CN102507934A - 产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法 - Google Patents

Abstract

产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法，涉及一种病原菌的检测。提供一种灵敏度高、特异性强、简便快速的产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法。产酸克雷伯氏菌菌株的微生物学鉴定；制备免抗产酸克雷伯氏菌抗体；IgG的Eu³⁺标记及纯化；建立产酸克雷伯氏菌TRFIA检测方法。灵敏度为1.0×10⁵cfu/孔，高于荧光抗体法。应用荧光抗体法进行病原菌全菌体检测，需要显微镜目测观察荧光强度大小，主观性大，由于背景荧光的干扰，检测灵敏度低，且无法给出具体的灵敏度数值。通过TRFIA测定不同浓度的产酸克雷伯氏菌CPS值表明，该法的范围宽，能定量检测。

Description

产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法

技术领域

本发明涉及一种病原菌的检测，尤其是涉及一种产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法。

背景技术

产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)是重要的条件致病菌，可导致人畜患病，引起食物中毒等疾病(董捷，等.产酸克雷伯菌引起的食物中毒临床分析.中华传染病杂志.2002，20：315-316)。建立灵敏、特异、快速的检测技术，对产酸克雷伯氏菌进行监测，对疾病的早期预防能起到积极的指导作用。

由于产酸克雷伯氏菌具有不同的血清型，传统的细菌形态和生理生化特性检测方法并不能满足疾病防治的需要。分子生物学手段如定量PCR检测已开始在病原菌检测中得到应用，但是检测之前需要提取病原菌核酸，选取内标基因，设计和合成基因引物，样品的前处理复杂，过程控制严格，实验室依赖程度高，限制了其在实际中的应用。免疫检测技术方法简单、特异性强，在国内外病原菌检测中应用更为广泛，其中又以酶联免疫吸附法(ELISA)和荧光抗体法最为常用。ELISA是以酶为标记物，但酶为生物大分子，容易失活，不易保存，大分子的酶易对免疫反应造成空间位阻效应，同时该法必须通过显色进行信号测定。荧光抗体法是以荧光物质为标记物，这种标记物分子量小，稳定，标记到抗原或抗体后对免疫反应影响小，可以直接测量荧光信号，不需要显色，弥补了ELISA法的不足，但由于测量时的背景荧光波长与标记物相近，干扰样品测定，导致测定灵敏度不高。时间分辨荧光免疫检测(TRFIA)是用稀土离子螯合物作为标记物，该螯合物是一种长寿命的荧光物质，通过具有时间分辨功能的荧光仪可与短寿命的背景荧光分开，有效消除背景荧光的干扰，该法已在化学、医学、食品和环境等领域(Wu F B，et al.Synthesis of a highly fluorescentbeta-diketone-europium chelate and its utility in time-resolved fluoroimmunoassay of serum totalthyroxine.Anal Chem，2002，74：5882-5889)得到广泛关注，但对产酸克雷伯氏菌的检测从未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种灵敏度高、特异性强、简便快速的产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法。

所述产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码100101，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.5060。

本发明利用时间分辨荧光免疫检测(TRFIA)法进行产酸克雷伯氏菌的检测。

本发明包括以下步骤：

1)产酸克雷伯氏菌菌株的微生物学鉴定；

2)制备免抗产酸克雷伯氏菌抗体(IgG)；

3)IgG的Eu³⁺标记及纯化；

4)建立产酸克雷伯氏菌TRFIA检测方法

将产酸克雷伯氏菌菌株首先用无菌生理盐水洗涤，4500r/min，离心5min，弃上清；Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液稀释，取100μL加入到96孔微孔板中包被，用洗涤液冲洗，每孔加入200μL 1％的BSA，37℃封闭2h，洗涤，加入1∶320稀释的Eu³⁺-IgG溶液100μL，37℃振动孵育1h，用洗涤液冲洗，每孔加入200μL增强液，振荡，多标记分析仪上测量荧光读数CPS；设碳酸盐包被液作阴性对照，以样品孔的CPS值(P)与对照孔的CPS值(N)之比大于2(即P/N＞2)时判断为阳性。

在步骤1)中，所述产酸克雷伯氏菌菌株的微生物学鉴定的具体方法是：可采用Biolog自动生化鉴定系统(GeneIII)进行鉴定。

在步骤2)中，所述制备免抗产酸克雷伯氏菌抗体(IgG)的具体方法可包括以下步骤：

(1)将产酸克雷伯氏菌菌株接种于0.5％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中，27℃培养24h，用甲醛及加热两种方法灭活，离心，再加入无菌生理盐水洗涤，调整细菌浓度至6×10⁸cfu/mL备用；

