CN101571549B - Vero细胞HCP检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,具体涉及Vero细胞HCP检测试剂盒及其应用。本发明所提供了Vero细胞HCP检测试剂盒特异性强、灵敏度高,重复性好,不仅可以应用于甲肝病毒等非分泌型病毒疫苗,还可以用于其它Vero细胞生产疫苗制备过程中的质量控制与分析。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及Vero细胞HCP检测试剂盒及其应用。
背景技术
Vero细胞(非洲绿猴肾细胞)是一种理想的疫苗生产基质,其遗传背景清楚,核型稳定,无外源因子污染,适合大规模培养,可用生物反应器生产,保证了疫苗大批量生产的均质性和安全性。多年来,国内外已成功的研制了多种采用Vero细胞生产的疫苗并获准上市,包括人用狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活(纯化)疫苗(IPV)、乙型脑炎灭活疫苗(JE)。采用Vero细胞生产的疫苗有两种生产方式:其一为分泌型病毒培养方式(病毒复制完成后,分泌到细胞外的培养液中);在分泌型病毒培养过程中,其病毒为利用细胞环境进行病毒复制,造成宿主细胞结构受损,导致细胞死亡,致使细胞破裂后释放大量的宿主细胞结构蛋白于培养液中;同时由于细胞生长增殖需要,在Vero细胞生长增殖的过程中会向培养液中释放大量的促细胞生长因子。其二为非分泌型病毒培养方式,即病毒在宿主细胞内培养(病毒复制完成后,病毒存在于宿主细胞内),非分泌型病毒如甲肝病毒等在宿主细胞内的培养过程中,病毒的复制不会对宿主细胞产生病变,因此,此类病毒的释放需要采取物理或化学的方法破碎细胞;在收获的病毒液中,除了含有细胞生长增殖过程中释放的促细胞生长因子外,还存在大量的由于细胞破碎而产生的成份更为复杂的细胞裂解蛋白。
经过多年的临床应用,证明Vero细胞作为疫苗生产基质是安全、有效的。但与此同时,不能排除Vero细胞生产疫苗在理论上的潜在致肿瘤性风险。控制该风险的措施有两个:其一为控制Vero细胞的代次在130~150代,其二为降低Vero细胞残余DNA含量、Vero细胞残余蛋白含量。鉴于目前国际上尚无特异性Vero细胞蛋白的检测手段,现仍以疫苗蛋白总量进行间接质量控制。(高恩明et al.国家食品药品监督管理局药品评审中心《关于Vero细胞疫苗残余物质的考虑》,20070112)。而这种情况下,残余宿主细胞蛋白(Host CellProtein,HCP)中的某些组分有可能成为疫苗中的过敏原,WHO于1998年组织制定了《使用动物细胞作为细胞基质生产生物制品规程》,要求将传代细胞HCP含量降低至可接受水平。这一举动表明WHO已开始关注HCP的含量及其对于疫苗安全性的影响。
田博和丁志芬报道了定量检测疫苗中Vero细胞HCP的方法(田博、丁志芬,中国生物制品杂志.2005,18(2):159-161,164);王辉等也报道了疫苗制品中Vero细胞残余蛋白的检测(王辉、张月兰、过琴媛等.中国生物制品杂志.2007,20(2):937-939,947)。但上述文章中所述Vero细胞残余蛋白检测方法仅针对分泌型病毒培养所制备的疫苗中残余宿主蛋白的检测,并不适用于非分泌型病毒培养所制备的疫苗中残余宿主蛋白的检测。因此,上述文献中所述在疫苗中Vero细胞HCP的检测方法尚存在不足。
目前,国内外尚无检测Vero细胞HCP残余量的试剂盒出售。
发明内容
本发明所要解决的技术问题之在于提供了一种Vero细胞HCP检测试剂盒及其应用,以解决现有Vero细胞HCP的检测方法存在不足。
为了解决上述技术问题,
一方面,本发明公开了一种Vero细胞HCP检测试剂盒,包括固相、位于固相中的抗体、标记物偶联抗体、蛋白标准品,其特征在于所述抗体为抗Vero细胞裂解蛋白抗体,所述蛋白标准品为Vero细胞裂解蛋白。
另一方面,本发明还公开了一种Vero细胞HCP检测试剂盒,包括固相、位于固相中的抗体、生物素修饰的抗体以及标记物偶联的抗生物素蛋白,其特征在于所述抗体为抗Vero细胞裂解蛋白抗体,所述蛋白标准品为Vero细胞裂解蛋白。
另一方面,本发明还公开了一种Vero细胞HCP检测试剂盒,包括固相、位于固相中的抗体、2,4-二硝基苯酚修饰的抗体以及标记物偶联的抗2,4-二硝基苯酚蛋白,其特征在于所述抗体为抗Vero细胞裂解蛋白抗体,所述蛋白标准品为Vero细胞裂解蛋白。
在一些实施方案里,所述标记物偶联抗体中标记物为酶、核素、荧光素。
所述酶选自过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶及6-磷酸葡糖脱氢酶。
所述核素选自3H、188Re、131I。
所述荧光素选自异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明、3价镧系螯合物如铕(Eu3+)、铽(Tb3+)、铈(Ce3+)等。
本发明所述试剂盒,根据需要也可包含用于检测上述标记物偶联的(或标记的)抗生物素蛋白或标记物偶联的(或标记的)抗2,4-二硝基苯酚蛋白的试剂。
在实施方式里,在所述标记物为酶时,本发明试剂盒还包括辅助试剂,包括酶联反应底物溶液、显色液、反应终止液和清洗缓冲液。
一种辅助试剂配制方法如下:
1.底物溶液:磷酸-柠檬酸缓冲液(pH5.0)配制的3%H2O2;
2.显色液:0.1mg/ml TMB甲醇溶液.或0.0013mol/L TMB盐酸盐溶液;
3.反应终止液:2mol/L硫酸;
4.清洗缓冲液:PBS溶液。
另一方面,本发明还提供所述Vero细胞HCP检测盒在检测Vero细胞HCP残余量中的应用。
