CN101921838A - 一种运用pcr-dhplc检测沙门氏菌的方法 - Google Patents

一种运用pcr-dhplc检测沙门氏菌的方法 Download PDF

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Abstract

一种运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌的方法，属于生物分析化学技术领域。本发明运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌，包括沙门氏菌培养，磁性纳米粒子的制备，沙门氏菌基因组DNA的提取，沙门氏菌特异性引物的选择，PCR扩增，PCR产物的DHPLC检测。本发明以DHPLC检测PCR产物代替传统的琼脂糖电泳，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的；PCR-DHPLC检测方法与传统微生物检验方法以及PCR-凝胶电泳法相比，具有敏感性高、特异性强、快速、准确、结果分析简单，对待样品要求不高，可进行大通量检测等优点。

Description

一种运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌的方法
技术领域
一种运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌的方法，属于生物分析化学技术领域。
背景技术
病原微生物广泛分布于自然界，可以侵犯人体和动物，引起感染甚至传染病，对人类和动物健康都会构成极大危害，预防病原微生物在公共卫生学上具有重要意义。食用被病原菌污染的食品是食源性疾病的主要传播途径。人畜感染后可呈无症状带菌状态，或有临床症状的疾病，它可能加重病态或死亡率，或者降低动物的繁殖能力。
传统的检测细菌的方法包括了生化培养、分离鉴定，检验程序复杂繁琐、报告检验结果大致需4～7d，耗时太长，而且检测灵敏度低。所以，建立快速而准确的检测方法一直是病原微生物检验研究的核心问题。随着分子生物学的发展，以核酸为基础的聚合酶链反应方法(PCR)，已被广泛应用于病原微生物菌的检测工作。
变性高效液相色谱(DHPLC)，在非变性温度下，DNA双链不解开，由于PCR产物片段大小的不同，在柱子内停留的时间也有差异，小片段的DNA分子首先被洗脱出来，通过紫外吸收光(260nm)检测，WAVE Maker核苷酸片段分析系统专用软件包将其转换为不同的峰型，参照分子量标准，通过软件系统便可读出PCR产物的不同。
PCR-DHPLC检测方法与传统微生物检验方法以及PCR-凝胶电泳法相比，具有敏感性高、特异性强、快速、准确、结果分析简单，对待样品要求不高，可进行大通量检测等优点。
病原微生物常见的有沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌等。
发明内容
本发明的目的是提供一种运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌的方法，灵敏度高，操作方便。
本发明的技术方案：一种运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌的方法，包括沙门氏菌培养，磁性纳米粒子的制备，沙门氏菌基因组DNA的提取，沙门氏菌特异性引物的选择，PCR扩增，PCR产物的DHPLC检测；工艺步骤为：
(1)沙门氏菌的培养：
按传统培养方法对沙门氏菌进行增菌培养，将沙门氏菌菌株一环接种于10mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC增菌液)，于36℃培养10h；
(2)磁性纳米粒子的制备：
制备羧基修饰的磁性纳米粒子，用于吸附病原微生物基因组DNA；
①取0.65g FeCl3，0.4g柠檬酸三钠，和20mL乙二醇，搅拌反应10min；
②取1.2g醋酸钠加入步骤①所得溶液中，搅拌反应20min；
③将步骤②所得溶液在230℃下搅拌反应10h；
④向步骤③所得溶液中加入20mL无水乙醇，超声10min，6000rpm离心10min，去上清；
⑤向步骤④所得沉淀中加入20mL去离子水，超声10min，6000rpm离心10min，去上清；
⑥向步骤⑤所得沉淀中加入5mL去离子水，得到粒径为350nm的磁性纳米粒子，备用。
(3)沙门氏菌基因组DNA的提取：
①取(1)中增菌液1mL，10000rpm离心5min，去除上清；
②将步骤①所得沉淀用1mL TE缓冲液溶解，加入100μL 10％十二烷基磺酸钠SDS；
所用TE缓冲液组成为：含50mM Tris-HCl和10mM EDTA的溶液，pH8.0；
③向步骤②所得溶液中加入20μL制备的磁性纳米粒子；
④向步骤③所得溶液中加入370μL质量浓度30％PEG 6000-6mol/L NaCl混合液，室温反应15min；
⑤将步骤④所得溶液放入磁力架中，去除上清；
⑥向步骤⑤所得磁性纳米粒子中加入1mL质量浓度70％乙醇；
⑦将步骤⑥所得溶液放入磁力架中，去除上清；
⑧向步骤⑦所得磁性纳米粒子中加入100μL TE缓冲液溶解，65℃反应10min，此时所用TE缓冲液组成为：含10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8.0；
⑨将步骤⑧所得溶液放入磁力架中，取上清，即为沙门氏菌基因组DNA。
(4)设计沙门氏菌特异性引物；
根据Gene Bank中已发表的沙门氏菌hil A基因，基因序列号U6923823，利用Primer 5.0软件设计一对2条引物。
