagcatttg ccttgtcagt caaaactgcc 11520

tgcatctcag gcgatttcaa caagtcacgg acaccagcac gggtcaactt gaatttcatt 11580

ctagccatac cgttccacca tcactttctt gttccactcg agcgggatca gatgttcaag 11640

accttccagc ggttcaccaa ctgttctcca tcgttggcca aaaaatcgaa cttccttgtt 11700

cgtccagttg tacatatccc ctttaggaat agcgagagta tagtcaactt tttttccggt 11760

cagattgatt tggttggtaa tatcctcagt tgatgcagga gcaatcaaga cattctcaac 11820

cacaatctcc acgtctgcag tcttgggatg accaaacgaa tccttgccaa tgatctgttt 11880

gtcaatcaag acaattggta tacctttaat ccgtcccata aatatccctc gctccaaaac 11940

gttgtttctt aagccccaat cgcttcagct cgctatcttt gataaagagc cctccaccag 12000

ggaccaaaaa agaacctgac accgaataac caagagctga ctcgttaaat tgagtcatag 12060

gctcttggtc tgttgatgtc atgagagtgc gagcgaccac atctaccgtg acggatttga 12120

caacagaagc aaagaccaag ctgtcactgg tcatgctatc caaatccttg ccaactttct 12180

gggcctcatg tcgcagagag tctgacacaa tctcaagcaa ggcttctgcc cgctccattt 12240

cgtcaaactt caacggtctc cacaaggtct ccaagtcaga cgtagttgca aaaggagtca 12300

taggctactc ctcttcattc agattctggc tttcttggta aagttgcaac aactcatctt 12360

tattcgcttt cggattaaat tcaatcccca attcggtcaa catcgacttc aattcaggca 12420

ctgtcggagt tttcagaaca tccttttctt taactagctc ccagttgcct tttagttcgc 12480

tatctgtgac aacgattgct ccagtttctt tatgtttata aatagccata gggcacctcc 12540

taagcttgtt cgacacgagc aaaggcagtc tcatccaaga taccccaacc gataaatgcc 12600

tctgtacgta gcaaaatctc attgtaagct ttcaaatcac gacctgagcc atctggatca 12660

ccatattcaa taatttccat tgggatgttt tcagcatacc cccacttgaa tttattctta 12720

aagtctccaa caatggcatg gtcagtcttg gcagtaccgc cagtcacagt tagcgtcttg 12780

ttgatgtcga gttccatgtt gaagaaattg tttggtcgtt gaccaaagcg gaattctggg 12840

tacataatac catcaaattt atccttgatt ttagacatag cctgacctgc aactggggac 12900

attgcaatac cagtcgcttc atttccgtta atgacaatag tttgaacagc tgcatcaatg 12960

ttatcatcga ttttatctgc actataggta ataacattcc ctgtaactac accatcaaac 13020

gaattagtcg ctttaaacga tgcatctgtt aaagattttg gttcaagacc atgtaaagca 13080

gcgatgtcaa aagcctctgc catctttttg gcaaatccat cggcatagtg tttcaaaaaa 13140

tccaactgct tctcttctga tgcatattta aattcatcag tcaaacgggc ttgatagaca 13200

aacttaagtg gtttgattac ttttgatgtg accgtagctg aaccagctcc tttttgctcc 13260

ccttcaccaa caatctgtgc attaccatcc agattaaaga taaattgctc agtaccattg 13320

aatggtattg gagtttgagt cgatagttta gcaagagtgg aatgaccttg aaccttcgac 13380

ataatttctt ttactaattc tggtttaaaa agtgttccag ctttcataga tgttgacata 13440

aattattctc ctttatttaa atcttttata acgtgacgcc atgcagcatc ctcgcctttt 13500

aattctggct caatgctttt gagtggtgga attggatctt gtggtttcat aaggcttgca 13560

aagcgttccg catctgccgt aaggcttgct tcatcttcgc cttgtaaacg atcagcaaat 13620

tcaataggca agccatattt gagagcaata gccgtcttcg ttttcgcagt ttcatagcct 13680

gcaatagttg acttataccc ttcaatttgg ctttcgaaat cagctgcagt ctgatttgat 13740

tgtgcgaccg tttctttgag cccagcgttc tccgcttcca atgttgaaac acgagatttc 13800

agttcgtcgt agtcagcata ttgctctttc agtcgattca aacgagcctt gataatggta 13860

tctagctctt cctgtgtttc gattgcttta aattcagaca tatcaatgtc tcctttctcc 13920

tgctttcccg gcagttcggt aatatttttt gcattaaaaa agacaggtca cccctgtcca 13980

cttaatacct aatttgttgc tttttcttag gcttggttgt agcacaagcc caatgtgcca 14040

gcaaagcact gtccattaaa ctaatatcca tatcgtcaaa gtgtgagcga tagccaaaac 14100

caccgtttga gccgatattc cgcttgtcgc agttagttac gaccttcgac agtgacggtt 14160

gcccattgtg acaaatcgtg tgctggtaga tgccctgttc ccacattgag ttagcgatga 14220

tgatttcctt gacggttggc aagatgacat tgcggatttt agagtctttc aactcctctt 14280