其应用步骤如下:
提取样本;
采用上述Vero细胞HCP检测试剂盒检测;
分析结果。
本发明所提供了Vero细胞HCP检测试剂盒特异性强、灵敏度高,重复性好,不仅可以应用于甲肝病毒等非分泌型病毒疫苗,还可以用于其它Vero细胞生产疫苗制备过程中的质量控制与分析。
附图说明
图1.Vero细胞裂解蛋白SDS-PAGE银染图
图2.本发明检测试剂盒的Vero细胞裂解蛋白标准曲线。
图3.本发明检测试剂盒的特异性试验。
具体实施方式
目前,Vero细胞是被接受并被批准用于生产适用于疫苗制造的传代猴肾细胞系,其中所述涉及人用疫苗包括人用狂犬病纯化疫苗、脊髓灰质炎灭活疫苗(IPV)、乙型脑炎灭活疫苗(JE)、甲型肝炎灭活疫苗(HAV),上述疫苗的生产工艺均为本技术领域人员所公知,如甲型肝炎灭活疫苗(HAV)的Vero细胞生产工艺可参考中国专利号ZL 0210685.9中的描述。
本发明中,Vero细胞,保藏号为ATCC CCL-81,如Kistner等人(疫苗(Vaccine).1998,16:960-968)或WO96/15231中所描述的,细胞适应于生长在有血清、无血清或无血清和蛋白质的培养基中。Vero细胞培养和所涉及试剂均为本技术领域人员所公知,可参考美国专利号4,783,407和WO2003/049767中的描述。对于在无血清培养基中的生长,使用补充有无机盐、氨基酸、碳酸氢钠(2g/L)和酵母或大豆提取物(1-10g/L)的DMEM HAM’sF12基本培养基或其它培养液。
本发明中所述Vero细胞裂解蛋白标准品产物亦经由化学的(例如有机溶剂)、酶促的(例如溶菌酶以及EDTA)、机械的、或是物理细胞破碎方法(例如菌化作用、超音波振荡、高压均化、摩擦搅动)。
本发明中所述Vero细胞裂解蛋白标准品产物的纯化可用多种方法进行,以有利于产物纯化或是去除非需要的污染物。一种方法为固-液相分离(例如离心/沉淀、萃取、过滤)。另一种方法是浓缩(例如蒸发、超滤、吸附、沉淀)。再一种方法为层析法(例如分子筛层析法、离子交换色层分析法、色层聚集法、疏水交互层析法、亲和层析法、金属离子螯合层析法、共价层析法)。本领域技术人员容易实施这些技术。若有需要,也可以应用杀菌技术,例如过滤或加热或照射(有关蛋白质纯化的更多资讯请参见RatledgeC,KristlansenB(2001)Basic biotechnology,2nd ed.Cambridge University press,Cambridge,U.K.)。
本发明中所述Vero细胞裂解蛋白标准品或抗原,包括但不限于下列一种制备工艺:
1.细胞培养收获:取工作细胞库中的1支Vero细胞株细胞管,将细胞接种到细胞培养瓶中,加入含10%小牛血清的199培养基适宜的培养液后置37±1℃培养。待复苏细胞生长成致密单层后用胰酶消化Vero细胞进行传代扩增,置35±1℃培养25天收获。用胰酶进行消化,以3500rpm、4℃离心30分钟,收集细胞沉淀。作为裂解蛋白制备样品源备用。
2.细胞破碎:收获的Vero细胞用超声方法进行破碎,以1400W输出功率,细胞破碎至无完整细胞结构。
3.氯仿抽提蛋白:在破碎后的细胞液中加入等体积的氯仿,在往复式振荡器上以300rpm的速率振荡20min,使氯仿与细胞液充分接触,待细胞碎片沉淀后,用4000rpm、4℃、20min离心,抽取上层的蛋白水相,向离心杯中补充等量的0.01mol/L PBS(pH7.8)反复提取4次。
4.浓缩:合并所有的抽提液,用MWCO 100KD的超滤膜进行浓缩;超滤浓缩液中加入PB缓冲盐,并使缓冲盐充分溶解,PB终浓度为1.0mol/L、pH6.8。
5.纯化:以50cm/h的流速经Phenyl Sepharose 6Fast Flow型疏水凝胶吸附,吸附完毕用1.0mol/L PB(pH6.8)溶液淋洗3管柱体积(column volumn,CV)后,开始用0.02mol/L PB(pH6.8)溶液进行线性洗脱5管柱体积(column volumn,CV),收集电导值低于48ms/cm的洗脱液;收集的洗脱液用MWCO 100KD的超滤膜进行浓缩,然后上样于Sepharose 4 Fast Flow型分子筛凝胶,用0.01mol/L PBS(pH7.4)溶液以45cm/h的流速进行洗脱,收集第二洗脱峰。
6.再次浓缩:将收集液先经用MWCO 100KD的超滤膜浓缩至200ml,再用50ml、MWCO100KD超滤离心管浓缩至30ml,即可获得特异性Vero细胞裂解蛋白(Vero细胞裂解蛋白标准品或抗原)。其含多种蛋白组分,分子量范围在55KD、11KD处及170KD~72KD、34~17KD之间。
抗体
如本文所用,所说“抗Vero细胞裂解蛋白抗体”是指将上述Vero细胞裂解蛋白作为抗原制备得到的抗体。该抗体与Vero细胞裂解蛋白具有特异性结合能力,本抗体为多克隆抗体。
抗Vero细胞裂解蛋白抗体的制备可通过以Vero细胞裂解蛋白为抗原,可以通过以下方法获得相应的各种抗体,但不只限于下列方法。
如兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG和豚鼠抗Vero细胞裂解蛋白IgG,其制备方法如下:
1)免疫三只家兔,初次免疫每只家兔用0.5mg实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏完全佐剂,乳化充分后,背部皮下注射6~8点。4周后第二次免疫:用0.5mg纯化Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏不完全佐剂,乳化充分后,皮下、肌肉多点注射。第二次免疫10天后同法进行第三次免疫。最后于第三次免疫2周后进行第四次免疫,一周后采血;
