CN105695440A - 一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法 - Google Patents

一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN105695440A
CN105695440A CN201610021643.3A CN201610021643A CN105695440A CN 105695440 A CN105695440 A CN 105695440A CN 201610021643 A CN201610021643 A CN 201610021643A CN 105695440 A CN105695440 A CN 105695440A
Authority
CN
China
Prior art keywords
elysin
lyases
streptococcus
lysmp
gene
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201610021643.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105695440B (zh
Inventor
王琰
杨世兴
郑敏
杜杉杉
冷靖
李禹昕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangsu University
Original Assignee
Jiangsu University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangsu University filed Critical Jiangsu University
Priority to CN201610021643.3A priority Critical patent/CN105695440B/zh
Publication of CN105695440A publication Critical patent/CN105695440A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105695440B publication Critical patent/CN105695440B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法；本发明是以lySMP编码区基因序列为模板，通过易错PCR对其进行随机突变，然后将PCR产物与pET-28a(+)连接，在BL21中诱导表达，通过96孔板筛选的方法获得比LySMP活性提高1.8倍的裂解酶elysin；并通过96孔板测定了其最适pH和最适温度；由于裂解酶具有作用迅速、不易产生抗性、与其他抗生素有协同杀菌作用的特点，现已成为一种有潜力的杀菌制剂；利用本发明中所获得裂解酶elysin可以进一步研究裂解酶作为一种有效的杀菌制剂在对抗猪链球菌感染中的作用，以期在猪链球菌的防控方面作出贡献。

Description

一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶
及其制备方法，具体的说是猪链球菌噬菌体裂解酶elysin的制备方法，特别是该裂解酶对猪链球菌SS2-4的抑菌活性是LySMP抑菌活性的1.8倍。
背景技术
猪链球菌病是由多种猪源链球菌(Streptococcussuis)引起的是一种疾病，其中，猪链球菌血清2型的感染能导致仔猪脑膜炎、败血症、关节炎、心内膜炎、肺炎和人的脑膜炎，对公共卫生尤其是相应从业人员的生命安全构成严重威胁。现阶段，对于猪链球菌病的治疗，有效的方法是使用抗生素。但抗生素的滥用能导致猪链球菌病的耐药性问题；应用噬菌体裂解酶（lysin）治疗细菌病是目前解决细菌耐药性的一种有效的方法（噬菌体裂解酶-一种新型的革兰氏阳性菌抗菌物.；FischettiVA.Bacteriophageendolysins:anovelanti-infectivetocontrolGram-positivepathogens[J].InternationalJournalofMedicalMicrobiology.2010,300(6):357-62.）。
裂解酶是噬菌体病毒复制晚期合成的一类细胞壁水解酶，又称内溶素、溶胞壁酶，可以水解宿主菌的肽聚糖结构。它位于穴蛋白（holin）的下游，与穴蛋白一起形成了双链DNA噬菌体的穴蛋白-裂解酶裂解系统，可以破坏细菌细胞壁结构，从而导致宿主菌破裂。
本发明的前期工作已经通过原核表达的方式获得了裂解酶LySMP，并证明该酶具有裂解猪链球菌的活性（纯化的噬菌体裂解酶LySMP：一种能够扩大猪链球菌的裂解谱的酶；WangY,SunJH,LuCP.PurifiedrecombinantphagelysinLySMP:anextensivespectrumoflyticactivityforSwineStreptococci[J].CurrentMicrobiology.2009,58:609-615.）。在此基础上，本发明通过易错PCR的方法对LySMP的基因序列进行随机突变，通过96孔板筛选活性增强的突变株。