ctaacatctt ctggccacta gctccgtcaa tgacgatttg agccacatct gcctgtttca 14340

aaaaggcaac cagccaggca ctaccattcc gcacagattg acaatcaatg gtttccacaa 14400

agaattgacc gtcttctgtc cgaacagcaa tagacaaagc aacgttggta ccgtcttgcc 14460

cgaacttgat gccagcaaat agcttgccag tcagcttcgg catatcgtca atcttgagtg 14520

cgttccactc ggtctcagat atagctgatt tctgattgta agtcggccaa aaacccaaac 14580

gctgcacatt atggtctaac ttatcctcgc caagctcagc ctcaatctta cgttcgttca 14640

aatgatagcc catggacgga ttagagttat accatgctgc tacatcgtca atttctttct 14700

cctgatccac agaccattca gcccatcccg aatacttccc cttgccaaac agacaagttt 14760

cacgatactt agtaaagacc gtaccgcttg aaactggagt cggtggtgtt ccacacatga 14820

ccgtcatcgg attgtccgaa tccgtcacag tatacttaag agccgattcc tgctccgtgg 14880

tgtattcctg ggcttcgtca atgataagca ggtcaaatcc ctcaccaaga ccgccagtac 14940

ctgttcgagt acggaactgg accacaccgc ctgtctcata gagctcgatt ctttcctgcc 15000

ccttagctcg aatggagtta aagtcctctc cgtccacata gcccattttc tccagatatc 15060

gcttgacctt ttcgaaggac gagtgcgatg ttgaaatgcg gtgggctgtg tgcaggatat 15120

tgagaccgtt gtgcaagccc caaatctcta gcatatagag aatttcagac ttaccattcc 15180

gacgcgggat agagtaacca aacttttgat gtacccacag accattcttg tcaacagcca 15240

tgataggatt gagcaaattg acctgccaag catagcaaga cagacctgtt cgctcataga 15300

gttctatcgc ttctttggct ttggaatttc gtttaacgta tttgagtatt accgattgag 15360

taggattttg attgccaagc tttttccttg ccatatatcc gtcctttcaa tcgtatcgca 15420

tgataaccct atcgctggga gaaattagat caccgaccct ttctcttgta ccaaggtttc 15480

tgcagttgct taacctgctc ctgcaattca gtaatcaaaa gcccctgttg ctcgaacagc 15540

tgattgattg actggacatt cttcgaacca tcttcctcga aacgctccat ccgctgaaca 15600

acttcttcca caataccagc caaaccgtca agacttgctg aagtagccaa ggcaagagta 15660

gcaactgccg ccaaccgcac ctcctggtca cgctttttct taatacgctt attcatagcg 15720

ttctcctttc tatttttttg caacaaaaaa gcactcgatt actcgaatgc ttatccccac 15780

ccaaacgaca actctttacg atagttcccg tcttggtctt taaaattttg taaaaacttc 15840

cctaaatact tcgtgttggc atcgtcaaat gtattaacac gaatcacttt agtttcaggg 15900

ttaaaaacaa gcgtttgctt atgctcctcc ttgttttcag ggtaaatctc atagtgataa 15960

aaaccatcgt caccaatatc tatcaaaaca aatcttaaat acataaactt accctttctt 16020

tttaaattca ttgacagctt cggagtaatt aaataattca tctacttttt tgtgagctgt 16080

atcataatcc aacttgctag tcacatacat ataatcatgt tctaagcgtt catgctttag 16140

caaaattaaa tcatgcggtt gaatgttttt cccagaaatt aatctctccc atgattgagc 16200

catgtcaatg tctggtgcaa acaacccctt tccataattc aactcatgaa cattattaaa 16260

cacatgatcg aacgctttat caacatcatc ttttgaaaag ccattcattt ctttgaactt 16320

cccaatgttc gaatagattt tacgtttttc caaatcttga ttgctgtttt ttatcctgtc 16380

gtaggttaaa taagcatgtt tttcggcttt aataaaatcc tttggcaaaa gctcgtcgtt 16440

tgaatcatca cgaacataat tctttgcgcc agcttgaaca agtagtccga tgcctttcct 16500

ttcctctatt ttagcatttt ttaaaggatc agaccaacgt ttagagtgtg cattctgttt 16560

tttgccgttt cctgggtgat aatcaacagt acacctgcac cgattatgcc tcctccaaac 16620

atcctttgga acatctggat agttataaac cccaacaaca gccctacacc atttacaaca 16680

attaccactt tcttttctga caactttagg tgtcaaccct gccttggcat gaaaatccgc 16740

attcgctttg ataatatcat ccacaatcga ctgcgtaaag ttcacaatcg gctcctgcaa 16800

caaccaagcc accttatcga actcatcctc agacgacaaa cgattgacaa gaccatcaat 16860

cctgtcctga ttgacatcag gtacctgcac ctgtagacca atcttggcag acctattcaa 16920

atcctcctga acttgaccag cataaccact cacaagctcg aaattccgcc ctagcgtgtc 16980

catcagtagc ctttgggcta tattgtaata cattttaccg tctggcaacc tatcgcccgt 17040