免疫三只豚鼠,初次免疫每只豚鼠用0.2mg实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏完全佐剂,乳化充分后,在背部皮下注射5~6点,每点0.1ml。2周后第二次免疫:每只豚鼠用0.4mg纯化Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏不完全佐剂,乳化充分后,皮下多点注射。第二次免疫10天后同法进行第三次免疫。最后于第三次免疫2周后进行第四次免疫,一周后采血;
2)分别选择两种动物效价较高的抗血清进行纯化;
3)纯化后效价检测。
IgG纯化可采用硫酸铵盐析、辛酸-硫酸铵法、Protein-A亲和柱层析等方法。
在本发明中,“效价”采用终末效价,即是能检测到阳性抗体的血清最大稀释度来表示。
“标记物偶联抗体”(或又称“标记的抗体”)
正如本领域技术人员所公知的,采用过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶及6-磷酸葡糖脱氢酶等酶标记(或偶联)、荧光标记(或偶联)或用放射性同位素标记(或偶联),可以使纯化的抗体定量化,将这样的抗体称其为“标记物偶联抗体”或“标记的抗体”。如采用酶标记抗体时,该酶在合适的底物存在下进行反应时,将酶联反应生成物作为标记物,可定量或定性检测与抗体特异性结合的抗原。另外,应用荧光标记和放射性同位素标记抗体时,将荧光和放射活性作为标记物时,也可定量或定性检测与抗体特异性结合的抗原。
在“标记物偶联抗体”或“标记的抗体”中进一步包含通过生物素、2,4-二硝基苯酚等修饰的抗体。生物素与抗生物素蛋白特异地结合,而2,4-二硝基苯酚与抗2,4-二硝基苯酚蛋白特异地结合。进而,上述标记的抗体可通过酶、核素或荧光素标记的抗生物素蛋白和抗2,4-二硝基苯酚蛋白进行定量或定性测定。
上述标记的抗体可通过生物素标记的试剂(NHS-LC-Biotin,Pierce公司)和/或如带有偶联剂的过氧化物酶(Maleimide activated HRP,Pierce公司)与抗体反应制得。
如本文所用,“固相”是指能用本发明的方法在其上对多个液体样品进行分别检验的任何固体基质,如ELISA试验平板、蛋白芯片载体如薄膜、玻璃片等。如本文所用,固相的“反应孔”是指固相上作为平板样品接受区的范围。典型的固相的反应孔,是通过在平板表面形成凹陷来得到的,该凹陷足够接收并容纳样品体积和检测过程中任一步中所加入的缓冲液或洗涤液的体积。如本文所用,对于靶分子的“测量”,是指检测、定量或者测定某一分析物或靶分子的量。
检测方式
抗体是许多应用于医学、兽医学和其它领域的检测技术中的关键试剂。这类测定包括许多常规使用的免疫测定技术,例如蛋白芯片、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、免疫组织化学(IHC)和免疫荧光(IF)测定。这些技术的一般指导,参见Ausubel等(1987)的“Current Protocols in Molecular Biology”John Wiley and Sons,New York,N.Y。另外,免疫测定也可是一种用来观测组织样品中的免疫组织化学(IHC)染色或免疫荧光(IF)方法。参见“Principles and Practice ofImmunoassay”(1991)Christopher P.Price和David J.Neoman,StocktonPress,New York,N.Y。
以下是对本发明的分析方法(免疫酶分析法)的详细说明,所述分析方法通过使用针对待测的特定分子形式的Vero细胞裂解蛋白多克隆抗体,来测定如疫苗样品等中总的(非复合的加上与抗体复合的)或游离的(非复合的)Vero细胞裂解蛋白量。
1.平板包被:用抗Vero细胞裂解蛋白抗体,以最佳浓度包被于试验平板的反应孔的表面。最佳抗体浓度是通过用已知浓度的Vero细胞裂解蛋白绘制一条标准曲线来确定的,该曲线在所要求的有效浓度范围中具有所要求的灵敏度和精确度。对于Vero细胞裂解蛋白,本试剂盒可以检测的有效Vero细胞裂解蛋白浓度范围为62.5ng/ml到4000ng/ml。本领域的普通技术人员,可以方便地确定在所要求范围内是否具有合适灵敏度和精确度,而无须进行多余的实验。
2.平板洗涤:将包被溶液倒去,加入洗涤缓冲液(每孔大约400微升)然后倒去。按要求将这个洗涤循环重复多次。洗涤缓冲液可选为0.01mol/L磷酸缓冲液(0.0027mol/L氯化钾,0.137mol/L氯化钠,pH7.4,含有0.01%w/v TritonX-100)。
3.平板封闭:将含有蛋白质和去垢剂封闭缓冲液(含1%BSA/0.1%Triton X-100的包被缓冲溶液)加入反应孔。平板可以此形式储存。
4.样品和标准品的加入:平板按上述方式进行洗涤。
向平板反应孔内分别加入标准品与待测样本各100μl,然后每孔分别加入偶联物试剂50μl,轻轻混合15秒后置37℃孵育60分钟,丢弃反应液,用缓冲液清洗反应板5次,吸干多于水分,向反应孔内加入50μl显色液,置于37℃孵育15分钟,终止反应。将反应板置于酶标仪上读取光密度值。每一孔内成色反应不同,光密度值也不同。
5.用于定量复合物显色的合适酶底物的例子有:用于碱性磷酸酶的硝基-苯磷酸,或用于辣根过氧化物的四甲基联苯胺磺酸盐(TMBS)。显色的程度可通过吸光度单位(AU,如果是对硝基酚,读取405nm的吸光度;如果是TMBS,读取450nm的吸光度)读出,可以作为测试样品中HCP的含量的指标,其确切浓度可以通过读取测试样品的吸光度、再参考由HCP标准品所作出的标准曲线来换算得出。