(2)选择2只健康的2～3kg的新西兰大白兔，背部两侧皮下多点注射免疫，分4次免疫，免疫间隔期为2周，第1次免疫时与弗氏完全佐剂1∶1混合、乳化，第2次免疫时与弗氏不完全佐剂1∶1混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射剂量为1mL；

(3)最后一次免疫10天后，耳静脉采血，分离血清，用试管凝集法测定抗血清效价，效价达到1∶1280以上方可使用；

(4)采用SPA亲和层析法从从血清中纯化抗体(IgG)，然后脱盐和冷冻干燥。

在步骤(1)中，所述离心的条件可采用4500r/min，5min。

在步骤3)中，所述IgG的Eu³⁺标记及纯化的具体方法可包括以下步骤：

1mg的IgG抗体溶于250μL Na₂CO₃-NaHCO₃(0.1mol/L，pH 9.1)缓冲溶液中，与0.2mg的Eu³⁺标记试剂充分混匀，4℃磁力搅拌12h，在pH 7.8的Tris-HCl(0.05mol/L，0.9％NaCl)缓冲液4℃透析24h，其间换透析液两次。通过蛋白纯化系统用Sephadex G-50柱层析(1×20cm)，洗脱液仍为Tris-HCl缓冲液，监测280nm处吸光度(A₂₈₀)并合并收集蛋白峰，计算合并液中Eu³⁺和IgG的浓度，得到纯化的IgG标记复合物Eu³⁺-IgG，复合物溶液中Eu³⁺和IgG浓度分别为4.5×10^-6mol/L和1.5×10^-6mol/L，标记比为3。

在步骤4)中，所述Eu³⁺-IgG溶液的工作浓度可分别采用1∶80、1∶320、1∶1280、1∶5120、1∶20480和1∶81920稀释，选择荧光读数CPS接近10⁶且P/N值最大的稀释度为最佳稀释度；

所述包被的条件可分别采用4℃、37℃和60℃的包被温度，12h、18h和24h的包被时间，固定Eu³⁺-IgG及菌株浓度，观察P/N值，选择最高P/N所对应的包被温度和包被时间。

以下给出敏感性试验的方法：

将产酸克雷伯氏菌(1.0×10⁸cfu/mL)用包被液作10倍倍比连续稀释，观察P/N＞2所对应的最高稀释倍数，其对应浓度为检测灵敏度。

以下给出重复性实验的方法：

重复性通过板内变异系数和板间变异系数反映。固定细菌浓度和Eu³⁺-IgG浓度，在同一块微孔板上进行TRFIA测定，由每个微孔中的CPS值计算出平均值与标准差，进而计算出板内变异系数＝板内标准差/平均值×100％；用同样浓度的细菌和Eu³⁺-IgG，在5块板上进行TRFIA测定，根据CPS值计算板间变异系数。

结果：建立了产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法，Eu³⁺-IgG的最佳工作浓度为1∶320，最佳包被温度60℃，最佳包被时间24h。而对于包被液是否烘干影响不大，检测灵敏度为1.0×10⁵cfu/孔，板内变异系数为5.60％，板间变异系数为10.08％。

本发明具有以下突出优点：

1)TRFIA用于产酸克雷伯氏菌的检测在国内外未见报道。

2)灵敏度为1.0×10⁵cfu/孔，高于荧光抗体法。应用荧光抗体法进行病原菌全菌体检测，需要显微镜目测观察荧光强度大小，主观性大，由于背景荧光的干扰，检测灵敏度低，且无法给出具体的灵敏度数值(参见文献：夏春.间接荧光抗体法快速检测中国淡水鱼主要病原菌.中国兽医学报.1998，18：466-468)。

3)通过TRFIA测定不同浓度的产酸克雷伯氏菌CPS值表明，该法的范围宽，能定量检测。

附图说明

图1为TRFIA的标准曲线。在图1中，横坐标为产酸克雷伯氏菌浓度/(cfu/mL)，纵坐标为荧光读数/CPS。

具体实施方式

以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。

本发明的具体步骤是：

1、产酸克雷伯氏菌菌株的微生物学鉴定

材料及器具：Biolog自动生化鉴定系统(GeneIII)，菌株(由本实验室分离于日本鳗鲡)。

方法：采用自动生化鉴定系统进行鉴定。

结果：表1为全自动细菌生化鉴定特性表，其中+为阳性，-为阴性，鉴定结果为产酸克雷伯氏菌，id％为92.1％。

表1

2、制备免抗产酸克雷伯氏菌抗体(IgG)

材料及器具：产酸克雷伯氏菌菌株，新西兰大白兔，牛肉膏蛋白胨培养液，甲醛，弗氏完全佐剂，弗氏不完全佐剂，无菌生理盐水，TG16-W高速台式离心机，YXQ-SG46-280S压力蒸汽灭菌锅，SPA亲和层析柱，AKTA Purifier 100蛋白纯化系统，LGJ-10冷冻干燥机。