cacagacgaa ctgagagcct ctgacagaat gtccccaacc tccagagcaa aatcatttgc 17100

tgtggcatag gttgcttttt tctttttcag ttcagcaaaa gcatttctga ccacttcact 17160

cttcccataa gaaacttcaa acttgtcctg aacttctttt agcaagtctg gtaaaatatc 17220

acgttccatg cattcttact cctcagtatt atatttccga agattagcaa ctctgttctt 17280

aaatttttca aaaagtaatc tactgttttc ttccctctct ccttcaatag tcatttggtt 17340

tccgactcct gataaaacgt tttcgactac cggtggtagt ggattacctg ctataccggt 17400

taaatcacga atagtctctg cggtgatata ccccggcaaa gcctggttaa ttttgataac 17460

accatcacct aacatggtca atgtcgttgc atcagcctca aacaacggct cccatttagg 17520

aacagtcttg acgaactgtt ctctcaaaaa cggatactca tcacgcaagc aagcagcaac 17580

ataagcgaca ttcagcaagc cactacctaa acttcgttga gcttttcgac ctgctaatcg 17640

caaattttca tgactagctt tgatagcttc caccgatgat ggattgtccg acacaaaacc 17700

aaggtcatct aatgtcaatc ccatttcccc agcgaaaccg gccgccgcag tccgtaactg 17760

ctcggtaaac ggactcatgc tagctgttgt aaattgtcca atgctcggca cgtcaccatc 17820

gtcatcctta gtgaattcca agagactagt cacagtcgct ttccacttgt ccataggttc 17880

cgcatcttga ctcgtaccca aaacatattt ctgcgggaac gaatagaact cagccgtcac 17940

atcggcacgt tccagcgttc gcttggcata cgactgatag tacatacctg cacgagtgat 18000

tcgactacga ccaaacggac gaaccgcatc tggcctatga atgactggca ccagtaacgg 18060

acgacctgtt ggattggcaa tcggagtgaa cgttccaccc gaaatgtaaa ttgtttgctc 18120

tgctgtaaaa taagcctcta acttcggact accattatca tctcgttgca agaccgcata 18180

gccttcggtc aatagccctg taattggatc aagtatacct gtcgcgttac tggactcaat 18240

gacttgcagt cgcactttgt cctctacctt ggtcaaatag acaaagctac acgatccaat 18300

caaggacgac aagaccaccg agtcgaagaa cacatctgga ttgttttgct gaaaaatatc 18360

attgacctgg aattgatcgt tgtcaaactc gcgaaagacc aatctgtccg ctaagctatc 18420

cacacctttc gcgcaccagc ccaagacaga ccgatactgc tgacgaatgt ttggcggaat 18480

cgtaattccg aaagagctat ctgtgtgctg catagcatac tgcttatacc tcatttccac 18540

tcgtggcttg acctcgttta gctttcgtct gaggtatccg atacctttat attccaatct 18600

ggtctccttt caattttggc gcgagaaaaa atgtatagtg acggcgtgaa gtgccgacga 18660

gaatagaggg agggtggtac cccccctacg ttttcaacct cgataatttg cccaatttat 18720

gctttgtggc aaattgcgat ttccaatcac tttaggattg cttgatacat cgttgaatag 18780

tttgtcagat ttttgtctat tacattgcct gtgcgttaat tgcatgttag atatatctga 18840

tggatgtcca ccttttgcaa ttggtatgat atggtctatt gctgcactca taggatgagg 18900

agctttgata gacttatcaa ctggatgtcc acatatcgca caaatcgttg cagtttttaa 18960

tattcttttt ttatttttat ctgcctcagt cctgtgcgga ccaagcttat ccgctcgtat 19020

gctaaccata tcatcctttc gttttaaaaa agccacacga ttgtgtgact aatgcatatt 19080

aggtcttggt ccgatatgcg attgaccaga cctccgagtc aaggtccccg taggattcac 19140

ttactcttaa acgggaacaa caggattcga acctgcatat taagcaacca tgcttcaaaa 19200

ggaatcaaac cttattcgca agacttcccc tcttgcgact ctaccaattg agctatgttc 19260

ccaatttaga taccgagttc gattttctaa ggagactggc agtcaattga caatgactga 19320

aatgttaacg tttatctctt ctcggtatct tgacaatact attttaacat ctcgaaaaac 19380

gaataatcta tacaaaaact tttgatttct tggtcaaaac tctaattttg aactaacaaa 19440

cttccgcttc tatattgttc cgcaaacgat aacagtgcat cgttgagttc gatatagaaa 19500

ctagcttctg ataagtacaa gtcgttgtag atttcaaaat cataccgctt gcctgcgtaa 19560

agatacttct cataaagaat gcgtctgtgc gtcggattga gtagattgtt gatcgcatac 19620

tcgatagctt caagttctgc ttccgcatct actcgattga ttgccaagcg ttccacgggc 19680

ctgctaggat tgccattagc ttgtctcggt tcgaaagtgt acactgcagt aactttctgt 19740

ccatctacat cgttcgctac tctacgccag cgagggtact ctttcagttt tcgttttgca 19800