6.读数当得到足够检测信号时,使用如全波长酶标仪或荧光酶标仪等仪器对信号进行测量。
7.数据处理用已知浓度的Vero细胞裂解蛋白标准溶液所获得的检测信号,来建立一条校正曲线。该校正曲线用于换算出试验样品中Vero细胞裂解蛋白的浓度。
以下结合具体实施例,进一步阐明本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。比例和百分比基于重量或体积,除非特别说明。
材料来源:
Vero细胞工作种子细胞:ATCC系列号为No:CCL-81
试验动物
家兔(普通级)来源于上海普欣生物公司
豚鼠(清洁级)来源于中国科学院上海实验动物中心
主要仪器试剂:
细胞超声破碎仪:SONICS VCF1500,最大输出功率为1500W;超滤器:Pellicon2 Cassette Filter;Biomax-100A(MWCO=100KD)(Millipore公司);超滤浓缩器,(MWCO=100KD)(Millipore公司);色谱纯化仪:(GEHealthcare公司);色谱柱:BPG 140/950;INdEX 140/500(GE Healthcare公司);纯化介质:Phenyl Sepharose 6 Fast Flow型疏水凝胶(GE Healthcare公司);Sepharose 4 Fast Flow型分子筛凝胶(GE Healthcare公司);Protein-A亲和层析柱、辣根过氧化物酶(HRP)(Sigma公司);酶标板(Costar公司);酶标仪,Thermo Multiskan MK3型;小牛血清购自兰州民海生物技术有限公司,批号:051203;细胞培养液为199培养基(GIBCO);牛血清白蛋白(BSA,Fraction V),Calbiochem公司制造,怡成生物科技有限公司分装;羊抗兔-HRP、羊抗豚鼠-HRP均购自KPL公司;卵清蛋白(Albumin from chicken egg white),sigma公司制造;甲型肝炎病毒(HAV),Hepatitis A Virus Strain pHM175,10.81ug/ml购自BIODESIGN International;抗HAV-IgG标准品,75IU/ml,购自中国药品生物制品检定所;胰酶,BD公司制造;水解乳蛋白,GIBCO公司制造;Proclin 300;Supelco公司制造;TMB盐酸盐,购自苏州新区贝克精细化学品有限公司;
实施例1:Vero细胞裂解蛋白的制备
制备方法:
1.细胞培养收获:取工作细胞库中的1支Vero细胞株细胞管,将细胞接种到细胞培养瓶中,加入含10%小牛血清的199培养液后置37±1℃培养。待复苏细胞生长成致密单层后用胰酶消化Vero细胞进行传代扩增,置35±1℃培养25天收获。用胰酶进行消化,以3500rpm、4℃离心30分钟,收集细胞沉淀。作为裂解蛋白制备样品源备用。
2.细胞破碎裂解:收获的Vero细胞用超声方法进行破碎裂解,以1400W输出功率,细胞破碎至无完整细胞结构。
3.氯仿抽提蛋白:在破碎后的细胞液中加入等体积的氯仿,在往复式振荡器上以300rpm的速率振荡20min,使氯仿与细胞液充分接触,待细胞碎片沉淀后,用4000rpm、4℃、20min离心,抽取上层的蛋白水相,向离心杯中补充等量的0.01mol/L PBS(pH7.8)反复提取4次。
4.浓缩:合并所有的抽提液,用MWCO 100KD的超滤膜进行浓缩;超滤浓缩液中加入PB缓冲盐,并使缓冲盐充分溶解,PB终浓度为1.0mol/L、pH6.8。
5.纯化:以50cm/h的流速经Phenyl Sepharose 6 Fast Flow型疏水凝胶吸附,吸附完毕用1.0mol/L PB(pH6.8)溶液淋洗3CV后,开始用0.02mol/L PB(pH6.8)溶液进行线性洗脱5CV,收集电导值低于48mS/cm的洗脱液;收集的洗脱液用MWCO 100KD的超滤膜进行浓缩,后上样于Sepharose 4 FastFlow型分子筛凝胶,用0.01mol/L PBS(pH7.4)溶液以45cm/h的流速进行洗脱,收集第二洗脱峰。
6.再次浓缩:将收集液先经用MWCO=100KD的超滤膜浓缩至200ml,再用50ml(MWCO=100KD)超滤离心管浓缩至30ml,即可获得特异性Vero细胞裂解蛋白(Vero细胞裂解蛋白标准品或Vero细胞HCP)。
实验结果:用Lowry法测得Vero细胞裂解蛋白浓度为540μg/ml,本发明的相关实验数据见以下列表。
表1各纯化工艺阶段样品蛋白含量变化表
工艺阶段 | Vero细胞破碎 | 蛋白抽提 | 浓缩 | 疏水纯化 | 分子筛层析 |
体积(ml) | 2300 | 10600 | 2250 | 12286 | 2543 |
蛋白含量(μg/ml) | 17690 | 2137 | 3779 | 192 | 16 |
Vero细胞蛋白去除率 | - | 44.3% | 79.1% | 94.2% | 99.9% |
SDS-PAGE电泳、银染,结果参见图1,1:标准分子量蛋白;2:步骤4的未纯化Vero细胞裂解蛋白;3:Vero细胞裂解蛋白,结果表明经过纯化得到的Vero细胞裂解蛋白,含多种蛋白组分,分子量范围为55KD、11KD处及170KD~72KD、34~17KD之间。
实施例2Vero细胞裂解蛋白抗体制备
1.免疫家兔:
免疫三只家兔,初次免疫每只家兔用0.5mg实施例l制备的Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏完全佐剂,乳化充分后,背部皮下注射6~8点。4周后第二次免疫:用0.5mg实施例l制备的Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏不完全佐剂,乳化充分后,皮下、肌肉多点注射。第二次免疫10天后同法进行第三次免疫。最后于第三次免疫2周后进行第四次免疫,一周后采血,并测定效价。
