CN109564217A - 用于检测宿主细胞蛋白的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

除了其他以外，本申请公开了用于在产品(例如，重组蛋白，例如抗体)生产过程中对宿主细胞蛋白进行检测和/或定量的方法和组合物。

Description

用于检测宿主细胞蛋白的组合物和方法
相关申请
本申请要求2016年4月14日提交的美国临时申请号62/322,621的优先权，其全部内容通过引入并入本申请。
技术领域
本公开内容涉及在产品(例如重组蛋白，例如抗体)生产过程中对宿主细胞蛋白杂质进行检测和/或定量的方法。
背景技术
宿主细胞蛋白(HCP)是一种不需要的宿主蛋白的复杂混合物，其可能存在于经过多种生产工艺后的最终产品中。除了其他以外，那些HCP可能对产品的有效性和患者的安全性构成风险。因此，需要对最终的生物医药产品中的HCP进行检测和定量的方法。
发明内容
除了其他以外，本公开内容提供了一种用于检测HCP的具有较高灵敏度的方法。在一个方面中，本申请公开了用于检测、监测、鉴定或定量含有重组多肽的样品中GS-CHO宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：a)提供或获得含有重组多肽的样品；b)将所述样品与固定化于固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；c)将所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；d)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；e)使用用于所述可检测抗体的检测方法检测与所述抗体结合的GS-CHO HCP的存在情况；f)任选地对所检测的GS-CHO HCP的水平进行定量；g)任选地对所检测的一种或多种GS-CHO HCP进行鉴定；以及h)任选地对所鉴定的所述一种或多种GS-CHO HCP进行定量。
在一些实施方式中，重组多肽是均聚物或异聚物多肽，例如，激素、生长因子、受体、抗体、细胞因子、受体配体、转录因子或酶，优选地抗体或抗体片段，例如人源抗体或人源化抗体或其片段，例如来源于小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊或奶牛抗体(通常是家兔来源的)人源化抗体或其片段。在一些实施方式中，重组多肽是治疗性多肽。在一些实施方式中，重组多肽是表1中公开的多肽。在一些实施方式中，重组多肽是表2中公开的多肽。在一些实施方式中，重组多肽是抗体。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，单克隆抗体是治疗性抗体。
在一些实施方式中，样品来自在所述重组多肽生产过程中的下游处理步骤。在一些实施方式中，样品来自在所述重组多肽生产过程中的上游处理步骤。在一些实施方式中，样品来自所述重组多肽的最终产品。在一些实施方式中，所述方法包括来自在所述重组多肽生产过程中的一个或多个步骤的2、3、4、5、6、7、8、9、10或者10个以上样品。在一些实施方式中，可检测抗体是直接可检测的。在一些实施方式中，可检测抗体是通过荧光测定试剂放大的。在一些实施方式中，可检测抗体是生物素化的以及检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
在一个方面中，本公开内容提供了生产重组多肽药品的方法，所述方法包括：a)提供或获得重组多肽制品的样品；b)将所述样品与固定化于固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；c)将所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；d)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；e)使用用于所述可检测抗体的检测方法对与所述捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及f)如果所述GS-CHO HCP的水平低于预先设定的参照水平，则将所述制品的至少一部分加工成药品，从而生产重组多肽药品。
在一些实施方式中，加工包括下述中的一种或多种：配制所述多肽制品；将所述多肽制品加工成药品；将所述多肽制品与第二成分(例如，赋形剂或缓冲剂)组合；改变所述多肽在所述制品中的浓度；将所述多肽制品冻干；将所述多肽的第一份和第二份组合以提供更大的第三份；将所述多肽制品分成更小的份；将所述多肽制品置于容器(例如，气体或液体密封的容器)中；包装所述多肽制品；将包含所述多肽制品的容器与标签结合(例如，贴签)；将所述多肽制品运输或移动到不同位置。
在一些实施方式中，加工步骤包括将所述多肽制品与赋形剂或缓冲剂组合。在一些实施方式中，参照水平是约100ppm(例如，低于100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、1ppm)。在一些实施方式中，参照水平是1ppm至1000ppm之间。在一些实施方式中，参照水平是至少1ppm、10pppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm。在一些实施方式中，参照水平是不超过1ppm、5ppm、10pppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm。在一些实施方式中，GS-CHO HCP的水平低于所述参照水平是所述药品的出厂检查合格标准。在一些实施方式中，GS-CHO HCP的水平低于所述参照水平是根据公共卫生服务(PHS)法案第351(a)条的规定的所述药品的出厂检查合格标准。在一些实施方式中，GS-CHO HCP的水平来自1个、2个或更多个样品或批次。
在一些实施方式中，重组多肽是均聚物或异聚物多肽，例如，激素、生长因子、受体、抗体、细胞因子、受体配体、转录因子或酶，优选地抗体或抗体片段，例如人源抗体或人源化抗体或其片段，例如来源于小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊或奶牛抗体(通常是家兔来源的)人源化抗体或其片段。在一些实施方式中，重组多肽是治疗性多肽。在一些实施方式中，重组多肽是表1中公开的多肽。在一些实施方式中，重组多肽是表2中公开的多肽。在一些实施方式中，重组多肽是抗体。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，单克隆抗体是治疗性抗体。
在一些实施方式中，样品来自在所述重组多肽生产过程中的下游处理步骤。在一些实施方式中，样品来自在所述重组多肽生产过程中的上游处理步骤。在一些实施方式中，样品来自所述重组多肽的最终产品。在一些实施方式中，所述方法包括来自在所述重组多肽生产过程中的一个或多个步骤的2、3、4、5、6、7、8、9、10或者10个以上样品。在一些实施方式中，可检测抗体是直接可检测的。在一些实施方式中，可检测抗体是通过荧光测定试剂放大的。在一些实施方式中，可检测抗体是生物素化的以及检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
在一个方面中，本公开内容提供了生产重组多肽药品的方法，所述方法包括：a)在适于生产(例如，表达和分泌)重组多肽的条件下培养GS-CHO细胞，b)将分泌的重组多肽与宿主细胞分离；c)对所述分泌的重组多肽进行一个或多个纯化步骤以生产重组多肽制品；d)采集重组多肽制品的样品；e)将所述样品与固定化在固体支持物上的多克隆抗-GS-CHOHCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；c)将所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；f)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；g)使用用于所述可检测抗体的检测方法对与所述捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及h)如果所述GS-CHO HCP的水平低于预先设定的参照水平，则将所述制品的至少一部分加工成药品，从而生产重组多肽药品。
在一些实施方式中，加工包括下述中的一种或多种：配制所述多肽制品；将所述多肽制品加工成药品；将所述多肽制品与第二成分(例如，赋形剂或缓冲剂)组合；改变所述多肽在所述制品中的浓度；将所述多肽制品冻干；将所述多肽的第一份和第二份组合以提供更大的第三份；将所述多肽制品分成更小的份；将所述多肽制品置于容器(例如，气体或液体密封的容器)中；包装所述多肽制品；将包含所述多肽制品的容器与标签结合(例如，贴签)；将所述多肽制品运输或移动到不同位置。
在一些实施方式中，加工步骤包括将所述多肽制品与赋形剂或缓冲剂组合。在一些实施方式中，参照水平是约100ppm(例如，低于100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、1ppm)。在一些实施方式中，参照水平是1ppm至1000ppm之间。在一些实施方式中，参照水平是至少1ppm、10pppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm。在一些实施方式中，参照水平是不超过1ppm、5ppm、10pppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm。在一些实施方式中，GS-CHO HCP的水平低于所述参照水平是所述药品的出厂检查合格标准。在一些实施方式中，GS-CHO HCP的水平低于所述参照水平是根据公共卫生服务(PHS)法案第351(a)条的规定的所述药品的出厂检查合格标准。在一些实施方式中，GS-CHO HCP的水平来自1个、2个或更多个样品或批次。
在一些实施方式中，重组多肽是均聚物或异聚物多肽，例如，激素、生长因子、受体、抗体、细胞因子、受体配体、转录因子或酶，优选地抗体或抗体片段，例如人源抗体或人源化抗体或其片段，例如来源于小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊或奶牛抗体(通常是家兔来源的)人源化抗体或其片段。在一些实施方式中，重组多肽是治疗性多肽。在一些实施方式中，重组多肽是表1中公开的多肽。在一些实施方式中，重组多肽是表2中公开的多肽。在一些实施方式中，重组多肽是抗体。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，单克隆抗体是治疗性抗体。
在一些实施方式中，样品来自在所述重组多肽生产过程中的下游处理步骤。在一些实施方式中，样品来自在所述重组多肽生产过程中的上游处理步骤。在一些实施方式中，样品来自所述重组多肽的最终产品。在一些实施方式中，所述方法包括来自在所述重组多肽生产过程中的一个或多个步骤的2、3、4、5、6、7、8、9、10或者10个以上样品。在一些实施方式中，可检测抗体是直接可检测的。在一些实施方式中，可检测抗体是通过荧光测定试剂放大的。在一些实施方式中，可检测抗体是生物素化的以及检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
在一个方面中，本公开内容提供了生产重组多肽药品的方法，所述方法包括：a)提供或获得来自GS-CHO细胞培养物的重组多肽制品的样品；b)获取所述样品中GS-CHO宿主细胞蛋白(HCP)的值，其中所述值是多克隆GS-CHO抗体与所述样品结合的函数、与其成比例或从其获得，从而生产重组多肽药品。在一些实施方式中，所述方法包括：评价所获取的值，例如通过将所述所获取的值与参照值比较。在一些实施方式中，所述方法包括：对所述评价做出响应，分类、选择、接受、放行、加工成药品，运输、移动到不同位置，制剂、贴签、包装、商业推广、销售或准备销售的所述制品。在一些实施方式中，通过本申请所述的方法确定所述值。
在一些实施方式中，重组多肽是均聚物或异聚物多肽，例如，激素、生长因子、受体、抗体、细胞因子、受体配体、转录因子或酶，优选地抗体或抗体片段，例如人源抗体或人源化抗体或其片段，例如来源于小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊或奶牛抗体(通常是家兔来源的)人源化抗体或其片段。在一些实施方式中，重组多肽是治疗性多肽。在一些实施方式中，重组多肽是表1中公开的多肽。在一些实施方式中，重组多肽是表2中公开的多肽。在一些实施方式中，重组多肽是抗体。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，单克隆抗体是治疗性抗体。
在一些实施方式中，样品来自在所述重组多肽生产过程中的下游处理步骤。在一些实施方式中，样品来自在所述重组多肽生产过程中的上游处理步骤。在一些实施方式中，样品来自所述重组多肽的最终产品。在一些实施方式中，所述方法包括来自在所述重组多肽生产过程中的一个或多个步骤的2、3、4、5、6、7、8、9、10或者10个以上样品。在一些实施方式中，可检测抗体是直接可检测的。在一些实施方式中，可检测抗体是通过荧光测定试剂放大的。在一些实施方式中，可检测抗体是生物素化的以及检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
在一个方面中，本公开内容提供了评价在GS-CHO宿主细胞中生产重组多肽的方法的方法，所述方法包括：a)在适于生产(例如，表达和分泌)重组多肽的条件下培养GS-CHO细胞，b)将分泌的重组多肽与宿主细胞分离以提供第一多肽制品；c)任选地采集所述第一多肽制品的样品；d)对所述第一多肽制品进行纯化步骤以生产第二多肽制品；e)采集所述第二多肽制品的样品；f)任选地对所述第二多肽制品进行第二个、第三个、第四个、第五个或第六个纯化步骤以提供随后的多肽制品；g)任选地采集步骤f)中提供的任意随后的多肽制品的样品；h)将所采集的每个所述样品与固定化在固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；i)将每个所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；j)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；k)使用用于所述可检测抗体的检测方法对与所述捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及l)基于所述定量，对所述方法做出决定，从而评价生产重组多肽的方法。
在一些实施方式中，所述方法包括将所述GS-CHO HCP的水平与参照水平进行比较，例如其中如果所述GS-CHO HCP的水平低于参照水平，则验证了用于生产所述重组多肽的方法。
在一些实施方式中，参照水平是：i)在1ppm至1000ppm之间，ii)至少1ppm、10pppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm，或者iii)不超过1ppm、5ppm、10pppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm。
在一些实施方式中，重组多肽是均聚物或异聚物多肽，例如，激素、生长因子、受体、抗体、细胞因子、受体配体、转录因子或酶，优选地抗体或抗体片段，例如人源抗体或人源化抗体或其片段，例如来源于小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊或奶牛抗体(通常是家兔来源的)人源化抗体或其片段。在一些实施方式中，重组多肽是治疗性多肽。在一些实施方式中，重组多肽是表1中公开的多肽。在一些实施方式中，重组多肽是表2中公开的多肽。在一些实施方式中，重组多肽是抗体。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，单克隆抗体是治疗性抗体。
在一些实施方式中，样品来自在所述重组多肽生产过程中的下游处理步骤。在一些实施方式中，样品来自在所述重组多肽生产过程中的上游处理步骤。在一些实施方式中，样品来自所述重组多肽的最终产品。在一些实施方式中，所述方法包括来自在所述重组多肽生产过程中的一个或多个步骤的2、3、4、5、6、7、8、9、10或者10个以上样品。在一些实施方式中，可检测抗体是直接可检测的。在一些实施方式中，可检测抗体是通过荧光测定试剂放大的。在一些实施方式中，可检测抗体是生物素化的以及检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
