CN107533054A - 免疫测定方法以及用于所述方法的测定试剂 - Google Patents

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Abstract

本发明的一个目的是降低L‑FABP免疫测定中非特异性反应发生的可能性，并且提供更准确且具有良好的灵敏性的测定方法。更具体地，本发明的目的是提供甚至在测定物质的浓度低(例如，L‑FABP浓度在正常值附近)时也灵敏和准确的测定方法。使用抗L‑FABP抗体的L‑FABP的免疫测定方法，其中通过包括包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的多肽或通过包括与其具有至少90％序列同一性的多肽，甚至在灵敏的测定中可以容易地抑制非特异性反应，其中SEQ ID NO：1是来自大肠杆菌的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位氨基酸至第607位氨基酸的序列。

Description

免疫测定方法以及用于所述方法的测定试剂
技术领域
本发明涉及使用抗L-FABP抗体的用于L-FABP的免疫学测定方法以及该方法中使用的测定试剂。
背景技术
脂肪酸结合蛋白(FABP)是存在于细胞溶胶中并具有约14千道尔顿的分子量和结合脂肪酸的能力的一组蛋白质，并且包括至少七种已知分子种类，如肝脏型(L-FABP)、肠型(I-FABP)、心型(H-FABP)、脑型(B-FABP)、皮肤型(C-FABP/E-FABP)、脂肪细胞型(aP2)和外周神经细胞型(髓磷脂P2)，这些被认为是由共同的祖先基因进化来的家族。尽管每种类型的FABP显示出特定的组织分布，但是名称表明在其中首先发现所述类型的组织，而不必然表示该类型仅存在于该组织中。例如，至少两种类型的FABP，即肝脏型(L-FABP)和心型(H-FABP)在人肾脏组织中表达，其中L-FABP分布在近端小管中，而H-FABP主要分布在远端小管中(Maatman等，Biochemical Journal，第288卷，第285-290页，1992；Maatman等，Biochemical Journal，第273卷，第759-766页，1991)。
在组织损伤进展之前，L-FABP由于肾小管的局部缺血(血流衰竭)和对肾小管的氧化应激而排泄到尿中。尿L-FABP与人肾活检组织中的间质小管障碍的程度相关，并且是反应小管障碍的标志物(Kamijo等，Am J Pathol，第165卷，第4期，第1243-1255页，2004)。早已知道肾病的进展和预后与间质小管损伤的程度而不是肾小球病变的程度相关(Risdon等，Lancet，第2卷，第363-366页，1968)，尿L-FABP为小管损伤的标志物，并可用于预测肾病的进展。
专利文献1公开了一种肾病检查方法，其特征在于关注L-FABP在肾组织中的表达与肾病的预后之间的关系和检测试验样品中存在的来源于肾组织的脂肪酸结合蛋白。更具体地，在描述的实例中，使用由肾病患者收集的尿作为样品通过使用抗小鼠L-FABP多克隆抗体利用作为免疫学测定方法的夹心ELISA测定渗漏到尿中的L-FABP的量。对于免疫学测定方法，重要问题包括使反应体系的量最小化，减少测定时间，改善测定灵敏度等，期望也改善L-FABP测定中的测定灵敏度。然而，专利文献1中没有描述详细的测定条件(样品处理和抗原-抗体反应的条件)、检测灵敏度、测定值等。
改善免疫学测定方法的测定灵敏度的方法包括提高检测上限的方法和降低测定范围的检测下限的方法。尽管免疫学测定方法的特征在于高特异性和良好的灵敏度，但是还已知各种干扰妨碍抗原和抗体之间特异性反应的检测。由于干扰造成的非特异性反应破坏测定值的准确度，并造成获得的测定值与真实值不同的问题。为了降低检测下限以提高灵敏度(从而即使在低浓度范围也准确地进行测定)，必须抑制如上所述的非特异性反应。
为了抑制非特异性反应和改善特别是在低浓度范围与常规试剂的测定结果的相关性，专利文献2公开了一种在多羧酸型表面活性剂的存在下进行抗原-抗体反应和/或测定的免疫学测定方法。
为了抑制空白测定值的变化和降低空白测定值以改善低浓度范围试验物质的测定准确度，专利文献3公开了一种允许聚氧乙烯烷基醚硫酸酯和聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯在反应体系中共存的免疫学测定方法。
引用列表
专利文献
专利文献1：日本已公开的专利公开第H11-242026号
专利文献2：日本已公开的专利公开第2013-205408号
专利文献3：WO 2010/113943
发明内容
技术问题
本发明的一个目的是提供降低L-FABP免疫学测定中非特异性反应发生可能性的更准确和灵敏的测定方法。更具体地，一个目的是提供即使在分析物的浓度低(例如，L-FABP浓度在正常值附近)时也准确和灵敏的测定方法。
问题的解决方案
作为深入研究的结果，本发明人已经发现，在使用抗L-FABP抗体的L-FABP的免疫学测定方法中，通过允许由SEQ ID NO：1所示的来源于大肠杆菌(E.coli)的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位至第607位氨基酸组成的多肽或与该多肽具有至少90％序列同一性的多肽存在，即使在高灵敏测定中也可以容易地抑制非特异性反应。
特别地，本发明具有以下构成。