经过对现有文献分析，利用易错PCR的方法对LySMP的编码基因进行随机突变，突变产物经原核表达获得了增强的裂解活性，利用该酶和该流程筛选猪链球菌噬菌体裂解酶在国内未见报道。
发明内容
本发明的目的在于对原有的LySMP裂解酶通过易错PCR的方法进行随机突变后，再导入大肠杆菌BL21中进行表达，以期获得对猪链球菌SS2-4裂解活性增高的裂解酶，筛选了一株裂解活性增强的裂解酶elysin。
本发明是通过以下技术方案实现的：
（1）易错PCR扩增裂解酶基因，使之产生随机突变：以LySMP编码区基因序列为模板，通过易错PCR对其进行随机突变；
（2）将步骤（1）获得的PCR产物通过酶切回收插入载体pET-28a(+)中，获得重组质粒；
（3）步骤（2）将所获得的重组质粒导入大肠杆菌BL21中进行表达获得一个裂解酶基因的突变表达文库，通过96孔板筛选具裂解活性的裂解酶并进行纯化；
（4）用96孔板进一步测定所筛选的裂解酶的最适pH和温度。
本发明通过以上方法筛选获得了一株活性增强的裂解酶，命名为elysin，其裂解效率是LySMP对猪链球菌SS2-4裂解效率的1.8倍；elysin的基因序列是发生碱基突变的LySMP蛋白编码序列，elysin的蛋白序列是发生氨基酸突变的LySMP的氨基酸序列。
所述的elysin的基因序列（SEQ.ID.NO.1）是发生碱基突变的LySMP蛋白编码序列，具体的说是LySMP的第286位G→A、第660位T→C、第728位C→A、第860位T→C、第979位T→C，共发生5个碱基突变。
所述的elysin的基因序列，是指编码猪链球菌噬菌体裂解酶的含有1446bp的开放阅读框架。
所述的elysin的蛋白序列（SEQ.ID.NO.2）是发生氨基酸突变的LySMP的蛋白序列，具体的说是LySMP氨基酸序列的第96位Ala→Thr、第243位Ala→Asp、第287位Phe→Ser、第327位Ser→Pro，共发生4个氨基酸突变。
所述的elysin的蛋白序列，是指编码猪链球菌噬菌体裂解酶的481个氨基酸，分子量51.9kD。
本发明的有益效果：
本发明提供的elysin基因序列和蛋白序列是将裂解酶LySMP通过易错PCR的方法筛选所获得的裂解活性增强了一株裂解酶。它对猪链球菌SS2-4的裂解活性是LySMP的1.8倍。裂解酶是一种对细菌有裂解活性的酶类，利用裂解酶治疗细菌病是解决细菌耐药性的一种方法。但是，有些裂解酶的裂解活性不强问题制约了这一方法在治疗细菌病时的有效应用，所以，通过易错PCR的方法筛选活性增强的裂解酶是提高其应用的有效手段。本发明提供的elysin裂解酶活性比LySMP增强，对猪链球菌SS2-4的裂解效率是LySMP的1.8倍，这为裂解酶治疗猪链球菌细菌病的应用打下良好的基础。
由于裂解酶具有作用迅速、不易产生抗性、与其他抗生素有协同杀菌作用的特点，现已成为一种有潜力的杀菌制剂。利用本发明中所获得裂解酶elysin可以进一步研究裂解酶作为一种有效的杀菌制剂在对抗猪链球菌感染中的作用，以期在猪链球菌的防控方面作出贡献。
附图说明
图1为重组表达elysin裂解酶的SDS-PAGE分析结果；图中：1为蛋白Marker；2为未加IPTG诱导的表达裂解酶elysin的大肠杆菌BL21；3为加IPTG诱导的表达裂解酶elysin的大肠杆菌BL21。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列事实例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册（NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1：Elysin的原核表达和纯化
（1）elysin表达载体的构建：
根据GenBank上SMP的裂解酶序列(GenBank序列号EF116926.2)，合成LySMP（GenBank序列号ABK91888.1）编码基因序列，设计error-pronePCR的引物Pl、P2，分别在5′端和3′端插入限制性内切酶EcoRI和XhoI的酶切位点，引物序列如下：
P1：5′-GAGGAATTCATGACAATCAACAT-3′；
P2：5′-GCGCTCGAGAACGAATAAACTAC-3′
采用易错PCR扩增试剂盒（上海博耀生物科技有限公司，即用型易错PCR试剂盒V1.2）对LySMP的编码基因序列进行扩增，使碱基突变频率控制于<1％。
PCR反应体系：
易错PCRMix，10×5μL
易错PCR专用dNTP，10×5μL
MnCl2,5mM5μL
LySMP基因2μL
引物P1，10μM1μL
引物P2，10μM1μL
TaqDNA聚合酶（5U/μL）1μL
补水到50μL
PCR反应程序如下：
94℃预变性5min，循环程序：95℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸1min40s，循环30次。
