CN105017419A - 抗人nmp-22的单克隆抗体及其检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗人NMP-22的单克隆抗体及其检测试剂盒。具体而言，提供了一种利用基因克隆重组技术表达的人核基质蛋白22(NMP-22)，并应用免疫学技术获取抗人NMP-22的鼠单克隆抗体。本公开还涉及一种特异性检测人样本中NMP-22的试剂盒，其包含两株特异性的抗人NMP-22的单克隆抗体。本公开的试剂盒使得能够迅速、灵敏、特异地定量检测样本中的NMP-22含量。

Description

抗人NMP-22的单克隆抗体及其检测试剂盒

技术领域

本公开属于分子免疫学领域，具体涉及重组表达的人核基质蛋白22(NMP-22)及其制备与纯化方法；应用免疫学技术获取的抗人NMP-22的单克隆抗体；以及人NMP-22的检测试剂盒。

背景技术

膀胱肿瘤是泌尿系统最常见的肿瘤，也是我国最常见的泌尿系肿瘤，其中90％以上为膀胱移行细胞癌(bladder transitional cell carcinoma，BTCC)。

BTCC的生物学行为复杂多变，显著特征为高复发率和肿瘤生物学行为恶性程度低。BTCC表现为易复发、多发、浸润和转移。所以，这些因素容易影响对膀胱癌的诊断和治疗。早期诊断比较局限，如能及时发现与治疗，其五年生存率为94％；一旦肿瘤发生局部扩散和转移，五年生存率将分别降至49％和6％。因此，早期发现早期治疗对膀胱肿瘤患者的预后有很重要的意义。

目前，膀胱癌的诊断主要依靠膀胱镜检查和尿脱落细胞学。膀胱镜检查属于侵入性检查，患者较痛苦，并且其精确性受血尿的影响。甚至在某些情况下，膀胱镜检查有导致尿路感染的可能性，因而不适用于膀胱癌的群体性筛查。尿脱落细胞学检查虽然特异性高，但是灵敏度较差仅为30至50％，容易受到尿路感染等因素的干扰，对早期级别癌的灵敏度仅为30％。

通常，一种新的临床早期诊断和检测方法应该具有非侵入性、较好的灵敏度和特异性、操作简便、使用成本低等特点。因此，寻找灵敏度高、特异性强、并且便于群体性筛查的无创性检查方法是近年来膀胱癌临床研究的热点。

NMP-22是核基质的重要组成部分，和DNA的复制、转录及RNA的合成、基因表达的调控有关。NMP-22是核有丝分裂装置蛋白(NuMA)的一个亚单位。NuMA和有丝分裂期间纺锤体的形成有关，其主要功能为协调核有丝分裂期间染色体正确均匀地分配到子代细胞。故NMP-22多分布于有丝分裂较活跃的组织，如上皮细胞，尤其是尿路上皮细胞。当细胞恶变(malignant transformation)时，核内遗传物质在分裂末期分配极度异常，NMP22的合成激增，可视其为尿路上皮特异性肿瘤标记物。根据NMP-22在细胞中的作用推断，膀胱癌患者尿液NMP-22含量升高是由于癌细胞增殖异常活跃使细胞内NMP-22含量增高，在细胞凋亡过程中释放到尿液中所致。NMP-22在尿液中的含量在一定程度上反映了肿瘤细胞的增殖状况，提示尿液中NMP-22含量可作为筛选膀胱癌的一个肿瘤标志物，对判断疾病的进展及治疗效果评价有重要参考价值。

Carpinito等(Urinary Nuclear Matrix Protein as a Marker for Transitional Cell Carcinomaof the Urinary Tract，The Journal of Urology，第156卷第4期，1280–1285页，1996年10月)研究证实，活动期BTCC患者的NMP-22浓度和健康志愿者之间有显著差异。该研究测定了包括膀胱癌、良性膀胱疾病患者和正常人在内的667例的尿NMP-22浓度。活动性移行细胞癌患者的NMP-22浓度明显高于那些不患癌的患者。

FDA批准NMP-22检测可指导泌尿外科医生决定患者是否需要膀胱镜检查，但不能代替膀胱镜检查。有报导其敏感性和特异性远高于尿细胞学检查的敏感性。还有研究认为，NMP-22不仅适用于确诊前的筛查，还在治疗后随访中有参考价值。

目前全球用于NMP-22检测的试剂寥寥无几。美国Alere公司生产制造的人NMP-22检测酶免法试剂盒(货号D1100E)在各大医院以及临床检测机构市场中占有很大比例，但市场反馈其灵敏度低，且试剂盒操作比较费时费力。鉴于此，临床上仍然迫切需要特异性强且灵敏度高的人NMP-22测定试剂盒。

发明内容

根据本公开的一方面，提供了一种重组技术获得的分离人NMP-22抗原。

天然NMP-22在正常人尿液中含量较低，从尿液中大量获取天然人NMP-22抗原较为困难。因此，本发明人利用基因克隆重组技术将人NMP-22部分基因片段克隆至表达载体并导入表达宿主中，使其在细胞中进行大量表达，对重组表达的蛋白进行纯化获得目的蛋白。

人NMP-22的基因全长为1974bp(GenBank登录号BC043499.1)。然而，在一些实施方式中，分离的人NMP-22抗原并非全长的天然蛋白，而是其片段；优选地其氨基酸序列为SEQ ID No.1。在一些实施方式中，编码本申请的人NMP-22抗原的多核苷酸如SEQ ID No.2所示；其中SEQ ID No.2对应着全长基因序列第140至1057位的片段。