方法：将产酸克雷伯氏菌菌株接种于0.5％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中，27℃培养24h，用甲醛及加热两种方法灭活，离心(4500r/min，5min)，再加入无菌生理盐水洗涤，调整细菌浓度至6×10⁸cfu/mL备用。选择2只健康的2-3kg的新西兰大白兔，背部两侧皮下多点注射免疫，分4次免疫，免疫间隔期为2周，第1次免疫时与弗氏完全佐剂1∶1混合、乳化，第2次免疫时与弗氏不完全佐剂1∶1混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射剂量为1mL。最后一次免疫10天后，耳静脉采血，分离血清，用试管凝集法测定抗血清效价，效价达到1∶1280以上方可使用。采用SPA亲和层析法纯化抗血清，然后脱盐和冷冻干燥。

结果：抗血清效价为1∶1280，亲和层析法纯化后得到白色的IgG抗体粉末。

3、IgG的Eu³⁺标记及纯化

材料及器具：IgG纯化抗体，Eu³⁺标记试剂盒(1244-302，Perkins-Elmer公司)，Na₂CO₃-NaHCO₃(0.1mol/L，pH 9.1)缓冲溶液，Tris-HCl(0.05mol/L，0.9％NaCl，pH 7.8)缓冲溶液，透析膜，磁力搅拌器，Sephadex G-50层析柱(GE Healthcare公司)，AKTA Purifier100蛋白纯化系统。

方法：1mg的IgG抗体溶于250μL Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液中，与02mg的Eu³⁺标记试剂充分混匀，4℃磁力搅拌12h，在Tris-HCl缓冲液4℃透析24h，其间换透析液两次。通过蛋白纯化系统用Sephadex G-50柱层析(1×20cm)，洗脱液仍为Tris-HCl缓冲液，监测280nm处吸光度(A₂₈₀)并合并收集蛋白峰，计算合并液中Eu³⁺和IgG的浓度。

结果：得到了纯化的IgG标记复合物Eu³⁺-IgG，复合物溶液中Eu³⁺和IgG浓度分别为4.5×10^-6mol/L和1.5×10^-6mol/L，标记比约为3。

4、建立产酸克雷伯氏菌TRFIA检测方法

材料及器具：产酸克雷伯氏菌菌株，Eu³⁺-IgG标记复合物，Na₂CO₃-NaHCO₃(0.05mol/L，pH 9.6)缓冲溶液，PBS(0.01mol/L，pH 7.4)缓冲溶液，牛血清白蛋白(BSA)，增强液、洗涤液(Perkins-Elmer公司)，96孔白色微孔板，SHA-C恒温振荡器，TG16-W高速台式离心机，具有时间分辨功能的PerkinElmer VICTOR X4多标记分析仪(Perkins-Elmer公司)。

方法：将产酸克雷伯氏菌菌株首先用无菌生理盐水洗涤，4500r/min离心5min，弃上清。用Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液稀释菌株，取100μL加入到96孔微孔板中，在60℃包被12h，用洗涤液冲洗2次，每孔加入200μL的1％BSA，37℃封闭2h，洗涤2次，加入1∶320稀释的Eu³⁺-IgG溶液100μL，37℃振动孵育1h，用洗涤液冲洗6次，每孔加入200μL增强液，室温振荡10min，多标记分析仪上测量荧光读数CPS。设碳酸盐包被液作阴性对照，以样品孔的CPS值(P)与对照孔的CPS值(N)之比大于2(即P/N＞2)时判断为阳性。

1)Eu³⁺-IgG的最佳工作浓度的优选

在上述步骤4中，所述Eu³⁺-IgG的工作浓度分别采用1∶80、1∶320、1∶1280、1∶5120、1∶20480和1∶81920稀释，选择CPS接近10⁶且P/N值最大的稀释度为最佳稀释度。

2)包被时间和包被温度的优选

在上述步骤4中，分别采用4℃、37℃和60℃的包被温度，12h、18h和24h的包被时间，固定Eu³⁺-IgG及菌株浓度，按照上述工作程序进行试验，观察P/N值，选择最高P/N所对应的包被温度和包被时间。

3)敏感性试验

将产酸克雷伯氏菌(1.0×10⁸cfu/mL)用包被液作10倍倍比连续稀释，观察P/N＞2所对应的最高稀释倍数，其对应浓度为检测灵敏度。

4)重复性实验

重复性通过板内变异系数和板间变异系数反映。固定细菌浓度和Eu³⁺-IgG浓度，在同一块微孔板上进行TRFIA测定，由每个微孔中的CPS值计算出平均值与标准差，进而计算出板内变异系数＝板内标准差/平均值×100％。用同样浓度的细菌和Eu³⁺-IgG，在5块板上进行TRFIA测定，根据CPS值计算板间变异系数。