[1]一种利用抗L-FABP抗体检测样品中的L-FABP(肝脏型脂肪酸结合蛋白)的方法，或一种使利用抗L-FABP抗体检测样品中的L-FABP的方法中的测定值稳定化的方法，其包括使以下成分彼此接触的步骤：
疑似包含L-FABP的样品，
具有固定的抗L-FABP抗体的颗粒，
分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物，和
由SEQ ID NO：1所示的来源于大肠杆菌的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位至第607位氨基酸组成的多肽或与该多肽具有至少90％序列同一性的多肽。
[2]根据以上第[1]项所述的方法，其中所述分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物为选自式(1)表示的化合物或其盐或酯和式(2)表示的化合物或其盐中的一种或两种以上：
式(1)的化合物或其盐或酯
[化学式1]
[在式(1)中，R1为氢原子、羟基或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，R2至R6各自独立地表示氢原子、卤原子、可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基、羟基、羧基、氨基或-SR7(R7表示氢原子、羟基或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，并且当存在多个R7时，R7可以是彼此相同的基团或彼此不同的基团)]；和
式(2)的化合物或其盐
[化学式2]
[在式(2)中，R11至R14各自独立地表示氢原子、卤原子、可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基、氨基、可以经卤原子取代的苯基或-SR16(R16表示氢原子、羟基或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，并且当存在多个R16时，R16可以是彼此相同的基团或彼此不同的基团)，其中存在于同一分子中的R11和R12可以一起形成羰基，并且存在于同一分子中的R13和R14可以一起形成羰基，
R15为氢原子、卤原子、或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，
X11为氮原子或硫原子，
X12和X13各自独立地为碳原子或氮原子，
l1、l2、m1、m2和n各自独立地为0或1，
X11和X13之间的双虚线以及X12和X13之间的双虚线各自独立地为单键或双键，其中
l1、l2、m1、m2和n的值以及X11和X13之间的双虚线以及X12和X13之间的双虚线的键指示依照X11至X13的化合价确定的值和化学键]。
[3]根据以上第[2]项所述的方法，其中式(2)表示的化合物或其盐为选自以下化合物或其盐中的一种或两种以上：
式(2)的化合物或其盐
[化学式3]
[在式(2)中，R11至R14各自独立地表示氢原子、卤原子、可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基、氨基、可以经卤原子取代的苯基或-SR16(R16表示氢原子、羟基或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，并且当存在多个R16时，R16可以是彼此相同的基团或彼此不同的基团)，其中存在于同一分子中的R11和R12可以一起形成羰基，并且存在于同一分子中的R13和R14可以一起形成羰基，
R15为氢原子、卤原子、或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基]，其中
在X11至X11、l1+l2、m1+m2、n(l1、l2、m1、m2和n各自独立地表示0或1)和双虚线的组合中，
(a)X11为硫原子，X12和X13为碳原子，l1+l2为2，m1+m2为2，n为0，X11和X13之间的双虚线以及X12和X13之间的双虚线为单键，
(b)X11为硫原子，X12和X13为碳原子，l1+l2为1，m1+m2为1，n为0，X11和X13之间的双虚线为单键，X12和X13之间的双虚线为双键，
(c)X11为氮原子，X12和X13为碳原子，l1+l2为2，m1+m2为2，n为1，X11和X13之间的双虚线以及X12和X13之间的双虚线为单键，
(d)X11为氮原子，X12和X13为碳原子，l1+l2为1，m1+m2为1，n为1，X11和X13之间的双虚线为单键，X12和X13之间的双虚线为双键，
(e)X11和X12为氮原子，X13为碳原子，l1+l2为1，m1+m2为1，n为0，X11和X13之间的双虚线为双键，X12和X13之间的双虚线为单键，或(f)X11、X12和X13为氮原子，l1+l2为0，m1+m2为0，n为1，X11和X13之间的双虚线为单键，X12和X13之间的双虚线为双键。
[4]根据以上第[1]项所述的方法，其中分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物为苯甲脒或2-氨基-2-噻唑啉。
[5]根据以上第[1]项至第[4]项中任一项所述的方法，其中
在使疑似包含L-FABP的样品、抗L-FABP抗体、分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物和由SEQ ID NO：1所示的来源于大肠杆菌的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位至第607位氨基酸组成的多肽或与该多肽具有至少90％序列同一性的多肽彼此接触的步骤中，