ttagctttcg ttttttcgaa atcaacttct ggaaaaaaag tcatctgctc atacctttct 19860

gtgatataat agttttagag ttttattcac atagtcagta caagtgtgct ggcttttttt 19920

atttccccca cggctgtcgc tgatggctat aatacgggta cactagccga attttccctc 19980

tcggagctag caccttaggc tcgtaaggct tgacttgctc gtacagctcg tctattttat 20040

ccaacatgcg ttgtcgcggt ggtcgtccgt ctagccattt gtagacagat agagtcgtca 20100

cgtccatctc ggtcgcaaat tggcccctcg tccatcctgt cttttgtagg atgtatttga 20160

ttttatctgc tgtggtcatt ccaaatcctc caacgctacc catctaaatt gtgggtactt 20220

tttagcttct tcttgggtgc aacgacatgc ataggctcta acgaataatt ctgaatccgt 20280

atcaagaatc ctatgtttcc cattcgttct gacaagaata gaatactttg tcatcctcgg 20340

ctctggcaca tcgaccagta gcacacctag tttttcagtc atctaatacc tccatagcca 20400

gagcaataac ttgccctgtt tcctcgttaa aatacatgag cgttgtacca ttttttaaat 20460

ttttgatatc atttttagtc agcttgaccg tatgcacatc gtactcatta tcttcaaaac 20520

gtattttagc tacttctcga tttgtcatta tttgaactcc ttaaattgaa aatcaatgac 20580

tctaatatga acaggattta tcacagtatt cccaatgata gccgcatgtc cgttgttcaa 20640

ttgggaaatc accttttctc ggatttttat tgcttcatca tcggatttaa ctgtatatac 20700

agtttttgaa taatctgtac aaactgttat tttacacata acctacccct ccaccaattc 20760

cggattttcg tagatgttgc cagatagaaa aaccgtacaa ttttccaaac agtcaaacaa 20820

actatcccaa acttcttttc ctgttttgac atccaacagc ttccaacaac catctctgta 20880

cacaattcta gcttttcccg tatcttcaaa ttcatcaaaa taagtccaaa aaattacatc 20940

atcttcaaat aactcatctt cagaaaatgt actaaacagc cctgtggatt gcatgagaac 21000

gacatcatca agcgggaccg tcatatgagt cgttccccgc agatgcttga ttttgacttt 21060

ctgacgttcg tagcttattg ctaagacctc gctcgttctt tgcatggcct tatgccatgc 21120

tctaaacttc ggtactacca ttcttcgcct ctttctacac gttcgaccaa acaatcgcca 21180

cagtgacctg tctgaaagat actgccatag tccaatgtgc cctctttata cttgcacccg 21240

cattcttcac aggtctcaat tttcggtatc attttctgcc tcctcgttta aatactggat 21300

ttttcttttc aagctctttc tgcttatgat agtcattttc tctccacatc actccatctg 21360

gacctcttcg gaccgacagc atgtaggaac ttaaattttc catcactcca cctctttcgc 21420

ccactgccac agcctttcat cctgttgttt gatttcttgc tctgttagtc tagtagtata 21480

aatagccttg tcaaaaacat cagaaacatt tccgaaaggc aacatcttat attgaacatt 21540

actccctctt gtaattttcg tcagaatcgc ctctgctatc tccaccgtat acaacttctc 21600

ctgctcgacc tcatagccat aaagataagc taagtgtagt ttttttgcat tgcaatcata 21660

attttcataa acccaattct gaacagattc gtcaacaaca tcataattga gaccaaacag 21720

accatgttca tctaatgtat ctatccactc cgccacaaac ttcggcacca caaccttctg 21780

cggttcgtgt tgtttcagga accgatacac ttgtttaacc atcattctaa aaggatgtgt 21840

ggcgctatgc actgtgacac caactccgtc agcgaatgtt tcattgattg ttacaggtat 21900

aaactccgta cacccgttca cttcgtaaaa atcattctgt ttcatctgtt tccctctcta 21960

caaaaatagt gtgacaatcc aaagtagaac gaatgtaata ataggggttc cgattacttt 22020

tgccaacaat tcggcaaaat cataatcagc ttcctttcgt ccaccgctaa caataatata 22080

gctgaccagt atatcaagac ctatcgcttg tgctagtgtt atacttggga ctccgtctaa 22140

agttgttaag atgttattcc atccatattg tattaccaat cccgataaga taaagcttaa 22200

tgggaataca aacaatactg ccagtaattg ttctcttgtg ctcattttat tattcatctg 22260

tttcctcctt gaaaaaggta tcaaagtcca accaatcatc tttaataaga tttccaatct 22320

tcgttactct acatccaaaa ccgttactct caatacggat atacttccct tgcagttctt 22380

cccagctatt tgcaccgaca acctccaaga tacggtctat cagctcaaag ctcttgtaaa 22440

aagctactcg ttttttcttg tgttcgtcgt atttatctag gcagtatcct ccaatagata 22500

ctccagatcc atatccctca acagtcagat aacaagttaa aattccatgg tcttctctgc 22560