将扩增的PCR产物经EcoRI和XhoI酶切后插入pET-28a(+)载体（Novagen公司），转入BL21感受态细胞（天根生化科技有限公司）中，37℃培养过夜。经抗性筛选（50ug/mL卡那霉素）后，挑取平板上的单克隆，提取质粒，用限制性内切酶EcoRI和XhoI双酶切鉴定重组子是否构建成功。
（2）96孔板筛选活性增强的突变株：
将LySMP的基因插入pET-28a(+)载体中导入BL21宿主菌表达，以此细菌单克隆作为对照。挑取对照组单克隆和步骤（1）所述平板上的单克隆菌落分别接种到含LB培养基的96孔板中37℃培养过夜；将培养的菌液100μL再次接种新的96孔板，用PBS缓冲液调整菌液的OD600至0.5，37℃培养1h。用终浓度为1mmol/LIPTG于30℃诱导4h后，将96孔板离心，去除上清，将细菌沉淀反复冻融后加入PBS缓冲液100μL，吸取上层清液转入新的96孔板中，再加入用PBS溶解的OD600为1.0的猪链球菌菌株SS2-4100μL（参照：纯化的噬菌体裂解酶LySMP：一种能够扩大猪链球菌的裂解谱的酶；WangY,SunJH,LuCP.PurifiedrecombinantphagelysinLySMP:anextensivespectrumoflyticactivityforSwineStreptococci[J].CurrentMicrobiology.2009,58:609-615.，由南京农业大学惠赠）至该96孔板，37℃反应30min后读取OD600数值。OD600小于对照的菌落单克隆即为筛选的菌落的菌液，用于下一步实验。
（3）裂解酶的纯化：
将步骤（2）中得到的OD值小于对照的96孔板中的菌液每个接种到1L含50μg/mL卡那霉素抗性的LB培养基中，经终浓度为1mmol/LIPTG诱导后，用10mMPBS（pH7.2）洗涤一次离心，将沉淀溶于25mL预冷的裂解缓冲液（50mM磷酸钠缓冲液，pH8.0），超声破碎，超声功率为4.5W，工作5s，间隔10s，30个循环；超声后，将细菌悬浮物8000g离心，取上清，以8个柱体积的裂解缓冲液洗Ni2+柱使OD280<0.1，用预冷的洗涤缓冲液A（50mM磷酸钠缓冲液+5mM咪唑溶液）洗柱，直至OD280<0.1；再用预冷的洗涤缓冲液B（50mM磷酸钠缓冲液+20mM咪唑溶液）洗柱，直至OD280<0.1；最后用溶出液（50mM磷酸钠缓冲液+250mM咪唑溶液）洗柱，收集的洗脱液，即为纯化的裂解酶，以BCA蛋白浓度测定试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）测定蛋白浓度，本发明所筛选到的菌落获得的纯化后的裂解酶浓度为0.12-0.35mg/mL。
（4）突变裂解酶活性增强的验证：
将猪链球菌SS2-4离心后用PBS缓冲液调节OD600至1.0-1.2，将其加入96孔板中，每孔100μL；再将步骤（3）中获得的纯化裂解酶用PBS缓冲液调至浓度为50μg/mL，取100μL加入有上述猪链球菌SS2-4的96孔板中，每种纯化的裂解酶各做3个重复；空白对照为PBS缓冲液加入到有上述猪链球菌SS2-4的96孔板中；并且用50μg/mL的LySMP裂解酶（参考：WangY,SunJH,LuCP.PurifiedrecombinantphagelysinLySMP:anextensivespectrumoflyticactivityforSwineStreptococci[J].CurrentMicrobiology.2009,58:609-615.）加入有上述猪链球菌SS2-4的96孔板中做为参照。37℃反应30min，测定OD600值，纯化裂解酶OD600的数值小于参照的，即为活性增强的裂解酶。
结果表明，本发明筛选得到一株活性增强的裂解酶，命名为elysin。
此步骤筛选到的裂解酶elysin，它可以在37℃，30min内使SS2-4的OD600值下降64.2%，而LySMP使SS2-4的OD600值下降35.78%，elysin对猪链球菌SS2-4的的裂解效率是LySMP的裂解效率的1.8倍。
（5）SDS-PAGE电泳：
配制14%的分离胶和5%的浓缩胶。将表达有elysin的BL21细菌（加IPTG诱导和未加IPTG诱导）用上样缓冲液在水中煮沸4min。浓缩胶电压80V，分离胶电压136V。电泳4-5h。
考马斯亮兰染色2h。
脱色液脱色观察，在51.9KD处有明显的条带出现。见附图1。
将筛选到的裂解酶elysin基因送生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序鉴定，测序结果表明：
所述的elysin的基因序列（SEQ.ID.NO.1）是指编码猪链球菌噬菌体裂解酶的含有1446bp的开放阅读框架序列；是发生碱基突变的LySMP蛋白编码序列，具体的说是LySMP的第286位G→A、第660位T→C、第728位C→A、第860位T→C、第979位T→C，共发生5个碱基突变。
所述的elysin的蛋白序列（SEQ.ID.NO.2）是指编码猪链球菌噬菌体裂解酶的481个氨基酸序列，分子量51.9kD；是发生氨基酸突变的LySMP的蛋白序列，具体的说是LySMP氨基酸序列的第96位Ala→Thr、第243位Ala→Asp、第287位Phe→Ser、第327位Ser→Pro，共发生4个氨基酸突变。