在使所述疑似包含L-FABP的样品、所述化合物和所述多肽彼此接触的步骤之后是使样品与抗L-FABP抗体接触的步骤。
[6]根据以上第[5]项所述的方法，其中使疑似包含L-FABP的样品、化合物和多肽彼此接触的步骤中所述多肽的浓度为0.04mmol/L至1.36mmol/L。
[7]根据以上第[1]至[6]项中任一项所述的方法，其中抗L-FABP抗体为具有彼此不同的识别位点的两种以上单克隆抗体。
[8]根据以上第[1]至[7]项中任一项所述的方法，其中颗粒为乳胶颗粒。
[9]根据以上第[7]项或第[8]项所述的方法，其中将具有彼此不同的识别位点的两种以上抗L-FABP单克隆抗体分别固定在乳胶颗粒上，其中通过乳胶比浊免疫测定检测L-FABP。
[10]根据以上第[7]项所述的方法，其中，用标记物质标记具有彼此不同的识别位点的两种以上单克隆抗体中的一种单克隆抗体，同时将另外的一种或多种单克隆抗体固定在一个或多个固相上，其中通过免疫色谱检测L-FABP。
[11]根据以上第[1]至[10]项中任一项所述的方法，其中所述样品为尿、全血、血清或血浆。
[12]一种用于利用抗L-FABP抗体检测样品中的L-FABP的颗粒免疫测定的试剂，其包含：抗L-FABP抗体；分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物；和由SEQ ID NO：1所示的来源于大肠杆菌的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位至第607位氨基酸组成的多肽或与所述多肽具有至少90％序列同一性的多肽。
[13]一种避免利用颗粒免疫测定检测样品中正常值附近的L-FABP的方法中的非特异性反应的方法，其中疑似包含L-FABP的样品和测定试剂的混合液体包含分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物和由SEQ ID NO：1所示的来源于大肠杆菌的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位至第607位氨基酸组成的多肽或与所述多肽具有至少90％序列同一性的多肽。
[14]一种使利用颗粒免疫测定检测样品中正常值附近的L-FABP的方法中的测定值稳定化的方法，其中疑似包含L-FABP的样品和测定试剂的混合液体包含分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物和由SEQ ID NO：1所示的来源于大肠杆菌的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位至第607位氨基酸组成的多肽或与所述多肽具有至少90％序列同一性的多肽。
发明的有益效果
根据本发明，由于甚至在高灵敏免疫学测定方法中也可以抑制来源于反应体系的非特异性反应，因此可以提供更准确和灵敏的免疫学测定方法。例如，可以在正常值附近的尿L-FABP测定中准确测定试样(如2.2±2.3μg/gCR，根据Renapro(注册商标)L-FABP试验TMB的包装说明书)。
具体实施方式
现在将详细地描述本发明。
(样品)
本发明中使用的样品的实例包括尿、血液(全血、血浆或血清)、肾组织、来自肾组织的提取物等。其中，尿为特别优选的样品。任何样品都是可使用的，只要样品疑似包含L-FABP即可，包括来源于健康受试者的样品、来源于患者的样品、来源于疑似患有疾病的人的样品等。
(抗L-FABP抗体)
对于本发明中使用的抗L-FABP抗体，可以将由器官、细胞、体液等纯化的天然L-FABP制备为免疫原(抗原)。L-FABP主要分布在肝或肾中，由此可以由这些器官等纯化和分离。此外，已知L-FABP在人、小鼠、猪、牛和大鼠中是高度同源的，在氨基酸水平上具有90％以上的同源性，因此例如可以使用小鼠L-FABP作为抗原用于获得与人L-FABP结合的抗体。
可以根据Kelvin等(J.Biol.Chem.，第263卷，第15762-15768页，1988)中所述的方法等进行天然L-FABP的纯化。具体地，在使切除的器官匀化后，通过凝胶过滤、阴离子交换层析等将通过超速离心获得的细胞质级分分为小部分，并通过使用分子量或脂肪酸结合活性作为指标选择包含L-FABP的级分，并将其分离和纯化。对所选择的级分进行SDS-聚丙烯酰胺电泳以确认纯化的蛋白质形成单一条带，并且，如果需要的话进行进一步纯化。对于纯化的蛋白质，确定氨基酸组成和N端氨基酸序列，并将其与报道的组成和序列进行比较，以确认蛋白质为目标分子种类。
用作抗原的L-FABP可以是通过基因工程技术生成的重组蛋白。由于例如(Veerkamp和Maatman，Prog.Lipid Res.，第34卷，第17-52页，1995)已经报道了L-FABP的氨基酸序列和基因序列，因此可以基于这些序列设计引物用于通过PCR(聚合酶链式反应)法由合适的cDNA文库等克隆cDNA。该cDNA可以用于进行基因重组以制备重组L-FABP。此外，L-FABP的片段或具有其部分序列的合成肽等可以根据需要与载体大分子物质(BSA、血蓝蛋白等)结合，并用作抗原。
特异性结合L-FABP的抗体可以是抗血清、多克隆抗体、单克隆抗体等中的任一种。