表2免疫兔血清效价
2.免疫豚鼠:
免疫三只豚鼠,初次免疫每只豚鼠用0.2mg实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏完全佐剂,乳化充分后,在背部皮下注射5~6点,每点0.1ml。2周后第二次免疫:每只豚鼠用0.4mg实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白加入等体积福氏不完全佐剂,乳化充分后,皮下多点注射。第二次免疫10天后同法进行第三次免疫。最后于第三次免疫2周后进行第四次免疫,一周后采血,并测定效价。
表3免疫豚鼠血清效价
3.抗血清纯化:
分别选择上述步骤中两种动物效价较高的抗血清进行纯化。用市售预装Protein-A Sepharose affinity column进行亲和层析,得到抗Vero细胞裂解蛋白IgG,测定280nm和260nm吸光度。计算蛋白含量:C(mg/ml)=1.45×OD280nm-0.74×OD260nm。
表4纯化后抗体蛋白含量
4.纯化后抗体效价检测:
采用间接ELISA法检测,用碳酸缓冲液(0.05mol/L CB,pH9.6)将实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白稀释至10μg/ml,100μl/孔包被,4℃过夜。次日用PBS洗涤2次,加入2%BSA封闭,125μl/孔,室温2h,PBS洗涤二次。将步骤3中抗Vero细胞裂解蛋白IgG分别稀释至1mg/ml后再按10倍系列稀释,加入微孔板,100μl/孔,37℃孵育60分钟后,洗涤拍干,各孔分别加入100μl酶标二抗(羊抗兔-HRP或羊抗豚鼠-HRP)37℃孵育30分钟后,洗涤拍干。各孔加入显色液A液、B液37℃孵育15分钟。2mol/L硫酸终止反应,在酶标仪上比色。计算抗体效价。
表5纯化后抗体效价
实施例3酶标抗体制备
选用高碘酸钠法(骆加里等,生物化学与生物物理学报,1981,13:1),分别选取步骤3中抗体效价最高的抗Vero细胞裂解蛋白IgG(1#豚鼠抗Vero细胞裂解蛋白IgG、2#兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG)标记辣根过氧化物酶(HRP)。
表6 HRP-抗Vero细胞裂解蛋白IgG
实施例4豚鼠抗Vero细胞裂解蛋白IgG最佳包被浓度的确定。
将实施例2制备的豚鼠抗Vero细胞裂解蛋白IgG用0.05mol/L CB(pH 9.6)稀释成5~20μg/ml,包被微孔板,100μl/孔,4℃过夜。次日,用0.01mol/LPBS(pH 7.4)洗涤2次,每孔加2%BSA-PBS 150μl,置室温封闭2h。PBS洗涤2次,风干。加入系列稀释的Vero细胞裂解蛋白标准品(实施例1制备,浓度参见表7),37℃反应60min,洗涤4次,拍干。用PBS-T(含10%小牛血清及0.03%proclin300)将酶标抗体HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG(1∶500~1∶1000)每孔100μl,37℃反应60min,用PBS-T洗涤4次,拍干。显色37℃反应10min。终止,比色。根据结果分析:反应板条最佳包被浓度范围在5~20μg/ml。
表7豚鼠抗Vero细胞裂解蛋白IgG抗体包被浓度优化实验
实施例5HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG最佳稀释比例确定。
用实施例2中纯化豚鼠抗Vero细胞裂解蛋白IgG(10μg/ml)包被的微孔板,加入系列稀释的Vero细胞裂解蛋白标准品(实施例1制备,浓度参见表8),37℃反应60min,洗涤4次,拍干。用PBS-T(含10%小牛血清及0.03%proclin300)将酶标抗体HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG稀释成适当比例(1∶500~1∶1000)。每孔加入100μl已稀释的酶标抗体,振荡混匀,37℃反应60min,用PBS-T洗涤4次,拍干。显色37℃反应10min。终止,比色。根据结果分析:HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG最佳稀释浓度在1∶500~1∶1000之间。
表8 HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG稀释浓度
实施例6 ELISA双抗体夹心法的建立:
包板:将纯化豚鼠抗Vero细胞裂解蛋白IgG用0.05mol/L CB(pH 9.6)稀释成5~20μg/ml,包被微孔板,100μl/孔,4℃过夜。次日,用0.01mol/L PBS(pH7.4)洗涤2次,每孔加2%BSA-PBS 150μl,置室温封闭2h。PBS洗涤2次,风干,用自封袋密封,每袋放一小包干燥剂。4℃保存,备用。
加样品:用PBS-T将实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白标准品稀释成4000ng/ml、2000ng/ml、1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/ml、62.5ng/ml。各孔分别加入100μl上述标准品、0.01mol/L PBS-T和待测样品。37℃反应60min,用PBS-T洗涤4次,拍干。
加HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG:用PBS-T(含10%小牛血清及0.03%proclin300)将实施例2制备的HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG稀释成适当比例(1∶500~1∶1000)。每孔加入100μl已稀释的HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG,振荡混匀,37℃反应60min,用PBS-T洗涤4次,拍干。
显色:每孔加入底物显色剂A(0.1mol/L乙酸钠-柠檬酸缓冲液,含0.0038mol/L过氧化氢,2万单位/L庆大霉素,pH5.0),显色剂B(0.02mol/L Tris盐酸缓冲液,含0.0005mol/L二水合乙二胺四乙酸二钠,0.0013mol/L TMB盐酸盐),37℃反应10min。
比色:每孔加入终止液(2mol/L H2SO4)50μl,振荡混匀。于酶标仪450nm波长读取各孔OD值。
计算:将各浓度标准品及样品OD值减去0ng/ml标准品(即样品稀释液:0.01mol/L PBS-T)的OD值(消零),绘制标准曲线。显示直线回归方程及R2值。参照标准曲线计算样品Vero细胞HCP含量。
实施例7标准曲线的相关性
用实施例1制备的Vero细胞裂解蛋白标准品,自4000ng/ml倍比稀释至62.5ng/ml的不同浓度,按照实施例6所述进行检测,以Vero细胞裂解蛋白标准品浓度为纵坐标,将各浓度标准品OD值减去0ng/ml标准品(即样品稀释液:0.01mol/L PBS-T)的OD值(消零)×1000为横坐标,绘制其曲线图为一条近似的直线,参见图2。标准品浓度在62.5~4000ng/ml之间时,相关性成立(R2≥0.99)。
表9Vero细胞裂解蛋白标准品测定结果
Vero细胞标准品含量(ng/ml) | 62.5 | 125 | 250 | 500 | 1000 | 2000 | 4000 |
OD450nm | 0.057 | 0.100 | 0.217 | 0.396 | 0.880 | 1.623 | 3.135 |
实施例8一种Vero细胞HCP检测试剂盒
包被豚鼠抗Vero细胞裂解蛋白IgG的反应板 96孔×1块
标准品(实施例1制备的纯化Vero细胞裂解蛋白,8000ng/ml) 500μl×1瓶
HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG 50μl×1瓶
酶稀释液 20ml×1瓶
20×PBS洗涤液 50ml×1瓶
显色剂A 7ml×1瓶
显色剂B 7ml×1瓶
终止液(2mol/L H2SO4) 7ml×1瓶
实施例9一种Vero细胞HCP检测试剂盒
包被兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG的反应板 96孔×1块
标准品(实施例1制备的纯化Vero细胞裂解蛋白,8000ng/ml) 500μl×1瓶
HRP-兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG 50μl×1瓶
酶稀释液 20ml×1瓶
20×PBS洗涤液 50ml×1瓶
显色剂A 7ml×1瓶
显色剂B 7ml×1瓶
终止液(2mol/L H2SO4) 7ml×1瓶
实施例10 Vero细胞HCP检测试剂盒特异性试验
实施例8所述试剂盒主要用来检测Vero细胞疫苗生产中的中间产品中宿主细胞蛋白含量,这些中间产品可能含有的除宿主细胞蛋白外的其他成分不应产生对本检测的干扰,这些成分主要有:小牛血清、细胞培养液、BSA、卵清蛋白、甲型肝炎病毒(HAV)、抗HAV-IgG、胰酶、水解乳蛋白。因此,以小牛血清、细胞培养液、2%BSA、2%卵清蛋白、HAV(1∶4稀释,2.7ug/ml)、抗HAV-IgG(2IU/mL)、0.25%胰酶、2%水解乳蛋白作为样品,采用实施例8所述试剂盒,按照实施例6所述进行检测,判断该检测方法的特异性。
结果参见图3,图中1)Vero细胞裂解蛋白标准品;2)PBS-T;3)细胞培养液;4)小牛血清;5)BSA;6)卵清蛋白;7)HAV;8)HAV-IgG;9)胰酶;10)水解乳蛋白。结果表明本发明的检测试剂盒与小牛血清、细胞培养液、BSA、卵清蛋白、HAV、抗HAV-IgG、胰酶、水解乳蛋白无交叉反应,具有很高的特异性。
实施例11 Vero细胞HCP检测试剂盒精密性试验
采用实施例8所述试剂盒,按照实施例6所述的方法在同一块板条上测定1000ng/ml标准品10孔的OD450nm值,重复试验三次,计算批内变异系数(CV%)平均为6.0%。
表10测定1000ng/ml标准品OD450nm值
实施例12疫苗样品检测及重复性试验:
参考中国专利号ZL 0210685.9中的描述中的描述生产甲型肝炎灭活疫苗样品4批,采用实施例8所述试剂盒,按照实施例6所述方法进行检测6次,Vero细胞HCP含量结果如表11所示。平均CV=6.2%,重复性良好。
表11疫苗样品Vero细胞HCP含量
实施例13回收率试验
采用实施例8所述试剂盒,按照实施例6所述步骤,以NO.3批疫苗样品(对倍稀释后)稀释HCP标准品,与用PBS-T稀释的标准品同时检测,HCP在疫苗样品中的回收率平均为96%(参见表12、13)。表明疫苗样品基质对本方法测定HCP的特异性无任何干扰。
表12 Vero细胞裂解蛋白(HCP)标准品及疫苗样品(对倍稀释)测定结果