实施例2：Elysin最佳pH和温度的确定
操作方法参照文献：WangY,SunJH,LuCP.PurifiedrecombinantphagelysinLySMP:anextensivespectrumoflyticactivityforSwineStreptococci[J].CurrentMicrobiology.2009,58:609-615.
将猪链球菌SS2-4离心，分别用20mMpH4.0醋酸钠缓冲液、20mMpH5.2醋酸钠缓冲液、10mMpH6.8磷酸盐缓冲液、10mMpH7.2磷酸盐缓冲液和20mMTris-ClpH8.5处理，用以上各缓冲液调节细菌OD600为1.0-1.2。将上述细菌悬液加入96孔板中，每孔100μL。取100μL50μg/mL纯化的裂解酶加入96孔板中，每种缓冲液各做3个重复，用PBS缓冲液作为空白对照。37℃反应30min，测定使猪链球菌SS2-4的OD600下降最低的pH值，即为最佳pH值。
然后分别在4℃、18℃、25℃、37℃、42℃作用30min，每种温度各做3个重复，其余步骤同上，测定使使猪链球菌SS2-4的OD600下降最低的温度值，即为最佳温度。
结果显示，elysin在pH7.2和37℃下发挥最高的裂解活性。
在具体实施中，本发明提供的突变裂解酶elysin具有比LySMP更高的抑菌活性，elysin对猪链球菌SS2-4的裂解活性是LySMP的1.8倍。进一步对elysin的最适pH和最适温度的实验得知，该酶在pH7.2和37℃下发挥最高的裂解活性。
SEQUENCELISTING
<110>江苏大学
<120>一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法
<130>一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法
<160>2
<170>PatentInversion3.5
<210>1
<211>1446
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
atgacaatcaacattgaaacagctatccgctggatgacggaccgtgtcggtcttgttaag60
tattccatggactatcgaaatggaccaaattcttttgactgctccagctcagtctactat120
gctctcatggctggtggtgctatctcagcaggctgggcggtcaatactgaatatgagcat180
gattggctcatcaagaatggctacaagttaattgctgaaaatcaggactgggacgctaag240
cgtggggatatttttatctggggccgtcgtggacagtctagcggtactggtggtcatact300
ggtatttttgtagatccagataatatcatccactgtaattatgccaacaacagcattacc360
atcaacaattacaatcaaacagcggcagctagtggttggatgtattgctatgtttaccgc420
ttgggtaaccaacccacaactagcccagcaggaaaaactcttgatacattggttaaagag480
actcttgctggaaaatacggaaacggagatcagcggaaagcagctcttggtaatcaatat540
gaggctgtcatggcagtcatcaatggcaaagctacggcacctaaaaagactgttgaccaa600
ctggctcaagaagtgattcaggggaaacatggcaacggtgaagaccgtaaaaaatccctc660
ggtcctgactatgacgcagttcaaaaacgtgtaactgaaatcctgcaaggtagcacatca720
ggaaatgaccctaaactggcctcagacgctccaaaaaatgaggtggtaaattcctccacc780
gaacctaagacagaggaaacttgggcaactggtaaagcgacagataccaaaatcactaaa840
gaagatggtgacttgtcctctaacggtgcaatcctgaaaaaatctgtccttgatgttatc900
cttgctaactgtaagaaacatgatatccttccaagctatgctttgaccattctgcactat960
gaaggcctttggggaactccagccgtaggcaaggctgacaacaactggggaggcatgaca1020
tggactggtaaaggagagcgtccaagtggtgtgactgtcacccaaggaacagcaagacca1080
gcttgcgagggtggacattatatgcactatgcctctgtagatgactttcttacagattgg1140
ttctacctgctacgttcaggaggtagctacaaggtttcaggagccaagaccttttcagat1200