抗体优选具有高特异性，例如在抗L-FABP抗体的情况下，理想地，抗体基本上不与H-FABP交叉反应。为了获得具有较高特异性的抗体，有利地使用高度纯化的和高纯度的抗原。当制备抗体时，通过接种如上所述制备的纯化抗原使非人类温血动物免疫。用于免疫的非人类温血动物的实例包括哺乳动物(兔、绵羊、大鼠、小鼠、豚鼠、马、猪等)和鸟类(鸡、鸭、鹅等)。在兔的情况下，例如，在背部或后足掌部皮下接种在约1mL生理盐水和弗氏完全佐剂中乳化的约100μg至1mg抗原，从第二次开始，佐剂替换为弗氏不完全佐剂，并且以二至四周的间隔接种抗原三至八次用于免疫，以使用在最终接种后约7至12天产生的抗体。在小鼠的情况下，通常以约两周的间隔皮下、腹膜内或静脉内接种10至30μg/动物的抗原用于免疫，以使用在最终接种后的约二至四天产生的抗体。
多克隆抗体可以通过收集来自如上所述免疫的动物的血液、分离血清(抗血清)并由所获得的抗血清回收Ig级分来制备。例如，多克隆IgG可以通过凭借使用蛋白G柱的亲和层析等由抗血清回收IgG级分来制备。
单克隆抗体由通过使由免疫动物收集的抗体产生细胞与永生化细胞融合获得的杂交瘤产生。小鼠和大鼠优选用作用于单克隆抗体的免疫动物。可以根据如下的Kohler和Milstein(Kohler和Milstein，Nature，第256卷，第495-897页，1975)的方法产生杂交瘤。收集来自如上所述免疫的动物的抗体产生细胞(如脾细胞或淋巴结细胞)，并使其与合适的永生化细胞融合。例如，骨髓瘤细胞的细胞系(NSI-Ag 4/1、Sp2/O-Agl4等)优选用作永生化细胞。骨髓瘤细胞优选为自身不产生抗体或者免疫球蛋白H或L链的非分泌细胞。骨髓瘤细胞优选具有选择标记物，使得可以在选择培养基中筛选未融合的骨髓瘤细胞和融合的杂交瘤。例如，对于选择标记物，通常使用具有8-氮鸟嘌呤耐受性(次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶缺陷)、胸苷激酶缺陷等的细胞系。通过添加合适的融合促进剂如聚乙二醇来进行细胞融合。细胞融合优选以每个永生化细胞约10个抗体产生细胞的比例进行，并且可以优选地以约106个细胞/mL的抗体产生细胞的细胞密度进行。
适当地稀释进行融合处理的细胞，然后在选择培养基中培养一周至两周。例如，当使用耐受8-氮鸟嘌呤的骨髓瘤细胞并在HAT(次黄嘌呤、氨基喋呤、胸苷)培养基中培养时，未融合的骨髓瘤细胞死亡，未融合的抗体产生细胞由于有限的分裂周期也死亡；但是，仅融合细胞可以继续进行分裂并在选择培养基中生存。在选择培养基中培养后，例如，利用固定在固相上的抗原对上清液进行ELISA，以检测目标抗体的存在/不存在，克隆可以通过有限稀释法进行以选择产生识别目标抗原的单克隆抗体的杂交瘤。在选择时，选择产生具有期望性质(如抗体效价、抗体种类、亚类、对抗原的亲和性、特异性、表位等)的单克隆抗体的杂交瘤。IgG通常优选作为单克隆抗体种类。
将单克隆抗体产生杂交瘤腹膜内植入到与用于免疫的动物相同物种的动物中，经过一定时间后，可以由所述动物收集腹水以分离目标单克隆抗体。或者，可以在合适的动物细胞培养基中培养杂交瘤，可以由培养液分离单克隆抗体。一旦获得目标杂交瘤，就可以由杂交瘤获得编码单克隆抗体的基因，以通过常用的基因重组技术在合适的宿主(例如蚕等)中表达和产生目标单克隆抗体。例如，可以根据需要按照通过组合硫酸铵沉淀、凝胶层析、离子交换层析、亲和层析等获得的通常纯化方法进行抗体的分离和纯化。
本发明中使用的抗L-FABP抗体可以是已知抗体或未来开发的抗体。尽管没有特别限制，但是可以使用的市售抗L-FABP抗体包括圣克鲁斯生物技术(Santa CruzBiotechnology)的C-4(目录号：sc-374537)、F-9(目录号：sc-271591)，R&D系统(R&Dsystems)的328607(目录号：MAB2964)，Hycult biotech的L2B10(目录号：HA 2049-IA)，Lifespan Biosciences的2G4(目录号：LS-B3001)等。这些抗体与来源于人类的L-FABP蛋白的内部区域、N端区域等的多肽结合，即使当抗体与L-FABP分子的内部区域结合时，也可以通过使用本发明的分子中具有NH2-C＝N-局部结构和环状结构的化合物以较高灵敏度和较高特异性检测L-FABP。
本发明中的“抗体”不仅包括完全的免疫球蛋白分子，还包括本领域中已知的具有抗原结合能力的抗体片段或抗体衍生物，如Fab、Fab'2、CDR、人源化抗体、多功能抗体和单链抗体(ScFv)。
(检测)
本发明的用于使用抗L-FABP抗体检测L-FABP的方法为免疫学测定方法。更具体地，其实例包括但不限于颗粒免疫凝集测定法如乳胶比浊免疫测定(LTIA)、化学发光检测法和免疫色谱(侧流型、流过型)。其中，更优选不包括用于B/F分离的步骤的免疫学测定方法(均相免疫测定法)。应注意，当在本说明书中描述LTIA作为测定方法时，其检测方法可以通过使用任何已知检测方法，如透射光(吸光度)变化的测定、散射光变化的测定和粒径变化的测定来实现。此外，术语“检测”或“测定”必须最广义地解释，包括L-FABP的存在的证明和/或定量，而必须不以限制的方式进行解释。
(不溶载体)
本发明中使用的不溶载体可以是由聚合物基材如聚苯乙烯树脂、无机基材如玻璃、多糖基材如纤维素和琼脂糖等制成的不溶载体，并且在其形状方面没有特别限制，可以根据所采用的测定方法选择任何形状，包括小珠或颗粒状(例如乳胶颗粒、金属胶体颗粒)、平板或片状(例如多孔膜)等。