在一个方面中，本公开内容提供了评价纯化重组多肽的方法的方法，所述方法包括：a)对所述第一多肽制品进行纯化步骤以生产第二多肽制品；b)采集所述第二多肽制品的样品；c)任选地对所述第二多肽制品进行第二个、第三个、第四个、第五个或第六个纯化步骤以提供随后的多肽制品；d)任选地采集步骤c)中提供的任意随后的多肽制品的样品；e)将所采集的每个所述样品与固定化在固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；f)将每个所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；g)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；h)使用用于所述可检测抗体的检测方法对与所述捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及i)基于所述定量，对所述方法做出决定，从而评价纯化重组多肽的方法。
在一些实施方式中，所述方法包括：将所述GS-CHO HCP的水平与参照水平进行比较。在一些实施方式中，如果所述GS-CHO HCP的水平低于参照水平，则验证了用于生产所述重组多肽的方法。在一些实施方式中，参照水平在1ppm至1000ppm之间。在一些实施方式中，参照水平是至少1ppm、10pppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm。在一些实施方式中，参照水平是不超过1ppm、5ppm、10pppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm。
在一些实施方式中，纯化步骤包括下述中的一种或多种或者其任意组合：体积排阻色谱(SEC)、离子交换色谱(IEX)、疏水性相互作用色谱(HIC)、反相色谱(RPC)、固定化金属螯合色谱、硫酸铵沉淀、亲硫吸附、蛋白A层析、蛋白G层析、蛋白L层析和亲和层析。
在一些实施方式中，纯化步骤包括一个或多个亲和层析步骤。在一些实施方式中，纯化步骤包括蛋白A层析和一个或多个亲和层析步骤。在一些实施方式中，纯化步骤包括：蛋白A层析和CNBr层析。在一些实施方式中，纯化步骤包括：蛋白A层析和随后的CNBr层析。在一些实施方式中，纯化步骤包括：蛋白A层析和NHS层析。在一些实施方式中，纯化步骤包括：蛋白A层析和随后的NHS层析。
在一些实施方式中，纯化步骤包括：i)蛋白A层析和一个或多个亲和层析步骤，ii)蛋白A层析和CNBr层析，例如蛋白A层析和随后的CNBr层析，或iii)蛋白A层析和NHS层析，例如蛋白A层析和随后的NHS层析。
在一些实施方式中，重组多肽是均聚物或异聚物多肽，例如，激素、生长因子、受体、抗体、细胞因子、受体配体、转录因子或酶，优选地抗体或抗体片段，例如人源抗体或人源化抗体或其片段，例如来源于小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊或奶牛抗体(通常是家兔来源的)人源化抗体或其片段。在一些实施方式中，重组多肽是治疗性多肽。在一些实施方式中，重组多肽是表1中公开的多肽。在一些实施方式中，重组多肽是表2中公开的多肽。在一些实施方式中，重组多肽是抗体。在一些实施方式中，抗体是单克隆抗体。在一些实施方式中，单克隆抗体是治疗性抗体。
在一些实施方式中，样品来自在所述重组多肽生产过程中的下游处理步骤。在一些实施方式中，样品来自在所述重组多肽生产过程中的上游处理步骤。在一些实施方式中，样品来自所述重组多肽的最终产品。在一些实施方式中，所述方法包括来自在所述重组多肽生产过程中的一个或多个步骤的2、3、4、5、6、7、8、9、10或者10个以上样品。在一些实施方式中，可检测抗体是直接可检测的。在一些实施方式中，可检测抗体是通过荧光测定试剂放大的。在一些实施方式中，可检测抗体是生物素化的以及检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
在一个方面中，本申请提供了试剂盒，所述试剂盒包含：a)固定化在固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体；b)任选地可检测抗体；c)任选地洗涤缓冲液；和d)任选地检测试剂。在一些实施方式中，检测试剂与捕获试剂相同。在一些实施方式中，检测试剂与捕获试剂相同但仅经过修饰以通过荧光测定试剂放大。在一些实施方式中，检测抗体是生物素化的并且检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
在一个方面中，本申请提供了纯化的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体制品。在一些实施方式中，抗-GS-CHO抗体是绵羊抗体。在一些实施方式中，抗-GS-CHO抗体是山羊、马、家兔、牛、小鼠、仓鼠或人抗体。在一些实施方式中，制品基本上不含非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，制品含有不超过0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，制品含有少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％的非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，通过包括下述的方法进行纯化：蛋白A层析和一个或多个亲和层析步骤(例如，CNBr层析，NHS层析)。
在一个方面中，本申请提供了反应混合物，所述反应混合物包含抗-GS-CHO抗体的多克隆制品(例如，本申请所述的多克隆制品)和选自表1或表2的重组多肽。在一些实施方式中，反应混合物包含与抗-GS-CHO抗体结合的抗体。
在一个方面中，本申请提供了确定是否某一批次或批号的重组多肽药品符合或满足出厂合格标准的方法，其中所述合格标准是预先确定的GS-CHO HCP的参照水平，所述方法包括：a)提供或获得重组多肽制品的样品；b)将所述样品与固定化在固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；c)将所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；d)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；e)使用用于所述可检测抗体的检测方法对与所述捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及f)如果所述GS-CHO HCP的水平符合、满足或低于所述出厂合格标准，则将所述制品的至少一部分加工成药品，从而确定是否某一批次或批号的重组多肽药品符合或满足出厂合格标准。在一些实施方式中，加工包括：分类、选择、接受、放行、加工成药品，运输、移动到不同位置，制剂、贴签、包装、商业推广、销售或准备销售的所述制品。在一些实施方式中，通过本申请所述的方法确定所述值。
在一个方面中，本申请公开了制备多克隆抗-HCP抗体制品的方法，所述方法包括：a)获取包含抗体的样品，例如来自使用宿主细胞(例如，细胞系，例如哺乳动物、啮齿动物或昆虫细胞或细胞系，例如CHO、SP2、NSO宿主细胞)的HCP免疫的动物(例如，绵羊、家兔、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊等)的抗血清；以及b)从所述样品中分离抗-HCP抗体，例如将所述样品与HCP亲和试剂接触，从而生产多克隆抗-HCP抗体制品。
在一些实施方式中，步骤b)包括：b.1)从所述样品中分离抗体(例如，IgG抗体)以提供抗体制品；和b.2)从所述抗体制品中分离抗-HCP抗体。在一些实施方式中，分离抗体包括将所述抗体与亲和试剂(例如，蛋白A)接触。在一些实施方式中，分离抗体包括通过包括蛋白A层析的纯化方法从抗血清中纯化多克隆抗-HCP抗体。在一些实施方式中，从抗体制品中分离抗-HCP抗体包括将所述抗体制品与HCP-亲和试剂接触。在一些实施方式中，HCP-亲和试剂包含与基底偶联的HCP，例如不溶性或固体基底，例如琼脂糖小珠，例如葡聚糖凝胶(Sepharase)，例如溴化氰(CNBr)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)层析衍生化的基底。
在一些实施方式中，纯化除去至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，纯化除去至少99％的非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，纯化除去超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，纯化除去超过99％的非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，多克隆抗体制品基本上不含非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，多克隆抗体制品含有不超过0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，多克隆抗体制品含有少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％的非-HCP特异性IgG。
在一个方面中，本申请公开了制备用于检测重组多肽制品中HCP的ELISA的多克隆抗-HCP抗体制品的方法，所述方法包括：a)获取包含抗体的样品，例如来自使用宿主细胞(例如，细胞系，例如哺乳动物、啮齿动物或昆虫细胞或细胞系，例如CHO、SP2、NSO宿主细胞)的HCP免疫的动物(例如，绵羊、家兔、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊等)的抗血清；b)通过将所述抗血清与蛋白A亲和试剂接触从所述抗血清中分离抗体以提供抗体制品；c)通过将所述抗体制品与HCP-亲和试剂接触从所述抗体制品中分离抗-HCP抗体，从而生产多克隆抗-HCP抗体制品。
在一些实施方式中，纯化除去至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，纯化除去至少99％的非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，纯化除去超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，纯化除去超过99％的非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，多克隆抗体制品基本上不含非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，多克隆抗体制品含有不超过0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的非-HCP特异性IgG。在一些实施方式中，多克隆抗体制品含有少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％的非-HCP特异性IgG。
在一个方面中，本申请公开了检测、监测、鉴定或定量含有重组多肽的样品中的宿主细胞蛋白(HCP)(例如，CHO HCP)的方法，所述方法包括：a)提供或获得含有重组多肽的样品；b)将所述样品与固定化在固体支持物上的多克隆抗-HCP抗体(例如，抗-CHO HCP抗体)接触并进行孵育以形成固定化的抗体-HCP复合物，其中所述多克隆抗体是由本申请所述的任意方法生产的；c)将所述样品与所述与所述固定化的抗体-HCP复合物分离；d)将所述固定化的抗体-HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；e)使用用于所述可检测抗体的检测方法检测与所述抗体结合的HCP的存在情况；f)任选地对所检测的HCP的水平进行定量；g)任选地对所检测的一种或多种HCP进行鉴定；以及h)任选地对所鉴定的所述一种或多种HCP进行定量。
在一个方面中，本申请公开了本申请公开了检测、监测、鉴定或定量含有重组多肽(例如，治疗性多肽)的样品中的GS-CHO宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：a)提供或获得含有重组多肽的样品；b)将所述样品与固定化在支持物(例如，不溶性或固体支持物)上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；c)将所述样品与固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；d)将固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与可检测试剂(例如，同GS-CHO HCP结合的抗体)接触；e)使用用于所述可检测抗体的检测方法检测与所述抗体结合的GS-CHO HCP的存在情况；f)任选地对所检测的GS-CHO HCP的水平进行定量；g)任选地对所检测的一种或多种GS-CHO HCP进行鉴定；以及h)任选地对所鉴定的所述一种或多种GS-CHO HCP进行定量。
在一些实施方式中，i)重组多肽是均聚物或异聚物多肽，例如，激素、生长因子、受体、抗体、细胞因子、受体配体、转录因子或酶，优选地抗体或抗体片段，例如人源抗体或人源化抗体或其片段，例如来源于小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊或奶牛抗体(通常是家兔来源的)人源化抗体或其片段，或者ii)重组多肽是表1或2中公开的多肽。
在一些实施方式中，重组多肽是抗体，例如单克隆抗体，例如治疗性抗体。
在一些实施方式中，i)样品来自在所述重组多肽生产过程中的下游处理步骤，ii)样品来自在所述重组多肽生产过程中的上游处理步骤，iii)样品来自所述重组多肽的最终产品，或者iv)所述方法包括来自在所述重组多肽生产过程中的一个或多个步骤的2、3、4、5、6、7、8、9、10或者10个以上样品。
在一些实施方式中，可检测抗体是：i)直接可检测的，ii)通过荧光测定试剂放大的，或者iii)生物素化的以及检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
在一个方面中，本申请公开了生产重组多肽(例如，治疗性多肽)药品的方法，所述方法包括：a)提供或获得重组多肽制品的样品；b)将所述样品与固定化于固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；c)将所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；d)将所述固定化的抗体-GS-CHOHCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；e)使用用于所述可检测抗体的检测方法对同所述捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及f)如果所述GS-CHO HCP的水平低于预先设定的参照水平，则将所述制品的至少一部分加工成药品，任选地其中加工包括下述中的一种或多种：配制所述多肽制品；将所述多肽制品加工成药品；将所述多肽制品与第二成分(例如，赋形剂或缓冲剂)组合；改变所述多肽在所述制品中的浓度；将所述多肽制品冻干；将所述多肽的第一份和第二份组合以提供更大的第三份；将所述多肽制品分成更小的份；将所述多肽制品置于容器(例如，气体或液体密封的容器)中；包装所述多肽制品；将包含所述多肽制品的容器与标签结合(例如，贴签)；将所述多肽制品运输或移动到不同位置，从而生产重组多肽药品。
在一个方面中，本申请公开了生产重组多肽(例如，治疗性多肽)药品的方法，所述方法包括：a)在适于生产(例如，表达和分泌)重组多肽的条件下培养GS-CHO细胞，b)将分泌的重组多肽与所述宿主细胞分离；c)对所述分泌的重组多肽进行一个或多个纯化步骤以生产重组多肽制品；d)获取重组多肽制品的样品；e)将所述样品与固定化于固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；c)将所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；f)将所述固定化的抗体-GS-CHOHCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；g)使用用于所述可检测抗体的检测方法对同所述捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及h)如果所述GS-CHO HCP的水平低于预先设定的参照水平，则将所述制品的至少一部分加工成药品，任选地其中加工包括下述中的一种或多种：配制所述多肽制品；将所述多肽制品加工成药品；将所述多肽制品与第二成分(例如，赋形剂或缓冲剂)组合；改变所述多肽在所述制品中的浓度；将所述多肽制品冻干；将所述多肽的第一份和第二份组合以提供更大的第三份；将所述多肽制品分成更小的份；将所述多肽制品置于容器(例如，气体或液体密封的容器)中；包装所述多肽制品；将包含所述多肽制品的容器与标签结合(例如，贴签)；将所述多肽制品运输或移动到不同位置，从而生产重组多肽药品。