在一些实施方式中，根据本申请的人NMP-22抗原是分离的和/或纯化的。在一些实施方式中，根据本申请的人NMP-22抗原，其纯度不低于90％。允许通过本领域中任何公知的适当方法确定蛋白的纯度，如色谱纯度，例如SDS-PAGE法。在另一些实施方式中，本申请的人NMP-22抗原允许有效制备一种或更多抗人NMP-22单克隆抗体。

根据本公开的又一方面，提供了一种表达载体，其包含SEQ ID No.2所示的多核苷酸。在具体实施方式中，表达载体是原核表达载体。本公开还提供一种表达宿主，其转化有上述限定的表达载体。在具体实施方式中，所述表达宿主是原核细胞；在本领域公知的适当培养条件下，所述表达宿主能够表达SEQ ID No.1所示的人NMP-22抗原。

根据本公开的又一方面，本公开提供了上述人NMP-22抗原在制备单克隆抗体中的用途。还提供了一种制备抗人NMP-22单克隆抗体的方法，方法包括使用根据本申请的分离的人NMP-22抗原免疫动物的步骤。

根据本公开的又一方面，提供一种抗NMP-22的单克隆抗体，其特异性地结合上述限定的人NMP-22抗原。在具体的实施方式中，抗NMP-22的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10586的杂交瘤细胞所产生。在另一些具体的实施方式中，抗NMP-22的单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10585的杂交瘤细胞所产生。

根据本公开的又一方面，提供一种杂交瘤细胞，其于2015年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.10585。

根据本公开的又一方面，提供一种杂交瘤细胞，其于2015年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号分别为CGMCC No.10586。

根据本公开的又一方面，提供一种检测试剂，其包含上述限定的抗NMP-22的单克隆抗体。在具体的实施方式中，所述检测试剂包含由保藏号为CGMCC No.10586的杂交瘤细胞所产生的抗NMP-22的单克隆抗体、和/或由保藏号为CGMCC No.10585的杂交瘤细胞所产生的抗NMP-22的单克隆抗体。在一些具体的实施方式中，检测试剂同时包含上述两种单克隆抗体。

根据本公开的又一方面，提供根据本申请的抗NMP-22的单克隆抗体在制备检测试剂中的用途。在一些具体的实施方式中，提供由保藏号为CGMCC No.10586的杂交瘤细胞所产生的抗NMP-22的单克隆抗体和/或由保藏号为CGMCC No.10585的杂交瘤细胞所产生的抗NMP-22的单克隆抗体在制备检测试剂中的用途。在一些具体的实施方式中，所述检测试剂选自：胶体金检测试剂、ELISA检测试剂、免疫比浊检测试剂、磁颗粒检测试剂、化学发光检测试剂、免疫荧光检测试剂和放射免疫检测试剂。然而，本领域技术人员理解，任何利用抗体进行待测物检测的检测方法都适用于本申请。尽管此处提及了上述具体的检测试剂类型，但并不限于此，自申请日以后所开发的未来检测类型仍然属于本申请的范围之内。

根据本公开的又一方面，提供一种人NMP-22的检测试剂盒，其包含包被有第一抗人NMP-22单克隆抗体的多孔板、和生物素标记的第二抗人NMP-22单克隆抗体。

在一些实施方式中，公开了一种人NMP-22的检测试剂盒，其包含如下：

包被有第一抗人NMP-22单克隆抗体的多孔板；

生物素标记抗体工作液，其包含生物素标记的第二抗人NMP-22单克隆抗体；

洗涤液；

辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液；以及

任选地，样本稀释液、和/或底物液。

在一些实施方式中，第一抗人NMP-22单克隆抗体和第二抗人NMP-22单克隆抗体识别不同的抗原表位。在具体的实施方式中，包被有第一抗人NMP-22单克隆抗体的多孔板上的第一抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10586或10585的杂交瘤细胞所产生。优选地，多孔板包被有600ng/孔的第一抗人NMP-22单克隆抗体。

在一些实施方式中，生物素标记抗体工作液包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠，小牛血清、生物素标记的第二抗人NMP-22单克隆抗体和防腐剂。在具体实施方案中，生物素标记抗体工作液包含5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300和12mg/L生物素标记的第二抗人NMP-22单克隆抗体。在一些实施方式中，第二抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10585或10586的杂交瘤细胞所产生。第二抗人NMP-22单克隆抗体能特异性识别并结合样本中的NMP-22，抗体上所标记的生物素与HRP标记的链霉亲和素结合，HRP进而与底物反应产生信号。产生的信号换算成浓度，用于定量分析。

第一抗人NMP-22单克隆抗体和第二抗人NMP-22单克隆抗体识别抗原的不同表位。因此，当第一抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10586的杂交瘤细胞所产生时，第二抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10585的杂交瘤细胞所产生；或者当第二抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10586的杂交瘤细胞所产生时，第一抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10585的杂交瘤细胞所产生。

在一些实施方式中，洗涤液包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠，小牛血清和防腐剂。在具体实施方式中，洗涤液包含5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清和0.5ml/L Proclin-300。此处的洗涤液是20×浓缩倍数。技术人员可以理解，洗涤液的其它浓缩倍数也包括在本发明范围内。

在一些实施方式中，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、小牛血清、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素和防腐剂。

在一些实施方式中，试剂盒中任选地可以包含样本稀释液。当然，技术人员也可以使用其它市售样本稀释液或者自行配制。在一些实施方式中，样本稀释液包含氯化钠、山羊血清、吐温-20和防腐剂。在具体的实施方式中，样本稀释液包含30g/L氯化钠、25ml/L山羊血清、5ml/L吐温-20和0.5ml/L Proclin-300。样本稀释液可以配制成浓缩型，也可以不是。技术人员可以理解，其它浓缩倍数也包括在本发明范围内。