ccaagaaagt tttggttatc tttacgtttt caattgtttt attcatctgt tccctccaac 22620

tcctcaatca accaatctag attctgacga gccttcttca agtcctcaac accgttcttc 22680

tgctgaaatc gcaacagata cttgatgaca ttgccccaat agtaggcgcg ctcgcctgct 22740

aaatcccaga taaaattctt gaccacttcc aaggcttcca taccatactt cccttggtaa 22800

tgttttggtt tggttacgtt gttaaattgt tcttcttgtc cctcacattc aggacaagtg 22860

caagcgtaaa tcatttgtgt cataaaattt cctccacttt aatctcaatt ctcggtctag 22920

gactgtacac ctttcttgtt gtatgctcga caatgatgtt atcatccgtc caaacacacc 22980

cagcattgct gatgctgtca taaaccgctt tttccagatt atctagatct ggttttttat 23040

ctacgtaaat tcgctcattg ataaagtcat catactgtcg cactttcttg gccttggacc 23100

gaggcttagg cggttctgac atggacttcg gagcaggcat gtagaatgtc atgtctacct 23160

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tcctccaagc aaccatctta ccgtcttcgt aaaccgtcgc atgtctgcct tgtacactag 23280

ctctcggtct gctttgaggt ttgggttcaa ttggtataat caacctcata ccagaactcc 23340

ataaaatcct aattcctcaa acaaattctt tttatttccc tcgataaact caaacaaggt 23400

ctgaatttct tttatgtctt ttcctagttc tttcgcaata ttggaatcat caaggaagag 23460

cttatctgga tattcagctt ctaaaaccag tctatattct ggttcaaaca tatctccatt 23520

ttcatccaga gatatttggt tatcttgcac aacaaactct gctttgatgt tccataggct 23580

accgccaatc acttccatac tctgcttcac ttcatttgtc acaagtgtga aaggtgtttt 23640

taaaattgct gtttttttca ttttttcttt ccaaaatcca gcgactgcca ttgtgtgagt 23700

ttggctaaat acgggcagtc gctgtcgtcc aactgtcaac tgattgtttc caattgacac 23760

gctttctagt tcgctttttt cgtggttcac ggcacgttag tttcatattt ccaacaattc 23820

actaatcgac actatgcgat tcagtttctt tttgctacgg caataatcac attttccgca 23880

cttaatcggc ccaactttcc cagttgccac atcccataca tggctagcac gctcagaaac 23940

gaattctaag ccctctgaga gcatttcttc gtcaaggctt aatatttcct tgtctggctc 24000

gttttccttg ctcacagcga cgattagagg cctatacgaa cgtcctgtca tttgcttcag 24060

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accgggaact ttttgtttca agtcttgact ccactcttta tcataaattg ttttcatagt 24180

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cgtgcctgca atagttcctg tcacaatcat ctctttctct acctggtctc cttttcgacc 24300

gtggtataga ttattgaaca gctcatcagt ttccaaggtt gcgataacct tatctgccaa 24360

tttgtaatca gccagcatgc cgtatggttt acgactggaa aacaaatctg acttatgctc 24420

ttctaaaaat ttctgatgag cttctgcact ttcaaaatag ctatggacat aattaccaaa 24480

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ataattatct tgcgttaggg tcttcatatt tcaaatccaa ctccccgttg tcttttagct 24660

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tcaactttct aaaaccattt agtaaactga agctcgcaaa atacccgata acctcatctt 25020

gtggttgagt aaaatcaagg gtcagttctt caaacaatgg gtcataagat acaaactgac 25080

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ctcatcttca tgattcgtct tttgtcttga tggctaccat cccaaacatt agcaagcatg 25560

tcgtcttgta gttgctgttt gagctttttt aaacataatc gcttcttcaa tgttttctcc 25620

ttttcactat tcatagccca tcgctacatt gtctttccat tcgtcatagg ctctgtcctc 25680

gtcttcgtct attttccaga tgtcaactgg tggttctggt ggtgtgctta accatgtatc 25740

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aacttcttct ggatgatatg gtgcttctgt tgtaacaaca gccccctgac ctcatcacct 25860

atctggccat acttttcttc gtggtcagca atcattttta atttctcttg catcatccct 25920

cctaaaacgg taattctcgt ctgctttgcg cattatctgg atacttaaag atattgttca 25980

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tagacagatg gctcttgccg ataccgggct taccttggat aatagcgttc cctttgcctt 26400