颗粒的实例包括在颗粒免疫凝集测定法中通常使用的主要由聚苯乙烯构成的乳胶颗粒，以及包含苯乙烯-丁二烯共聚物、(甲基)丙烯酸酯聚合物等作为基材的颗粒。由金属胶体、明胶、脂质体、微囊、二氧化硅、氧化铝、炭黑、金属化合物、金属、陶瓷或磁性材料制成的颗粒也是可以使用的。对于本发明中使用的载体颗粒，可以使用同一种材料或两种以上材料。
载体颗粒的粒径优选为0.15μm至0.45μm，更优选0.2μm至0.4μm。可以组合地使用平均粒径不同的两种以上的载体颗粒。
多孔膜可以是已知的膜，并且可以由任何材料制成。多孔膜的材料的实例包括但不限于聚乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、尼龙、玻璃、多糖如纤维素和纤维素衍生物、陶瓷等。具体地，实例包括由密理博(Millipore)、东洋滤纸(Toyo Roshi)、沃特曼(Whatman)等销售的玻璃纤维滤纸、纤维素滤纸等。
(抗体固定在不溶载体上)
用于将抗L-FABP抗体固定在不溶载体上的方法没有特别限制，可以使用任何已知方法。当将抗L-FABP抗体固定在颗粒上时，这通过使用例如利用混合颗粒和抗体造成的物理吸附的物理吸附法、或利用偶联剂如碳二亚胺使颗粒表面上的羧基或氨基与抗体分子化学结合的化学结合法来实现。抗体分子可以凭借间隔分子固定在颗粒上。此外，在通过使用化学结合法使抗体与另一蛋白质如白蛋白结合之后，蛋白质可以物理地或化学地固定在颗粒上。
当将抗L-FABP抗体固定在多孔膜上时，抗体可以例如通过将一定量的包含所述抗体的溶液以线、点、特定符号如+的形状涂布至多孔膜来固定化。
在本说明书中，“不溶载体”被称为“固相”，使不溶载体能够物理地或化学地支撑抗原或抗体或者使不溶载体能够物理地或化学地支撑抗原或抗体的状态在一些情况下被称为“固定”、“固定化”、“固相化”、“敏化”或“吸附”。
(标记的抗体)
用于标记抗体的标记物质的实例包括例如酶、荧光物质、化学发光物质、生物素、抗生物素、放射性同位素、胶体金颗粒或着色乳胶颗粒。使标记物质和抗体结合的方法可以是本领域技术人员可用的方法，如戊二醛法、马来酰亚胺法、吡啶基二硫化物法或高碘酸法。标记物质和结合方法都不限于以上描述的那些，可以使用任何已知方法。对于标记的检测，例如，当使用酶如过氧化物酶或碱性磷酸酶作为标记物质时，可以通过使用酶的特定底物(例如，当酶为辣根过氧化物酶时，使用1，2-苯二胺或3，3’，5，5’-四甲基联苯胺，或在碱性磷酸酶的情况下使用磷酸对硝基苯酯)测定酶活性，当使用生物素作为标记物质时，至少用与生物素不同的标记物质标记的抗生物素一般与其反应。
(分子中具有NH2-C＝N-局部结构和环状结构的化合物)
本发明的分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物还可以具有环状结构，并且由式(1)和式(2)表示(在本说明书中有时称为“式(1)的化合物”和“式(2)的化合物”)。
式(1)的化合物为以下化合物或其盐或酯：
[化学式4]
[在式(1)中，R1为氢原子、羟基或可以带支链的具有1至3的碳数的烷基，R2至R6各自独立地表示氢原子、卤原子、可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基、羟基、羧基、氨基或-SR7(R7表示氢原子、羟基或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，并且当存在多个R7时，R7可以是彼此相同的基团或彼此不同的基团)]。
式(2)的化合物为以下化合物或其盐：
[化学式5]
[在式(2)中，R11至R14各自独立地表示氢原子、卤原子、可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基、氨基、可以经卤原子取代的苯基或-SR16(R16表示氢原子、羟基或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，并且当存在多个R16时，R16可以是彼此相同的基团或彼此不同的基团)，其中存在于同一分子中的R11和R12可以一起形成羰基，存在于同一分子中的R13和R14可以一起形成羰基，
R15为氢原子、卤原子、或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，
X11为氮原子或硫原子，
X12和X13各自独立地为碳原子或氮原子，
l1、l2、m1、m2和n各自独立地为0或1，
X11和X13之间的双虚线以及X12和X13之间的双虚线各自独立地为单键或双键，其中
l1、l2、m1、m2和n的值以及X11和X13之间的双虚线以及X12和X13之间的双虚线的键指示依照X11至X13的化合价确定的值和化学键]。
此外，式(2)的化合物为以下化合物或其盐：
[化学式6]
[在式(2)中，R11至R14各自独立地表示氢原子、卤原子、可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基、氨基、可以经卤原子取代的苯基或-SR16(R16表示氢原子、羟基或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，并且当存在多个R16时，R16可以是彼此相同的基团或彼此不同的基团)，其中存在于同一分子中的R11和R12可以一起形成羰基，存在于同一分子中的R13和R14可以一起形成羰基，
R15为氢原子、卤原子、或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基]，其中
