CN103792366A - 口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法 - Google Patents

口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于检测口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白的双抗夹心酶联免疫试剂盒，所述双抗夹心酶联免疫试剂盒包括：标准品，兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，抗BHK21细胞蛋白抗体液，稀释液，封闭液，洗液，终止液2M H2SO4，显色液，其中，所述的标准品为幼仓鼠肾细胞蛋白，包被抗体和检测抗体均为兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体。本发明检测试剂盒中包被抗体量更加稳定均一、对微量抗原的乳化更加简便充分、结合抗体与检测抗体为同一抗体在制作试剂盒过程中更加便捷高效，避免不同抗体之间的交叉影响。

Description

口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法
技术领域
本发明涉及一种口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法，具体涉及一种用于检测口蹄疫疫苗中宿主细胞（即幼仓鼠肾细胞）残留蛋白的双抗体夹心酶联免疫试剂盒及其使用方法，属于生物检测领域。
背景技术
口蹄疫是猪、牛、羊等主要家畜和其它家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大政治、经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类传染病之首。目前，有三分之二的OIE成员国流行口蹄疫，时刻威胁着无口蹄疫国家和地区的家畜安全和畜产品贸易。口蹄疫病毒属于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属。其最大颗粒直径为23纳米，最小颗粒直径为7-8纳米，是目前所知病毒中最细微的一级。
牛尤其是犊牛对口蹄疫病毒最易感，骆驼、绵羊、山羊次之，猪也可感染发病。本病具有流行快、传播广、发病急、危害大等流行病学特点，疫区发病率可达50％-100％，犊牛死亡率较高，其他则较低。病畜和潜伏期动物是最危险的传染源。病畜的水疱液、乳汁、尿液、口涎、泪液和粪便中均含有病毒。该病人侵途径主要是消化道，也可经呼吸道传染。本病传播虽无明显的季节性，且春秋两季较多，尤其是春季。风和鸟类也是远距离传播的因素之一。
口蹄疫是目前我国最具影响的动物传染病之一。口蹄疫病毒型多易变，宿主广泛，致病性强，而免疫原性又相对较弱。该病传播方式及感染途径多而复杂，康复动物可长期带毒排毒，致使口蹄疫的防控十分困难。因此对口蹄疫疫苗质量要求越来越高，致使用以衡量疫苗质量，检测其他无关蛋白方法及相关产品呼之欲出。随着无血清细胞培养技术的产生和应用，宿主细胞残留蛋白成为影响疫苗的主要因素，所以对宿主细胞残留蛋白的检测尤为重要。与这一需求相矛盾的情况是，口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白检测相关产品的缺失，这为疫苗的检测监督造成了缺口和漏洞。在这种供求矛盾面前显得这一发明尤为重要。
发明内容
本发明的目的之一提供一种口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白双抗夹心酶联免疫检测试剂盒及使用方法。
本发明的目的之二提供一种微量抗原乳化的方法
本发明的技术方案如下：
一种用于检测口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白的双抗夹心酶联免疫试剂盒，所述双抗夹心酶联免疫试剂盒包括：标准品，兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，稀释液，抗BHK21细胞蛋白抗体液，封闭液，洗液，终止液2M H2S04，显色液，其中，所述的标准品为幼仓鼠肾细胞蛋白，包被抗体和检测抗体均为兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体。