HCP标准品含量(ng/ml) | 62.5 | 125 | 250 | 500 | 1000 | 2000 | 4000 | 疫苗样品(ng/ml) | 133 |
OD450nm | 0.057 | 0.100 | 0.217 | 0.396 | 0.880 | 1.623 | 3.135 | 疫苗样品OD450nm | 0.130 |
表13:回收率检测
本发明的范围不受所述具体实施方案的限制,所述实施方案只欲作为阐明本发明各个方面的单个例子,本发明范围内还包括功能等同的方法和组分。实际上,除了本文所述的内容外,本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。上文提及的每篇参考文献皆全文列入本文作为参考。
Claims (20)
1.一种Vero细胞HCP检测试剂盒,包括固相、位于固相中的抗体、标记物偶联抗体、蛋白标准品,其特征在于所述抗体为以Vero细胞裂解蛋白为抗原制备的抗体,所述蛋白标准品为Vero细胞裂解蛋白,所述Vero细胞裂解蛋白通过以下步骤制备:
a)细胞培养收获:Vero细胞接种到细胞培养瓶中,加入含10%小牛血清的M199培养液后置37±1℃培养,待细胞生长成致密单层后用胰蛋白酶消化Vero细胞进行传代扩增,置35±1℃培养25天收获;用胰蛋白酶进行消化,以3500rpm、4℃离心30分钟,收集细胞沉淀;
b)细胞破碎:收获的Vero细胞用超声方法进行破碎,以1400W输出功率,细胞破碎;
c)氯仿抽提蛋白:在破碎后的细胞液中加入等体积的氯仿,在往复式振荡器上以300rpm的速率振荡20min,使氯仿与细胞液充分接触,待蛋白沉淀后,用4000rpm、4℃、20min离心,抽取上层的蛋白水相,向离心杯中补充等量的0.01mol/L PBS pH7.8反复提取4次;
d)浓缩:合并所有的抽提液,用MWCO100KD的超滤膜进行浓缩;将超滤浓缩液加入到1.0mol/L PB pH6.8缓冲盐并使缓冲盐充分溶解;
e)纯化:以50cm/h的流速经Phenyl Sepharose6Fast Flow型疏水凝胶吸附,吸附完毕用1.0mol/L PB pH6.8溶液淋洗3CV后,开始用0.02mol/L PBpH6.8溶液进行线性洗脱5CV,收集电导值低于48mS/cm的洗脱液;收集的洗脱液用MWCO100KD的超滤膜进行浓缩,后上样于Sepharose4FastFlow型分子筛凝胶,用0.01mol/L PBS pH7.4溶液以45cm/h的流速进行洗脱,收集第二洗脱峰;
f)甲醛灭活:在收集峰中加入甲醛至终浓度为1:4000,经37±1℃、12天处理;
g)再次浓缩:将灭活后处理液先经用MWCO100KD的超滤膜浓缩至200ml,再用50ml离心管浓缩至30ml,即可获得特异性Vero细胞裂解蛋白。
2.根据权利要求1所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述抗Vero细胞裂解蛋白抗体为豚鼠抗Vero细胞裂解蛋白IgG或兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG。
3.根据权利要求1所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述标记物偶联抗体中标记物为酶、核素或荧光素中之一。
4.根据权利要求3所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述酶选自过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或6-磷酸葡糖脱氢酶中之一。
5.根据权利要求3所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述核素选自3H、188Re或131I中之一。
6.根据权利要求3所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述荧光素选自异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或3价镧系螯合物中之一。
7.一种Vero细胞HCP检测试剂盒,包括固相、位于固相中的抗体、生物素修饰的抗体以及标记物偶联的抗生物素蛋白,其特征在于所述抗体为以Vero细胞裂解蛋白为抗原制备的抗体,所述蛋白标准品为Vero细胞裂解蛋白,所述Vero细胞裂解蛋白通过以下步骤制备:
a)细胞培养收获:Vero细胞接种到细胞培养瓶中,加入含10%小牛血清的M199培养液后置37±1℃培养,待细胞生长成致密单层后用胰蛋白酶消化Vero细胞进行传代扩增,置35±1℃培养25天收获;用胰蛋白酶进行消化,以3500rpm、4℃离心30分钟,收集细胞沉淀;
b)细胞破碎:收获的Vero细胞用超声方法进行破碎,以1400W输出功率,细胞破碎;
c)氯仿抽提蛋白:在破碎后的细胞液中加入等体积的氯仿,在往复式振荡器上以300rpm的速率振荡20min,使氯仿与细胞液充分接触,待蛋白沉淀后,用4000rpm、4℃、20min离心,抽取上层的蛋白水相,向离心杯中补充等量的0.01mol/L PBS pH7.8反复提取4次;
d)浓缩:合并所有的抽提液,用MWCO100KD的超滤膜进行浓缩;将超滤浓缩液加入到1.0mol/L PB pH6.8缓冲盐并使缓冲盐充分溶解;