在一些实施方式中，试剂盒中任选地可以包含底物液。技术人员也可以使用其它市售底物、或者也允许自行配制。在一些实施方式中，底物液包含辣根过氧化物酶(HRP)底物。应当理解，任何公知的HRP底物都可以使用。在具体实施方式中，底物液包含底物液A和底物液B。底物液A含有鲁米诺和发光增强剂。底物液B含有过氧化物和发光增强剂。

应当理解，本公开的各试剂可以配制成浓缩型，也可以不是。在一些实施方式中，一些试剂配制成浓缩型，这可以减少运输、储存体积。技术人员可以理解，除了具体实例以外，其它浓缩倍数的试剂、其它干燥形式(例如冻干形式)的试剂也包括在本发明范围内。

在一些实施方式中，样本来自哺乳动物，优选来自人类。在具体实施方式中，样本为人类尿液。

在一些实施方式中，本公开的试剂盒还可以根据需要包括校准品。校准品用于标准曲线的绘制。校准品包含已知浓度的人NMP-22，NMP-22的浓度在0ng/ml至100ng/ml范围内(含端点值)。在具体实施方式中，校准品中人NMP-22浓度分别为100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0ng/ml。技术人员理解，其它浓度同样适用，例如只需三个浓度点就足以建立一条标准曲线。

在一些实施方式中，本公开的试剂盒还可以根据需要包括质控品。质控品包含已知浓度的人NMP-22。在具体实施方式中，质控品中人NMP-22浓度分别为40ng/ml至60ng/ml；1.6ng/ml至2.4ng/ml。

在一些实施方式中，校准品或质控品是已知人NMP-22浓度的源自人类的样本；这种样本可以市售获得的、或收集自临床机构；其经灭活处理，并且抗-TP、HBsAg、抗-HCV和抗-HIV均为阴性。在一些实施方式中，还可以使用阴性样本(或稀释液)稀释人NMP-22纯品(或者人NMP-22参考物质)来制备校准品或质控品。

附图说明

图1：PCR扩增目的基因的琼脂糖凝胶电泳图。

图2：菌液PCR琼脂糖凝胶电泳图。

图3：3号克隆的测序与目的基因序列的比对结果。

图4：NMP-22-pEASY-T1双酶切的琼脂糖凝胶电泳图。

图5：pET-28a载体图谱与目的基因NMP-22插入位置。

图6：pET-28-NMP-22双酶切的琼脂糖凝胶电泳图。

图7：pET-28-NMP-22诱导表达后菌液裂解上清/沉淀的SDS-PAGE电泳图。

图8：pET-28-NMP-22重组蛋白经纯化后的SDS-PAGE电泳图。

图9：5只小鼠第三次免疫后的血清效价检测。

具体实施方式

为了使本发明易于理解，下面结合具体实施例进一步阐述本发明。以下提供了本发明实施方式中所使用的具体材料及其来源。但是，应当理解的是，这些仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。

实施例1.重组人NMP-22蛋白的制备与纯化

1.根据北京博迈德基因技术有限公司生产的EASYspin全血RNA快速提取试剂盒(货号RN06)使用说明书实施操作，提取全血RNA。

2.根据北京全式金生物技术有限公司生产的Transcript First-strand cDNA SythesisSuperMix试剂盒(货号AT301-02)使用说明书实施操作，其中使用以下反应体系完成：

cDNA第一链合成反应体系

42℃孵育30min后，于85℃时5分钟灭活逆转录酶，终止反应。

其中Oligo(DT)18、2×反应混合溶液、酶混合物均来源于上述试剂盒，RNA来源于步骤1提取的全血RNA。

3.按如下反应体系与反应条件进行PCR反应扩增NMP-22目的基因：

(1)PCR反应体系的配制

(2)PCR反应条件

其中2×反应混合溶液为北京全式金生物技术有限公司生产的2×TransTaq-T PCRSuperMix(货号AS122)，主要成分包含DNA聚合酶、dNTP与反应缓冲液。NMP-22-上游引物、NMP-22-下游引物是根据GenBank中登录人NuMA的基因编码区序列(登陆号BC043499.1)，选取基因部分片段140-1057bp(SEQ ID No.2)进行克隆重组。利用primer-primer 5.0引物设计软件进行引物设计，并分在上游引物与下游引物5’端分别加入BamHI和XhoI限制性酶切位点，并交由北京博迈德基因技术有限公司合成，引物序列如下，

NMP-22上游引物(5’-3’)：GGATCCATGACACTCCACGCCAC(SEQ ID NO.3)；

NMP-22下游引物(5’-3’):CTCGAGTTACTTCTCTGTCTTCAGGTC(SEQ ID NO.4)。

4.对PCR扩增反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图1。扩增的DNA条带大小位于750-1000bp之间，与NMP-22目的基因片段918bp位置相符。使用北京全式金生物技术有限公司生产的琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号H41118)，根据制造商使用说明书实施操作，对PCR扩增产物进行回收。

5.使用北京全式金生物技术有限公司T载体连接试剂盒(货号H20724)，根据使用说明书，DNA回收产物与pEASY-T1Simple载体于25℃下连接15min。将10μl连接产物转化加入至50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上孵育30min，42℃热应激90s后，立即放置冰上2min，加入500μl LB液体培养基，37℃下200-250rpm振荡培养45min后，将菌液涂在具有氨苄抗性筛选培养板上，平板正向放置10min后，晾干残余菌液，倒置平皿，37℃培养过夜。

6.随机挑取步骤5中6个单菌落于3ml LB培养基中，进行37℃过夜扩大培养。以菌液为cDNA模板，参考步骤3进行菌液PCR鉴定，并进行琼脂糖凝胶电泳，结果见图2。从图2中可见，以1号至6号克隆为模板扩增DNA位置均在750-1000bp之间，与目的基因NMP-22(918bp)大小位置相符。选取1号、2号、3号克隆送至北京博迈德基因技术有限公司进行DNA测序。反馈的测序报告与GenBank中登录人NuMA的基因编码区序列(登录号BC043499.1)进行Blast对比，其中3号克隆测序基因序列与目的基因序列完全一致，序列比对结果见图3。使用北京全式金生物技术有限公司生产的小量提取质粒DNA试剂盒(货号H41105)，根据试剂盒使用说明书实施操作，对NMP-22-pEASY-T1Simple 3号克隆小提质粒DNA。对提取的DNA使用纽英伦生物技术(北京)有限公司生产的限制性内切酶BamHI(货号#R0136V)与XhoI(货号#R0146V)进行双酶切验证，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图4。箭头所示位置为酶切释放片段，大小在750-1000bp之间，与目的基因NMP-22(918bp)大小相符。

7.使用纽英伦生物技术(北京)有限公司生产的限制性内切酶BamHI(货号#R0136V)与XhoI(货号#R0146V)，根据制造商使用说明，对NMP-22-pEASY-T1质粒与原核表达载体pET-28a质粒(载体图谱见图5，图中框标注位置为目的基因NMP-22插入位置)进行双酶切，使其具有互补粘性末端。使用北京全式金生物技术有限公司生产的琼脂糖凝胶回收试剂盒(货号H41118)，根据制造商使用说明书实施操作，将具有互补粘性末端的目的基因产物与酶切载体片段分别进行DNA回收。使用大连TaKaRa公司生产的T4DNA Ligase试剂盒(货号D2011A)，根据制造商使用说明，将具有互补粘性末端的目的基因产物与酶切载体片段进行16℃水浴连接12小时。将连接产物全部加入至50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上孵育30min；42℃热应激90s后，立即放置冰上2min；加入500μl LB液体培养基，37℃ 200-250rpm振荡培养45min；将菌液涂在具有氨苄抗性筛选培养板上，平板正向放置10min后，晾干残余菌液；倒置平皿，37℃培养过夜。随机挑取2个pET-28a-NMP-22单菌落于3ml LB培养基中，进行37℃过夜扩大培养。使用北京全式金生物技术有限公司生产的小量提取质粒DNA试剂盒(货号H41105)，根据试剂盒使用说明书实施操作，对pET-28a-NMP-22小提质粒DNA。对提取的DNA使用纽英伦生物技术(北京)有限公司生产的限制性内切酶BamHI(货号#R0136V)与XhoI(货号#R0146V)进行双酶切验证，酶切产物琼脂糖凝胶电泳，电泳结果见图6。箭头所示位置为酶切片段，大小在750-1000bp之间，与目的基因NMP-22(918bp)大小相符。

8.对于步骤7构建好的原核表达质粒pET-28-NMP-22转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆菌落于5ml的LB液体培养基(含卡那霉素)中220rpm，37℃培养过夜培养。过夜培养菌按1:100转接到新鲜的LB液体培养基中，220rpm，37℃培养，待菌液浓度OD600≈0.6时加入IPTG开始诱导(IPTG终浓度为0.25mM)；28℃ 220rpm诱导4h收菌；超声破碎菌体，超声条件：每处理3秒间隔7秒，超声5min，输出功率50％。9500rpm，4℃离心20min，分离上清和沉淀，并对其进行SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定(图7)，其中泳道1为未加IPTG诱导的阴性全菌、泳道2为超声破碎诱导菌沉淀泳道、泳道3为超声破碎诱导菌上清。箭头所示位置为表达的目的蛋白，大小在30kd-40kd之间，与目的蛋白NMP-22大小(34kd)位置一致，并且大部分蛋白以上清形式呈可溶性表达。

9.按照步骤8中的诱导表达条件，100ml菌液于0.25mM IPTG，28℃ 220rpm诱导4小时。9500rpm，4℃离心2min，收集菌体。加入预冷的上样缓冲液20ml(300mMNaCl、50mM NaH₂PO₄、10mM咪唑、10mM Tris碱，pH 8.0)，重悬菌体，超声破碎菌体：每处理3秒间隔7秒，超声20min，输出功率50％。9500rpm，4℃离心20min，分离上清和沉淀。上样前将上清用孔径0.22μm的滤膜进行过滤。制好Ni²⁺-NTA亲和层析柱，用去离子水进行缓慢洗脱，用10倍柱床体积的上样缓冲液进行预平衡；将过滤后的样本过柱并收集流出液；用20倍柱床体积的冲洗缓冲液(300mM NaCl、50mMNaH₂PO₄、20mM咪唑、10mM Tris碱，pH 8.0)进行漂洗，收集滤过液。用5倍柱床体积的洗脱缓冲液(300mM NaCl、50mM NaH₂PO₄、300mM咪唑、10mM Tris碱，pH 8.0)进行洗脱，收集目的蛋白，将目的蛋白透析至0.01M PBS缓冲体系。使用北京博迈德基因技术有限公司生产的BCA蛋白定量试剂盒(货号PP0102)，根据制造商产品使用说明书实施操作，对pET-28-NMP-22重组抗原进行定量，蛋白浓度约为1.32mg/ml，最终得到5.28mg。对pET-28-NMP-22重组抗原SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结果见图8，箭头位置为目的蛋白位置，大小在30kd-40kd之间，与目的蛋白NMP-22大小(34kd)位置一致，蛋白纯度大于90％，纯化的蛋白应用于实施例2的免疫原与实施例3中的产品校准品。