gctgtcaagggtatgtttaagataggcggtgcagtctatgattatgctgctagtggattt1260
gacagctacattatcggagcgtcaagccgtctgaaagctatcgaggcagaaaatggatca1320
ttggacaagttcgataaacagaccgtcacggatgtcggtcagtctgacaaaatcgaagta1380
accattgaggggattgaaatttcaatcaatggcgttacctacacactttcaaaaaaacca1440
gtttaa1446
<210>2
<211>481
<212>PRT
<213>人工序列
<400>2
MetThrIleAsnIleGluThrAlaIleArgTrpMetThrAspArgVal
151015
GlyLeuValLysTyrSerMetAspTyrArgAsnGlyProAsnSerPhe
202530
AspCysSerSerSerValTyrTyrAlaLeuMetAlaGlyGlyAlaIle
354045
SerAlaGlyTrpAlaValAsnThrGluTyrGluHisAspTrpLeuIle
505560
LysAsnGlyTyrLysLeuIleAlaGluAsnGlnAspTrpAspAlaLys
65707580
ArgGlyAspIlePheIleTrpGlyArgArgGlyGlnSerSerGlyThr
859095
GlyGlyHisThrGlyIlePheValAspProAspAsnIleIleHisCys
100105110
AsnTyrAlaAsnAsnSerIleThrIleAsnAsnTyrAsnGlnThrAla
115120125
AlaAlaSerGlyTrpMetTyrCysTyrValTyrArgLeuGlyAsnGln
130135140
ProThrThrSerProAlaGlyLysThrLeuAspThrLeuValLysGlu
145150155160
ThrLeuAlaGlyLysTyrGlyAsnGlyAspGlnArgLysAlaAlaLeu
165170175
GlyAsnGlnTyrGluAlaValMetAlaValIleAsnGlyLysAlaThr
180185190
AlaProLysLysThrValAspGlnLeuAlaGlnGluValIleGlnGly
195200205
LysHisGlyAsnGlyGluAspArgLysLysSerLeuGlyProAspTyr
210215220
AspAlaValGlnLysArgValThrGluIleLeuGlnGlySerThrSer
225230235240
GlyAsnAspProLysLeuAlaSerAspAlaProLysAsnGluValVal
245250255
AsnSerSerThrGluProLysThrGluGluThrTrpAlaThrGlyLys
260265270
AlaThrAspThrLysIleThrLysGluAspGlyAspLeuSerSerAsn
275280285
GlyAlaIleLeuLysLysSerValLeuAspValIleLeuAlaAsnCys
290295300
LysLysHisAspIleLeuProSerTyrAlaLeuThrIleLeuHisTyr
305310315320
GluGlyLeuTrpGlyThrProAlaValGlyLysAlaAspAsnAsnTrp
325330335
GlyGlyMetThrTrpThrGlyLysGlyGluArgProSerGlyValThr
340345350
ValThrGlnGlyThrAlaArgProAlaCysGluGlyGlyHisTyrMet
355360365
HisTyrAlaSerValAspAspPheLeuThrAspTrpPheTyrLeuLeu
370375380
ArgSerGlyGlySerTyrLysValSerGlyAlaLysThrPheSerAsp
385390395400
AlaValLysGlyMetPheLysIleGlyGlyAlaValTyrAspTyrAla
405410415
AlaSerGlyPheAspSerTyrIleIleGlyAlaSerSerArgLeuLys
420425430
AlaIleGluAlaGluAsnGlySerLeuAspLysPheAspLysGlnThr
435440445
ValThrAspValGlyGlnSerAspLysIleGluValThrIleGluGly
450455460
IleGluIleSerIleAsnGlyValThrTyrThrLeuSerLysLysPro
465470475480
Val

Claims (6)

1.一种猪链球菌噬菌体裂解酶elysin，其氨基酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。
2.编码权利要求1所述猪链球菌噬菌体裂解酶的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示。