结果：建立了产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法，Eu³⁺-IgG的最佳工作浓度为1∶320，最佳包被温度60℃，最佳包被时间24h。而对于包被液是否烘干影响不大，检测灵敏度为1.0×10⁵cfu/孔，板内变异系数为5.60％，板间变异系数为10.08％。

通过TRFIA测定不同浓度的产酸克雷伯氏菌CPS值表明，以CPS为纵坐标，不同浓度的细菌为横坐标，绘制标准曲线，结果见图1，由图1可以看出，该法的范围宽，能定量检测。

Claims (7)

1.产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法，其特征在于所述产酸克雷伯氏菌Klebsiella oxytoca已于2011年07月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.5060；

所述检测法包括以下步骤：

1)产酸克雷伯氏菌菌株的微生物学鉴定；

2)制备免抗产酸克雷伯氏菌抗体；

3)IgG的Eu³⁺标记及纯化；

4)建立产酸克雷伯氏菌TRFIA检测方法

将产酸克雷伯氏菌菌株首先用无菌生理盐水洗涤，4500r/min，离心5min，弃上清；Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液稀释，取100μL加入到96孔微孔板中包被，用洗涤液冲洗，每孔加入200μL 1％的BSA，37℃封闭2h，洗涤，加入1∶320稀释的Eu³⁺-IgG溶液100μL，37℃振动孵育1h，用洗涤液冲洗，每孔加入200μL增强液，振荡，多标记分析仪上测量荧光读数CPS；设碳酸盐包被液作阴性对照，以样品孔的CPS值与对照孔的CPS值之比大于2时判断为阳性。

2.如权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法，其特征在于在步骤1)中，所述产酸克雷伯氏菌菌株的微生物学鉴定的具体方法是：采用Biolog自动生化鉴定系统进行鉴定。

3.如权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法，其特征在于在步骤2)中，所述制备免抗产酸克雷伯氏菌抗体的具体方法包括以下步骤：

(1)将产酸克雷伯氏菌菌株接种于0.5％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养液中，27℃培养24h，用甲醛及加热两种方法灭活，离心，再加入无菌生理盐水洗涤，调整细菌浓度至6×10⁸cfu/mL备用；

(2)选择2只健康的2～3kg的新西兰大白兔，背部两侧皮下多点注射免疫，分4次免疫，免疫间隔期为2周，第1次免疫时与弗氏完全佐剂1∶1混合、乳化，第2次免疫时与弗氏不完全佐剂1∶1混合乳化，第3、4次免疫采用菌液注射，每次每只注射剂量为1mL；

(3)最后一次免疫10天后，耳静脉采血，分离血清，用试管凝集法测定抗血清效价，效价达到1∶1280以上方可使用；

(4)采用SPA亲和层析法从从血清中纯化抗体，然后脱盐和冷冻干燥。

4.如权利要求3所述的产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法，其特征在于在步骤(1)中，所述离心的条件采用4500r/min，5min。

5.如权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法，其特征在于在步骤3)中，所述IgG的Eu³⁺标记及纯化的具体方法包括以下步骤：

1mg的IgG抗体溶于250μL Na₂CO₃-NaHCO₃缓冲溶液中，与0.2mg的Eu³⁺标记试剂充分混匀，4℃磁力搅拌12h，在pH 7.8的Tris-HCl缓冲液4℃透析24h，其间换透析液两次。通过蛋白纯化系统用Sephadex G-50柱层析，洗脱液仍为Tris-HCl缓冲液，监测280nm处吸光度并合并收集蛋白峰，计算合并液中Eu³⁺和IgG的浓度，得到纯化的IgG标记复合物Eu³⁺-IgG，复合物溶液中Eu³⁺和IgG浓度分别为4.5×10^-6mol/L和1.5×10^-6mol/L，标记比为3。

6.如权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法，其特征在于在步骤4)中，所述Eu³⁺-IgG溶液的工作浓度分别采用1∶80、1∶320、1∶1280、1∶5120、1∶20480和1∶81920稀释，选择荧光读数CPS接近10⁶且P/N值最大的稀释度为最佳稀释度。

7.如权利要求1所述的产酸克雷伯氏菌的时间分辨荧光免疫检测法，其特征在于所述包被的条件分别采用4℃、37℃和60℃的包被温度，12h、18h和24h的包被时间，固定Eu³⁺-IgG及菌株浓度，观察P/N值，选择最高P/N所对应的包被温度和包被时间。

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