在一些实施方式中，参照水平是：i)约100ppm(例如，低于100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、1ppm)，ii)在1ppm至1000ppm之间，iii)至少1ppm、10pppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm，或者iv)不超过1ppm、5ppm、10pppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm。
在一些实施方式中，所述GS-CHO HCP的水平低于所述参照水平是所述药品的出厂检查合格标准(例如，根据公共卫生服务(PHS)法案第351(a)条的规定)，以及任选地其中所述GS-CHO HCP的水平来自1个、2个或更多个样品或批次。
在一些实施方式中，i)重组多肽是均聚物或异聚物多肽，例如，激素、生长因子、受体、抗体、细胞因子、受体配体、转录因子或酶，优选地抗体或抗体片段，例如人源抗体或人源化抗体或其片段，例如来源于小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊或奶牛抗体(通常是家兔来源的)人源化抗体或其片段，或者ii)重组多肽是表1或2中公开的多肽。
在一些实施方式中，重组多肽是抗体，例如单克隆抗体，例如治疗性抗体。
在一些实施方式中，i)样品来自在所述重组多肽生产过程中的下游处理步骤，ii)样品来自在所述重组多肽生产过程中的上游处理步骤，iii)样品来自所述重组多肽的最终产品，或者iv)所述方法包括来自在所述重组多肽生产过程中的一个或多个步骤的2、3、4、5、6、7、8、9、10或者10个以上样品。
在一些实施方式中，可检测抗体是：i)直接可检测的，ii)通过荧光测定试剂放大的，或者iii)生物素化的以及检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
在一个方面中，本申请公开了生产重组多肽药品的方法，所述方法包括：a)提供或获得来自GS-CHO细胞培养物的重组多肽制品的样品；b)获取所述样品中GS-CHO宿主细胞蛋白(HCP)的值；c)任选地评价所获取的值，例如通过将所述所获取的值与参照值比较；以及d)任选地对所述评价做出响应，分类、选择、接受、放行、加工成药品，运输、移动到不同位置，制剂、贴签、包装、商业推广、销售或准备销售的所述制品，其中所述值是多克隆GS-CHO抗体与所述样品结合的函数、与其成比例或从其获得，从而生产重组多肽药品。
在一些实施方式中，通过本申请所述的任意方法确定所述值。
在一个方面中，本申请公开了试剂盒，所述试剂盒包含：a)固定化于固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体；b)任选地可检测抗体；c)任选地洗涤缓冲液；和d)任选地检测试剂，例如检测试剂与捕获试剂相同或与捕获试剂相同但仅经过修饰以通过荧光测定试剂放大，和任选地其中检测抗体是生物素化的并且检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
在一个方面中，本申请公开了纯化的多克隆抗-GS-CHO抗体制品，任选地其中所述抗-GS-CHO抗体是绵羊、山羊、马、家兔、牛、小鼠、仓鼠或人抗体。
在一些实施方式中，所述制品基本上不含非-HCP特异性IgG，例如所述制品含有不超过0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的非-HCP特异性IgG或者所述制品含有少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％的非-HCP特异性IgG。
在一个方面中，本申请公开了确定是否某一批次或批号的重组多肽药品符合或满足出厂合格标准的方法，其中所述合格标准是预先确定的GS-CHO HCP的参照水平，所述方法包括：a)提供或获得重组多肽制品的样品；b)将所述样品与固定化在固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；c)将所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；d)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；e)使用用于所述可检测抗体的检测方法对与所述捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及f)如果所述GS-CHO HCP的水平符合、满足或低于所述出厂合格标准，则将所述制品的至少一部分加工成药品，以及任选地其中加工包括分类、选择、接受、放行、加工成药品，运输、移动到不同位置，制剂、贴签、包装、商业推广、销售或准备销售的所述制品，从而确定是否某一批次或批号的重组多肽药品符合或满足出厂合格标准。
在一个方面中，本申请公开了制备多克隆抗-HCP抗体制品的方法，所述方法包括：a)获取包含抗体的样品，例如来自使用宿主细胞(例如，细胞系，例如哺乳动物、啮齿动物或昆虫细胞或细胞系，例如CHO、SP2、NSO宿主细胞)的HCP免疫的动物(例如，绵羊、家兔、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊等)的抗血清；以及b)从所述样品中分离抗-HCP抗体，例如将所述样品与HCP亲和试剂(例如，蛋白A)接触，以及任选地其中b)包括：b.1)从所述样品中分离抗体(例如，IgG抗体)以提供抗体制品；和b.2)从所述抗体制品中分离抗-HCP抗体，例如通过将所述抗体制品与HCP亲和试剂接触，从而生产多克隆抗-HCP抗体制品。
在一些实施方式中，所述纯化除去：i)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的非-HCP特异性IgG，例如至少99％的非-HCP特异性IgG，或者ii)不超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的非-HCP特异性IgG，例如不超过99％的非-HCP特异性IgG。
在一些实施方式中，多克隆抗体制品基本上不含非-HCP特异性IgG，例如含有不超过0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的非-HCP特异性IgG或者含有少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％的非-HCP特异性IgG。
附图说明
图1描述了绵羊GS-CHO HCP抗体的示例性纯化工艺。
具体实施方式
为了使重组生物药品蛋白可以向人类患者施用，重要的一点是从最终的生物产品中除去由生产和纯化过程产生的残留污染物。这些过程污染物包括培养基蛋白、免疫球蛋白亲和配体、病毒、内毒素、DNA和宿主细胞蛋白(HCP)。HCP可能产生一系列可能影响产品安全性性质的不利影响，包括免疫应答、佐剂活性、直接生物活性或者产品相互作用/降解。这些宿主细胞污染物包括过程特异性HCP，这是来自重组DNA技术的生物制剂中与过程相关的杂质/污染物。
美国和外国法规通常要求除去这种污染物。例如，美国食品和药物管理局(FDA)要求拟供人体内使用的生物药品应尽可能不含外源性免疫球蛋白和非免疫球蛋白污染物，并要求进行对潜在污染物(如HCP)进行检测和定量的检测。国际协调会议(ICH)为生物技术/生物制品的检测程序和合格标准提供了指导原则。该指导原则建议，对于HCP，可以使用能够检测多种蛋白杂质的灵敏的免疫测定。尽管存在可用于检测免疫球蛋白、DNA、内毒素、病毒等的商品化的测定方法和试剂，但是目前尚无能够对细胞系特异性GS-CHOHCP进行检测和定量的商品化试剂或分析方法。
除了其他以外，本公开内容提供了一种耐用的、灵敏的HCP ELISA平台测定法和使用方法，以支持多种表达系统，包括例如哺乳动物表达系统，例如CHOK1SV表达系统。HCPELISA方法的质量主要由2个参数定义(1)定量限(LOQ)和(2)能够作为污染物存在的HCP的覆盖百分比。目前可用的HCP ELISA提供的LOQ为200ng/ml-1000ng/mg和通过点计数确定的覆盖度为40％-60％。本申请所述的ELISA提供的LOQ为2ng/mg和通过点匹配(这是一种比点计数更好的方法)确定的覆盖度为71％，同时满足了这两个参数。平台测定法能够支持对来自稳定细胞系和过程(例如，GS-CHO)的不同产品中HCP的检测。
定义
除非另有定义，否则在本申请中使用的所有技术和科学术语均与本发明所属领域普通技术人员的通常理解具有相同含义。尽管与本申请所述的那些类似或等同的任何方法和材料均可用于本发明的实施和/或测试，但是本申请描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本发明时，将根据所定义的方式使用下述术语，其中提供了所述术语的定义。
还应当理解的是，本申请使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且并非旨在进行限制。
在本申请中使用的冠词“一个”和“一种”指该冠词的一个或多于一个(即，至少一个)语法对象。举例来说，“一个细胞”可以指一个或多于一个细胞。
如在本申请中所使用的，术语“宿主细胞蛋白”或“HCP”指由用于生产重组多肽产品且与预期重组产品无关的生物体产生或编码的任何蛋白。
HCP在最终原料药中是不需要的。
如在本申请中所使用的，术语“GS-CHO”指表达重组谷胱甘肽合成酶(GS)的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。例如，a CHO-K1SV GS(Lonza Biologics,Inc.)。
如在本申请中所使用的，术语“GS-CHO HCP”指来自GS-CHO细胞的宿主细胞蛋白。
如在本申请中所使用的，术语“内源性的”指来自生物体、细胞、组织或系统或者由其内部天然产生的任何物质。
如在本申请中所使用的，术语“外源性的”指引入生物体、细胞、组织或系统或者在其外部产生的任何物质。因此，“外源性核酸”指引入生物体、细胞、组织或系统或者在其外部产生的核酸。在一个实施方式中，外源性核酸的序列不是外源性核酸所引入的生物体、细胞、组织或系统天然产生的，也不是能够在其中发现的。在一个实施方式中，外源性核酸的序列是非天然产生的序列或者编码非天然产生的产品。
如在本申请中所使用的，术语“异源的”指当引入来自不同物种的生物体、细胞、组织或系统时的来自一个物种的任何物质。
如在本申请中所使用的，术语“核酸”、“多核苷酸”或“核酸分子”可以互换使用，指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)或者其DNA或RNA的组合，以及其单链或双链形式的聚合物。术语“核酸”包括但不限于基因、cDNA或mRNA。在一个实施方式中，核酸分子是合成的(例如，化学合成的或人工的)或重组的。除非特别限制，否则该术语包括含有与参照核酸具有相似的结合性质并且以与天然或非天然存在的核苷酸类似的方式代谢的天然核苷酸类似物或衍生物的分子。除非另有说明，否则特定核酸序列还隐含地包括其保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列以及明确指出的序列。特别地，简并密码子取代可以通过产生其中一个或多个选定(或全部)密码子的第三位置被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列实现(Batzer等，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
如在本申请中所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白”可以互换使用，指通过肽键或肽键以外的其他方式共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白或肽必须含有至少两个氨基酸，并且对可包含蛋白质或肽序列的最大氨基酸数量没有限制。在一个实施方式中，蛋白可以含有一个以上(例如，2、3、4、5个或更多个)多肽，其中每个多肽彼此之间通过共价或非共价键/相互作用结合。多肽包括含有彼此之间通过肽键或肽键以外的其他方式连接的两个或多个氨基酸的任何肽或蛋白。如在本申请中所使用的，该术语指多种类型的短链(例如，在本领域中通常还将其称为肽、寡肽和寡聚物)和更长的链(在本领域中通常将其称为蛋白)。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、经修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。
如在本申请中所使用的，“产品”指由细胞生产(例如，表达)的分子、核酸、多肽或其任意杂合体，所述细胞被修饰或经工程化改造以生产所述产品。在一个实施方式中，产品是天然存在的产品或非天然存在的产品，例如合成产品。在一个实施方式中，产品的一部分是天然存在的，而产品的另一部分是非天然存在的。在一个实施方式中，产品是多肽，例如重组多肽。在一个实施方式中，产品适于诊断或临床前用途。在另一个实施方式中，产品适于治疗用途，例如用于治疗疾病。在一个实施方式中，产品选自表1或表2。在一个实施方式中，经修饰或经工程改造的细胞包含控制所述产品表达或编码所述产品的外源性核酸。在其他实施方式中，经修饰或经工程改造的细胞包含控制细胞中的所述产品表达或构建的其他分子(例如，非核酸)。
在一个实施方式中，细胞的修饰包括引入外源性核酸，所述外源性核酸包含控制或改变(例如，增加)内源性核酸序列(例如，内源性基因)表达的核酸序列。在此类实施方式中，经修饰的细胞产生内源性多肽产品，所述内源性多肽产品由细胞天然地或内源性表达，但是与未经修饰的细胞相比(例如，与所述多肽的内源性产生或质量相比)修饰增加了所述产品的产生和/或所述产品的质量。
在另一个实施方式中，细胞的修饰包括引入编码如本申请所述的重组多肽的外源性核酸。在此类实施方式中，经修饰的细胞产生能够天然存在或非天然存在的重组多肽产品。在此类实施方式中，经修饰的细胞产生也能够由细胞内源性表达或不能被细胞内源性表达的重组多肽产品。在重组多肽产品也能够被细胞内源性表达的实施方式中，与未经修饰的细胞相比(例如，与所述多肽的内源性产生或质量相比)，修饰增加了所述产品的产生和/或所述产品的质量。
如在本申请中所使用的，“重组多肽”或“重组蛋白”指能够由本申请所述的细胞产生的多肽。重组多肽是其编码多肽的序列的至少一个核苷酸或控制多肽表达的序列的至少一个核苷酸由(细胞或前体细胞的)基因工程改造形成的多肽。例如，改变至少一个核苷酸，例如将其引入细胞或其是基因工程改造重排的产品。在一个实施方式中，重组多肽的序列与天然存在的多肽或蛋白的同种型没有区别。在一个实施方式中，重组多肽的氨基酸序列不同于天然存在的多肽或蛋白的同种型的序列。在一个实施方式中，重组多肽和细胞来自相同的物种。在一个实施方式中，重组多肽对细胞而言是内源性的，换言之，细胞来自第一物种且重组多肽是第一物种天然存在的。在一个实施方式中，重组多肽的氨基酸序列与由细胞内源性基因组编码的多肽相同或基本上相同或差别不超过1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99％。在一个实施方式中，重组多肽与细胞来自不同物种，例如重组多肽是人多肽，细胞是非人源的，例如啮齿类动物，例如CHO或昆虫细胞。在一个实施方式中，重组多肽对细胞而言是外源性的，换言之，细胞来自第一物种，而重组多肽来自第二物种。在一个实施方式中，多肽是合成的多肽。在一个实施方式中，多肽来自非天然存在的来源。在一个实施方式中，重组多肽是人多肽或蛋白，其与天然存在的人多肽或蛋白的同种型的氨基酸序列不存在差异。在一个实施方式中，重组多肽的不超过1、2、3、4、5、10、15或20个氨基酸残基与天然存在的人多肽或蛋白的同种型不同。在一个实施方式中，重组多肽的不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或15％的氨基酸残基与天然存在的人多肽的同种型不同。