4.一种猪链球菌噬菌体裂解酶的制备方法，其特征在于，按照以下步骤进行：
（1）易错PCR扩增裂解酶基因，使之产生随机突变；
（2）将步骤（1）获得的PCR产物通过酶切回收插入载体pET-28a(+)中，获得重组质粒；
（3）步骤（2）将所获得的重组质粒导入大肠杆菌中进行表达获得一个裂解酶基因的突变表达文库，通过96孔板筛选具裂解活性的裂解酶并进行纯化；
（4）用96孔板进一步测定所筛选的裂解酶的最适pH和温度。
5.根据权利要求4所述的一种猪链球菌噬菌体裂解酶的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述的易错PCR是以lySMP编码区基因序列为模板。
6.一种猪链球菌噬菌体裂解酶在制备杀灭猪链球菌的杀菌制剂中的应用。
CN201610021643.3A 2016-01-14 2016-01-14 一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法 Active CN105695440B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610021643.3A CN105695440B (zh) 2016-01-14 2016-01-14 一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610021643.3A CN105695440B (zh) 2016-01-14 2016-01-14 一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105695440A true CN105695440A (zh) 2016-06-22
CN105695440B CN105695440B (zh) 2019-12-31

Family

ID=56227222

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610021643.3A Active CN105695440B (zh) 2016-01-14 2016-01-14 一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105695440B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111226986A (zh) * 2020-01-20 2020-06-05 上海交通大学 含养殖环境噬菌体组合物的喷雾消毒剂、其制备方法和应用
CN112368373A (zh) * 2018-06-04 2021-02-12 尹特荣生物科技株式会社 新型猪链球菌噬菌体str-sup-3及其在抑制猪链球菌细菌增殖方面的用途
CN112437810A (zh) * 2018-06-04 2021-03-02 尹特荣生物科技株式会社 新型猪链球菌噬菌体str-sup-2及其在抑制猪链球菌细菌增殖方面的用途
CN113166730A (zh) * 2018-06-04 2021-07-23 尹特荣生物科技株式会社 新型猪链球菌噬菌体str-sup-1及其在抑制猪链球菌细菌增殖方面的用途
CN113201523A (zh) * 2021-05-17 2021-08-03 吉林大学 一种特异性杀灭猪链球菌的基因工程裂解酶及医用用途
CN116640754A (zh) * 2023-07-21 2023-08-25 临沂大学 一种链球菌前噬菌体裂解酶lys224及应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101671662A (zh) * 2009-10-30 2010-03-17 上海交通大学 裂解多种血清型猪链球菌的裂解酶的制备方法
CN102121420A (zh) * 2010-01-07 2011-07-13 通用电气公司 用于燃气涡轮的温度启动阀

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101671662A (zh) * 2009-10-30 2010-03-17 上海交通大学 裂解多种血清型猪链球菌的裂解酶的制备方法
CN102121420A (zh) * 2010-01-07 2011-07-13 通用电气公司 用于燃气涡轮的温度启动阀

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Y.WANG 等: "Purified Recombinant Phage Lysin LySMP: An Extensive Spectrum of Lytic Activity for Swine Streptococci", 《CURR MICROBIOL》 *
王琰: "猪链球菌噬菌体SMP裂解酶和受体研究", 《中国博士学位论文全文数据库》 *