在X11至X13、l1+l2、m1+m2、n(l1、l2、m1、m2和n各自独立地表示0或1)和双虚线的组合中，
(a)X11为硫原子，X12和X13为碳原子，l1+l2为2，m1+m2为2，n为0，X11和X13之间的双虚线以及X12和X13之间的双虚线为单键，
(b)X11为硫原子，X12和X13为碳原子，l1+l2为1，m1+m2为1，n为0，X11和X13之间的双虚线为单键，X12和X13之间的双虚线为双键，
(c)X11为氮原子，X12和X13为碳原子，l1+l2为2，m1+m2为2，n为1，X11和X13之间的双虚线以及X12和X13之间的双虚线为单键，
(d)X11为氮原子，X12和X13为碳原子，l1+l2为1，m1+m2为1，n为1，X11和X13之间的双虚线为单键，X12和X13之间的双虚线为双键，
(e)X11和X12为氮原子，X13为碳原子，l1+l2为1，m1+m2为1，n为0，X11和X13之间的双虚线为双键，X12和X13之间的双虚线为单键，或(f)X11、X12和X13为氮原子，l1+l2为0，m1+m2为0，n为1，X11和X13之间的双虚线为单键，X12和X13之间的双虚线为双键。
式(1)表示的化合物的实例包括苯甲脒衍生物，式(2)表示的化合物的实例包括氨基噻唑衍生物、氨基三唑衍生物、氨基四唑衍生物和氨基咪唑衍生物。分子中具有NH2-C＝N-局部结构的每个化合物的盐可以根据需要选自盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、氟硼酸盐、草酸盐、乳酸盐、己二酸盐、酒石酸盐、氢碘酸盐、甲苯磺酸盐、丙二酸盐、碳酸氢盐等，考虑本发明的效果以及处理的简易性、可用性等没有特别的限制。
式(1)的化合物的更具体的实例包括苯甲脒盐酸盐(CAS号：1670-14-0)、苯甲脒盐酸盐水合物(CAS号：206752-36-5)、4-氟苯甲酰胺肟(CAS号：69113-32-2)和4-氯苯甲脒盐酸盐(CAS号：14401-51-5)。式(2)的化合物的更具体的实例包括氨基噻唑啉(CAS号：1779-81-3)、2-氨基-2-噻唑啉盐酸盐(CAS号：3882-98-2)、假乙内酰硫脲(pseudothiohydantoin，CAS号：556-90-1)、2-氨基-5-溴噻唑氢溴酸盐(CAS号：61296-22-8)、2-氨基-4，5-二甲基噻唑氢溴酸盐(CAS号：7170-76-5)和2，4-二氨基-5-苯基噻唑单氢溴酸盐(CAS号：6020-54-8)。其中，苯甲脒盐酸盐和2-氨基-2-噻唑啉盐酸盐为特别优选的。
本发明的分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物的实例包括具有胍基(H2N-(C＝NH)-NH-R)的化合物。化合物或其盐中的R为氢原子、氨基、苯基、烷基、羧基烷基、经取代或未经取代的氨基烷基、经取代或未经取代的氨基羧基烷基、经取代或未经取代的氨基羰基烷基、磺酰基等。烷基的实例可以包括在直链或支链上具有1、2、3、4、5或6的碳数的烷基，并且在直链或支链上具有1、2、3、4、5或6的碳数的烷基具体举例为甲基、乙基、丙基、丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基等。
具有胍基的化合物的实例包括胍盐或其衍生物。更具体的实例包括胍(CAS号：113-00-8)、氨基磺酸胍(CAS号：50979-18-5)、氨基胍(CAS号：79-17-4)。
本发明的分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物可以单独使用，或者可以作为两种以上化合物的组合使用。
(BPF)
由来源于大肠杆菌的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位至第607位氨基酸组成的多肽(也称为封闭肽片段(Blocking Peptide Fragment)；下文有时也称为“BPF”)为在WO 2005/003155和Polymer Preprints，Japan，第55卷，第2期，5211-5212(2006)中作为在免疫学测定方法中用于封闭的新物质公开的具有约22000的分子量的肽，并且也可商购获得。
用于本发明的方法的BPF等可以根据WO 2005/003155的描述制备。或者，可以使用市售产品(由东洋纺株式会社(TOYOBO CO.，LTD.)制造，目录号：BPF-301)。
(使疑似包含L-FABP的样品、抗L-FABP抗体、分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物和BPF彼此接触的方法)
使疑似包含L-FABP的样品、抗L-FABP抗体、分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物和BPF彼此接触的步骤可以通过使用任何方法来实现，只要在使疑似包含L-FABP的样品、化合物和BPF彼此接触的步骤之后是使样品与抗L-FABP抗体接触的步骤。
例如，使疑似包含L-FABP的样品与化合物和/或BPF接触的方法可以是例如将包含化合物和/或BPF的液体试剂与样品混合的方法。另一方法可以是将样品供应至化合物和/或BPF浸润的不溶载体(如多孔膜)使得接触发生的方法。应注意，可以不必同时使化合物和BPF与疑似包含L-FABP的样品接触。本领域技术人员可以考虑测定试剂的构成等适当地完成设定。