作为在本申请中使用的术语“获取(Acquire或acquiring)”指通过“直接获取”或“间接获取”物理实体或值获得物理实体或值(例如，数值)的过程。“直接获取”指进行获得物理实体或值的过程(例如，进行合成或分析方法)。“间接获取”指从另一方或来源(例如，直接获取物理实体或值的第三方实验室)接收物理实体或值。直接获取物理实体包括进行某一过程，所述过程包括在物理物质(例如，初始原料)中的物理变化。示例性变化包括从两种或多种初始原料制备物理实体，剪切或破碎物质，分离或纯化物质，将两种或多种单独的实体组合成混合物，进行包括破坏或形成共价或非共价键的化学反应。直接获取值包括进行某一过程，所述过程包括在样品或另一物质中的物理变化，例如进行分析过程，其包括在物质(例如，样品、分析物或试剂)中的物理变化(在本申请中有时称为“物理分析”)，进行分析方法，例如包括下述中的一种或多种的方法：从另一物质中分离或纯化物质，例如分析物或者其片段或其他衍生物；将分析物或者其片段或其他衍生物与另一物质(例如，缓冲剂、溶剂或反应物)组合；或者改变分析物或者其片段或其他衍生物的结构，例如通过在分析物的第一和第二原子之间破坏或形成共价或非共价键；或者通过改变试剂或者其片段或其他衍生物的结构，例如通过在试剂的第一和第二原子之间破坏或形成共价或非共价键。
作为在本申请中使用的术语“获取样品”指通过“直接获取”或“间接获取”样品获得样品(例如，组织样品或核酸样品)的过程。“直接获取样品”指进行获得样品的过程(例如，进行物理方法如手术或提取)。“间接获取样品”指从另一方或来源(例如，直接获取样品的第三方实验室)接收样品。直接获取样品包括进行某一过程，所述过程包括在物理物质中的物理变化，例如初始原料，如组织，例如在人患者中的组织或此前已从患者中分离的组织。示例性变化包括从初始原料制备物理实体，解剖或刮取组织；分离或纯化物质(例如，组织样品或核酸样品)；将两种或多种单独的实体组合成混合物，进行包括破坏或形成共价或非共价键的化学反应。直接获取样品包括进行某一过程，所述过程包括在样品或另一物质(例如，如上文所述的)中的物理变化。
作为在本申请中使用的术语“下游处理步骤”指在选择的分离步骤之后或以后(例如，从含有重组蛋白产品的培养基中分离细胞之后或以后)的重组多肽生产过程中的任何步骤。
作为在本申请中使用的术语“上游处理步骤”指在选择的分离步骤之前或以前(例如，从含有细胞的培养基中分离重组蛋白产品之前)的重组多肽生产过程中的任何步骤。
作为在本申请中使用的术语“最终产品”指从其他细胞成分中基本上纯化的重组多肽。在一些实施方式中，最终产品是配制用于储存、运输和/或作为药物使用的最终产品。
作为在本申请中使用的术语“生产过程”指生产重组多肽的方法或一系列步骤。在一些实施方式中，生产过程是设计用于生产重组多肽的生产过程。在一些实施方式中，生产过程是用于纯化重组多肽的方法。在一些实施方式中，生产过程还包括评价步骤、分析步骤和/或基于所述评价和分析的确定步骤。在一些实施方式中，生产过程的最终产品是配制用作药物使用的重组多肽。
在本申请中引用的每件专利、专利申请和出版物的公开内容的全部内容均通过引用并入本申请。尽管已参考特定方面公开了本发明，但是显而易见的是，在不脱离本发明真实精神和范围的前提下，本领域技术人员可以设计出本发明的其他方面和变体。所附权利要求旨在被解释为包括所有这些方面和等同变化。
该过程的一般描述
可以将本申请所述的方法表征为酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA和ELISA变体的一般方法是本领域技术人员公知的。下面是对本申请所述方法的一般描述，仅用于说明方法中涉及步骤的时间轴。公开内容不应以任何方式限于或限制在本说明书。描述这些组件仅用于说明目的。
包被剂(例如，抗-GS-CHO HCP抗体)固定化于固体支持物(例如，微量滴定板)上。一旦将包被剂固定化在固体支持物上，使用封闭缓冲液(例如，含0.2％酪蛋白的1X DPBS)封闭固体支持物上残留的结合位点。封闭缓冲液含有能够与固体支持物非特异性结合以饱和开放的结合位点的组分，从而阻止游离配体与固体支持物上任何过量的位点结合。选择包被和封闭孵育阶段的特定条件以使得固体支持物的包被最大化；并且其变化是本领域技术人员公知的。在将固体支持物包被和封闭后，使用适宜的稀释缓冲液(例如，含0.2％酪蛋白的1X DPBS)对待分析的标准品和/或样品(例如，对HCP进行检测的样品)进行适当稀释并将其加入固定化的支持物。选择标准品/样品孵育阶段的特定条件以使得测定灵敏度最大化和解离最小化；其变化是本领域技术人员公知的。
通过使用适宜洗涤缓冲液(例如，含0.05％20的1XDPBS)以适宜次数(例如，3次，每次300μl)洗涤固体支持物除去任何非固定化标准品/样品(例如，HCP)。选择任何洗涤步骤的特定洗涤缓冲液和洗涤次数以便将本底最小化和将灵敏度最大化；并且其变化是本领域技术人员公知的。然后，可以直接或间接检测任何固定化的标准品/样品。对于间接检测，将针对标准品/样品中目标抗原的抗体(一抗)(例如，抗-GS-CHO HCP抗体)加入固体支持物；并且选择孵育条件以便将信号放大最大化。然后，通过使用适宜洗涤缓冲液以适宜次数洗涤固体支持物以除去任何非固定化抗体。之后，将抗体加入固体支持物，所述抗体与可以通过一些方法检测的部分缀合(检测抗体)并且能够与固定化的标准品或样品中的HCP结合。随后，通过使用适宜洗涤缓冲液以适宜次数洗涤固体支持物以除去任何未结合的检测抗体。可以使用与所使用的检测抗体相容的检测系统确定与包被剂结合的标准品/样品中目标抗原的水平(例如，HCP)。适宜的检测方法将是本领域技术人员公知的。
在对标准品/样品中的目标抗原进行直接检测的情况下，一抗与可以通过一些方法检测的部分缀合，因此其也是检测抗体，即一抗与检测抗体是相同的。随后，通过使用适宜洗涤缓冲液以适宜次数洗涤固体支持物以除去任何未结合的检测抗体。可以使用与所使用的一抗/检测抗体相容的检测系统确定与包被剂结合的标准品/样品中目标抗原的水平(例如，HCP)。适宜的检测系统将是本领域技术人员公知的。
除了其他以外，结果证实了这是一种耐用的、敏感的HCP ELISA平台测定法，以支持多种宿主细胞表达系统，包括例如CHOK1SV表达系统和GS-CHO表达系统。该ELISA测定的灵敏度提高了至少约40倍，其优于未使用本申请所述的纯化多克隆HCP抗体的HCP ELISA。在HCP抗体纯化过程中，超过99％的总IgG未显示出对HCP的免疫应答，因此从最终的HCP抗体中消除。由于跨行业和法规没有完全匹配的定量标准品，因而HCP测定的灵敏度是对细胞系和过程具有特异性的测定。可以将本申请所述的方法用于产生针对任何重组宿主细胞的耐用的、灵敏的HCP ELISA平台测定法，所述重组宿主细胞包括但不限于例如哺乳动物宿主细胞(例如，CHO，例如GS-CHO)、真核宿主细胞、原核宿主细胞、昆虫细胞。此外，可以将本发明的方法与重组蛋白生产的法规要求结合使用。
在一些实施方式中，本发明的HCP ELISA测定显示出合格的准确度、精密度和线性，其在下述浓度范围进行耐用的和可靠的HCP检测，所述浓度范围包括0.1-100、0.5-100、1-100、1.5-100、2-100、2.5-100、3-100、0.1-90、0.5-90、1-90、1.5-90、2-90、2.5-90、3-90、0.1-80、0.5-80、1-80、1.5-80、2-80、2.5-80、3-80、0.1-70、0.5-70、1-70、1.5-70、2-70、2.5-70、3-70、0.1-60、0.5-60、1-60、1.5-60、2-60、2.5-60或3-60ng/ml。在一些实施方式中，HCP ELISA测定显示出合格的准确度、精密度和线性，其在2至60ng/ml浓度范围进行耐用的和可靠的HCP检测。在一些实施方式中，HCP ELISA测定显示出合格的准确度、精密度和线性，其在3至80ng/ml浓度范围进行耐用的和可靠的HCP检测。在一些实施方式中，本发明HCP ELISA测定的检测限是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ng/ml.在一些实施方式中，本发明HCP ELISA测定的检测限是0.5ng/ml。在一些实施方式中，本发明HCP ELISA测定的检测限是2ng/ml。在一些实施方式中，本发明HCP ELISA测定的定量限是0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10ng/ml。在一些实施方式中，本发明HCP ELISA测定的定量限是3ng/ml。
抗-GS-CHO HCP抗体
本申请所述的方法能够提供用于检测HCP的抗-GS-CHO HCP抗体。抗-GS-CHO HCP抗体可以通过标准分子生物学技术制备。抗体可以来自任何物种。抗体可以是单克隆的或多克隆的或者本申请所述“抗体”的任何变体。在一些实施方式中，抗体是多克隆抗体。在一些实施方式中，抗体是在绵羊中制备的多克隆抗体。抗体可以通过附接可检测标记直接检测，例如化学修饰、酶缀合、荧光染料标记、发光标记等。抗体也可以是不能直接检测的，并且需要辅助手段进行检测。具有这些不同性质的抗体可以购买或由标准分子生物学技术制备。
样品
样品可以包括但不限于取自在重组蛋白生产过程中任意阶段的细胞培养物的样品，例如在上游或下游处理过程中的任意时间点例如，样品可以取自细胞培养物(例如，重组蛋白产品分离之前)。样品可以取自下游处理过程中，例如将细胞与含有重组蛋白产品的培养基分离之后。样品可以取自纯化过程中的任何和多个时间点。样品可以包括最终产品的样品。因此，样品可以包括过程产品(最终制剂之前)和最终产品(例如，所有纯化步骤之后的最终制剂产品)。
固体支持物
固体支持物可以包括能够将包被剂(例如，抗-GS-CHO HCP抗体)或其等同物固定化于其上的任何表面。用于固定化的固体支持物可以是任何惰性支持物或载体，其基本上不溶于水且可用于免疫测定，包括例如表面、颗粒、多孔基质等形式的支持物。常用支持物的实例包括小片、Sephadex、聚氯乙烯、塑料小珠和由聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯等制成的测定板或试管，包括96孔微量滴定板，以及颗粒材料如滤纸、琼脂糖、交联葡聚糖和其他多糖。或者，反应性水不溶性基质如溴化氰活化的碳水化合物适于作为包被试剂进行固定化。可以使用固定化包被剂包被微量培养板，例如能够用于一次分析若干样品的多孔微量滴定板。固体支持物表面还可以包括但不限于膜(例如，硝酸纤维素膜、聚四氟乙烯膜、醋酸纤维素膜、硝酸纤维素膜)、使用含有疏水性基团的分子包被的固体表面、使用含有亲水性基团的分子包被的固体表面。固体支持物表面可以是微量滴定板形式，例如聚苯乙烯微量滴定板、细胞培养板或其任何变体。
捕获试剂
术语“捕获试剂”指直接与目标抗原(例如，GS-CHO HCP)结合的抗体。捕获抗体还可以是具有蛋白修饰的检测抗体，例如生物素化。抗体可以来自不同物种，包括但不限于人、家兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、鸡、人、马、犬、猫、仓鼠、猴、黑猩猩、羊、马、猪、牛、灵长类等。在一些实施方式中，一抗是在免疫中生产并经过亲和纯化的抗-GS-CHO HCP抗体。
检测试剂
术语“检测试剂(detecting reagent或detection reagent)”指用于检测“抗原”或“抗体”的标记抗体。检测抗体还可以是一抗。抗体可以来自不同物种，包括但不限于人、家兔、小鼠、大鼠、绵羊、山羊、鸡、人、马、犬、猫、仓鼠、猴、黑猩猩、羊、马、猪、牛、灵长类等。在检测抗体上使用的标记可以是不干扰HCP与抗体结合的任何可检测官能团。适宜标记的实例是已知用于免疫测定的许多标记，包括可以直接检测的部分，如荧光色素、化学发光和放射性标记，以及必须反应或衍生化以检测的部分，如酶。可用于本发明的适宜标记方法包括但不限于同位素标记、化学修饰、酶缀合、荧光染料标记、发光标记以及本领域技术人员通常公知的其他标记方法。
针对多种抗原的市售抗体是本领域公知的。本领域技术人员将意识到针对抗体或其他检测剂的各种标记方法。标记方法包括但不限于酶，如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶(AP)、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、与使用过氧化氢将染料前体氧化的酶偶联(如HRP、乳过氧化物酶或微过氧化物酶)，生物素/抗生物素蛋白，生物素/抗生物素蛋白链菌素，生物素/具有MUG的抗生物素蛋白链菌素-β-半乳糖苷酶，自旋标记，噬菌体标记，稳定的自由基或其他酶等。还可以使用放射性同位素标记检测剂，例如125I、32P、14C、3H和131I或其他同位素。荧光标记可以包括但不限于荧光团如稀土金属或荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、单磺酰、伞形酮、荧光素酶，例如萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶(美国专利号4,737,456)、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、Texas Red、Alexa488、Cy5、Cy3、Alexa610、7-AAD、碘化丙啶、Cy7、藻红蛋白等。可以使用荧光色素(荧光染料)标记检测剂，所述荧光色素能够通过荧光酶标仪、荧光显微镜、荧光剂、照相机或扫描仪检测。检测剂也可以由光色素标记，所述光色素能够通过发光方法检测。或者，可以使用生物素标记检测剂，所述生物素能够与抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素结合。可以将抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素作为检测剂，其能够与生物素、生物素化抗体或生物素化多肽结合。
可以使用常规方法将这些标记与蛋白或多肽共价结合。例如，可以将诸如二醛、碳二亚胺、二马来酰亚胺、双亚氨酸酯、双重氮化联苯胺等的偶联剂用于使用上述荧光、化学发光和酶标记标记抗体。参见例如，美国专利号3,940,475(荧光测定法)和3,645,090(酶)；Hunter等，Nature 144:945(1962)；David等，Biochemistry 13:1014-1021(1974)；Pain等，J.Immunol.Methods 40:219-230(1981)；以及Nygren J.Histochem.and Cytochem.30:407-412(1982)。本申请优选的标记是荧光以放大信号并将灵敏度增至8pg/ml，更优选的是使用抗生物素蛋白链菌素-β-半乳糖苷酶和MUG的生物素以放大信号。
这种标记(包括酶)与抗体的缀合是免疫测定技术领域普通技术人员的标准操作程序。参见例如，O'Sullivan等，“Methods for the Preparation of Enzyme-antibodyConjugates for Use in Enzyme Immunoassay”，Methods in Enzymology，J.Langone和H.Van Vunakis编著，Vol.73(Academic Press,New York,N.Y.,1981)，pp.147-166。
检测系统
术语“检测系统”指能够用于给出读数的方法，所述读数包括与样品中蛋白或试剂的含量或相对量相关的信息。对检测系统的选择取决于对所使用的检测抗体的选择。例如，如果检测抗体是使用酶标记的，其中化学反应能够产生有色或化学发光信号；则检测系统可以包括适宜底物和与化学反应相关的任何必需的试剂以及检测化学反应的方法，例如目测检查，能够检测信号的装置，例如吸光度酶标仪、化学发光酶标仪、CCD照相机等；或者，如果检测抗体是荧光标记的，则可以使用荧光显微镜、荧光酶标仪、荧光细胞分选仪、荧光扫描仪、照相机等；或者，如果检测抗体是同位素标记的，则可以使用X射线胶片或其他同位素敏感材料。
本领域技术人员将意识到适于使用不同检测系统。这些检测系统可以包括例如使用报告酶的显色反应的检测系统，如辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)等等。报告酶可以使用不同底物进行显色反应，例如HRP可以使用4CN(4-氯-1-萘酚)、DAB/NiCl2(3,3’-二氨基联苯胺/NiCl2)或TMB作为底物进行显色反应。荧光标记包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)、罗丹明、Texas Red、Alexa488、Cy5、Cy3、Alexa610、7-AAD、碘化丙啶、Cy7、藻红蛋白等。可以使用各种适宜的终止剂终止检测反应。所使用的特定终止剂将取决于所使用的检测剂且将是本领域技术人员公知的。例如，可以使用1M硫酸作为使用辣根过氧化物酶的检测系统的终止底物。
封闭缓冲液
在使用包被剂孵育后，可以使用封闭缓冲液封闭固体支持物上的任何残留结合位点。封闭缓冲液的实例包括但不限于酪蛋白，例如含酪蛋白的1XPBS，含0.1-1％酪蛋白的1XPBS，含0.1-0.5％酪蛋白的1XPBS，含0.2％酪蛋白的1XPBS；BSA，例如含BSA的1XPBS，例如含1％BSA的1XPBS，含1-10％BSA的1XPBS，含1-20％BSA的1XPBS，含1-50％BSA的1XPBS；脱脂奶粉、鱼明胶或其他化学试剂。可以在任何适宜缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液(PBS)或tris缓冲盐(TBS))中稀释上文所述的任何试剂或其他适宜的化学试剂。