1、兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体的制备
首次免疫采用弗氏完全佐剂乳化抗原，家兔背部脊柱两侧四点注射，注射BHK21细胞蛋白总量1000ug/只；首次免疫后14天后进行二次免疫，步骤及剂量与首次免疫相同，二次免疫采用弗氏不完全佐剂乳化抗原；二次免疫后21天进行三次免疫，步骤及剂量与二次免疫相同；之后每隔21天检测抗体效价，免疫一次，效价超过1:32000可以心脏大量采血。
2、BHK21细胞（幼仓鼠肾细胞）蛋白的制备
BHK21细胞（幼仓鼠肾细胞）购自中检所，应用DMEM培养基加马血清培养传代，待细胞长满培养瓶底用pH7.2的10×PBS洗涤5次，将培养基洗涤干净，胰酶消化细胞待细胞脱落，后再用10×PBS洗涤5次后装入孔径为8000-14000nm的透析袋，在100倍体积10×PBS缓冲液中4℃透析12小时，而后将细胞放入离心管中，-80℃反复冻容5次，镜下观察无完整细胞后进行7500r/min离心，去除细胞碎片，取上层溶液，此溶液为所需抗原蛋白溶液，考马斯亮蓝法检测蛋白含量。
3、抗原蛋白溶液的乳化方法
将2中获得的抗原蛋白溶液用10×PBS稀释成所需浓度，再与蛋白液等体积的弗氏佐剂混合后乳化。做冰水点滴试验，冰水中超过10min不扩散即达到乳化标准。本发明的乳化方法可以快速充分乳化少量抗原蛋白液，具体操作方法为硅胶管两端分别加装5号针头，硅胶管处加蠕动泵作为乳化动力源，两针头放入同一装有抗原液与佐剂混合的混合液的离心管，一端插入蛋白液另一端在液面上，抽吸40min后乳化完成。
5、包被抗体血清的制备
应用3中获得的乳化抗原进行免疫，首次免疫采用弗氏完全佐剂乳化抗原，家兔背部脊柱两侧四点注射，注射BHK21细胞蛋白总量1000ug/只；首次免疫后14天后进行二次免疫，二次免疫采用弗氏不完全佐剂乳化抗原，步骤及剂量与首次免疫相同；二次免疫后21天进行三次免疫，步骤及剂量与二次免疫相同；之后每隔21天免疫一次并且采血检测抗体效价，当效价超过1:32000可以大量采血，置于血凝管中离心制备血清。
6、间接ELISA法检测抗体效价
用2中提取的蛋白以10ug/ml量包被后，用0.1%BSA封闭90分钟，然后将4中制备的血清稀释16倍后加入第一列，然后依次两倍稀释，结合110分钟，加入稀释到工作浓度的酶标二抗20分钟，之后显色终止，酶标仪设定波长为450nm，读取数据，每个步骤完成后用洗涤液洗涤3到5次。
7、包被抗体的纯化
（1）辛酸硫酸铵法粗提抗体
首先动物血清用4倍体积的乙酸乙酸钠缓冲液稀释，0.1mol/LNaOH调pH至4.5，室温下搅拌并缓慢加入辛酸，10000r/min离心20min，取上清，量体积，按1/10体积加入10×PBS，并用5mol/L的NaOH调pH至7.4，在4℃按277g/L缓慢加入硫酸铵粉末，加完后继续搅拌30min，离心弃上清，收集沉淀，沉淀用10×PBS溶解，透析过夜，透析后的抗体溶液在50-55℃水浴中加热20min，5000r/min离心20min，取上清液放置-20℃保存。
（2）亲和层析柱纯化抗体
用结合缓冲液稀释4中获得的抗体，至pH接近7.0，然后将蛋白A填料装入柱子，用5倍体积结合缓冲液平衡柱子。上样，结合缓冲液洗柱子，收集洗脱缓冲液洗下的结合在柱料上的抗体，然后用结合缓冲液复生柱料。
8、酶标板的处理
用10%硫酸鱼精蛋白溶液每孔100ul37℃2小时处理酶标板，后用抗体效价对照稀释包被，即将间接ELISA检测效价为1：2048的抗体液稀释32倍后加入酶标板每孔100ul，37℃包被过夜，后封闭2小时，封存。
9、使用本发明双抗夹心酶联免疫试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）加入待测样品：取出酶标板加入稀释后的待测样品，100ul每孔，37℃，2小时；
（2）加入检测抗体：取出检测抗体稀释32倍，每孔加入100ul，37℃，1.5小时；
（3）加酶标二抗：将酶标二抗稀释10000倍后每孔加入100ul，37℃，20分钟；
（4）显色：每孔加入显色液100ul37℃4分钟；
（5）终止：每孔加入40ul2M硫酸溶液；
（6）酶标仪测量在波长为450nm的值，计算BHK21细胞蛋白含量；
其中，所述的计算方法为：
采用样品读取值与阴性值作差后引入公式y=Z（4925.2x-702.52）中计算细胞蛋白含量，其中Y代表细胞蛋白含量，单位ug/ml，X值为阴阳性吸光值之差，Z为稀释倍数。