此外，在与化合物和/或BPF接触之后或者同时，通过已知的适当方法使样品中的L-FABP与固定在不溶载体上的抗L-FABP抗体接触。
使本发明的分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物与样品接触的方法的实例包括其中使所述化合物作为样品的稀释剂与样品的提取液或样品的保存液、展开液等接触的方法。
本发明的分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物的浓度的优选范围可以是50mmol/L至1000mmol/L、50mmol/L至500mmol/L、50mmol/L至600mmol/L、100mmol/L至900mmol/L、200mmol/L至800mmol/L、300mmol/L至600mmol/L、300mmol/L至550mmol/L、300mmol/L至500mmol/L和350mmol/L至450mmol/L，优选为50mmol/L至500mmol/L。所使用的分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物中每一个的最佳浓度可以如本说明书中所述地实验获得。
BPF的浓度的优选范围可以是0.01％至5％、0.02％至5％、0.03％至5％、0.04％至5％、0.05％至5％、0.1％至5％、0.2％至5％、0.3％至5％、0.4％至5％、0.75％至5％、1％至5％、1％至4％和1％至3％，并且可以举例为优选0.05％至5％，更优选0.075％至5％，进一步优选0.1％至3％(全以w/v％计)。本领域技术人员可以实验地确定BPF的最佳浓度。
例如，当使用具有约22000的分子量的BPF-301时，浓度可以是0.0045mmol/L至2.27mmol/L、0.0090mmol/L至2.27mmol/L、0.013mmol/L至2.27mmol/L、0.018mmol/L至2.27mmol/L、0.022mmol/L至2.27mmol/L、0.045mmol/L至2.27mmol/L、0.090mmol/L至2.27mmol/L、0.13mmol/L至2.27mmol/L、0.18mmol/L至2.27mmol/L、0.22mmol/L至2.27mmol/L、0.45mmol/L至2.27mmol/L、0.45mmol/L至1.81mmol/L和0.45mmol/L至1.36mmol/L，并且优选0.022mmol/L至2.27mmol/L，更优选0.034mmol/L至2.27mmol/L，进一步优选0.045mmol/L至1.36mmol/L。
(测定试剂盒)
根据本发明提供的测定试剂盒中除本发明的分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物之外的组分没有特别限制，只要可以免疫学测定L-FABP即可。以下将通过以免疫色谱和LTIA作为实例来描述测定试剂盒。
(免疫色谱)
通过使用测试条来设置典型的免疫色谱，所述测试条沿包含样品的溶液在片状不溶载体(如多孔膜)上展开的方向按顺序配置有“1.样品供应部位”、“2.保持标记抗体的部位(标记抗体保持部位)”和“3.使用于捕获由标记抗体和L-FABP抗体形成的复合物的抗体固定的部位(捕获抗体部位)”，使得样品溶液由于毛细管作用持续移动。在免疫色谱的情况下，测定试剂盒至少包括如上所述的测试条。
具体地，当将预定量的包含L-FABP的样品添加至样品供应部位时，样品由于毛细管作用进入标记保持部位，L-FABP和标记抗体结合到一起形成复合物。当通过膜展开的复合物进入捕获抗体部位时，复合物被固定在膜上的抗体(捕获抗体)捕获以形成[捕获抗体]-[L-FABP]-[标记抗体]的三元复合物。可以通过任意方法(例如，在可以可视化的标记如胶体金颗粒的情况下的凝集图像，或在酶的情况下由于添加底物的显色反应)检测标记，从而检测L-FABP的存在。
例如，本发明的分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物和/或BPF可以初步被添加至样品稀释剂等中，或可以初步被包含在样品供应部位或标记保持部位中，由此可以使其与样品中的L-FABP接触。
(乳胶比浊免疫测定)
在乳胶比浊免疫测定的情况下，测定试剂盒至少包括具有固定于其上的抗体的乳胶颗粒。对于乳胶比浊免疫测定中使用的抗体，可以使用“具有不同抗原识别位点的两种单克隆抗体”、“多克隆抗体”或“单克隆抗体和多克隆抗体”的任意组合。在该情况下，乳胶颗粒为同时具有固定于其上的抗体和标记物质的不溶载体。
可以按照粒径和材料适当地选择用于这些测定试剂的乳胶颗粒，以获得期望的性能，如改善的灵敏度。乳胶颗粒可以是适合于支撑抗体的任何颗粒。例如，颗粒可以包含聚苯乙烯、苯乙烯-磺酸(盐)共聚物、苯乙烯-甲基丙烯酸共聚物、丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物、氯乙烯-丙烯酸酯共聚物、乙酸乙烯酯-丙烯酸酯共聚物等作为基材。尽管乳胶颗粒的形状没有特别限制，但是优选地，平均粒径足够大，足以使得可以用裸眼或者光学地检测由于乳胶颗粒表面上的抗体与L-FABP之间的凝集反应而产生的聚集体。可以使用由诸如金属胶体、明胶、脂质体、微囊、二氧化硅、氧化铝、炭黑、金属化合物、金属、陶瓷或磁性材料的材料制成的颗粒代替乳胶颗粒。
在临床检查中使用的用于LTIA的典型测定试剂盒通常以第一试剂和第二试剂的形式提供。可以在第一试剂或第二试剂中包含上述具有固定化抗体的两种乳胶颗粒的两者或之一。尽管通常优选的是在第二试剂中包含两种具有固定化抗体的乳胶颗粒，但是可以分别在第一试剂和第二试剂中包含颗粒中的一种和另一种。