可以将洗涤缓冲液用于在各个步骤中除去未结合的组分。洗涤缓冲液的实例包括但不限于酪蛋白，例如含酪蛋白的1XPBS，含0.1-1％酪蛋白的1XPBS，含0.1-0.5％酪蛋白的1XPBS，含0.2％酪蛋白的1XPBS；BSA，例如含BSA的1XPBS，例如含1％BSA的1XPBS，含1-10％BSA的1XPBS，含1-20％BSA的1XPBS，含1-50％BSA的1XPBS；含有20的含BSA的1XPBS，例如含有0.05％20的含BSA的1XPBS，含有0.05％20的含1％BSA的1XPBS，含有0.05-1％20的含1％BSA的1XPBS； 20，例如含20的1XPBS，例如含0.05％20的1XPBS；脱脂奶粉、酪蛋白、鱼明胶或其他化学试剂。洗涤缓冲液可以包括含有下述中任意一种的含Triton X 100或20等的溶液：BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、鱼明胶或其他化学试剂。可以在任意适宜缓冲液中对这些溶液进行稀释，包括但不限于磷酸盐缓冲液(PBS)、tris缓冲盐(TBS)。
可以进行多次洗涤步骤，并且其将取决于所使用的洗涤缓冲液。例如，在给定洗涤阶段可以重复进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次或10次以上的洗涤步骤。本领域技术人员将能够根据所使用的洗涤缓冲液和其他实验条件确定洗涤步骤需要的次数。
用于稀释任何标准品、样品、抗体或检测剂的缓冲液将是本领域技术人员公知的并且其可以包括但不限于酪蛋白，例如含酪蛋白的1XPBS，含0.1-1％酪蛋白的1XPBS，含0.1-0.5％酪蛋白的1XPBS，含0.2％酪蛋白的1XPBS；BSA，例如含BSA的1XPBS，例如含1％BSA的1XPBS，含1-10％BSA的1XPBS，含1-20％BSA的1XPBS，含1-50％BSA的1XPBS；脱脂奶粉、酪蛋白、鱼明胶或其他化学试剂。在某些情况下，用于稀释任何标准品、样品、抗体或检测剂的缓冲液与作为封闭缓冲液使用的将是相同试剂。
孵育时间和温度
本领域技术人员能够确定不同步骤的适宜孵育时间。因孵育步骤温度的变化可以改变特定孵育步骤的时间，同样地孵育步骤的时间变化可能需要改变孵育步骤的温度。包被步骤可以例如在4℃或约4℃下过夜、在2-10℃或约2-10℃下过夜、在37℃或约37℃下4小时、在37℃或约37℃下2-4小时、在37℃或约37℃下1-4小时、在32℃或约32℃下4小时、在32℃或约32℃下2-4小时、在32℃或约32℃下1-4小时条件下进行。封闭步骤可以例如在32℃或约32℃下1小时；在32℃或约32℃下1-2小时；在4℃或约4℃下过夜条件下进行。标准品/样品孵育步骤可以例如在32℃或约32℃下2小时；在32℃或约32℃下1-2小时；在4℃或约4℃下过夜条件下进行。一抗或一抗/检测抗体孵育步骤可以例如在32℃或约32℃下1小时；在32℃或约32℃下1-2小时；在4℃或约4℃下过夜条件下进行。任何检测系统的孵育阶段和时间将取决于所使用的确切检测抗体，并且将是本领域技术人员公知的。
试剂盒
用于进行本申请所述方法的包含一种或多种组分的试剂盒可以包括但不限于进行本申请所述方法所必需的任何必要组分、试剂或材料和/或进行本申请所述方法的说明书。试剂盒可以任选地包括任何附加洗涤剂、孵育容器、固体支持物表面等以进行本申请所述的方法。
试剂盒可以含有用于包被剂的固体支持物，其可以作为单独的元件提供或者已将包被剂固定化于其上。因此，在试剂盒中的包被剂可以固定化在固体支持物上，或者其可以固定化在试剂盒中附带提供的此类支持物上或者与试剂盒分开提供。可以将包被剂包被在微量滴定板上。一抗可以是未标记的或标记的。一抗可以是标记的，也可以在检测抗体中。当标记是酶时，试剂盒可以含有底物和酶所需的辅因子，以及当标记是荧光团时，试剂盒可以含有提供可检测发色团的染料前体。试剂盒还可以含有用于进行测定的说明书，和/或参照标准品，以及其他添加剂如稳定剂、洗涤和孵育缓冲液等。
产品以及编码其的核酸
本申请提供了用于鉴定、选择或制备能够生产产品的细胞或细胞系的方法。本公开内容包括的产品包括但不限于能够在细胞中通过例如表达生产的分子、核酸、多肽(例如，重组多肽)或其杂合体。在一些实施方式中，对细胞进行工程化改造或修饰以生产产品。此类修饰包括引入控制或使得产品生产的分子。例如，通过引入编码多肽(例如，重组多肽)的外源性核酸对细胞进行修饰，并且在适于生产(例如，表达和分泌)多肽(例如，重组多肽)的条件下培养细胞。在另一个实例中，通过引入控制(例如，增加)由细胞内源性表达的多肽表达的外源性核酸对细胞进行修饰，以使得细胞产生与例如在未经修饰的细胞中内源性产生的水平或质量相比更高水平或质量的多肽。
在实施方式中，通过本申请所述方法鉴定、选择或产生的细胞或细胞系产生可用于治疗医疗病况、病症或疾病的产品(例如，重组多肽)。医疗病况、病症或疾病的实例包括但不限于代谢疾病或病症(例如，代谢酶缺乏)、内分泌病症(例如，激素缺乏)、止血、血栓形成、造血功能障碍、肺部病症、胃肠道病症、免疫调节(例如，免疫缺陷)、不育、移植、癌症和感染性疾病。
在一些实施方式中，产品是外源性蛋白，例如不能由细胞天然表达的蛋白。产品可以是治疗性蛋白或诊断性蛋白，例如用于药物筛选。治疗性或诊断性蛋白可以是抗体分子，例如抗体或抗体片段、融合蛋白、激素、细胞因子、生长因子、酶、糖蛋白、脂蛋白、受体蛋白、治疗性肽或者这些中任意一个的结构和/或功能片段或杂合体。
在一个实施方式中，产品(例如，重组多肽)是抗体分子。本申请包含的产品包括诊断性和治疗性抗体分子。诊断性抗体分子包括用于成像技术的抗体(例如，单克隆抗体或其抗体片段)。治疗性抗体分子适于向对象施用(例如，用于治疗或预防疾病或病症)。
抗体分子是来自与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子的蛋白或多肽序列。在一个实施方式中，抗体分子是全长抗体或抗体片段。抗体和多形式蛋白可以是多克隆或单克隆、多链或单链或者完整的免疫球蛋白，并且其可以来自天然来源或来自重组来源。抗体可以是免疫球蛋白分子的四聚体。在一个实施方式中，抗体是单克隆抗体。抗体可以是人源或人源化抗体。在一个实施方式中，抗体是IgA、IgG、IgD或IgE抗体。在一个实施方式中，抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体。
“抗体片段”指完整抗体的至少一部分或者其重组变体，以及指抗原结合结构域(例如，完整抗体的抗原决定可变区)，其足以赋予抗体片段与靶点(如抗原)的识别和特异性结合。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、scFv抗体片段、线性抗体、单域抗体如sdAb(VL或VH)、骆驼VHH结构域、由抗体片段形成的多特异性抗体(如包含在铰链区通过二硫键桥连接的两个Fab片段的二价片段)以及抗体分离的CDR或其他表位结合片段。还可以将抗原结合片段引入单域抗体、大抗体(maxibodies)、微抗体、纳米抗体、胞内抗体、双体、三体、四体、v-NAR和双-scFv(参见例如，Hollinger和Hudson,NatureBiotechnology 23:1126-1136,2005)。还可以将抗原结合片段移植入基于多肽(如III型纤连蛋白(Fn3))的支架中(参见美国专利号：6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽微抗体)。
在下表中提供了使用本申请所述的方法或细胞生产的示例性产品(例如，多肽，例如重组多肽)。
表1：示例性产品
在另一个实施方式中，产品是双特异性分子。如本申请所述的双特异性分子包括能够与两个或多个不同的抗原或靶点结合的分子。在一个实施方式中，双特异性分子包括抗体片段。在一个实施方式中，双特异性分子包括双特异性抗体、双特异性抗体融合蛋白或双特异性抗体缀合物、双特异性T细胞衔接器(Engager)(BiTE)分子、双亲和性再靶向(DART)分子、双作用Fab(DAF)分子、纳米抗体或者产生具有识别或结合两个不同抗原能力的分子的抗体片段的其他重排。
表2：示例性产品，例如双特异性分子
其他示例性治疗性或诊断性蛋白包括但不限于Leader等，“Proteintherapeutics:a summary and pharmacological classification”,Nature ReviewsDrug Discovery,2008,7:21-39(通过引用并入本申请)的表1-10中所述的任何蛋白；或者本申请所述重组多肽的任何缀合物、变体、类似物或功能性片段。
其他重组产品包括非抗体支架或者替代蛋白支架，例如但不限于：DARPin、亲和体和adnectin。可以对此类非抗体支架或者替代蛋白支架进行工程化改造以使其识别或结合至1个或2个或者更多个(例如，1、2、3、4或5个或者更多个)不同的靶点或抗原。
本申请还提供了编码本申请所述产品(例如多肽，例如重组多肽)的核酸(例如，外源性核酸)。可以使用本领域公知的重组方法获得编码所需重组多肽的核酸序列，例如使用标准技术筛选来自表达所需核酸序列(例如，基因)的细胞的文库，从已知含有其的载体衍生核酸序列，或者从含有其的细胞和组织直接分离。或者，可以合成而非克隆生产编码重组多肽的核酸。重组DNA技术是非常先进的并且在本领域中已很好地建立。因此，具有本申请所述重组多肽的氨基酸序列知识的普通技术人员能够容易地设想或得出将编码重组多肽的核酸序列。
在一些实施方式中，外源性核酸控制由宿主细胞内源性表达的产品的表达。在此类实施方式中，外源性核酸包含增加内源性产品表达的一个或多个核酸序列(也称为“内源性产物反式激活序列”)。例如，内源性产品的表达增加的核酸序列含有组成型活性启动子或更强的启动子，例如在所需位点增加转录，例如增加所需内源性基因产物的表达。在引入含有内源性产物反式激活序列的外源性核酸之后，将所述外源性核酸整合至细胞的染色体基因组(例如，在与编码内源性产物的基因组序列接近的预先选定的位置)，以使得内源性产物反式激活序列增加所需内源性产品的转录活化或表达。用于修饰细胞(例如，引入外源性核酸)以增加内源性产品表达的其他方法参见例如美国专利号5,272,071；其全部内容通过引用并入。
本申请所述产品的表达通常通过将编码重组多肽或其部分的核酸与启动子可操作地连接，并将构建体引入表达载体实现。载体能够适于复制和整合真核生物或原核生物。典型的克隆载体含有其他调控元件，如转录和翻译终止子、起始序列以及用于调控所需核酸序列表达的启动子。
可以将编码产品(例如，重组多肽)或含有能够控制内源性产品表达的核酸序列的本申请所述的核酸序列克隆进入多种载体。例如，可以将核酸序列克隆进入包括但不限于下述的载体：质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特别关注的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。在实施方式中，可以以病毒载体形式将表达载体提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的并且参见例如Sambrook等，2012,MolecularCloning:A Laboratory Manual,第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY，以及其他病毒学和分子生物学手册。作为载体使用的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。在通常情况下，适宜的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制原点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点以及一种或多种选择性标记物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；以及美国专利号6,326,193)。来自病毒的载体是实现长期基因转移的适宜工具，因为其能够在子代细胞中长期、稳定地整合转基因以及繁殖。
载体还可以包含例如促进分泌的信号序列、多聚腺苷酸化信号和转录终止子(例如，来自牛生长激素(BGH)基因)、能够使得进行游离型复制和在原核细胞中复制的元件(例如，SV40原点和ColE1或本领域公知的其他元件)和/或能够进行选择的元件(例如，选择标记物或报告基因)。
在一个实施方式中，包含编码多肽(例如，重组多肽)的核酸序列的载体还包含负责募集聚合酶以使得多肽(例如，重组多肽)的表达能够转录起始的启动子序列。在一个实施方式中，适于本申请所述方法的启动子序列通常与增强子结合以驱动更大量的转录并因此递送更多个拷贝的靶外源性mRNA。在一个实施方式中，启动子包括巨细胞病毒(CMV)主要立即早期启动子(Xia,Bringmann等，2006)和SV40启动子(Chernajovsky,Moryetal.1984)，其均来自其同名病毒或来源于其的启动子。在引入表达载体后，一些不太常见的病毒启动子也成功驱动了转录，所述启动子包括劳氏肉瘤病毒长末端重复序列(RSV-LTR)和莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)(Papadakis,Nicklinetal.2004)。在另一个实施方式中，可以使用特定内源性哺乳动物启动子以驱动目标基因的组成型转录(Pontiller,Grossetal.2008)。替代基于病毒的序列的CHO特异性中国仓鼠延伸因子1-α(CHEF1α)启动子提供了较高的产率(Deer,Allison2004)。除了启动子以外，本申请所述的载体还包含如上文所述的增强子区；与核心启动子接近的特定的核苷酸基序区，其能够募集转录因子以上调转录速率(Riethoven 2010)。与启动子序列类似，这些区域通常来自病毒并且包含在启动子序列中(如hCMV和SV40增强子序列)，或者可以附加地包含如腺病毒来源的序列(Gaillet,Gilbert等，2007)。
在一个实施方式中，包含编码本申请所述产品(例如多肽，例如重组多肽)的核酸序列的载体还包含编码选择标记物的核酸序列。在一个实施方式中，选择性标记物包括谷氨酰胺合成酶(GS)；二氢叶酸还原酶(DHFR)，例如对甲氨蝶呤(MTX)具有抗性的酶；或者抗生素标记物，例如对诸如下述的抗生素具有抗性的酶：潮霉素、新霉素(G418)、博来霉素、嘌呤霉素或杀稻瘟素。在另一个实施方式中，选择标记物包括Selexis选择系统(例如，SUREtechnology PlatformTM和Selexis Genetic ElementsTM，由Selexis SA购得)或Catalant选择系统或者与之兼容。
在一个实施方式中，包含编码本申请所述的重组产品的核酸序列的载体含有选择标记物以用于鉴定含有编码本申请所述的重组产品的核酸的细胞。在另一个实施方式中，选择标记用于鉴定如本申请所述的包含将编码重组产品的核酸序列整合至基因组的细胞。可以将对已整合了编码重组蛋白的核酸序列的细胞的鉴定用于选择和工程化改造稳定表达产品的细胞。
所使用的适宜载体是市售的，并且包括与来自Lonza Biologics,Inc的GS表达系统TM、GS XceedTM基因表达系统或CHOK1SV技术结合的载体，例如Fan等，Pharm.Bioprocess.(2013)；1(5):487-502中所述的载体，其全部内容通过引用并入本申请。GS表达载体包含GS基因或其功能性片段(例如，GS迷你基因)以及一个或多个(例如，1、2或3个或者更多个)用于表达目标基因(例如，编码本申请所述的重组多肽的核酸)的高效转录盒。GS迷你基因包含例如由基因组CHO GS基因的内含子6组成。在一个实施方式中，GS载体包含与SV40L启动子和一个或两个polyA信号可操作地连接的GS基因。在另一个实施方式中，GS载体包含与SV40E启动子、SV40剪接和多聚腺苷酸化信号可操作地连接的GS基因。在此类实施方式中，转录盒(例如，用于表达目标基因或本申请所述的重组多肽)包含hCMV-MIE启动子以及来自含有第一内含子的hCMV-MIE基因的5’非翻译序列。可以基于GS表达载体构建其他载体，例如其中使用其他选择标记物替代本申请所述表达载体中的GS基因。
适于在本申请所述方法中使用的载体包括但不限于其他市售载体如pcDNA3.1/Zeo、pcDNA3.1/CAT、pcDNA3.3TOPO(Thermo Fisher，此前为Invitrogen)；pTarget、HaloTag(Promega)；pUC57(GenScript)；pFLAG-CMV(Sigma-Aldrich)；pCMV6(Origene)；pEE12或pEE14(Lonza Biologics)或pBK-CMV/pCMV-3Tag-7/pCMV-Tag2B(Stratagene)。
细胞和细胞培养
在实施方式中，细胞是哺乳动物细胞。在其他实施方式中，细胞是哺乳动物细胞之外的细胞。在一个实施方式中，细胞是小鼠、大鼠、中国仓鼠、叙利亚仓鼠、猴、猿、犬、马、雪貂或猫的细胞。在实施方式中，细胞是哺乳动物细胞，例如人细胞或啮齿动物细胞，例如仓鼠细胞、小鼠细胞或大鼠细胞。在另一个实施方式中，细胞来自鸭、鹦鹉、鱼、昆虫、植物、真菌或酵母。在一个实施方式中，细胞是古细菌。在一个实施方式中，细胞是一种放线菌。
在一个实施方式中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方式中，细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1SV细胞、DG44CHO细胞、DUXB11CHO细胞、CHOS、CHO GS敲除细胞、CHOFUT8GS敲除细胞、CHOZN或CHO来源的细胞。CHO GS敲除细胞(例如，GSKO细胞)是例如CHO-K1SV GS敲除细胞(Lonza Biologics,Inc.)。CHO FUT8敲除细胞是例如CHOK1SV(Lonza Biologics,Inc.)。
在一个实施方式中，细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。在一个实施方式中，细胞是CHO-K1细胞、CHO-K1SV细胞、CHO-GSKO细胞、CHOXceed细胞。CHO GS敲除细胞(例如，GS-CHO细胞)是例如CHO-K1SV GS敲除细胞(Lonza Biologics,Inc.)。CHO FUT8敲除细胞是例如CHOK1SV(Lonza Biologics,Inc.)，
在另一个实施方式中，细胞是HeIa、HEK293、HT1080、H9、HepG2、MCF7、Jurkat、NIH3T3、PC12、PER.C6、BHK(幼仓鼠肾细胞)、VERO、SP2/0、NS0、YB2/0、Y0、EB66、C127、L细胞、COS(例如，COS1和COS7)、QC1-3、CHOK1、CHOK1SV、Potelligent CHOK1SV、CHO GS敲除、CHOK1SV GS-KO、CHOS、CHO DG44、CHO DXB11和CHOZN或者来源于其的任何细胞。在一个实施方式中，细胞是干细胞。在一个实施方式中，细胞是由本申请所述的任何细胞分化的。在一个实施方式中，细胞是来自培养的任何原代细胞的细胞。
在一个实施方式中，细胞是本申请所述的任意一种细胞，所述细胞包含编码重组多肽(例如，表达重组多肽，例如选自表1或2的重组多肽)的外源性核酸。
在一个实施方式中，细胞培养是以批量培养、加料批量培养、抽吸和填充培养或连续培养的形式进行的。在一个实施方式中，细胞培养是悬浮培养。在一个实施方式中，将细胞或细胞培养物置于体内以表达重组多肽，例如置于模型生物或人类对象中。
在一个实施方式中，培养基不含血清。无血清和无担保培养基是市售的，例如Lonza Biologics。
针对哺乳动物细胞系的适宜培养基和培养方法是本领域熟知的，例如如在美国专利号5,633,162中所描述的。用于实验室培养瓶或低密度细胞培养并适于特定细胞类型需求的标准细胞培养基的实例例如：Roswell Park Memorial Institute(RPMI)1640培养基(Morre,G.,The Journal of the American Medical Association,199,p.519f.1967)、L-15培养基(Leibovitz,A.等，Amer.J.of Hygiene,78,1p.173ff,1963)、经Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)、Eagle最低必需培养基(MEM)、Ham F12培养基(Ham,R.等，Proc.Natl.Acad.Sc.53,p288ff.1965)或缺乏白蛋白、转铁蛋白和卵磷脂的经Iscoves改良的DMEM(Iscoves等，J.Exp.med.1,p.923ff.,1978)。例如，专门为培养CHO细胞而设计的HamF10或F12培养基。在EP-481 791中描述了特别适于CHO细胞培养的其他培养基。已知的是，可以在此类培养基中补充胎牛血清(FBS，也称为胎牛血清FCS)，后者提供了大量激素和生长因子的天然来源。哺乳动物细胞的细胞培养现在是在科学教科书和手册中被充分描述的常规操作，在例如R.Ian Fresney,Culture of Animal cells,a manual，第4版，Wiley-Liss/N.Y.,2000中对其进行了详细描述。
其他适宜的培养方法是本领域技术人员公知的并且其可能取决于重组多肽产品和所使用的宿主细胞。本领域普通技术人员能够确定或优化适于由细胞表达的重组蛋白的表达和生产的适宜条件。
在一个方面中，细胞或细胞系包含编码产品(例如，重组多肽)的外源性核酸。在一个实施方式中，细胞或细胞系表达产品(例如，治疗性或诊断性产品)。对细胞进行基因修饰或工程化改造以使其表达所需多肽或蛋白的方法是本领域熟知的，并且包括例如转染、转导(例如，病毒转导)或电穿孔。
用于将核酸(例如，本申请所述的外源性核酸或载体)导入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于生产包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见例如，Sambrook等，2012,Molecular Cloning:ALaboratory Manual，第1-4卷，Cold Spring Harbor Press,NY)。
用于将核酸(例如，本申请所述的外源性核酸或载体)导入宿主细胞的化学方法包括胶体分散系统，如大分子复合物、纳米囊、微球、小珠和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内递送载剂的示例性胶体系统是脂质体(例如，人工膜囊泡)。可以使用现有技术中靶向递送核酸的其他方法，如使用靶向的纳米粒子或其他适宜的亚微米级递送系统递送多核苷酸。
在实施方式中，将外源性核酸整合至宿主核酸(例如，宿主细胞的基因组或染色体核酸)是所需要的。用于确定是否已经发生外源性核酸整合至宿主细胞基因组的方法可以包括GS/MSX选择法。GS/MSX选择法使用重组GS基因对谷氨酰胺营养缺陷型的互补选择来自细胞的高水平表达蛋白。简言之，GS/MSX选择法包括在含有编码重组多肽产物的外源性核酸的载体上包含编码谷氨酰胺合成酶的核酸。给予甲硫氨酸亚砜亚胺(MSX)选择已将编码重组多肽和GS的外源性核酸稳定整合至基因组的细胞。由于GS可以由一些宿主细胞(例如，CHO细胞)内源表达，因此可以对使用MSX选择的浓度和持续时间进行优化以鉴定编码重组多肽产品的外源性核酸稳定整合至宿主基因组的高产细胞。在Fan等，Pharm.Bioprocess.(2013)；1(5):487-502中进一步描述了GS选择及其系统，其全部内容通过引用并入本申请。
用于鉴定和选择已将外源性核酸稳定整合至宿主细胞基因组的细胞的其他方法包括但不限于在外源性核酸上引入报告基因并评估报告基因在细胞中的存在情况，以及对外源性核酸进行PCR分析和检测。
在一个实施方式中，使用本申请所述方法选择、鉴定或产生的细胞与仅使用稳定表达的选择方法选择出的细胞相比(例如，整合编码重组多肽的外源性核酸)能够产生更高产率的蛋白产品。在一个实施方式中，使用本申请所述方法选择、鉴定或产生的细胞与未与蛋白降解抑制剂接触的细胞或者仅对编码重组多肽的外源性核酸的稳定表达(例如，整合)进行选择的细胞相比产生了2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或者更多倍的产品(例如，重组多肽)。
用于细胞系和重组多肽生产的方法
在哺乳动物和微生物选择系统中的现有技术水平是在DNA转录为RNA的水平上施加选择压力。将目标基因与选择标记物紧密连锁使得选择性标记物的高水平表达可能会导致目标基因的高表达。以高水平表达选择标记物的细胞能够存活和增殖，而没有高水平表达选择性标记物的细胞则不可能存活和增殖(例如，凋亡和/或死亡)。通过这种方式，细胞群能够富集表达选择标记物的细胞和引入高水平的目标基因。该方法已被证明能够非常成功且简单明了地表达蛋白。
在一个方面中，本公开内容提供了用于产生用于生产产品(例如，重组多肽)的细胞或细胞系的方法。在另一方面中，本公开内容提供了使用利用本申请所述的方法鉴定、分类、选择或产生的细胞生产产品(例如，本申请所述的重组多肽)的方法。包括如本申请所述的评价、鉴定、分类或选择细胞的任何前述方法(例如，通过将细胞与蛋白降解抑制剂接触)可以鉴定或制备使产品(例如，重组多肽)具有高产能力的细胞。本申请所述的方法增加重组多肽的产生(例如，表达和/或分泌)。
不希望受到理论的束缚，据信具有更高生产能力的细胞对蛋白降解抑制剂的敏感性更低，因此据信将细胞与包含本申请所述的外源性核酸的蛋白降解抑制剂接触能够选择出具有更高生产能力的细胞。
在一些实施方式中，可以进行附加步骤以改善产品的表达(例如，产品的转录、翻译和/或分泌，或者产品的质量，例如一级序列的正确折叠和/或保真度)。此类附加步骤包括引入改善产品表达或产品质量的试剂。在一个实施方式中，改善产品表达或产品质量的试剂可以是小分子、多肽或者编码改善蛋白折叠多肽(例如，伴侣蛋白)的核酸。在一个实施方式中，核酸包含抑制性核酸(例如，微RNA或lncRNA)。在一个实施方式中，辅助蛋白折叠的试剂包含编码伴侣蛋白(例如，BiP、PD1或ERO1)的核酸(Chakravarthi&Bulleid 2004；Borth等，2005；Davis等，2000)。改善产品的产率和质量的其他附加步骤包括过表达转录因子(如SBP1和ATF6)(Tigges&Fussenegger 2006；Cain等，2013；Ku等2008)以及凝集素结合伴侣蛋白(如钙联接蛋白和钙网蛋白)(Chung等，2004)。通过引入编码蛋白的外源性核酸能够实现辅助或改善蛋白折叠和产品质量以及本申请所述的蛋白产率的试剂的过表达。在另一个实施方式中，改善产品表达或产品质量的试剂是能够加入细胞培养中以增加产品表达或产品质量的小分子。在一个实施方式中，细胞培养是在比细胞正常生长的温度更低的温度下(例如，低1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃或10℃)进行。
本申请所述的任何方法还可以包括用于鉴定具有较高生产率或生产高质量产品的细胞的附加选择步骤。例如，可以使用FACS选择法选择和分离具有所需特征(例如，折叠蛋白(例如，伴侣蛋白)具有更高的蛋白表达；或者产品具有改善的表达)的特定细胞。
在一个方面中，本公开内容提供了包括回收或取回重组多肽产品步骤的方法。在重组多肽是从细胞分泌的实施方式中，所述方法可以包括从细胞、细胞群或在其中培养细胞的培养基中回收、收集或分离重组多肽的步骤。在重组多肽是在细胞内的实施方式中，重组多肽产品的纯化包括将由细胞生产的重组多肽与下述任意一种或多种物质分离：宿主细胞蛋白、宿主细胞核酸、宿主细胞脂质和/或来自宿主细胞的其他碎片。
在实施方式中，本申请所述的过程提供了基本上纯的蛋白产品。如在本申请中所使用的，“基本上纯的”指基本上不含热源物质、基本上不含核酸和/或基本上不含内源性细胞蛋白酶和宿主细胞的成分，如聚合酶、核糖体蛋白和伴侣蛋白。基本上纯的蛋白产品含有例如少于25％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的来自宿主细胞的污染性内源性蛋白、核酸或其他大分子。
用于回收和纯化产品(例如，重组多肽)的方法在本领域中已经很好地建立。对于回收重组多肽产品而言，使用物理或化学或者物理-化学方法。物理或化学或者物理-化学方法可以是过滤法、离心法、超速离心法、提取法、冻干法、沉淀法、结晶法、层析法或者上述两种或多种方法的组合。在一个实施方式中，层析法包括体积排阻色谱(或凝胶过滤)、离子交换色谱(例如，阴离子或阳离子交换色谱)、亲和层析、疏水性相互作用层析和/或多元层析中的一种或多种。
实施例
通过参考下述实验实施例进一步详细描述了本发明。除非另有说明，否则提供这些实施例仅用于说明目的并且其并非旨在限制。因此，绝对不应将本发明解释为限于下述实施例，而是应将其解释为包含由本申请所提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
无需进行进一步描述，相信本领域的普通技术人员能够利用前述说明和下述说明性实施例制备和利用本发明的化合物并且实施所要求保护的方法。下述工作实施例具体地指出了本发明的各个方面，并且不应将其解释为以任何方式限制本公开内容的其余部分。
实施例1：抗-GS-CHO宿主细胞蛋白多克隆抗体的制备
在本实施例中提供的方法涉及抗-GS-CHO宿主细胞蛋白(HCP)多克隆抗体的制备。将所述抗体用于在实施例2中描述的ELISA实验。
抗-GS-CHO HCP抗体的生产
使用来自GS-CHO裸细胞系(即，使用空白GS载体转染的CHO-K1SV细胞)的HCP免疫三只绵羊。作为抗原的HCP来自细胞提取物(CE)或细胞上清液(SN)。根据标准方法制备抗原(例如，参见美国药典(USP)发布的针对官方测定程序和指导原则的所有指导原则。USP<1132>描述了“生物药品中残留宿主细胞蛋白的测量”(对USP 38-NF 33的第二次补充，7647-7667)，2015年12月发布)。
在不同采血日收集绵羊抗血清。将储存的绵羊抗血清用于亲和纯化抗-GS CHOHCP抗体。
抗-GS-CHO HCP抗体的纯化
纯化过程由MabSelect SuRe(MSS)亲和层析、浓缩/渗滤、溴化氰(CNBr)亲和层析和最终渗滤步骤组成。独特地，本发明示例性过程在两步亲和纯化中将蛋白A和CNBr层析组合。该两步亲和纯化除去了大部分非特异性IgG(即，没有与HCP结合的IgG)。目前的纯化方法利用了来自粗抗血清(即，没有进行纯化)或总IgG混合物的HCP抗体，其具有约99％的非特异性IgG。
使用相同条件进行两轮纯化(第1轮和第2轮)。在使用1800ml绵羊抗血清的第1轮纯化中，对纯化方法进行检测和确认。使用ELISA、SDS-PAGE、Western印迹和2D SDS-PAGE针对其对GS-CHO HCP的免疫覆盖率对亲和纯化的抗-GS-CHO HCP抗体进行了检测。在第2轮纯化中，初始使用8000ml抗血清通过流过的重复上样在MSS和CNBr纯化中最大化地生产GS-CHO HCP抗体。
通过PrA HPLC确定粗绵羊抗血清的IgG滴度，对于使用GS-CHO裸细胞提取物免疫的CE绵羊抗血清而言，第1轮纯化和第2轮纯化MSS步骤的产率分别为96.33％和122.86％(产率超过100％的差异是由于采用不同方法测定蛋白浓度所致)。总之，在第1轮纯化和第2轮纯化中分别从MSS层析中洗脱了10,315mg IgG和60,518mg IgG。在浓缩和渗滤之后，将洗脱的MSS IgG用于接下来的CNBr纯化步骤。在CNBr层析中，CNBr树脂与GS-CHO细胞提取物偶联并用于亲和纯化来自CE MSS IgG的抗-GS-CHO HCP抗体。在第1轮纯化中，得到了39.6mg抗-HCP抗体，其产率为0.37％，在第2轮纯化中得到了361.2mg HCP抗体，其产率为0.62％。通过2DE Western印迹，对来自第1轮纯化的抗-GS-CHO HCP抗体的免疫覆盖率进行检测。基于点计数针对来自GS-CHO细胞细胞提取物的针对GS-GHO裸细胞系提取物的覆盖率为77％，基于匹配的点为71％。
将来自第1轮和第2轮的抗-GS-CHO HCP抗体混合在一起以产生均匀的抗-GS-CHOHCP抗体制品。通过A280确定总共获得了391mg抗体，其针对整个纯化过程的总体累积产率为0.65％。通过2DE Western印迹检测最终抗-GS-CHO HCP抗体的免疫覆盖率。针对GS-CHO裸细胞系提取物的覆盖率为基于总点计数针对来自GS-CHO细胞系细胞提取物的覆盖率为77％以及基于匹配的点的为71％。
在本实施例中描述的示例性纯化过程如图1中所述。将最终的抗-GS-CHO HCP抗体用于实施例2中所述的ELISA。还将最终的抗体生物素化以用于实施例2中所述的ELISA。
实施例2：GS-CHO HCP ELISA
在本实施例中提供的方法涉及开发用于对GS-CHO HCP进行检测和定量的夹心ELISA。ELISA测定条件相对于当前方法具有优异的性能(参见例如，
实施例3)。
使用实施例1中所述的亲和纯化GS-CHO HCP抗体对ELISA进行优化。使用含2μg/mlGS-CHO HCP抗体的碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液包被ELISA板，每孔100μl，并在5±3℃下孵育过夜(18±2小时)。使用300μl洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的1X DPBS)将包被的板洗涤3次，随后每孔加入300μl封闭缓冲液(含0.2％酪蛋白的1X DPBS)，并在23±2℃和300±50rpm振荡条件下孵育60±5分钟。通过使用封闭缓冲液倍比稀释GS-CHO HCP标准品制备9个标准品(80ng/ml至0.31ng/ml)。表3中提供了示例稀释方案。
表3：GS-CHO HCP ELISA标准品的制备
标准品 浓度 样品(μl) 封闭缓冲液(μl)
N/A 1mg/ml 40储备标准品 208
N/A 10μg/ml 10的1mg/ml 990
Std 1 80ng/ml 16的10ug/ml 1984
Std 2 40ng/ml 1000的80ng/ml 1000
Std 3 20ng/ml 1000的40ng/ml 1000
Std 4 10ng/ml 1000的20ng/ml 1000
Std 5 5ng/ml 1000的10ng/ml 1000
Std 6 2.5ng/ml 1000的5ng/ml 1000
Std 7 1.25ng/ml 1000的2.5ng/ml 1000
Std 8 0.63ng/ml 1000的1.25ng/ml 1000
Std 9 0.31ng/ml 1000的0.63ng/ml 1000
空白对照 0ng/ml N/A 1000
按照表4中的示例制备HCP标记溶液。
表4：GS-CHO HCP ELISA标记溶液的制备
标记溶液 浓度(ng/ml) 样品(μl) 封闭缓冲液(μl)
No 1 400 80的10μg/ml 1920
No 2 200 1000的400ng/ml 1000
No 3 100 1000的200ng/ml 1000
No 4 40 800的100ng/ml 1200
No 5 20 1000的40ng/ml 1000
使用封闭缓冲液以预先确定的稀释倍数稀释样品，例如稀释5倍、稀释10倍等。使用300μl洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的1X DPBS)洗板3次。制备100μl样品，并将样品加入每孔中，制备三复孔。然后将板在23±2℃和300±50rpm振荡条件下孵育90±5分钟。使用300μl洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的1X DPBS)洗板3次，并将使用封闭缓冲液稀释的2μg/ml生物素化SG-CHO HCP抗体加入各孔中，每孔100μl。将板在23±2℃和300±50rpm振荡条件下孵育60±5分钟。使用300μl洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的1X DPBS)洗板3次，并将使用封闭缓冲液按照1:10,000稀释的抗生物素蛋白链菌素-HRP加入各孔中，每孔100μl。将板在23±2℃和300±50rpm振荡条件下孵育60±5分钟。使用300μl洗涤缓冲液(含0.05％吐温20的1X DPBS)洗板3次，并将100μl TMB 1C加入各孔中。将板在23±2℃和300±50rpm振荡条件下孵育10±1分钟。孵育结束后，每孔加入50μl终止液(2.5M硫酸，在室温下保存)终止反应。使用酶标仪以630nm作为参照在450nm波长下读板。使用SoftMax Pro(Ver 5.4.3)分析数据，并使用4-参数logistic拟合绘制标准曲线。
实施例3：GS-CHO HCP ELISA的评价
下述实施例提供了对实施例2中所述的GS-CHO HCP夹心ELISA的评价。评价结果如下文所示。
因此，检测5个GS-CHO原料(bulk)纯化产品、3个GS-CHO过程(in-process)产品和1个最终制剂缓冲液，以评价GS-CHO HCP ELISA。这些检测样品是用于GS-CHO HCP ELISA的代表性产品样品。对GS-CHO产品进行倍比稀释并使用实施例2中所述的ELISA检测。使用产品稀释物检测了5个标记水平(1、2、5、10和20ng/ml)。使用标记回收率评估针对每种产品的测定性能。
检测了5个原料纯化产品(BDS Mab DV、Mab BM、产品A15、Mab DU和Mab DH)，3个过程样品(Mab CZ、Mab BM、Mab MSS洗脱物)和Mab BM最终制剂缓冲液。对准确度、精密度、线性、工作范围、检测限、定量限和专属性的分析和描述如下。
准确度
通过全部5个标记水平的回收率分析ELISA的准确度。标记水平5、10和20ng/ml的准确度在回收率75％至125％的合格范围内。对于2ng/ml，大部分产品稀释物在回收率75％至125％的回收率合格范围内。高水平的内源性HCP浓度影响2ng/ml标记的准确度。由于较高内源性HCP水平的影响，使得1ng/ml标记水平的总体准确度不合格。
使用3个稀释度检测了GS-CHO产品BDS MAb DV、MAb BM、MAb DU和MAb DH，每个均使用最终的ELISA方法。对于2、5、10和20ng/ml标记对照的回收率而言，所有结果(n＝38)均在75％至125％范围内。对于1ng/ml的标记对照，38个回收率中的5个回收率不合格。计算5个不同标记水平的标记回收率，并且根据标记回收率评价方法的准确度。如果在每个HCP标记水平的总体平均回收百分率均在75％至125％的回收率之间，则认为该测定的准确度合格。对于5、10和20ng/ml的HCP标记水平，使用3个不同稀释度检测的全部4个待测BDS产品的总体标记回收率均在75％至125％的回收率之间，符合要求。所检测的内源性HCP在1.395ng/ml至24.044ng/ml之间变化。
对于2ng/ml的HCP标记水平，每个均使用2个不同稀释度检测了全部4个待测BDS产品的标记回收率，除了较低稀释度的BDS产品以外(例如，在BDS MAb DV中稀释2倍)，其回收率均在75％至125％的回收率之间，符合要求。内源性HCP浓度在13.467ng/ml至24.044ng/ml变化时，BDS产品稀释物的标记回收率不合格。内源性HCP浓度在1.395ng/ml至4.536ng/ml范围内时，BDS产品稀释物的标记回收率合格。
对于1ng/ml的HCP标记水平，使用不同稀释度的4个待测BDS产品的标记回收率均在75％至125％的回收率之间，符合要求。其内源性HCP浓度范围从1.395ng/ml至4.536ng/ml。BDS产品最低稀释度(例如，针对MAb DV、MAb DU、MAb BM稀释2倍(1:2)和针对MAb DH稀释32倍(1:32))的回收率不在75％至125％范围内。内源性HCP浓度在13.467ng/ml至24.044ng/ml范围内时，BDS产品稀释物的标记回收率不合格。
从标记回收率和标记水平可以得出结论，在较低标记水平下(例如，1ng/ml或2ng/ml)，在待测样品中存在较高水平的内源性HCP影响标记回收率检测的可靠性。因此，认为总体准确度合格。
精密度
分析了4个GS-CHO BDS(原料纯化)产品HCP测量结果的重复精密度和中间精密度。重复精密度和中间精密度均小于20％CV。在GS-CHO产品中HCP浓度的重复性在20％CV合格范围的上限。使用在整个评价过程中测定间对照和标记对照的HCP测量结果进一步分析了精密度。对于较高和较低的测定间对照(IAC)重复精密度和中间精密度均小于15％CV。对于1、2、5、10和20ng/ml的标记对照，重复精密度和中间精密度均低于15％CV。
针对GS-CHO BDS产品中HCP浓度测量结果的重复精密度(测定内)和中间精密度(测定间)分别由BDS产品中内源性HCP杂质的6个测量结果确定。在每个BDS产品中的内源性HCP浓度由在每个测量结果中的未加标样品计算得到，并且其已经过测定稀释因子校正。对于每个测量结果，由每个产品的3个不同稀释度测量HCP。计算每个产品HCP浓度的重复精密度％CV和中间精密度％CV。对于全部4个GS-CHO BDS产品的重复精密度％CV范围从10.7％至15.0％。与目标20％相比，重复精密度％CV合格。注意，对全部稀释度的结果均计算重复性。全部4个GS-CHO BDS产品中间精密度％CV的范围从7.5％至16.2％(n＝18)，与目标≤20％相比认为其是合格的。
线性
线性是一个重要的测定参数，其显示出测定应答与待测样品中的分析物浓度成比例，因此能够直接从剂量-应答校正曲线截取样品的应答。使用5个水平HCP标记的GS-CHO产品的HCP测量结果评估GS-CHO HCP ELISA的线性。在准确度研究和4个待测GS-CHO HCP产品的每个测定中，线性(r2)值的范围从0.984至1.000。
工作范围
将GS-CHO HCP ELISA标准曲线的工作范围确定为具有合格准确度的范围2ng/ml至80ng/ml。还使用GS-CHO BDS产品的HCP测量结果检测和确证了工作范围。
检测限
将GS-CHO HCP ELISA的检测限(LOD)确定为0.9ng/ml，这是由4种GS-CO BDS产品的41块板的全部6次测定的标准曲线计算得到的最高LOD。每次测定(板)的LOD由使用空白对照(0ng/ml的标准品)的平均吸光度加上其标准偏差的2.5倍(其提供了显著不同的信号)从标准曲线上截取的HCP浓度计算得到。所有待测板的最高LOD为0.875ng/ml，其四舍五入为0.9ng/ml。将0.9ng/ml定义为GS-CHO HCP ELISA的LOD。
定量限
将GS-CHO HCP ELISA的定量限(LOQ)确定为2ng/ml。使用合格的背景计算标准品与针对待测GS-CHO产品的合格准确度的组合定义GS-CHO HCP ELISA的定量限(LOQ)。具有合格背景计算(％RE≤15％)和重复精密度(％CV≤20％)的GS-CHO HCP ELISA的最低标准为1.25ng/ml。将具有合格回收率(6次检测中至少3次在75％至125％之间)的每个产品的LOQ总结在表12中。目前标准CHO HCP ELISA的LOQ为约200ng/ml。
表5：GS的定量限
专属性
针对蛋白A和CHO DNA杂质检测了GS-CHO HCP ELISA的专属性，这两种杂质可能是纯化过程中CHP的共杂质。蛋白A和CHO DNA的专属性％在97％至103％内。蛋白A和CHO DNA的交叉反应性％低于1％。专属性结果表明，在测量抗体产品中的HCP时，在GS-CHO HCPELISA中未观察到来自蛋白A和CHO DNA的潜在负向或正向偏倚。
总之，本申请所述的示例性结果显示了一个耐用、灵敏的HCP ELISA平台测定法，以支持多个表达系统，包括例如哺乳动物表达系统，例如CHOK1SV表达系统。对在绵羊中产生的多克隆HCP抗体进行亲和纯化，并且通过二维(2D)western印迹的点匹配评估得到的针对来自假转染裸细胞的细胞提取物的抗体免疫覆盖率为71％。在ELISA开发期间对抗体浓度、缓冲系统和检测系统进行优化以获得优异的免疫覆盖率和LOQ。
根据人用药品注册技术要求国际协调会议(ICH)Q2(R1)的指导原则评价最终耐用和灵敏的HCP ELISA。针对预先确定的标准对HCP ELISA的测定参数进行评估。理论HCP浓度相对于测量HCP浓度的准确度、测定内精密度、中间精密度和线性是合格的。将该ELISA的工作范围确定为从2ng/ml至80ng/ml。将HCP ELISA的定量限LOQ定义为2ng/ml，该浓度具有基于多个原料纯化产品的合格标记回收率。针对与HCP一起作为主要杂质来源的蛋白A和CHODNA的专属性也已被证明是合格的。
可以将HCP ELISA作为监测在生物纯化过程中和最终原料药中的HCP杂质的平台测定法。还可以将该测定用于对在GS-CHO表达系统中生产的产品进行验证和批次释放。此外，还可以将本申请所述的方法与重组蛋白生产的监管要求结合在一起使用；如ICH Q6B6.2指导原则所述，应将适当灵敏的免疫测定用于检测可能在生物产品中存在的HCP谱。
稳定性
在不同储存温度、时间和冻融条件下，检测GS-CHO HCP ELISA试剂(特别是HCP分析物)的稳定性。在贮存在5±3℃或-65℃或更低温度下之后的不同时间点评价在MAb样品中或加入GS-CHO HCP标记的MAb样品中GS-CHO HCP的稳定性。结果表明在t＝0天至t＝1天贮存阶段中在这两个温度下HCP不稳定并且可能降解，但是在t＝1天至t＝85天贮存阶段中HCP稳定。对于3个Mab样品中的2个，其中未将附加的HCP作为标记加入样品中，在这两个贮存温度下HCP的变化小于或等于30％，符合规定要求。这表明在5±3℃或-65℃或更低温度下贮存长达85天在MAb样品中存在的内源性HCP是稳定的。得出的结论是，HCP检测-65℃或更低的贮存温度对于原料纯化样品的检测是适宜的并且样品在-65℃或更低温度下能够贮存长达85天。
耐用性
为了证明样品制备程序中的小变化将不会影响该方法的性能，评价了测定漂移、测定孵育时间、测定孵育温度和测定试剂放置时间的耐用性。
通过向ELISA板的孔中加入含有高样品pg/ml或低样品pg/ml的测定间对照(IAC)，延迟5分钟后，向ELISA板中加入第二组IAC并且评价IAC的差异考察测定漂移的耐用性。在HCP ELISA的不同时间加入样品不会影响测定结果的准确度或精密度，所有结果均在正常测定变异性的范围内，并且将HCP ELISA定义为针对向ELISA板中加入样品所需的时间(最多5分钟)是耐用的。
通过向3块ELISA板的孔中加入2个MAb样品和含有高样品pg/ml或低样品pg/ml的IAC，然后改变向ELISA板施加的测定步骤的孵育时间考察测定孵育时间的耐用性。3块板的IAC结果和MAb样品结果均是合格的。所有结果均在正常测定变异性的范围内，并且将该检测方法定义为针对测定孵育时间的变化是耐用的通过向3块ELISA板的孔中加入2个MAb样品和含有高样品pg/ml或低样品pg/ml的IAC，然后在17℃下检测一块板、在23℃下检测一块板和在27℃下检测一块板考察测定孵育温度的耐用性。IAC结果和MAb样品结果均是合格的。对于所有3块板，标记对照和在MAb样品中HCP标记的中间精密度是合格的。总体而言，所有结果均在正常测定变异性的范围内，并且将该检测方法定义为在17±2℃至25±2℃的测定孵育温度的变化是耐用的。
通过使用在初始制备后1周、2周、3周和4周制备的测定试剂(包被缓冲液、封闭缓冲液和洗涤缓冲液)考察测定试剂放置时间的耐用性。总体而言，得出的结论是，测定试剂可以稳定长达一个月。

Claims (40)

1.一种在包含重组多肽，例如，治疗性多肽的样品中检测、监测、鉴定或定量GS-CHO宿主细胞蛋白(HCP)的方法，所述方法包括：
a)提供或获取包含重组多肽的样品；
b)使用固定化于支持物，例如，不溶性或固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体孵育所述样品，以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；
c)将所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；
d)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；
e)使用用于所述可检测抗体的检测方法检测与所述抗体结合的GS-CHO HCP的存在情况；
f)任选地对所检测的GS-CHO HCP的水平进行定量；
g)任选地对所检测的一种或多种GS-CHO HCP进行鉴定；以及
h)任选地对所鉴定的所述一种或多种GS-CHO HCP进行定量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中：
i)所述重组多肽是均聚物或异聚物多肽，例如，激素、生长因子、受体、抗体、细胞因子、受体配体、转录因子或酶，优选地抗体或抗体片段，例如人源抗体或人源化抗体或其片段，例如来源于小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊或奶牛抗体，通常是家兔来源的人源化抗体或其片段，或者
ii)所述重组多肽是表1或表2中公开的多肽。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述重组多肽是抗体，例如单克隆抗体，例如治疗性抗体。
4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其中：
i)所述样品来自在所述重组多肽生产过程中的下游处理步骤，
ii)所述样品来自在所述重组多肽生产过程中的上游处理步骤，
iii)所述样品来自所述重组多肽的最终产品，或者
iv)所述方法包括来自在所述重组多肽生产过程中的一个或多个步骤的2、3、4、5、6、7、8、9、10或者10个以上样品。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述可检测抗体是：
i)可直接检测的，
ii)通过荧光测定试剂放大的，或者
iii)生物素化的以及所述检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
6.一种生产重组多肽，例如，治疗性多肽、药品的方法，所述方法包括：
a)提供或获取重组多肽制品的样品；
b)将所述样品与固定化在固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；