实施例2.抗人NMP-22鼠单克隆抗体的制备

1.选取6周龄、体重约20g的雌性Balb/c 5只小鼠。取实施例1中制备的重组蛋白进行免疫。初次免疫，取100μg蛋白加0.01M PBS至500μl，与等体积福氏完全佐剂进行乳化，乳化充分后进行皮下多点注射。分别在第14和35天分别进行第二次和第三次免疫剂量同初次免疫，与福氏不完全佐剂进行乳化，乳化充分后进行皮下多点注射。三次免疫后1周取小鼠尾静脉血，包被重组抗原使用间接Elisa法进行血清效价检测，选取效价最高的小鼠(B鼠，参见图9)的脾进行细胞融合。融合前3天加强免疫，取剂量20μg重组蛋白稀释至100μl 0.01M PBS中尾静脉注射小鼠；3天后，取脾进行细胞融合。

2.取提前3天，加强免疫的小鼠，拉颈处死，无菌取脾脏。用10ml北京钮因泰克生物技术有限公司生产的RMPI-1640(1802-E)无血清培养液洗一次。脾脏研碎，过200目细胞筛。将脾细胞转移至10ml离心管中，800rpm离心10min。细胞用10ml培养液洗2次，用5ml无血清培养重悬细胞，并显微镜下细胞计数，共获得约1×10⁸个脾淋巴细胞悬液备用。收获处于对数生长期的小鼠骨髓瘤SP2/0细胞，用10ml无血清培养液洗2次，用5ml无血清培养重悬细胞，并显微镜下细胞计数，共获得约5×10⁷个SP2/0细胞悬液备用。

3.细胞融合：将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：2的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm，8min；弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇(PEG)浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。加入37℃预温的1ml 50％(0.5g/1ml)PEG聚乙二醇(分子量4000)溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。加37℃预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。离心，800rpm,6min，弃上清，并用含20％(v/v)特级胎牛血清与1×HAT培养基添加剂Hybri-Max(Sigma货号H0262)选择培养液重悬，将细胞悬液铺至96孔细胞培养板内，每孔加200μl。将培养板置37℃、5％CO2培养箱中培养。

4.细胞融合10天后，显微镜下观察，待杂交瘤细胞克隆布满孔底1/5面积时，即可采用间接Elisa法检测培养上清，筛选具分泌抗性阳性细胞克隆。用0.05M碳酸盐缓冲液稀释重组蛋白至5μg/ml，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜，将酶标板孔中的液体倒尽，加入PBST，重复洗涤三次；加入保温液(0.5％BSA，PBST稀释)200μl/孔进行封闭，置于37℃，1小时，拍干备用。加入100μl细胞培养上清，阳性对照加入1:1000保温液稀释的融合小鼠免疫血清，阴性对照为SP2/0培养上清，空白为洗涤液，于37℃静置45分钟。200μl/孔PBST洗板，重复洗涤三次。加入1:5000稀释HRP标记羊抗鼠二抗100μl/孔，于37℃静置45分钟。200μl/孔PBST洗板，重复洗涤三次。加入底物反应液100μl/孔，37℃置暗处反应10分钟。加入H₂SO₄(2mol/L)50μl/孔，终止反应。酶标仪检测450nm吸光度值，对比阳性对照OD值，选择大于等于阳性对照OD值的克隆孔进行克隆化。

5.筛选得到的阳性克隆，采用有限稀释法对杂交瘤克隆化，将待克隆的杂交瘤细胞用用含20％(v/v)特级胎牛血清与1×HT培养基添加剂(Sigma H0137)选择培养液从培养孔内轻轻吹干，细胞计数，并调整细胞为5个细胞/ml；每孔加入稀释细胞200μl，37℃、5％CO2培养箱中培养。10天可见细胞克隆形成，取单克隆细胞孔培养上清进行间接Elisa法检测，并将最强的阳性单克隆再次克隆化，直至单克隆细胞阳性率达100％，即可定株扩大培养并进行细胞冻存。经过3轮克隆化，共保留了13株细胞株，其克隆号为7H3、5E8、1E12、1D12、4E4、11A10、8A11、5D1、3H7、6A2、13H5、11F9和13A4。

6.腹腔注射500μl/只石蜡油于Balb/c小鼠。7天后再将步骤5中获得13株杂交瘤细胞按1×10⁶的细胞浓度进行腹腔注射，10天后收集腹水。使用GE医疗中国生产制造的Protein G Sepharose 4Fast Flow，根据产品使用说明书，对腹水进行亲和层析纯化。

7.用0.05M碳酸盐缓冲液稀释步骤6获得13株经纯化的抗体至5μg/ml，100μl/孔包被96孔酶标板，4℃过夜，将酶标板孔中的液体倒尽，加入PBST，重复洗涤三次；加入保温液(PBST中0.5％BSA)200μl/孔进行封闭，置于37℃，1小时，拍干备用。使用赛默飞生产制造的Sulfo-NHS-LC-Biotinylation试剂盒(货号21435)，根据试剂盒使用说明书实施操作，对13株抗NMP-22小鼠单克隆抗体进行生物素标记。双抗体夹心化学发光法对NMP-22天然样本进行配对检测，其中包被克隆号5E8抗体，使用11A10抗体作为生物素标记抗体，可以检测出5例膀胱癌患者尿液样本呈阳性。初步确定配对的抗体为5E8和11A10。实施例3中将以该配对组合抗体为生物原料制备化学发光试剂盒，并用于膀胱癌患者临床样本的检测。

8.单克隆抗体的保藏：将5E8和11A10号克隆于2015年4月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号分别为CGMCC No.10586或CGMCC No.10585。

实施例3：人NMP-22化学发光试剂盒的制备

1.制备包被有NMP-22第一抗体的微孔板：

a)包被：采用0.05M、pH值为9.6的碳酸盐缓冲液与适当浓度的实施例2制备的克隆号为5E8的鼠单克隆抗体，配制成不同浓度的包被溶液。选择包被浓度5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml，并将包被溶液加载于微孔板上120μl/孔，4℃包被12h；

碳酸盐缓冲液标准配方：

b)洗板：稀释20倍浓缩洗液至1倍浓度，使用1倍浓度洗液洗板2次；20倍浓缩洗液标准配方：

c)封闭：将封闭液(磷酸氢二钠5.8g、磷酸二氢钠0.593g、氯化钠8.0g、山羊血清100ml、Proclin-3000.5ml，纯化水定容至1000ml)加载于微孔板上，室温2小时，甩干，干燥过夜。

2.生物素化抗体的制备：

使用赛默飞生产制造的Sulfo-NHS-LC-Biotinylation试剂盒(货号21435)，根据试剂盒使用说明书实施操作，对实施例2中制备的克隆号11A10单克隆抗体进行标记。

3.采用棋盘法(矩阵法)确定最佳包被抗体与生物素化抗体的工作浓度。使用步骤1中包被好的浓度为5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml的微孔板、步骤2的生物素化抗体(工作浓度分别为：1:8k、1:16k、1:32k和1:64k稀释)、链酶亲和素标记的HRP(工作浓度为1:2.5k、1:5k、1:10k)进行实验。确定最终包被浓度为5μg/ml(相当于600ng/孔的抗人NMP-22单克隆抗体)、生物素化抗体工作浓度为1:8k及链霉亲和素标记HRP的工作浓度为1:5k。

4.生物素标记抗体工作液的配制：

将2步骤中制备的生物素化的单克隆抗体，以1：8000的比例溶于酶缓冲液中。酶缓冲液配方为：5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清和0.5ml/L Proclin-300。生物素化的单克隆抗体的终浓度为12mg/L。

5.样本稀释液的制备：

1000ml样本稀释液包括30.0g氯化钠、25.0ml山羊血清、5.0ml吐温-20、0.5mlProclin-300。

6.化学发光液A含鲁米诺和发光增强剂，化学发光液B含有过氧化物和发光增强剂。

7.辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液：200mL/L小牛血清、pH 7.4的磷酸缓冲液、100ng/mL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素和0.5mL/L Proclin 300。

8.校准品的赋值与配制：

按对比试剂盒说明书操作，以工作校准品定标，对样本稀释液稀释的NMP-22高值人源样本进行检测。在不同实验室、不同操作者条件下，重复独立测定20次，得出20次测量结果的OD值(光吸收值)。选择OD值稳定的人源样本作为产品校准品，计算其平均值根据纯品配制的工作校准品约定的标曲方程，将所对应的OD值带入上述方程中，求出对应的浓度值，即为产品校准品靶值。用样本稀释液根据赋值结果配制校准品：100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0ng/ml。

9.质控品的配制：

收集人NMP-22临床检测高值的人尿液样本(尿液可以是任何市售尿液样本、或收集自临床机构)，用样本稀释液稀释高值人尿液至期望的浓度范围内。高值质控：40ng/ml至60ng/ml；低值质控：1.6ng/ml至2.4ng/ml。2-8℃保存备用。

10.将上述各试剂组装成试剂盒，根据需要还可以在试剂盒中并入使用说明书、封板膜等工具。

测试例：

测试例1.本公开人NMP-22化学发光试剂盒的使用方法

1.实验前准备

1.1自4℃冰箱中取出试剂盒，均应平衡到室温(18-25℃)。

1.2 20倍浓缩洗涤液用纯化水或蒸馏水稀释20倍后使用。

2.试验方法

2.1加样温育：取足够数量的包被板条，固定于框架上，分别设置校准品孔、质控品孔和待测样本孔，记录各孔位置。在待测样本孔中加入80μl样本稀释，按顺序在样本孔中分别加入20μl的待测样本，等同于样本进行了5倍稀释。在校准品孔中加入校准品100μl，在质控品孔加入质控品100μl，在20min内完成此步操作。震荡混匀，加盖封板膜，室温温育60min。

2.2洗板：

手工洗板：每孔加入350μl洗涤液，静置5-10秒后弃尽，重复冲洗5次后，拍干；

洗板机洗板：每孔加入350μl洗涤液，每次洗涤间隔5-10秒，重复冲洗5次后，拍干。

2.3加生物素标记的抗NMP-22抗体：每孔加入生物素标记抗体工作液100μl，震荡混匀，加盖封板膜，室温温育60min。

2.4洗板：

手工洗板：每孔加入350μl洗涤液，静置5-10秒后弃尽，重复冲洗5次后，拍干；

洗板机洗板：每孔加入350μl洗涤液，每次洗涤间隔5-10秒，重复冲洗5次后，拍干。

2.5辣根过氧化物酶标记链霉亲和素：每孔加入辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液100μl，震荡混匀，加盖封板膜，室温温育60min

2.6洗板：

手工洗板：每孔加入350μl洗涤液，静置5-10秒后弃尽，重复冲洗5次后，拍干；

洗板机洗板：每孔加入350μl洗涤液，每次洗涤间隔5-10秒，重复冲洗5次后，拍干。

2.7发光：每孔加入50μl化学发光液A和50μl化学发光液B，充分混匀后读数。

2.8测定：立即置化学发光仪下测定RLU值。

2.9计算：根据校准品的浓度及对应的光子数，均以校准品S0孔调零(包括校准品S1-S5、质控品和待检测样本)。使用双对数线性拟合方式(log(X)-log(Y))计算结果(S0不参与计算)，结果乘以稀释倍数(5倍)，即为样本最终浓度。

线性方程为log(RLU)＝5.454+0.9769log(浓度)；r＝0.997。

表1：NMP-22化学发光试剂盒标准曲线检测RLU值

浓度	RLU值1	RLU值2	RLU(平均)
				100	21891797	23935459	22913628
50	12667724	13709393	13188559
				10	3167462	3247093	3207277.5
2	648367	696888	672627.5
				1	261933	286662	274297.5
0	36325	41764	39044.5
				高值质控	12468358	12935029	12701694
低值质控	661334	710826	686080

使用发明的NMP-22检测试剂盒总体反应时间为150分钟，而市场主流产品Alere公司的NMP-22反应总时间为240分钟；并且Alere公司的NMP22试剂盒主要组份大多需要提前进行稀释或者溶解，且酶标板在使用前需要清洗3次，对于操作人员实施较为繁琐。

测试例2.本公开人NMP-22化学发光试剂盒的方法学指标

1.准确度：回收率应在85％至115％之间；

2.空白检出限：应不高于0.2ng/ml；

3.测量系统的线性：在1ng/ml至500ng/ml范围内线性相关系数r≥0.9900。

4.重复性：批内变异系数CV批内应不超过10％；

5.批间差：批间变异系数CV批间应不超过15％；

表2：准确性、最低检出限、系统线性、重复性检测结果

6.分析特异性：

分别检测人NMP-22阴性样本N1、阳性样本P1尿液标本。

在N1、P1样本中分别添加三个浓度梯度的交叉反应原，检测交叉反应原对NMP-22抗体检测的交叉反应情况：

人膀胱肿瘤抗原(Human BTAA)浓度(25ng/ml、12.5ng/ml、0ng/ml)；

人尿膀胱癌抗原(Human UBC)(浓度10ng/ml、5ng/ml、0ng/ml)；

人纤维蛋白原降解产物(Human FDP)浓度(100ng/ml、50ng/ml、0ng/ml)；

鼠核基质蛋白(Mouse NUMA1)浓度(100ng/ml、50ng/ml、0ng/ml)。

交叉反应原通常是与待测物质具有较高的同源性、序列相似或者具有相似检测意义的蛋白。可以想象，如果样本中存在这些交叉反应原时，抗体可能会识别并结合这些交叉反应原，导致假阳性。因此，诊断试剂盒的交叉反应性是一项重要的指标。这对于临床结果的可靠性非常重要。

从表5可见，当人膀胱肿瘤抗原不大于25ng/ml、人尿膀胱癌抗原不大于10ng/ml、人纤维蛋白原降解产物和鼠核基质蛋白不大于100ng/ml时，对人NMP-22的检测结果没有明显影响。展示出本公开试剂盒优良的抗交叉反应性。

7.稳定性

7.1试剂盒各组份在37℃条件下存放3天、6天、8天后参数检测结果见表3。

表3：37℃存放稳定性实验结果

7.2试剂盒各组份在4℃条件下存放一个月、三个月、六个月后参数检测结果见表4

表4：4℃存放稳定性实验结果

R-H、R-L分别代表高值准确度参考品、低值准确度参考品。试剂盒保存稳定性良好，可以在37℃条件下存放8天，在4℃条件下可以存放6个月。

8.干扰物质分析

8.1血红蛋白，实验结果见表6。

结论：根据结果，当血红蛋白≤200mg/ml内，对人NMP-22抗原检测结果无明显影响。

8.2白蛋白，实验结果见表7。

结论：当白蛋白浓度在1.0mg/ml内，对人NMP-22抗原检测结果没有显著性影响。

8.3尿酸，实验结果见表8。

结果分析：当尿酸浓度不大于2.5mg/ml时，对人NMP-22抗原检测结果无明显影响。

8.4人IgG，实验结果见表9。

结果分析：当人IgG浓度不大于0.1mg/ml时对人NMP-22抗原检测结果无明显影响。

测试例3.本公开人NMP-22化学发光试剂盒与美国Alere NMP-22检测试剂盒(酶免法)的应用对比

前期收集了共300例尿液样本，其中50例为经金标准确诊的膀胱肿瘤患者的尿液样本，其余250例确诊为非膀胱癌的尿液样本(其中220例为体检结果正常的健康人尿液样本；30例为经确诊为非膀胱癌的其它相关疾病的患者，包括右肾透明细胞癌、左肾透明细胞癌、肾盂尿路上皮癌、前列腺癌等)。将本公开试剂盒与ALere公司的NMP-22检测试剂盒(货号D1100E)同时检测样本进行比较。参考北京大学吴阶平泌尿外科医学中心李宁忱编著《膀胱癌诊断治疗指南2013修订版》一书，目前临床中公认的金标准为膀胱镜检查，使用该检测方法可明确膀胱肿瘤的数目、生长部位、大小与形态等。

1.本公开试剂盒与金标准对比结果：

在金标准检出的50例阳性样本中，本公开试剂盒能够检出46例阳性样本；在非膀胱癌的250例样本中，本公开试剂盒能够检出243例检测为阴性。

以金标准检测结果为标准：

本公开试剂盒阳性符合率：46/(46+4)×100％＝92.0％

本公开试剂盒阴性符合率：243/(243+7)×100％＝97.2％

总符合率为：(46+243)/(46+243+4+7)×100％＝96.3％

Kappa系数＝0.871＞0.85。

如上述，本公开试剂盒检测结果与金标准对比具有较好的阳阴性符合率。

2.美国Alere公司生产制造的试剂盒与金标准对比结果：

在金标准检出的50例阳性样本中，Alere试剂能够检出44例阳性样本；在非膀胱癌的250例样本中，Alere试剂能够检出245例检测为阴性。

以金标准检测结果为标准：

Alere试剂盒阳性符合率：44/(44+6)×100％＝88.0％

Alere试剂盒阴性符合率：245/(245+5)×100％＝98.0％

总符合率为：(44+245)/(44+245+6+5)×100％＝96.3％

Kappa系数＝0.867＞0.85。

如上述，Alere试剂盒检测结果与金标准同样具有较好的阳阴性符合率。

综上所述，两试剂盒与金标准进行比较均具有很好的一致性。在阳性检测方面本公开试剂盒略高于Alere试剂盒，且Kappa系数也略高，说明本公开与金标准检测结果更加接近。

Claims (12)

1.一种人核基质蛋白22的检测试剂盒，其包含：

a)包被有第一抗人NMP-22单克隆抗体的多孔板；和

b)第二抗人NMP-22单克隆抗体，

当第一抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10586的杂交瘤细胞所产生时，第二抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10585的杂交瘤细胞所产生；或者

当第一抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10585的杂交瘤细胞所产生时，第二抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10586的杂交瘤细胞所产生。

2.一种人核基质蛋白22的检测试剂盒，其包含：

a)包被有第一抗人NMP-22单克隆抗体的多孔板；

b)生物素标记抗体工作液，其包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠，小牛血清、生物素标记的第二抗人NMP-22单克隆抗体和防腐剂；

c)辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液，其包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠、小牛血清、辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素和防腐剂；

d)任选地，洗涤液，其包含磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠，小牛血清和防腐剂；

e)任选地，样本稀释液，其包含氯化钠、山羊血清、吐温-20和防腐剂；和

f)任选地，底物液，其包含辣根过氧化物酶底物。

3.根据权利要求1或2所述的人核基质蛋白22的检测试剂盒，其还包含校准品，所述校准品包含已知浓度的人NMP-22；

优选地，人NMP-22的浓度范围从0ng/ml至100ng/ml。

4.根据权利要求1-3任一项所述的人核基质蛋白22的检测试剂盒，其还包含质控品，所述质控品包含已知浓度的人NMP-22；

优选地，人NMP-22的浓度范围为40至60ng/ml、和/或1.6至2.4ng/ml。

5.一种人核基质蛋白22的检测试剂盒，其包含：

a)包被有第一抗人NMP-22单克隆抗体的多孔板；

b)生物素标记抗体工作液，其包含5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清、0.5ml/L Proclin-300和12mg/L生物素标记的第二抗人NMP-22单克隆抗体；

c)洗涤液，其包含5.8g/L磷酸氢二钠、0.593g/L磷酸二氢钠、8.0g/L氯化钠、200ml/L小牛血清和0.5ml/L Proclin-300；

d)辣根过氧化物酶标记链霉亲和素工作液，其包含200mL/L小牛血清、pH 7.4磷酸缓冲液、100ng/mL辣根过氧化物酶标记链霉亲和素和0.5mL/L Proclin 300；

e)样本稀释液，其包含30g/L氯化钠、25ml/L山羊血清、5ml/L吐温-20和0.5ml/L Proclin-300；

f)底物液，其包含底物液A和底物液B，所述底物液A含有鲁米诺和发光增强剂，所述底物液B含有过氧化物和发光增强剂；

g)校准品，其包含浓度分别为100ng/ml、50ng/ml、10ng/ml、2ng/ml、1ng/ml、0ng/ml的人NMP-22；以及

h)质控品，其包含浓度分别为40ng/ml至60ng/ml；1.6ng/ml至2.4ng/ml的人NMP-22，

其中，当第一抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10586的杂交瘤细胞所产生时，第二抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10585的杂交瘤细胞所产生；或者

当第一抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10585的杂交瘤细胞所产生时，第二抗人NMP-22单克隆抗体由保藏号为CGMCC No.10586的杂交瘤细胞所产生。

6.一种抗人核基质蛋白22的单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC No.10586的杂交瘤细胞所产生。

7.一种抗人核基质蛋白22的单克隆抗体，其由保藏号为CGMCC No.10585的杂交瘤细胞所产生。

8.权利要求6所述的抗人核基质蛋白22的单克隆抗体和/或权利要求7所述的抗人核基质蛋白22的单克隆抗体在制备检测试剂中的用途，所述检测试剂选自：胶体金检测试剂、ELISA检测试剂、免疫比浊检测试剂、磁颗粒检测试剂、化学发光检测试剂、免疫荧光检测试剂和放射免疫检测试剂。

9.一种包含权利要求6所述的抗人核基质蛋白22的单克隆抗体和/或权利要7所述的抗人核基质蛋白22的单克隆抗体的检测试剂。

10.一种分离的人核基质蛋白22抗原，其氨基酸序列为SEQ ID No.1。

11.根据权利要求10所述的分离的人核基质蛋白22抗原，其纯度不低于90％。

12.一种分离的多核苷酸序列，其编码权利要求10所述的人核基质蛋白22抗原；优选地，其核苷酸序列为SEQ ID No.2。