黄庆庆 等: "高效广谱猪链球菌7型前噬菌体裂解酶的挖掘及活性研究", 《微生物学通报》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112368373A (zh) * 2018-06-04 2021-02-12 尹特荣生物科技株式会社 新型猪链球菌噬菌体str-sup-3及其在抑制猪链球菌细菌增殖方面的用途
CN112437810A (zh) * 2018-06-04 2021-03-02 尹特荣生物科技株式会社 新型猪链球菌噬菌体str-sup-2及其在抑制猪链球菌细菌增殖方面的用途
CN113166730A (zh) * 2018-06-04 2021-07-23 尹特荣生物科技株式会社 新型猪链球菌噬菌体str-sup-1及其在抑制猪链球菌细菌增殖方面的用途
CN113166730B (zh) * 2018-06-04 2023-06-06 尹特荣生物科技株式会社 新型猪链球菌噬菌体str-sup-1及其在抑制猪链球菌细菌增殖方面的用途
CN111226986A (zh) * 2020-01-20 2020-06-05 上海交通大学 含养殖环境噬菌体组合物的喷雾消毒剂、其制备方法和应用
CN113201523A (zh) * 2021-05-17 2021-08-03 吉林大学 一种特异性杀灭猪链球菌的基因工程裂解酶及医用用途
CN116640754A (zh) * 2023-07-21 2023-08-25 临沂大学 一种链球菌前噬菌体裂解酶lys224及应用
CN116640754B (zh) * 2023-07-21 2023-10-10 临沂大学 一种链球菌前噬菌体裂解酶lys224及应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN105695440B (zh) 2019-12-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105695440A (zh) 一种抑菌活性增强的猪链球菌噬菌体裂解酶及其制备方法
CN105543193B (zh) 一种n-酰基高丝氨酸内酯酶及其编码基因和重组菌
CN103436514B (zh) 一种耐热裂解酶TSPpgh和编码此酶的多核苷酸
CN104531672A (zh) 具有改善的噬菌体抗性的培养物
CN104593346B (zh) 一种来源于副溶血弧菌噬菌体的内溶素及其应用
CN114540330B (zh) 一种碱性蛋白酶突变体AprBpM及其应用
CN106967659A (zh) 一种表达谷氨酸脱羧酶的无抗生素抗性重组枯草芽孢杆菌的构建及发酵方法
CN104830825B (zh) 一种来源于沙门氏菌噬菌体的内溶素及其应用
CN107083351A (zh) 无毒修饰的鸡沙门氏菌菌株和利用其的药物组合物
CN110423833A (zh) 一种基于特异性靶标鉴定单增李斯特菌血清型的多重pcr方法
CN107828769A (zh) 一种耐热裂解酶MMPpgh和编码此酶的多核苷酸
CN108384771A (zh) 一种提高比活力的碱性蛋白酶突变体及其编码基因
CN102198265B (zh) 应用噬菌体裂解酶降解猪链球菌生物被膜的方法
CN107267545A (zh) 重组Bsa I限制性内切酶的制备方法
CN108048582A (zh) 一种利用lamp引物组定量快速检测原料乳中产耐热蛋白酶的荧光假单胞菌方法
Boyer et al. Bacteriophage prevalence in the genus Azospirillum and analysis of the first genome sequence of an Azospirillum brasilense integrative phage
CN107446873A (zh) 促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌及其构建和应用
JP2010512774A (ja) バクテリオファージのスクリーニング蛋白質へのランダム配列挿入により改変されたバクテリオファージの作製方法
CN105950596A (zh) 一种双功能酸性脲酶基因及其表达与应用
JP2010512774A5 (zh)
Wijayanti et al. DNA Barcoding of Swamp Sediment Bacterial Isolates for Swamp Aquaculture Probiotic
CN101671662A (zh) 裂解多种血清型猪链球菌的裂解酶的制备方法
CN103911337A (zh) 高粘附性丁酸梭菌及其制备方法
Sitdhipol et al. Characterization of alkaline phosphatase producing bacteria isolated from Thai fermented fish products
CN113801831B (zh) 一株高产中性蛋白酶的枯草芽孢杆菌及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant