CN107446873A - 促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌及其构建和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及农业微生物领域，具体地说是一种小麦促生茎瘤固氮根瘤菌及其构建和应用。本发明菌株具有良好的固氮、定植与促生特性，可以增加土壤养分，提高肥料有效性，促进植物对土壤养分吸收，具有开发成促进农作物生长的微生物接种剂或微生物菌肥的良好前景。本发明针对小麦具有显著的促生效果，菌株良好地促生特性促进了小麦生长。

Description

促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌及其构建和应用
技术领域
本发明涉及农业微生物领域，具体地说是一种小麦促生茎瘤固氮根瘤菌及其构建和应用。
背景技术
小麦为禾本科植物，是我国最主要的粮食作物之一，播种面积达粮食作物总面积的22％，小麦产量达到粮食总产量的20％以上。小麦作为我国主要的商品粮和贮备粮品种，在对稳定我国经济发展趋势和促进人民生活水平提高上有重要意义。
当前，我国土地资源匮乏，并伴随着全球气候异常、灌溉设施落后等土地资源的不合理利用方式，导致土壤盐碱化程度不断加深，此外，我国占全球8％的耕地消耗了世界30％以上的化肥，长期的过度施肥带来环境污染、土壤板结、生态恶化和农产品品质下降等一系列问题。因此，适应绿色农业以及农业可持续发展的需求，开发利用替代化学肥料的新肥源成为当务之急。
植物根际促生菌是指生存在根际土壤或附生于根表、根内，并可直接或间接促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。接种根际促生菌，不但能够减少化肥农药的使用，也能减轻因大量使用化肥农药而造成的环境污染和食品安全问题。促生菌茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans ORS571)属于杆菌，其细胞直径大于2.0μm且长短不一，呈卵圆状或类球状，其宿主特异性很强，目前只发现与毛萼田菁(Sesbania rostrata)形成共生结构。该菌不同于其它根瘤菌，除了可以与豆科宿主毛萼田菁共生固氮，还可自生或作为内生菌在其他植物的体内联合固氮。目前，人们已经对茎瘤固氮根瘤菌对小麦的促生作用和互作机制进行了研究，并证实其可被应用于农业，尤其是小麦生产。
发明内容
本发明目的在于提供一种小麦促生茎瘤固氮根瘤菌及其构建和应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌，茎瘤固氮根瘤菌为敲除趋化基因cheZ的茎瘤固氮根瘤菌。其中，出发菌株可为ORS571。
一种促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌的构建方法，：
(1)分别扩增茎瘤固氮根瘤菌cheZ基因上游的cheZ-Up和下游的cheZ-Down片段；
(2)构建敲除表达重组质粒pCM351::Up-Down。
(3)将上述获得重组质粒通过三亲结合导入茎瘤固氮根瘤菌(出发菌株)；
(4)使用分别含有庆大霉素和四环素抗性的TY固体培养基筛选阳性结合子，并通过PCR验证获得茎瘤固氮根瘤菌趋化基因cheZ敲除的茎瘤固氮根瘤菌株。
所述将上述获得重组质粒通过三亲结合导入茎瘤固氮根瘤菌为将茎瘤固氮根瘤菌、含有重组质粒的DH5α供体菌和含有辅助质粒pRK2013的DH5α辅助菌在LB固体培养基，37℃条件下培养48h进行三亲结合。
具体为：
将上述获得重组质粒通过三亲结合导入茎瘤固氮根瘤菌为将茎瘤固氮根瘤菌、含有重组质粒的DH5α供体菌和含有辅助质粒pRK2013的DH5α辅助菌分别在TY和LB液体培养基中37℃条件下过夜培养。将受体菌、供体菌和辅助菌分别按照1ml、200ul、300ul的比例进行混合，3500rpm离心3min，倒掉上清，将剩余约50ul混合菌液悬滴到LB固体培养基，37℃条件下培养48h进行三亲结合。
所述茎瘤固氮根瘤菌通过三亲结合导入重组质粒pCM351::Up-Down后，重组质粒与基因组自发进行同源重组。将重组后的结合子分别在含有庆大霉素和四环素的TY固体培养基上培养。在含有庆大霉素的TY培养基上生长，而在含有四环素培养基上不能生长的菌株为阳性结合子，进一步通过PCR进行验证。
一种促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌的应用，所述茎瘤固氮根瘤菌在用于促进小麦生长中的应用。
所述茎瘤固氮根瘤菌株在促进小麦生长中作为接种剂或微生物菌肥中的应用。
培养至OD600为1的所述茎瘤固氮根瘤菌作为接种剂(促生剂)或微生物菌肥。
具体：
在TY培养基中培养的趋化基因cheZ敲除的茎瘤固氮根瘤菌株作为作为接种剂(促生剂)或微生物菌肥浸泡发芽的小麦种子，时间为30分钟，后将小麦种子转移种灭菌的拌有低氮-磷酸钙培养液，并于室温下培养，进而促进小麦生长。
所述灭菌的0.3％琼脂的半固体低氮-磷酸钙培养基盛装于50ml体积三角瓶中；所述低氮-磷酸钙培养基成分为每升体积中柠檬酸铁(ferric citrate)0.075g，Ca(NO3)20.03g,KCl 0.075g，MgSO4·7H2O 0.06g，Ca3(PO4)2 5g,CaSO4 0.46g，微量元素1mL。所述每升微量元素组分为H3BO3 2.86g,MnSO4 1.81g，CuSO4·5H20 0.8g，ZnSO4 0.22g,H2MoO40.02g，pH至7.0。
所述室温培养的条件为温度控制在26±2℃，光照周期12h:12h。
本发明所具有的优点：
本发明茎瘤固氮根瘤菌AC601具有自生固氮、增加定植率的促生特性，可以增加土壤养分，提高肥料有效性，促进植物对氮养分吸收，可开发成促进农作物生长的微生物接种剂或微生物菌肥，接种30分钟后茎瘤固氮根瘤菌AC601的定植效率比ORS571高32％。进而本发明所获得菌株对小麦具有显著的促生效果，菌株良好地促生特性促进了小麦根部和地上部的生长。接入菌株AC601的小麦地上部和根部干重分别增长30％和88％，鲜重分别增长54％和22％，均优于接入菌株ORS571的促生效果，且对根部的促生效果尤为明显，试验中没有可见的病变表征。另外，在营养相对缺乏的培养环境下，该根际促生菌能显著地促进小麦的生长。
附图说明
图1是本发明实施例提供的出发株ORS571和突变株AC601的cheZ验证引物PCR扩增片段的1％琼脂糖凝胶电泳条带，其中，第1,2泳道为以ORS571和AC601基因组为模板，用cheZ上下游验证引物PCR扩增的条带。第4,5泳道分别以ORS571和AC601基因组为模板，用cheZ上游引物的F和内部引物cheZ-mid-R为引物对进行PCR扩增。第3泳道到2K-plusmaker。关键条带的大小在图中标出，并用箭头指示。
图2是本发明实施例提供的出发株和突变株在TY液体培养基中的生长曲线。其中，圆点表示出发株，正方形表示突变株。
图3是本发明实施例提供的出发株和突变株的趋化圈形成。
图4为本发明实施例提供的出发株和突变株竞争性定植小麦的比例图。
图5为本发明实施例提供的出发株和突变株分别单独形成根瘤的固氮能力测定。
图6为本发明实施例提供的温室培养18天后，接菌小麦与不接菌小麦生长状况对比照片。
图7为本发明实施例提供的温室培养18天后，接菌(包括出发株和突变株)小麦与不接菌小麦的八项促生指标比较。(*代表P<0.05，**代表P<0.01)。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步对本发明进行说明，不能理解为是对本发明的限制，实施例中使用的材料、试剂，仪器设备如无特殊说明，均可从商业途径得到。
菌株和质粒
茎瘤固氮根瘤菌ORS571由Toshihiro Aono馈赠，该菌株已经保藏，同时可以市购获得，并有大量文献记载该现有菌株,保藏信息为德国菌种保藏中心DSMZ，Azorhizobiumcaulinodans ORS571，DSM No.:5975；以及文献为Dreyfus,B.,Garcia,J.L.,Gillis,M.(1988).Characterization of Azorhizobium caulinodans gen.nov.a stem nodulatingnitrogen-fixing bacterium isolated from Sesbaniarastrata..Int.J.Syst.Bacteriol.38:89-98。克隆质粒pEASY Simple Vector购买于全式金公司，是具有卡那霉素(Kna.R)和氨苄青霉素抗性(Amp.R)的线性质粒载体。
培养基
(1)TY培养基:胰蛋白胨5g，酵母粉3g，CaCl2 0.66g(固体培养基加琼脂粉15g)，PH7.0，121℃，0.1MPa，灭菌30min。
(2)Hoagland半固体培养基：Ca(NO3)2 0.82g,KNO3 0.51g,MgSO4·7H2O 0.49g,KH2PO4 0.136g,Fe-EDTA 1ml,微量元素营养液1ml,琼脂3g，H2O 1000ml。
(3)L3半固体培养基：50％乳酸钠20ml，1M的K-Pi buffer 10ml，1000×Mg-Na-MoMix 1ml，1M的NH4CL 10ml(无氮培养基不加)，加水补充至1L(固体培养基加琼脂粉15g)，PH调为7.0，高压灭菌；待灭菌后冷却至40℃左右，分别加入1000×CaCl2 1ml、1000×FeCl31ml、1000×Vitamin mix 1ml
(4)LB培养基(1L)：胰蛋白胨10g,酵母提取物5g，氯化钠10g,琼脂粉15g。pH 7.0-7.2，121℃灭菌20min。
寡聚核苷酸引物
表1实施例中使用到的引物
引物名称 序列(5’→3’) 备注
CheZ-Up-F GGGGTACCTGCCCTTCAGCGTCTGC cheZ上游片段扩增
CheZ-Up-R GGAATTCCATATGGCGTCCTGGATCGTCTC cheZ上游片段扩增
CheZ-Down-F GACCGGTCGACCGACGAGAATGTGG cheZ下游片段扩增
CheZ-Down-F CGAGCTCGCTGCCGATCCTCTATGC cheZ下游片段扩增
cheZ-Com-F GGGGTACCGAAATCACGAGGCCGTAC cheZ突变验证
cheZ-Com-R CGGGATCCCATCCATCAAGCCAGCAA cheZ突变验证
CheZ-Mid-R GAAAATGCGGACGATCTG cheZ突变验证
实施例1茎瘤固氮根瘤菌趋化基因cheZ上下游片段的扩增。
用Tiangen细菌基因组DNA提取试剂盒提取茎瘤固氮根瘤菌ORS571的基因组DNA,提取方法参照内附说明书，提取样品通过Nanodrop 2000测定浓度，并保存于-20℃备用。以提取的基因组DNA作为模板，并用CheZ-Up-F和CheZ-Up-R引物扩增趋化基因cheZ(Genebank:AZC_0621)的上游片段cheZ-Up(785bp)；
用CheZ-Down-F和CheZ-Down-R引物扩增趋化基因cheZ的下游片段cheZ-Down(726bp)；
上述扩增采用Taraka DNA polymerase PCR 50uL体系：10uL 5×GC buffer，4uLdNTP，1uL上游引物，1uL下游引物，1uL提取的DNA，0.5uL Taraka Primestar高保真酶，32.5uL灭菌超纯水。PCR反应条件为：95℃变性5min；94℃变性1min，58℃退火1min，72℃延伸1min，从第二步开始30个循环。
将扩增得到的目的片段通过1％琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，大小与设计长度无异。PCR产物序列测定委托北京奥科鼎盛生物技术有限公司完成，测序后通过Lasergene软件进行序列比对，扩增片段(包括酶切位点)与设计片段同源性100％。
实施例2同源重组载体的构建—构建重组质粒pCM351::Up-Down。
利用全式金公司pEASY Simple载体试剂盒将PCR扩增到的上游片段cheZ-UP按pEASY Simple试剂盒说明书条件进行反应，连接到pEASY Simpe上。之后将连接到pEASYSimpe质粒上的cheZ-Up和市购的重组载体pCM351分别用KpnI和NdeI限制性内切酶酶切。然后用1％琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，分别通过全式金胶回收试剂盒纯化回收。再将回收的目的基因片段和载体片段按照5:1(载体量为1)的摩尔比例混合，用Thermofisherscientific T4连接酶，16℃过夜连接。连接后，42℃热激转化大肠杆菌，利用含有庆大霉素和四环素的LB固体培养基筛选阳性重组子，并进一步通过PCR扩增和测序验证连接正确，测序部分委托北京奥科鼎盛生物技术有限公司完成。对连接正确目的片段的pCM351:cheZ-Up，待用；
进一步，将PCR扩增的cheZ-Down片段连到pEASY Simpe克隆质粒上，方法同上。连接cheZ-Down的pEASAY Simple质粒与pCM351:cheZ-Up质粒分别用AgeI和SacI进行双酶切，而后胶回收cheZ-Down片段和线性化的pCM351:cheZ-Up，用Thermofisher scientific T4连接酶，16℃过夜连接，连接后转化至DH5α大肠杆菌中，并利用含有庆大霉素和四环素抗性的LB固体培养基进行筛选阳性克隆。最后将含有pCM351:Up-Down的阳性克隆委托北京奥科鼎盛生物技术有限公司完成测序，经比对序列无误后，备用。
实施例3：茎瘤固氮根瘤菌ORS571的三亲结合和重组茎瘤固氮根瘤菌ORS571的鉴定。
1、三亲结合获得结合子。茎瘤固氮根瘤菌ORS571为受体菌；含有重组载体pCM351:Up-Down的大肠杆菌为供体菌；含有pRK2013辅助质粒的大肠杆菌为辅助菌。通过受体菌、供体菌和辅助菌之间的三亲结合过程将重组质粒pCM351:Up-Down转入茎瘤固氮根瘤菌ORS571中。具体操作如下：
(1)将受体菌ORS571在TY固体培养基上活化(含NaI和Amp抗性)，37℃温箱中培养2天左右，挑取单菌落于5mlTY液体培养基中(含NaI和Amp抗性)，37℃摇床中以200rpm转速培养20h左右；
(2)把含有PCM351：：up-down质粒的DH5α大肠杆菌接种到含庆大霉素和四环素抗性的LB固体平板上，含有辅助质粒PRK2013的DH5α大肠杆菌接种到含有卡那霉素抗性的LB固体平板上，分别于37℃条件下过夜培养。第二天分别从平板上挑取单菌落接种于含抗生素的LB液体培养基中，所含抗生素种类、浓度与对应的LB固体平板保持一致。37℃，200rpm摇床中培养12h；
(3)过夜培养的受体菌、供体菌和辅助菌分别取1ml，室温条件下3500rpm离心3min，倒掉上清液，再用TY液体培养基清洗菌体两次；
(4)将清洗后受体菌、供体菌和辅助菌分别按照1ml、200ul、300ul的比例进行混合，颠倒混匀，3500rpm室温离心1min，倒掉上清后剩余约50μl的液体，轻轻吹打沉淀菌体使其悬浮；
(5)将上述获得混合悬浮液悬滴到无抗性的TY固体平板中央，待菌液吸干后于37℃培养箱中倒置培养1-2d；
2、上述获得的重组茎瘤固氮根瘤菌ORS571结合子的鉴定。将经过三亲结合的ORS571菌株进行分离，鉴定正确的阳性克隆。具体的操作步骤如下：
(1)将TY平板三亲结合后的混合三种菌的菌苔用移液枪刮取到装有1ml无菌水的EP管中，并用移液器枪吹打混匀，然后用无菌水或过滤除菌的磷酸缓冲液稀释成不同梯度(10-1，10-2，10-3)；
(2)取不同稀释梯度的悬浮液各100μl(原液、10-1，10-2，10-3)，涂布于含庆大霉素、萘啶酮酸和氨苄霉素三种抗性的TY固体培养基上，于37℃培养箱中倒置培养1-2d；
(3)挑取单菌落，同一菌落分别先后划线于含庆大霉素、萘啶酮酸、氨苄霉素和四环素四种抗性，和含庆大霉素、萘啶酮酸和氨苄霉素三种抗性的TY平板上，37℃培养1-2d后，将四抗和三抗平板上接种的同一单菌落做对比，取在三抗平板上能正常生长而在三抗平板上不能正常生长的单菌落。将筛选得到的结合子作为潜在基因敲除突变株，待进一步验证；
(4)取位于敲除基因cheZ的上下游片段中的部分序列作为上下游引物和内部已交换部分的序列作为内部引物分别对上述获得的结合子做菌落PCR验证，上下游引物对为cheZ-Com-F和cheZ-Com-R，内部引物对为cheZ-Com-F和cheZ-Mid-R。以野生型菌株ORS571做对照，内部引物扩增，如果野生型能扩增出大小对应的片段(835bp)而突变株不能扩出该片段则说明该突变株为成功同源双交换的基因敲除突变株；上下游引物扩增，如果野生型能扩增出大小对应的片段(1254bp)而突变株扩出相应较大的片段(1695bp)则说明该基因敲除突变株为成功同源双交换的基因敲除突变株；并将上下游引物扩增片段委托北京奥科鼎盛生物技术有限公司完成测序，确认cheZ在基因组中的序列被重组质粒中的庆大霉素基因替代。
(5)将确认的突变菌株命名为AC601,纯化培养并重新PCR验证后置于含20％甘油的保菌管中，-80℃冰箱中保存。
实施例4：突变茎瘤固氮根瘤菌的表型分析。
利用TY培养基和L3半固体培养基分别培养出发菌(ORS571)和上述获得突变株(AC601)，检测两种菌株相同条件下的生长状况：
在超净工作台内，将上述-80℃保藏的菌株分别用接种环在TY固体培养基上平板划线，在37℃条件下培养2天，观察菌落形态，并将菌落用PBS缓冲液稀释后置于显微镜下进行大小与运动能力观察(参见图3)。
通过监测生物量变化测定出发菌和突变体的生长曲线：
首先，分别取在TY培养基中活化的出发菌和突变体单菌落，分别接种到TY液体培养基中过夜培养。而后，将出发菌和突变体从液体培养基中分别接种到30mlTY液体培养基中，并将初始菌液浓度调到OD＝0.01。每个样品做三个重复。在37℃，180rpm条件下培养，每隔2h取菌液700微升，用Nanodrop 2000测定A600值，持续测定至36h。从生长曲线中可以看出，二者相同时间内的增长速度没有显著差异。
取活化后的出发菌和突变体单菌落，分别接种至TY液体培养基过夜培养，方法同上。将出发菌和突变体浓度稀释到OD＝0.8,分别取5微升垂直接种到L3半固体培养基中。从图中可以看出，突变菌的趋化能力完全丧失。
实施例5：所述菌株的固氮能力测定。
(1)将所述菌株用TY培养基活化后接种到TY液体培养基中置于摇床过夜培养，将菌液稀释至OD600＝1，分别接种到田菁种子，3min后用无菌水冲洗三次，然后将分别接种出发菌和突变菌的田菁移种到双层钵中。温室内培养30天待根瘤形成及长大，温度控制在26±2℃，光照周期12h:12h。
(3)将接种茎瘤固氮根瘤菌野生型ORS571和突变体AC601的田菁的根瘤小心取下，接种每种菌株的田菁根瘤共挑选大小平均的种子50颗，以10颗为一组加入到20ml血清瓶中。
(2)10个20mL血清瓶中各加入10个上述根瘤，用橡皮塞密封。之后用1ml针筒注射器分别抽出1ml空气和充入1ml乙炔气体。37℃条件下温育24h,后用气相色谱测还原成乙烯峰面积(参见图5)。
由图5A可见，AC601与宿主田菁共生形成的根瘤能够将乙炔转化为乙烯；由图5B可见，野生型ORS571与AC601形成的根瘤在固氮能力上无明显差别。
实施例6：所述菌株的小麦的定植与接种试验。
(1)小麦种子用10％(v/v)的次氯酸钠浸泡10min，对其进行表面消毒，而后用无菌水洗涤5次，置于湿润滤纸上温育发芽，挑选生长状况相同的小麦种子备用。
(2)对小麦定植部分，则将在TY液体培养基中37℃过夜培养的出发菌和突变菌调至OD600为0.8，并以1:1的体积比混合，将小麦种子在混合菌液中浸泡30min，浸泡后用无菌水冲洗小麦3次，洗掉未定植到小麦根的游离菌。将小麦根捣碎释放定植小麦根的根瘤菌，并用PBS缓冲液梯度稀释(10-1、10-2、10-3)后涂板，37℃条件下培养两天。待长出菌落后，用菌落PCR验证定植到小麦根的出发菌与突变菌比例。
(3)对于小麦促生部分，将出发菌和突变菌活化后取单菌落培养于TY培养基中，37℃过夜培养。将菌液浓度调整至OD600＝0.8，并分别将小麦种子在菌液中浸泡30min，用无菌水冲洗小麦3次，洗掉未定植到小麦根的游离菌，然后一部分移种到含有Hoagland培养基的三角瓶中。
(4)温室内培养，温度控制在26±2℃，光照周期12h:12h，整个处理遵循完全随机区组设计。每天定时观察小麦生长状况。18天时小麦收获，测完根、茎鲜重等六项指标后，放于烘箱内烘干至恒重，天平上称量各株干重(参见图7)。
综上实验表明：所述突变菌AC601具有良好的固氮、定植与促生特性，固氮能增加土壤氮含量，较强的定植能力能提高小麦对氮的有效吸收，虽然茎瘤固氮根瘤菌只能与其唯一宿主田菁共生，但该菌较强的自生固氮能力使其具有作为一种广泛的促生菌应用于其他植物，促进其他植物生长的潜能。因而该菌株具开发成微生物菌肥的良好前景。