上游引物S1为：5’-CTG CCG CAG TGT TAA GGA TA-3’，
下游引物S2为：5’-CTG TCG CCT TAA TCG CAT GT-3’，
长度为497bp。
(5)以步骤(3)得到的沙门氏菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增：
取沙门氏菌基因组DNA模板1μL，分别加入浓度10μM的引物S1、S2各1μL，浓度20μM的dNTP 1μL，酶活5U/μL的TaqDNA聚合酶0.5μL，10×PCR Buffer(终浓度Tris-HCl pH8.510mM、KCl 50nM、MgCl2 1.5nM)5μL，加水补足到50μL，把各组分加到0.2mL的PCR反应管中，按下列参数进行PCR循环。
预变性：94℃ 3min；
进入循环：94℃变性60s，59℃退火60s，72℃延伸60s，循环扩增35次；
终止延伸：72℃10min；
4℃保存PCR扩增产物。
(6)将步骤(5)获得的PCR扩增产物进行DHPLC检测，从而达到检测沙门氏菌的目的。
色谱柱：PS-DVB & C18DNA Sep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；
柱温：50℃；
流动相：体积比：缓冲溶液A浓度为50.2％，缓冲溶液B浓度为49.8％，其中，缓冲液A是浓度0.1mM的乙酸三乙胺TEAA水溶液，缓冲液B是浓度0.1mM TEAA与乙腈按照体积比3∶1的混合溶液；
流速：0.9mL/min；
检测器：荧光检测器：光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；
上样量：PCR扩增产物5μL。
本发明的有益效果：本发明以DHPLC检测PCR产物代替传统的琼脂糖电泳，简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的；PCR-DHPLC检测方法与传统微生物检验方法以及PCR-凝胶电泳法相比，具有敏感性高、特异性强、快速、准确、结果分析简单，对待样品要求不高，可进行大通量检测等优点。
具体实施方式
以沙门氏菌为例进行PCR-DHPLC检测。
实施例1
(1)沙门氏菌的增菌培养：
将沙门氏菌菌株一环接种于10mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液(SC增菌液)，于36℃培养10h。沙门氏菌(Salmonella)，由江苏省出入境检验检疫局提供。
(2)磁纳米粒子的制备：
①取0.65g FeCl3，0.4g柠檬酸三钠，20mL乙二醇，搅拌反应10min。
②取1.2g醋酸钠加入上述溶液中，搅拌反应20min。
③将上述溶液在230℃下搅拌反应10h。
④向上述溶液中加入20mL无水乙醇，超声10min，6000rpm离心10min，去上清。
⑤向上述沉淀中加入20mL去离子水，超声10min，6000rpm离心10min，去上清。
⑥向上述沉淀中加入5mL去离子水。
(3)沙门氏菌基因组DNA的提取：
①取(1)中SC增菌液1mL，10000rpm离心5min，去除上清。
②将①中沉淀用1mL TE缓冲液溶解(50mM Tris-Hcl，10mM EDTA，pH8.0)，加入100μL 10％SDS。
③向上述溶液中加入20μL(2)中制备的磁性纳米粒子。
④向上述溶液中加入370μL 30％(w/v)PEG6000-6mol/L NaCl混合液，室温下反应15min。
⑤将上述溶液放入磁力架中，去除上清。
⑥向上述磁粒子中加入1mL 70％乙醇洗涤。
⑦将上述溶液放入磁力架中，去除上清。
⑧向上述磁粒子中加入100μL TE缓冲液溶解(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)，65℃反应10min。
⑨将上述溶液放入磁力架中，取上清，即为沙门氏菌基因组DNA。
(4)特异性引物的选择：
根据Gene Bank中已发表的沙门氏菌hilA基因(基因序列号U6923823)，利用Primer 5.0软件设计一对2条引物。
上游引物(S1)为：5’-CTG CCG CAG TGT TAA GGA TA-3’
下游引物(S2)为：5’-CTG TCG CCT TAA TCG CAT GT-3’。
(5)PCR特异性扩增：
取步骤(3)制得的模板1μL，分别加入引物步骤(4)中引物S1、S2各1μL(终浓度10μM/L)，1μL dNTP(终浓度20μM)，0.5μL Taq DNA聚合酶酶(酶活5U/μL)，5μL 10×PCR Buffer(终浓度Tris-HCl pH8.510mM、KCl 50nM、MgCl2 1.5nM)，加水补足到50μL，把各组分加到0.2mL PCR反应管中，按下列参数进行PCR循环。
预变性：94℃ 3min；
进入循环：94℃变性60s，59℃退火60s，72℃延伸60s，循环扩增35次；
终止延伸：72℃10min；
4℃保存反应产物。扩增片段长度为497bp。
(6)PCR产物DHPLC检测：
色谱柱：PS-DVB & C18DNA Sep色谱柱(4.6mm×50mm，粒度3μm)；
柱温：50℃；
流动相：(体积比)缓冲溶液A浓度为50.2％，缓冲溶液B浓度为49.8％，其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的TEAA水溶液，缓冲溶液B是浓度0.1mM TEAA与乙腈按照体积比3∶1的混合溶液；
流速：0.9mL/min；
检测器：荧光检测器(光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s)。
上样量：PCR产物5μL。