Y=Z(4925.2X-702.52)的确立过程如下：
依照双抗夹心ELISA体系对BHK21细胞蛋白液进行检测，具体方法如下：
（1）将提取的BHK21细胞破碎提取蛋白；
（2）用考马斯亮蓝法定量蛋白液中蛋白含量；
（3）稀释蛋白液使蛋白含量分别为100ug/ml200ug/ml300ug/ml400ug/ml四个梯度，完成ELISA；
（4）进行多次实验分别得到四个蛋白含量梯度阴阳性差值的平均值，依照得到的四个平均值确定标准曲线建立方程。
试验阴阳性差平均值如下：
蛋白含量 100 200 300 400
阴阳性差OD值 0.163208 0.18275 0.20375 0.223875
根据以上四点做标准曲线得到方程Y=Z(4925.2X-702.52)
本发明优点在于，目前唯一针对且只针对BHK21细胞蛋白的检测试剂盒、包被抗体量更加稳定均一、对微量抗原的乳化更加简便充分、结合抗体与检测抗体为同一抗体在制作试剂盒过程中更加便捷高效，避免不同抗体之间的交叉影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1BHK21细胞细胞蛋白的制备
材料：10×磷酸盐-NaCl缓冲液：100mmol/LPBS，pH7.2。称NaCl80g、Na2HPO4·12H2O29g、KCl2g、KH2PO42g，加蒸馏水溶解，加入100mmol/LEDTA20m1，用去离子水定容至l000mL；
BHK21细胞（幼仓鼠肾细胞）购自中检所、DMEM培养基、马血清、透析袋（8000nm-14000nm）。
提取步骤：
BHK21细胞（幼仓鼠肾细胞）购自中检所，应用DMEM培养基加马血清培养传代，待细胞长满培养瓶底用pH为7.2的10×PBS洗涤5次，将培养基洗涤干净，胰酶消化细胞待细胞脱落，后再用pH为7.2的10×PBS洗涤5次后装入孔径为8000-14000nm的透析袋，在100倍体积缓冲液中4℃透析12小时，而后将细胞放入离心管中，-80℃反复冻容5次，镜下观察无完整细胞后进行7500r/min离心，去除细胞碎片，取上层溶液，此溶液为所需抗原蛋白溶液，考马斯亮蓝法检测蛋白含量。
考马斯亮蓝法操作步骤：
（1）浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定；
（2）标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug-150ug/100ul之间绘制标准曲线；
（3）将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同；
（4）按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，用滤纸滤去沉淀；
（5）每个1ml样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5-30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min；
（6）根据标准曲线公式计算蛋白的浓度。注释：每次配制考马斯亮蓝染液做一次标准曲线；
标准曲线公式为Y=（X-0.048）/0.0082。
实施例2抗原乳化
材料：弗氏佐剂、实施例1获得的抗原蛋白溶液
操作步骤：
（1）按需要量稀释蛋白液（BHK21细胞蛋白液500ug/ml，10ml加入10ml弗氏佐剂）；
（2）与蛋白液等体积混合弗氏佐剂；
（3）细硅胶管两端连接5号针头并且用扎带扎住；
（4）中间加一个小型蠕动泵，其转速为2ml/min；
（5）装有抗原佐剂混合液的离心管置于冰袋中；
（6）将管的两端同时放入离心管中一端伸入管底；
（7）打开蠕动泵循环抽吸40min，待冰水滴定试验不扩散为乳化完成。
实施例3包被抗体血清的制备：
材料：实施例2获得的乳化抗原、2ml注射器、10ml注射器、采血管、镊子、剪刀、酒精棉。
操作步骤：
（1）保定家兔(新西兰大耳兔)；
（2）剔除家兔耳缘静脉处皮肤上的兔毛；
（3）用2ml注射器采血，1ml/只；
（4）应用实施例2获得的乳化抗原进行免疫，首次免疫采用弗氏完全佐剂乳化抗原，家兔背部脊柱两侧四点注射，注射总量1000ug/只。首次免疫后14天后进行二次免疫，步骤及剂量与首次免疫相同，二次免疫采用弗氏不完全佐剂乳化抗原。二次免疫后21天进行三次免疫，步骤及剂量与二次免疫相同。之后每隔21天检测抗体效价，免疫一次，效价超过1:32000可以心脏大量采血，置于血凝管中离心制备血清，-80℃保存。
实施例4间接ELISA检测抗体效价
试剂配制
包被缓冲液(pH9.60.05M碳酸盐缓冲液)：NaCO31.59克、NaHCO32.93克、加蒸馏水至1000ml；
洗涤缓冲液(pH7.4)：0.15M KH2PO40.2克、Na2HPO4·12H2O2.9克、NaCl8.0克、KCl0.2克、0.05％的Tween-200.7ml、加蒸馏水至1000ml；
稀释液：牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗涤缓冲液至100ml;
终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml；
TMB(四甲基联苯胺)使用液：
A液：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，H2O20.3ml，补ddH2O至500ml；
B液：EDTA-Na0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，TMB0.2g，补ddH2O至500ml；
实施例3检测获得的血清效价。
操作步骤：
（1）包被：用0.05M PH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为10μg／ml。在每个板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗5次，每次3min；
（2）每孔加入0.1ml的0.1%BSA封闭，37℃温浴90min，洗5次，每次3min；
（3）加样：稀释方法第一孔1:16，后面孔稀释倍数以二倍增加，加稀释的待检血清0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育110min。然后洗涤5次，每次3min；
（4）加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体0.1ml。37℃孵育60min，洗涤；
（5）加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃6min；
（6）终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。
阴性阳性判定
在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。以P／N值(阳性孔OD值-空白值／阴性孔OD值-空白值)大于或等于2.1为阳性；P／N值小于2.1，但大于1.5为可疑阳性需重复试验；P／N小于1.5为阴性。
实施例5纯化抗体（IgG）的制备
1、辛酸硫酸铵粗提抗体（IgG）
试剂：
乙酸-乙酸钠缓冲液：60mmol乙酸钠，用乙酸将pH调至4.0，最终定容到1L；
10×磷酸盐-NaCl缓冲液：100mmol/LPBS，pH7.4。称NaCl80g、Na2HPO4·12H2O29g、KCl2g、KH2PO42g，加蒸馏水溶解，加入100mmol/LEDTA20m1，用去离子水定容至l000mL；
透析液：缓冲液即10mmoL／L Na2HPO4-KH2PO4缓冲液含15mmol/LNaCl，pH7.2；
硫酸铵；
辛酸；
操作步骤：
（1）将动物血清用3倍体积的乙酸乙酸钠缓冲液稀释，用0.1mol/LNaOH调pH至4.5；
（2）置于4℃环境搅拌并缓慢加入辛酸（每升血清稀释液加入25ml辛酸），加完继续搅拌30min，然后静置2小时，12000r/min离心30min，取上清并且测量体积。按1/10体积加入10×PBS，并用5mol/L的NaOH调至7.4；
（3）上清置于4℃冷遇10min，在4℃条件下按277g/L，缓慢加入硫酸铵粉末（终浓度达到45%饱和度）边加边搅拌，加完后继续搅拌30min，后静置1.5小时；
（4）10000r/min离心20min，弃上清收集沉淀；
（5）沉淀用原血清体积的1/10的溶解后装入透析袋，放入100倍体积的透析液中，4℃条件下透析过夜；
（6）12000r/min离心20min取上清液放置-20℃保存。
2、亲和层析纯化抗体
缓冲液
结合缓冲液：用50mM Tris-HCl pH7.0做缓冲液；
洗脱缓冲液：0.1M甘氨酸缓冲液pH3.0；
再生缓冲液：同洗脱缓冲液；
灭菌清洁液：75%酒精；
柱料贮存液：20%酒精。
准备纯化抗体样品的准备
抗体样品经硫酸铵粗提后，用结合缓冲液稀释5-10倍，以保证样品液的成分及pH和结合缓冲液接近。若上样体积过大，可以采取调节样品pH和盐浓度的方式，使样品中的缓冲体系与结合缓冲液相同。细胞培养液中大量的血清蛋白会对亲和层析造成一定的干扰，去血清处理或稀释样品将提高纯化抗体收率。样品在上柱前需0.45μm微孔滤膜过滤。
操作步骤
平衡：填料装柱后，用结合缓冲液洗5-10个柱床体积洗掉乙醇并平衡柱子；
上样：将样品上柱，上样流速≤60cm/h；
清洗：平衡缓冲液洗5-10个柱床体积，洗至基线；
洗脱：洗脱缓冲液洗脱，收集洗脱峰，洗脱液立即用中和缓冲液中和到中性；
再生：再生缓冲液流洗2-3个柱床体积；
保存：先后用结合缓冲液、体积分数为20%乙醇分别流洗3-5个柱床体积，层析柱内保留适当体积的体积分数为20%乙醇，置于4-8℃保存。
实施例6口蹄疫疫苗残留蛋白（BHK21细胞蛋白）检测试剂盒构成及制备方法
1、BHK21细胞蛋白检测试剂盒包括：标准品5ml，兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体包被的96孔酶标板10块，10000×辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG2×500ul，10×稀释液100ml，封闭液100ml，10×抗BHK21细胞蛋白抗体液100ml，10×洗液50ml，终止液2M H2S0450ml，显色液包括A液150ml，B液150ml。
2、ELISA相关溶液配制
酶标板处理液：10mg硫酸鱼精蛋白溶解于100ml蒸馏水中；
包被缓冲液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液)：NaCO31.59克，NaHCO32.93克加蒸馏水至1000ml；
洗涤缓冲液(PH7.410×PBS)：0.15M KH2PO40.2克，Na2HPO4·12H2O2.9克，NaCl8.0克，KCl0.2克，Tween-200.05％0.7ml，加蒸馏水至1000ml；
稀释液：牛血清白蛋白(BSA)0.2克加洗涤缓冲液至100ml；
终止液(2M H2SO4）：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸21.7ml。
TMB(四甲基联苯胺)使用液：
A液：醋酸钠13.6g，柠檬酸1.6g，H2O20.3ml，补ddH2O至500ml；
B液：EDTA-Na0.2g，柠檬酸0.95g，甘油50ml，TMB0.2g，补ddH2O至500ml。
3、抗体酶标板的制备
首先用10%硫酸鱼精蛋白溶液每孔100ul处理酶标板37℃2小时，然后将实施例5制备的间接ELISA检测效价为1:2048的抗体液,用包被缓冲液稀释32倍后按100ul/孔加入到酶标板中，放置4℃冰箱12小时，弃包被液，每孔加入洗涤缓冲液100ul洗涤3次，加入封闭液100ul/孔于37℃2h，弃封闭液风干后装入专用锡箔袋，抽真空，热压封口，后4℃条件保存。
实施例7口蹄疫疫苗残留蛋白（BHK21细胞蛋白）检测步骤：
（1）从4℃冰箱取出试剂盒，平衡各组至室温；
（2）稀释待测样品（疫苗的阻断样或破乳样用稀释液稀释），确保蛋白浓度在50ug-1000ug/ml之间。后每孔加入稀释后待检测样100ml，封口膜封口，置37℃温箱中2小时取出弃去检测液体；
（3）每孔加100ul洗涤液洗涤3次后加入稀释到工作浓度的一抗，100ul/孔，分别加入阳性和阴性，置37℃温箱1.5小时；
（4）取出，弃一抗，每孔加100ul洗涤液洗3次后加入稀释到工作浓度的酶标二抗，置37℃温箱20分钟后取出；
（5）弃二抗每孔加100ul洗涤液洗5次后风干；
（6）加入显色液每孔100ul，置37℃温箱4分钟；
（7）加入终止液40ul/孔终止反应；
（8）立即放入酶标仪读取，酶标仪设定波长为450nm。
结果计算：在加入一抗时，分别加入阳性和阴性。这样就出现阳性值和阴性值。接下来用公式y=Z（4925.2x-702.52）（公式经过增加重复试验数据进行校正更改如下）计算细胞蛋白含量，其中Y代表细胞蛋白含量，单位ug/ml。X值为阴阳性吸光值之差，Z为稀释倍数。
具体步骤如下
（1）取口蹄疫疫苗阻断样稀释5倍；
（2）按照上述检测步骤完成夹心ELISA，稀释后阻断样为待测样品，检测阻断样中BHK21细胞蛋白残留量；
（3）分别重复3组检测，根据公式要求计算阴阳性差值为0.1575、0.1607、0.1560，三者平均值为0.1581；
（4）带入y=Z（4925.2x-702.52）计算得到口蹄疫疫苗中含BHK21细胞蛋白量为380.7ug/ml。

Claims (6)

1.一种用于检测口蹄疫疫苗宿主细胞蛋白的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述双抗夹心酶联免疫试剂盒包括：标准品，兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体包被的96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，抗BHK21细胞蛋白抗体液，稀释液，封闭液，洗液，终止液2M H2S04，显色液，其中，所述的标准品为所述标准品为幼仓鼠肾细胞蛋白，包被抗体和检测抗体均为兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体。
2.根据权利要求1中所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述兔抗BHK21细胞蛋白多克隆抗体的制备方法为：
首次免疫采用弗氏完全佐剂乳化抗原，家兔背部脊柱两侧四点注射，注射BHK21蛋白总量1000ug/只；首次免疫后14天后进行二次免疫，步骤及剂量与首次免疫相同，二次免疫采用弗氏不完全佐剂乳化抗原；二次免疫后21天进行三次免疫，步骤及剂量与二次免疫相同；之后每隔21天检测抗体效价，免疫一次，效价超过1:32000可以心脏大量采血。
3.根据权利要求1中所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述幼仓鼠肾细胞蛋白的制备方法如下：
将BHK21细胞用DMEM培养基加马血清培养传代，待细胞长满培养瓶底用pH为7.2的10×PBS洗涤5次，将培养基洗涤干净，胰酶消化细胞待细胞脱落，后再用10×PBS洗涤5次后装入孔径为8000-14000nm的透析袋，在100倍体积10×PBS缓冲液中4℃透析12小时，而后将细胞放入离心管中，-80℃反复冻容5次，镜下观察无完整细胞后进行7500r/min离心，去除细胞碎片，取上层溶液，此溶液为所需抗原蛋白溶液，考马斯亮蓝法检测蛋白含量。
4.根据权利要求1中所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，可以快速充分乳化少量抗原蛋白液，方法为硅胶管两端分别加装5号针头，硅胶管处加蠕动泵作为乳化动力源，两针头放入同一装有抗原液与佐剂混合的混合液的离心管，一端插入蛋白液另一端在液面上，抽吸40min后乳化完成。
5.酶标板处理方法用10%硫酸鱼精蛋白溶液每孔100ul37℃2小时处理酶标板，后用抗据权利要求1中所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒，其特征在于，所述抗体效价对照稀释包被，即将间接ELISA检测效价为1：2048的抗体液稀释32倍后加入酶标板每孔100ul，37℃包被过夜，后封闭2小时，封存。
6.使用如权利要求1-5任一项所述的双抗夹心酶联免疫试剂盒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）加入待测样品：取出酶标板加入稀释后的待测样品，100ul每孔，37℃，2小时；
（2）加入检测抗体：取出检测抗体稀释32倍，每孔加入100ul，37℃，1.5小时；
（3）加酶标二抗：将酶标二抗稀释10000倍后每孔加入100ul，37℃，20分钟；
（4）显色：每孔加入显色液100ul，37℃，4分钟；
（5）终止：每孔加入40ul，2M硫酸溶液；
（6）酶标仪测量在波长为450nm的值，计算BHK21细胞蛋白含量；
其中，所述的计算方法为：
采用样品读取值与阴性值作差后引入公式y=Z（4925.2x-702.52）中计算细胞蛋白含量，其中Y代表细胞蛋白含量，单位ug/ml，X值为阴阳性吸光值之差，Z为稀释倍数。
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