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gatttgtaat tgtgtaggtc ttgtaagatg cgtctttcaa ctcttttggt atcatgctct 26520

tcttagcgaa tatgtcgtac gaactagccc acgtttcagc ttccaaggct tggcccacct 26580

ctctaatctg ttgttcgttc atcttttccc tggtgcattc agggcaacaa gtgagatacc 26640

gtggcactgt ttcattcttg accatgacct tgttctttgt tcgccataga tagacctgat 26700

gtttcaaaca catctcgtct atcacatcat ggacttcttc tattttcatt caaaatcctt 26760

tcagtttttg gtataattca gtcaatccac aaaggaagga ggggattgaa tgaaagtgat 26820

tcctaaatta ctcgagatgt acaaaacagt cgaagttgaa atgaaaactg gttctggata 26880

cttggttaaa agtcagaccg aaattcctga tttctacatc gcgagcgaac tttcggagta 26940

ccacaatcaa tacgtaaacg agtcaactgt ttatatcaat caagatgata tttcatctgc 27000

tcgtggtgtc gtcgatactt tgttcgttga tagcgacgtc taagttatcg attaatctct 27060

ttgaagtggt gtaaacaccc caaccatagt ccgttaaagc tttatcaata ttctttccaa 27120

ataatgattc aacagctgaa acggattttt ttagtgtctt aataatttct tgttctttca 27180

tttgcacctc tttctagtag ggtggtgggt agtttggatc tggcacccaa tcgtttgatt 27240

tttgtttatt tgctttacta tcgacaaact gtctctgctc ctcgtcctgt cgggcgacgg 27300

ttctgatgtc gttttttgcc caattagtta agatagagtt gatataattg aaatatcgct 27360

tagaaccatc agcagcttta tcgatagccc tcttgaccaa ttcgggctca aaatgttcaa 27420

tttcaagata ctctttcaac ttttcatatt gaaaaccatc taaagaatca atcctttgtt 27480

gatagtagtc ataaatattt gcgtcagtag cagtttttac tgtatctact tctaactcta 27540

tatttatatc tatctctttc tctatctcta tatctccgtt gcgttctgtt gcatcggtgt 27600

tgcattgcaa cgctttttgc atctctcgat gcttgcgaga cctacgggtg cttgcggttt 27660

cgctacctat caactctgga acttgctcaa gttgaaactc gaatttgtcc tttgtggtta 27720

gcaatttttt atttgttaaa aacaacaagg tcattcttac cgcctcaaca tcttcatcta 27780

tcagcaaagc gatttcttct gcaaggtcat tccctaggtt ttcaaaatag atttttccac 27840

tatcttgtag actggctaac atgattttga gatagataat cgtatgttcg tcaccgcctg 27900

gcaatcgtct gagaagtttc atttcttttg aagcaaagaa atcttctttc aactgcaacc 27960

agtaatatct tttgttttga gttaatgcca tcttccctcg actttctaac tacccactaa 28020

tatctgataa gcttctaaat ccagctccac catgactttc aaattcttgg tagatgtctc 28080

gatttgtttg cggtatgctg cgatccctgc ttgccgttct tcttctgtct gagcgatgaa 28140

atagccgaaa tggttgtcac gttttagccc gtaaacgggg attttgaact tgtttctcaa 28200

cttaacgaca atttgttcta cagttctttt ctcaaccccg gtcactcgag taatatcttt 28260

tcgaggtttt gggttatcaa atgttgcatg tcttacctct gcgaaaacaa tccgctcatt 28320

atctgtcatt ctgtcgatca tcttctgaag ctccgtcata ttccaaaatc ctttctacat 28380

cttcaaggtg ctcgatatcg ccagttcgaa gaaatcggtc gtatgattga gcaattagtt 28440

ctaatctaac taagcttgtc acccttctag aaccctcctc aaccgttcgt tttcatccct 28500

taatcgctga ttttcgatgc ggtattcgtt ccgttgttca gcgatgtcac gaaccatatc 28560

gtgcaacagt tgattttctt gctctagtga gtaaagcggt cgagagatag caggtttttc 28620

ttgttttaaa aaattagcta accattcttg catatctgtt ctcctcttta tcaatctgtt 28680

gggcatttcg cttcaggcta ttcttcatag actcttttcg acaagttttg taatactgtt 28740

cagcctgtgc ccatgtctta tatctaagct tttcaagctc tgtctcaagg agcaaggcta 28800

tctccctgtg cttccgttcc ttctcagcct tccgttgttc cagaactgct accgcaagca 28860

tcggcgctgc gaaaattcct aatgttaaaa ttgcttctgt catgcactca atcccttcac 28920

tttctttttc actttcatct ttgctttgta atattcaatg tctctttggt caaaacggaa 28980

atgagttcca gccatgtgat aagggatttt cccagccctc acaattgcca taaatgggtt 29040

acggctcatc cctatgattt cacaggcttc cttcacaccg atcgctttat tggagatttg 29100

agagtttttt ctctcgatag caagttcttt ccgaacttca ctcaagactt cttggataat 29160