所述菌株接种小麦后，显著地促进了小麦的地上部生长，且没有可见的病变，表明所述菌株可以用于促进小麦生长的生物接种剂或微生物菌肥的制备。
序列表
<110> 中国科学院烟台海岸带研究所
<120> 促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌及其构建和应用
<141> 2017-08-31
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> ORS571
<220>
<221> gene
<222> (1)..(25)
<400> 1
ggggtacctg cccttcagcg tctgc 25
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> ORS571
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<221> gene
<222> (1)..(30)
<400> 2
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<211> 25
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<220>
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<222> (1)..(25)
<400> 4
cgagctcgct gccgatcctc tatgc 25

Claims (7)

1.一种促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌，其特征在于：茎瘤固氮根瘤菌为敲除趋化基因cheZ的茎瘤固氮根瘤菌。
2.一种权利要求1所述的促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌的构建方法，其特征在于：
(1)分别扩增茎瘤固氮根瘤菌CheZ基因上游的cheZ-Up和下游的cheZ-Down片段；
(2)构建敲除表达重组质粒pCM351::Up-Down。
(3)将上述获得重组质粒通过三亲结合导入茎瘤固氮根瘤菌；
(4)使用分别含有庆大霉素和四环素抗性的TY固体培养基筛选阳性结合子，并通过PCR验证获得茎瘤固氮根瘤菌趋化基因cheZ敲除的茎瘤固氮根瘤菌株。
3.按权利要求2所述的促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌的构建方法，其特征在于：所述将上述获得重组质粒通过三亲结合导入茎瘤固氮根瘤菌为将茎瘤固氮根瘤菌、含有重组质粒的DH5α供体菌和含有辅助质粒pRK2013的DH5α辅助菌在LB固体培养基，37℃条件下培养48h进行三亲结合。
4.按权利要求2所述的促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌的构建方法，其特征在于：所述茎瘤固氮根瘤菌通过三亲结合导入重组质粒pCM351::Up-Down后，重组质粒与基因组自发进行同源重组；将重组后的结合子分别在含有庆大霉素和四环素的TY固体培养基上培养；在含有庆大霉素的TY培养基上生长，而在含有四环素培养基上不能生长的菌株为阳性结合子，进一步通过PCR进行验证。
5.一种权利要求1所述的促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌的应用，其特征在于：所述茎瘤固氮根瘤菌在用于促进小麦生长中的应用。
6.按权利要求5所述的促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌的应用，其特征在于：所述茎瘤固氮根瘤菌株在促进小麦生长中作为接种剂或微生物菌肥中的应用。
7.按权利要求6所述的促小麦生长的茎瘤固氮根瘤菌的应用，其特征在于：培养至OD600为1的所述茎瘤固氮根瘤菌作为接种剂(促生剂)或微生物菌肥。
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