c)将所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；
d)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；
e)使用用于所述可检测抗体的检测方法对与捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及
f)如果所述GS-CHO HCP的水平低于预先设定的参照水平，则将所述制品的至少一部分加工成药品，任选地其中加工包括下述中的一种或多种：配制所述多肽制品；将所述多肽制品加工成药品；将所述多肽制品与第二成分，例如，赋形剂或缓冲剂组合；改变所述多肽在所述制品中的浓度；将所述多肽制品冻干；将所述多肽的第一份(aliquot)和第二份组合以提供更大的第三份；将所述多肽制品分成更小的份；将所述多肽制品置于容器，例如，气体或液体密封的容器中；包装所述多肽制品；将包含所述多肽制品的容器与标签，例如，贴签结合；将所述多肽制品运输或移动到不同位置，
从而生产重组多肽药品。
7.一种生产重组多肽，例如，治疗性抗体、药品的方法，所述方法包括：
a)在适于生产，例如，表达和分泌重组多肽的条件下培养GS-CHO细胞，
b)将分泌的重组多肽与宿主细胞分离；
c)对所述分泌的重组多肽进行一个或多个纯化步骤以生产重组多肽制品；
d)采集重组多肽制品的样品；
e)将所述样品与固定化在固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；
c)将所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；
f)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；
g)使用用于所述可检测抗体的检测方法对与捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及
h)如果所述GS-CHO HCP的水平低于预先设定的参照水平，则将所述制品的至少一部分加工成药品，任选地其中所述加工包括下述中的一种或多种：配制所述多肽制品；将所述多肽制品加工成药品；将所述多肽制品与第二成分，例如，赋形剂或缓冲剂组合；改变所述多肽在所述制品中的浓度；将所述多肽制品冻干；将所述多肽的第一份和第二份组合以提供更大的第三份；将所述多肽制品分成更小的份；将所述多肽制品置于容器，例如，气体或液体密封的容器中；包装所述多肽制品；将包含所述多肽制品的容器与标签，例如，贴签结合；将所述多肽制品运输或移动到不同位置，
从而生产重组多肽药品。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述参照水平是：
i)约100ppm，例如，小于100、90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、1ppm，
ii)在1ppm至1000ppm之间，
iii)至少1ppm、10pppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm，或者
iv)不超过1ppm、5ppm、10pppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm。
9.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述GS-CHO HCP的水平低于所述参照水平是所述药品的出厂检查合格标准，例如，根据公共卫生服务(PHS)法案第351(a)条的规定，以及任选地其中所述GS-CHO HCP的水平来自1个、2个或更多个样品或批次。
10.根据权利要求6或7所述的方法，其中
i)所述重组多肽是均聚物或异聚物多肽，例如，激素、生长因子、受体、抗体、细胞因子、受体配体、转录因子或酶，优选地抗体或抗体片段，例如人源抗体或人源化抗体或其片段，例如来源于小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊或奶牛抗体，通常是家兔来源的人源化抗体或其片段，或者
ii)所述重组多肽是表1或表2中公开的多肽。
11.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述重组多肽是抗体，例如单克隆抗体，例如治疗性抗体。
12.根据权利要求6-11中任意一项所述的方法，其中：
i)所述样品来自在所述重组多肽生产过程中的下游处理步骤，
ii)所述样品来自在所述重组多肽生产过程中的上游处理步骤，
iii)所述样品来自所述重组多肽的最终产品，或者
iv)所述方法包括来自在所述重组多肽生产过程中的一个或多个步骤的2、3、4、5、6、7、8、9、10或者10个以上样品。
13.根据权利要求6或7所述的方法，其中所述可检测抗体是：
i)可直接检测的，
ii)通过荧光测定试剂放大的，或者
iii)生物素化的以及检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
14.一种生产重组多肽药品的方法，所述方法包括：
a)提供或获得来自GS-CHO细胞培养物的重组多肽制品的样品；
b)获取所述样品中GS-CHO宿主细胞蛋白(HCP)的值；
c)任选地评价所获取的值，例如通过将所述所获取的值与参照值比较；以及
d)任选地对所述评价做出响应，分类、选择、接受、放行、加工成药品，运输、移动到不同位置，配制、贴签、包装、商业推广、销售或准备销售的所述制品，
其中所述值是多克隆GS-CHO抗体与所述样品结合的函数、与其成比例或从其获得，
从而生产重组多肽药品。
15.根据权利要求14所述的方法，其中通过权利要求1-12中任意一项所述的方法确定所述值。
16.一种评价在GS-CHO宿主细胞中生产重组多肽的工艺的方法，所述方法包括：
a)在适于生产，例如，表达和分泌重组多肽的条件下培养GS-CHO细胞，
b)将分泌的重组多肽与宿主细胞分离以提供第一多肽制品；
c)任选地采集所述第一多肽制品的样品；
d)对所述第一多肽制品进行纯化步骤以生产第二多肽制品；
e)采集所述第二多肽制品的样品；
f)任选地对所述第二多肽制品进行第二个、第三个、第四个、第五个或第六个纯化步骤以提供随后的多肽制品；
g)任选地采集步骤f)中提供的任意随后的多肽制品的样品；
h)将所采集的每个所述样品与固定化在固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；
i)将每个所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；
j)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；
k)使用用于所述可检测抗体的检测方法对与所述捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及
l)基于所述定量，对所述方法做出决定，
从而评价生产重组多肽的工艺。
17.一种评价纯化重组多肽的工艺的方法，所述方法包括：
a)对所述第一多肽制品进行纯化步骤以生产第二多肽制品；
b)采集所述第二多肽制品的样品；
c)任选地对所述第二多肽制品进行第二个、第三个、第四个、第五个或第六个纯化步骤以提供随后的多肽制品；
d)任选地采集步骤c)中提供的任意随后的多肽制品的样品；
e)将所采集的每个所述样品与固定化在固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；
f)将每个所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；
g)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；
h)使用用于所述可检测抗体的检测方法对与所述捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及
i)基于所述定量，对所述方法做出决定，
从而评价纯化重组多肽的方法。
18.根据权利要求16或17所述的方法，包括将所述GS-CHO HCP的水平与参照水平进行比较，例如其中如果所述GS-CHO HCP的水平低于参照水平，则验证了用于生产所述重组多肽的工艺。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述参照水平是：
i)在1ppm至1000ppm之间，
ii)至少1ppm、10pppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm，或者
iii)不超过1ppm、5ppm、10pppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm、100ppm、500ppm或1000ppm。
20.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述纯化步骤包括下述中的一种或多种或者其任意组合：体积排阻色谱(SEC)、离子交换色谱(IEX)、疏水性相互作用色谱(HIC)、反相色谱(RPC)、固定化金属螯合色谱、硫酸铵沉淀、亲硫吸附、蛋白A层析、蛋白G层析、蛋白L层析和亲和层析。
21.根据权利要求16或17所述的方法，其中所述纯化步骤包括：
i)蛋白A层析和一个或多个亲和层析步骤，
ii)蛋白A层析和CNBr层析，例如蛋白A层析和随后的CNBr层析，或者
iii)蛋白A层析和NHS层析，例如蛋白A层析和随后的NHS层析。
22.一种试剂盒，所述试剂盒包含：
a)固定化在固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体；
b)任选地可检测抗体；
c)任选地洗涤缓冲液；和
d)任选地检测试剂，例如检测试剂与捕获试剂相同或与捕获试剂相同但仅经过修饰以通过荧光测定试剂放大，和
任选地其中检测抗体是生物素化的并且检测方法是抗生物素蛋白或抗生物素蛋白链菌素-过氧化物酶和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺。
23.一种纯化的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体制品，任选地其中所述抗-GS-CHO抗体是绵羊、山羊、马、家兔、牛、小鼠、仓鼠或人抗体。
24.根据权利要求23所述纯化的多克隆制品，其中所述制品基本上不含非-HCP特异性IgG，例如所述制品含有不超过0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的非-HCP特异性IgG或所述制品含有低于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％的非-HCP特异性IgG。
25.根据权利要求23所述纯化的多克隆制品，通过包括下述的方法纯化：蛋白A层析，以及一个或多个亲和层析步骤，例如，CNBr层析、NHS层析。
26.一种反应混合物，包含抗-GS-CHO抗体的多克隆制品(例如，本申请所述的多克隆制品)和选自表1或表2的重组多肽。
27.权利要求26所述的反应混合物，包含与所述抗-GS-CHO抗体结合的抗体。
28.一种确定是否某一批次或批号的重组多肽药品符合或满足出厂合格标准的方法，其中所述合格标准是预先确定的GS-CHO HCP的参照水平，所述方法包括：
a)提供或获得重组多肽制品的样品；
b)将所述样品与固定化在固体支持物上的多克隆抗-GS-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物；
c)将所述样品与所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物分离；
d)将所述固定化的抗体-GS-CHO HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；
e)使用用于所述可检测抗体的检测方法对与所述捕获试剂结合的GS-CHO HCP的水平进行定量；以及
f)如果所述GS-CHO HCP的水平符合、满足或低于所述出厂合格标准，则将所述制品的至少一部分加工成药品，和
任选地其中加工包括分类、选择、接受、放行、加工成药品，运输、移动到不同位置，配制、贴签、包装、商业推广、销售或准备销售的所述制品，
从而确定是否某一批次或批号的重组多肽药品符合或满足出厂合格标准。
29.根据权利要求28所述的方法，其中通过权利要求1-21中任意一项所述的方法确定所述值。
30.一种制备多克隆抗-HCP抗体制品的方法，所述方法包括：
a)获取包含抗体的样品，例如来自使用宿主细胞，例如，细胞系，例如哺乳动物、啮齿动物或昆虫细胞或细胞系，如CHO、SP2、NSO宿主细胞的HCP免疫的动物，例如，绵羊、家兔、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊等的抗血清；以及
b)从所述样品中分离抗-HCP抗体，例如将所述样品与HCP亲和试剂，例如，蛋白A接触，以及
任选地其中b)包括：
b.1)从所述样品中分离抗体，例如，IgG抗体以提供抗体制品；和
b.2)从所述抗体制品中分离抗-HCP抗体，例如通过将所述抗体制品与HCP亲和试剂接触，
从而生产多克隆抗-HCP抗体制品。
31.根据权利要求30所述的方法，其中分离抗体包括通过包括蛋白A层析的纯化方法从所述抗血清中纯化多克隆抗-HCP抗体。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述HCP-亲和试剂包含与基底偶联的HCP，例如不溶性或固体基底，例如琼脂糖小珠，例如葡聚糖凝胶(Sepharase)，例如溴化氰(CNBr)或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)层析衍生化的基底。
33.一种生产用于检测重组多肽制品中HCP的ELISA的多克隆抗-HCP抗体制品的方法，所述方法包括：
a)获取包含抗体的样品，例如来自使用宿主细胞，例如，细胞系，如哺乳动物、啮齿动物或昆虫细胞或细胞系，例如CHO、SP2、NSO宿主细胞的HCP免疫的动物，例如，绵羊、家兔、小鼠、大鼠、仓鼠、山羊等的抗血清；以及
b)通过将所述抗血清与蛋白A亲和试剂接触从所述抗血清中分离抗体以提供抗体制品；
c)通过将所述抗体制品与HCP-亲和试剂接触从所述抗体制品中分离抗-HCP抗体，
从而生产多克隆抗-HCP抗体制品。
34.根据权利要求30-33中任意一项所述的方法，其中所述纯化除去：
i)至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的非-HCP特异性IgG，例如至少99％的非-HCP特异性IgG，或
ii)超过50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％非-HCP特异性IgG，例如超过99％的非-HCP特异性IgG。
35.根据权利要求30-33中任意一项所述的方法，其中所述多克隆抗体制品基本上不含非-HCP特异性IgG，例如含有不超过0.5％、1％、2％、3％、5％、10％、20％、30％、40％或50％的非-HCP特异性IgG或者含有少于50％、40％、30％、20％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％的非-HCP特异性IgG。
36.根据权利要求1-21中任意一项所述的方法，其中所述多克隆抗体由权利要求30-35中任意一项所述的方法制备。
37.一种由权利要求30-35中任意一项所述的方法生产的多克隆抗-HCP抗体制品。
38.一种由权利要求30-35中任意一项所述的方法生产的纯化的多克隆抗-HCP抗体制品。
39.一种检测、监测、鉴定或定量含有重组多肽的样品中的宿主细胞蛋白(HCP)，例如，CHO HCP的方法，所述方法包括：
a)提供或获得含有重组多肽的样品；
b)将所述样品与固定化在固体支持物上的多克隆抗-HCP抗体，例如，抗-CHO HCP抗体接触并进行孵育以形成固定化的抗体-HCP复合物，其中所述多克隆抗体是由权利要求28-35中任意一项所述的方法生产的；
c)将所述样品与所述与所述固定化的抗体-HCP复合物分离；
d)将所述固定化的抗体-HCP复合物与同GS-CHO HCP结合的可检测抗体接触；
e)使用用于所述可检测抗体的检测方法检测与所述抗体结合的HCP的存在情况；
f)任选地对所检测的HCP的水平进行定量；
g)任选地对所检测的一种或多种HCP进行鉴定；以及
h)任选地对所鉴定的所述一种或多种HCP进行定量。
40.根据权利要求1-21中任意一项所述的方法，其中所述多克隆抗-GS-CHO HCP抗体由权利要求30-35中任意一项所述的方法生产。
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