ctcttgtttc aagaccttga acgcttctaa catagtatcc atcttgtcaa acctcgcttt 29220

cgtgtgttat acttcaagta agtaatttta gtaagagcct gattaccgtc aggctttttt 29280

tgtttttcaa gcaacatcat caaccaaaaa tttattgata aaatactgct gacctttgcc 29340

tgtaactttt acagttttgc taattgagat atgaccgtca gcatgtgtga tagttgtctc 29400

ttttatttca aataaaccta gttccataga cttctgcgtt ggcatgttcc aatcactgcc 29460

cttgcgctta atgagatagc cgttctcacg caaccaagca aacaagcgat tggcaccgat 29520

tttaaagccg ttttggctga ttaacttagc taggtctcca accaagatag acgagtgact 29580

agcactcaca gcgtctgcaa acagcacctt gggcttgtcc gcttcaatct gtgcttccag 29640

ctgatggacc tttttgtctg ccagtagcag agcgcgagcc ataatcttct ctggactgtt 29700

gaagtccttt tcaacctgga taaagtactg acgaacctgc ttgccacggt ctgtccgttg 29760

gatcatagca atttccttgg ccatgtccag cttgataatg tggtcaacct tgttgtgacc 29820

tccgcgacct gtttgcttca caaaattgtt aagcaaaaaa tcttgatttt ctgcaaagcc 29880

atactcaacc attcggtcaa accacataga gtatggtgtt ttgaccccca aagcctcatg 29940

taactgccga ccagacacaa caggctcatg gttgtcgttt agatttacgt taataatttc 30000

gtgcataata ctcctttcaa tatttattat tcttcaaatt tttcccacgg ctcacggatg 30060

cccaataatt ttgaaacacg caatttcaaa tcagcactcc ctttcccttt ggtcaacaaa 30120

tctgtgattg tgccttgact acgtaatccg acagcttgtg tcaaatcagc ttttgtccag 30180

cctttttcag ccaatcgttt ttccaccagt tctatccatt tttgatgttg ttgactcata 30240

aacttctcct ttctctttat tagttagaaa gtaaagcgaa agtttttgcg aaattttata 30300

gattccactt gactttttac aaactatagt ctaaaatcaa gacataagaa aaacaccgaa 30360

caaattaacc gataacacta taattcaact cgccaaagtt ttattttttt agttttatct 30420

tcgttttttg tttcgcttta ttattcgctt tacaaattat attctatact aaagtttgta 30480

tactgtcaac tatttttaca aacttttttc tagaattttt ttcgtaatgc ttagaaaggt 30540

tgttaaatca atgttctcaa cgttcgaaag aataaaagaa ttagctaaat ctagaggtgt 30600

tacgctaggt ggtctagaag aaagattggg gttaagtcga aattctattt ataccatgaa 30660

aaacaaaaag ccttcagctg agaggctaca gttaatagcc gactacttca acgtatctac 30720

tgattactta cttggtcgga ctgataatcc aagagttgct aaaactgatg acgaaattga 30780

taaaatagat ttcaaagagc tagcagccga gtcaatgtct tatgacggca agccgtttga 30840

cgaagacgat atagagtttt tctcatatat catggaacag cactttaaga acaaatataa 30900

ggaatagtaa aatgaccgca ttagaccttt gcgtacagca aggtattgat attttattct 30960

ttgatggtag agaaagagat aaaaaagcct tcttcaacaa acgtgctaat cttgttggaa 31020

tagacacgta tgtagatggt atcgaacgag ataagctact ctatcacgaa cttggtcata 31080

aaaaccatac accctatcaa taccaattac atagagagct gtgcgaactt caagcaaaca 31140

ggaatatgat tcatcatttg ctgaaagatg aattgtcgat gttagacgat tataacgact 31200

ttaactatgt tcgttttatg gaacgacatg gcttaaaaac tatgaccgat gaaagcatgg 31260

ttattgaaga atttcgcacc ctaactggaa aacatttata ataaggagaa catccaatga 31320

agaacaacac caacactttg cccttttatt taagaggttg gtttttcttg atactactta 31380

tactatctat cccaacttac ttatcgtcgt taatcctctt aataggattg ttcttgatta 31440

ggaataaaaa atatcccaat ctctctcccg accaacaagc cagatggaac gaaattcttt 31500

tagcgaatga acaagctgat aacatactaa aaactgcaaa ggaagaagct gataatctaa 31560

taaacaatgc taaaaaagaa gctaaagact ccattgatat ggctaataca attgtcgcag 31620

gagtggaatc gaaaaagaat aatctcaaag aagagattga taaactagaa atagctaaaa 31680

aagaggctga gctttattta tcagaaaaag ccgatgcatt actttttaaa gaaacaacgg 31740

tagatttcac agacaatata acagctaatg aaatcaaaaa tgaattatct ttaattcaat 31800

taaaagaaaa agaactaata aaagctgatg ttgcaataaa taatcttgga atacaaacaa 31860