e)纯化:以50cm/h的流速经Phenyl Sepharose6Fast Flow型疏水凝胶吸附,吸附完毕用1.0mol/L PB pH6.8溶液淋洗3CV后,开始用0.02mol/L PBpH6.8溶液进行线性洗脱5CV,收集电导值低于48mS/cm的洗脱液;收集的洗脱液用MWCO100KD的超滤膜进行浓缩,后上样于Sepharose4FastFlow型分子筛凝胶,用0.01mol/L PBS pH7.4溶液以45cm/h的流速进行洗脱,收集第二洗脱峰;
f)甲醛灭活:在收集峰中加入甲醛至终浓度为1:4000,经37±1℃、12天处理;
g)再次浓缩:将灭活后处理液先经用MWCO100KD的超滤膜浓缩至200ml,再用50ml离心管浓缩至30ml,即可获得特异性Vero细胞裂解蛋白。
8.根据权利要求7所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述抗Vero细胞裂解蛋白抗体为豚鼠抗Vero细胞裂解蛋白IgG或兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG。
9.根据权利要求7所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述标记物偶联的抗生物素蛋白中标记物为酶、核素或荧光素中之一。
10.根据权利要求7所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述酶选自过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或6-磷酸葡糖脱氢酶中之一。
11.根据权利要求7所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述核素选自3H、188Re或131I中之一。
12.根据权利要求7所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述荧光素选自异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或3价镧系螯合物中之一。
13.一种Vero细胞HCP检测试剂盒,包括固相、位于固相中的抗体、2,4-二硝基苯酚修饰的抗体以及标记物偶联的抗2,4-二硝基苯酚抗体,所述抗体为以Vero细胞裂解蛋白为抗原制备的抗体,所述蛋白标准品为Vero细胞裂解蛋白,所述Vero细胞裂解蛋白通过以下步骤制备:
a)细胞培养收获:Vero细胞接种到细胞培养瓶中,加入含10%小牛血清的M199培养液后置37±1℃培养,待细胞生长成致密单层后用胰蛋白酶消化Vero细胞进行传代扩增,置35±1℃培养25天收获;用胰蛋白酶进行消化,以3500rpm、4℃离心30分钟,收集细胞沉淀;
b)细胞破碎:收获的Vero细胞用超声方法进行破碎,以1400W输出功率,细胞破碎;
c)氯仿抽提蛋白:在破碎后的细胞液中加入等体积的氯仿,在往复式振荡器上以300rpm的速率振荡20min,使氯仿与细胞液充分接触,待蛋白沉淀后,用4000rpm、4℃、20min离心,抽取上层的蛋白水相,向离心杯中补充等量的0.01mol/L PBS pH7.8反复提取4次;
d)浓缩:合并所有的抽提液,用MWCO100KD的超滤膜进行浓缩;将超滤浓缩液加入到1.0mol/L PB pH6.8缓冲盐并使缓冲盐充分溶解;
e)纯化:以50cm/h的流速经Phenyl Sepharose6Fast Flow型疏水凝胶吸附,吸附完毕用1.0mol/L PB pH6.8溶液淋洗3CV后,开始用0.02mol/L PBpH6.8溶液进行线性洗脱5CV,收集电导值低于48mS/cm的洗脱液;收集的洗脱液用MWCO100KD的超滤膜进行浓缩,后上样于Sepharose4FastFlow型分子筛凝胶,用0.01mol/L PBS pH7.4溶液以45cm/h的流速进行洗脱,收集第二洗脱峰;
f)甲醛灭活:在收集峰中加入甲醛至终浓度为1:4000,经37±1℃、12天处理;
g)再次浓缩:将灭活后处理液先经用MWCO100KD的超滤膜浓缩至200ml,再用50ml离心管浓缩至30ml,即可获得特异性Vero细胞裂解蛋白。
14.根据权利要求13所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述抗Vero细胞裂解蛋白抗体为豚鼠抗Vero细胞裂解蛋白IgG或兔抗Vero细胞裂解蛋白IgG。
15.根据权利要求13所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述标记物偶联的抗生物素蛋白中标记物为酶、核素或荧光素中之一。
16.根据权利要求15所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述酶选自过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶或6-磷酸葡糖脱氢酶中之一。
17.根据权利要求15所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述核素选自3H、188Re或131I中之一。
18.根据权利要求15所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述荧光素选自异硫氰酸荧光素、四乙基罗丹明、四甲基异硫氰酸罗丹明或3价镧系螯合物中之一。
19.根据权利要求1-18中任一项所述Vero细胞HCP检测试剂盒,其特征在于所述固相可为ELISA试验平板或蛋白芯片载体。
20.权利要求1、7或13中任一项所述Vero细胞HCP检测试剂盒在Vero细胞HCP检测中的应用。
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