Claims (1)

1.一种运用PCR-DHPLC检测沙门氏菌的方法，其特征在于包括沙门氏菌培养，磁性纳米粒子的制备，沙门氏菌基因组DNA的提取，沙门氏菌特异性引物的选择，PCR扩增，PCR产物的DHPLC检测；工艺步骤为：
(1)沙门氏菌培养：
将沙门氏菌菌株一环接种于10mL亚硒酸盐胱氨酸增菌液，于36℃培养10h；
(2)磁性纳米粒子的制备：
制备羧基修饰的磁性纳米粒子，用于吸附沙门氏菌基因组DNA；
①取0.65g FeCl3，0.4g柠檬酸三钠，和20mL乙二醇，搅拌反应10min；
②取1.2g醋酸钠加入步骤①所得溶液中，搅拌反应20min；
③将步骤②所得溶液在220-230℃下搅拌反应10h；
④向步骤③所得溶液中加入20mL无水乙醇，超声10min，6000rpm离心10min，去上清；
⑤向步骤④所得沉淀中加入20mL去离子水，超声10min，6000rpm离心10min，去上清；
⑥向步骤⑤所得沉淀中加入5mL去离子水，得到粒径为350nm的磁性纳米粒子，备用；
(3)沙门氏菌基因组DNA的提取：
①取(1)中增菌液1mL，10000rpm离心5min，去除上清；
②将步骤①所得沉淀用1mL TE缓冲液溶解，加入100μL 10％十二烷基磺酸钠SDS；
所用TE缓冲液组成为：含50mM Tris-HCl和10mM乙二胺四乙酸EDTA的溶液，pH8.0；
③向步骤②所得溶液中加入20μL制备的磁性纳米粒子；
④向步骤③所得溶液中加入370μL质量浓度30％PEG 6000-6mol/L NaCl混合液，室温反应15min；
⑤将步骤④所得溶液放入磁力架中，去除上清；
⑥向步骤⑤所得磁性纳米粒子中加入1mL质量浓度70％乙醇；
⑦将步骤⑥所得溶液放入磁力架中，去除上清；
⑧向步骤⑦所得磁性纳米粒子中加入100μL TE缓冲液溶解，65℃反应10min，此时所用TE缓冲液组成为：含10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8.0；
⑨将步骤⑧所得溶液放入磁力架中，取上清，即为沙门氏菌基因组DNA；
(4)设计沙门氏菌特异性引物：
上游引物S1为：5’-CTG CCG CAG TGT TAA GGA TA-3’，
下游引物S2为：5’-CTG TCG CCT TAA TCG CAT GT-3’；
(5)以得到的沙门氏菌基因组DNA为模板，进行PCR扩增：
取沙门氏菌基因组DNA模板1μL，分别加入浓度10μM的引物S1、S2各1μL，浓度20μM的dNTP 1μL，酶活5U/μL的TaqDNA聚合酶0.5μL，10×PCR Buffer5μL，加水补足到50μL，把各组分加到0.2mL的PCR反应管中，按下列参数进行PCR循环；
预变性：94℃3min；
进入循环：94℃变性60s，59℃退火60s，72℃延伸60s，循环扩增35次；
终止延伸：72℃10min；
4℃保存PCR扩增产物；
(6)PCR产物的DHPLC检测：将获得的PCR扩增产物进行DHPLC检测，从而达到检测沙门氏菌的目的；
色谱柱：PS-DVB & C18DNA Sep色谱柱，4.6mm×50mm，粒度3μm；
柱温：50℃；
流动相：体积比：缓冲溶液A浓度为50.2％，缓冲溶液B浓度为49.8％，其中，缓冲溶液A是浓度0.1mM的乙酸三乙胺TEAA水溶液，缓冲液B是浓度0.1MTEAA与乙腈按照体积比3∶1的混合溶液；
流速：0.9mL/min；
检测器：荧光检测器：光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；
上样量：PCR扩增产物5μL。
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