cgaaagctaa tcttaacaaa caatctagac aacttctccg tgcattcaat gctgaatcgg 31920

actactatgt atctaacatt acagcaaaaa atgtagatag ctatcgtaat aaattagcaa 31980

aatcatttga aaatctaaat gcactatttg cagttgacgg agtaaaaatc agtcatgaac 32040

ttctcacgct aaagttaaag caactagatg tcatgtataa atatcaaaaa caacttgagg 32100

tcgagcgtga attattgaaa gctcaaaaag aagaaatacg cgaacaacag aaagtcgaaa 32160

aagaaatcca acaagcgaaa gctaagttgg aaaaagaaga aagacagttc caaaacgaga 32220

tgtctaaact attgaagtat cttaacagcg ctaacaacga ggtcgaacaa aatatatacg 32280

ctgataaaat taaagagctt gaggacaaaa ttaaggagct tgaaaaagat aaagaagacg 32340

ttctcaagcg tgaaagtaac acaagagctg gatttgttta tatcatttcc aatatagggt 32400

cattcggtca aaatgtctac aaaataggta tgacaagaag attagaaccg atggaccgta 32460

tcaatgaatt aagtagtgct tctgttccat ttccatttga tgttcacgct ctaatcttta 32520

gcgaggatgc tcctgctcta gagaatacgc ttcacaatta tttcagagat aaagaagtaa 32580

ataaagtcaa tccacgtaaa gagttcttta aagttgactt gcaagaaatc aaagagcttg 32640

ttcataaaga atataacaat accgtacatt ttactgattt agcagttgcg gaacagtatt 32700

atgaaagcat aaaattaagt tctgaataac aaataaaaaa tccccacact ctccgaacca 32760

tcggccagtc gtggatattt atagggagaa atgccccctg tggtaattga ggagtttaat 32820

aatttaattt gacaattgaa acacatcatg atacaataga gacaatcgaa gtgaatgctc 32880

ccccctggga gccctaaaga gctattgtgt ccgcacagta gctctttttg attttgaggt 32940

aaatatgctg actaaaccat tcaaaactat tgatgaacag attgagattc taaaatccag 33000

aaacctcact ttcctgcatg agccttcagc caaaagaata ttggctactg ttggttacta 33060

cgaacttatc aacggttata aggatattgg tattgagaca ggtgagactt tcaaagatgg 33120

ctttacattt gaacaacttt ttcatgtttt taatatggac aaagaaatcc gctcagcagt 33180

caatgccgcg atacttgaaa tagaagctca tctaagaacc gccctatcct atactgtagc 33240

caaacactac accgcagacc agaatatcta tctgaacaga gaaaactacg aaagagggga 33300

tgataaattt caaacatctc aacgagacaa gttattaaag aaatgtcata aaatcatcaa 33360

cgatgattct catccctata aacattaccg agaaaaacac aaaaacgttc cgccttggat 33420

tctcgtaaaa ggaatgacat ttgggaactt gatagcattc tataaacttc aaaaaagcca 33480

agtgaaatca gaaatagtca gtgaattgac aggtatccca gttgaattag tttctgacga 33540

tttcaagtcc cttatcatta acattctgta cttcctttta gcttaccgaa atcgttgtgc 33600

acaccttgga agggtcttta attttgaaac aaccaaaaac aagattcatt acaacaaatt 33660

attccatgat aggatgaaga taaccgaatc tgaatacaag caaggaaaag gacaatttgg 33720

tctcgcaacc cttgtatcat ccttatcttg gttttcaaca actggagaag tttaccaggt 33780

agtcacaata ctcaatttta aaatacaaga agctatcaac aactatctta aactctaccc 33840

agcagacaaa gattttatct acaatcaatt aggtggagat ttgataccaa tcatataatg 33900

aaggagcact caataaaaaa attacttaca ggaacaatta ctctactatc tgttgtaaca 33960

cttgtagcgt gttctcaatc aaataaaggt a 33991

PCT/RO/134表

Claims (7)

1.一种从自然界分离出的长尾噬菌体科噬菌体Str-SUP-1(保藏号：KCTC13514BP)，其具有杀死猪链球菌的能力，并且具有由SEQ ID NO:1表示的基因组。

2.一种用于预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的组合物，其包括根据权利要求1所述的噬菌体Str-SUP-1(保藏号：KCTC 13514BP)作为活性成分。

3.根据权利要求2所述的组合物，其中，使用所述组合物来制备饲料添加剂、饮用水添加剂或者消毒剂。

4.一种预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法，其包括：

将根据权利要求2所述的包括噬菌体Str-SUP-1(保藏号：KCTC 13514BP)作为活性成分的组合物喷洒到环境中。

5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述组合物为消毒剂的形式。

6.一种预防和治疗由猪链球菌引起的疾病的方法，其包括：

向除人之外的动物给予根据权利要求2所述的包括噬菌体Str-SUP-1(保藏号：KCTC13514BP)作为活性成分的组合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述组合物为饮用水添加剂或者饲料添加剂的形式。

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