优选在第一试剂中包含本发明的分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物和/或BPF。通过将包含本发明的分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物的第一试剂和/或BPF与样品混合，样品中的L-FABP与本发明的分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物和/或BPF接触。
除了上述那些之外，本发明的试剂盒适当地包括缓冲组分(缓冲液)。例如，可用于本发明的缓冲液可以是任何常用的缓冲液，包括tris-盐酸、硼酸、磷酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、邻苯二甲酸、戊二酸、马来酸、甘氨酸及其盐，以及Good's缓冲剂，如MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、ACES、MOPSO、BES、MOPS、TES和HEPES。
为了改善测定灵敏度和抑制非特异性反应，本发明的试剂盒根据需要还包括糖类、蛋白质等。其实例包括促进抗原-抗体反应的组分(高分子化合物，如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、磷脂聚合物等)、蛋白质和肽(白蛋白、酪蛋白等)、氨基酸、糖类(蔗糖、环糊精等)和防腐剂(叠氮化钠、ProClin 300等)。
尽管来源于组织(如肝和肾)的天然L-FABP可以在样品测定中用作标准物质(L-FABP标准物质)，但是标准物质可以是通过基因工程技术产生的重组蛋白。由于例如(Veerkamp和Maatman，Prog.Lipid Res.，第34卷，第17-52页，1995)已经报道了L-FABP的氨基酸序列和基因序列，因此可以基于这些序列设计引物用于通过PCR(聚合酶链式反应)法由合适的cDNA文库等克隆cDNA。该cDNA可以用于通过基因重组技术来制备重组L-FABP。对于标准物质，更优选使用具有稳定结构的重组蛋白。
实施例
以下将描述本发明的实施例，以更具体地描述本发明；然而，本发明不限于此，并且可以在不脱离本发明的技术思想的范围内不同地应用。
(固定抗L-FABP抗体的乳胶颗粒混悬液)
(1)固定克隆L抗体的乳胶颗粒混悬液的制备
向13mL包含0.64mg/mL抗L-FABP抗体克隆L(由CMIC HOLDINGS Co.，Ltd.制造)的20mmol/L Tris缓冲液(pH 8.5)中，添加13mL的平均粒径为0.212μm的1％乳胶颗粒(由积水化学工业株式会社(SEKISUI CHEMICAL CO.，LTD.)制造)混悬液，并在4℃搅拌两小时。在这之后，添加13mL包含0.5％BSA的20mmol/L Tris缓冲液(pH 8.5)，并在4℃搅拌一小时。然后，进行利用5mmol/L MOPS缓冲液(pH 7.0)的透析以获得固定克隆L抗体的乳胶颗粒混悬液。
(2)固定克隆1抗体的乳胶颗粒混悬液的制备
向8mL包含0.64mg/mL抗L-FABP抗体克隆1(由CMIC HOLDINGS Co.，Ltd.制造)的5mmol/L Tris缓冲液(pH 7.5)中，添加8mL的平均粒径为0.315μm的1％乳胶颗粒(由积水化学工业株式会社(SEKISUI CHEMICAL CO.，LTD.)制造)混悬液，并在4℃搅拌两小时。在这之后，添加8mL包含0.5％BSA的5mmol/L Tris缓冲液(pH 7.5)，并在4℃搅拌一小时。然后，进行利用5mmol/L MOPS缓冲液(pH 7.0)的透析以获得固定克隆1抗体的乳胶颗粒混悬液。
(L-FABP标准物质)
通过专利文献1中所述的基因重组来获得L-FABP标准物质。
(L-FABP基准测定法：基准方法)
基于ELISA的体外诊断产品(Renapro(注册商标)L-FABP试验TMB)用于基准方法。
(第一对照试剂：也用作标准物质稀释剂)
300mmol/L Bis-Tris缓冲液(pH 6.9)
100mmol/L NaCl
0.47％至0.57％Lipidure-BL403SE
(第二试剂)
5mmol/L MOPS缓冲液(pH 7.0)
3.75Abs/mL固定克隆L抗体的乳胶颗粒混悬液(*)
3.75Abs/mL固定克隆1抗体的乳胶颗粒混悬液(*)
(*)Abs表示在280nm的吸光度。
(标准溶液)
通过使用标准物质稀释剂将L-FABP标准物质调整至期望浓度，并用作标准溶液。
(冷冻解冻的尿)
收集后在-30℃冷冻保存的部分尿(n＝32；基准方法中的测定值为0.3ng/mL至4.6ng/mL)仅解冻一次并用于测定。
(LTIA的测定条件)
(1)分析装置：日立7170自动分析仪(Hitachi 7170 Automatic Analyzer，由日立高新技术公司(Hitachi High-Technologies Corporation)制造)
(2)样品量和试剂量：3μL样品，150μL第一试剂，50μL第二试剂
(3)反应时间(反应温度)：第一试剂5分钟(37℃)，第二试剂5分钟(37℃)
(4)测光点和测光对象：刚添加第二试剂后与添加后5分钟之间的吸光度变化
[实施例1]确认BPF对具有正常值附近L-FABP浓度的试样的非特异性反应抑制效果，第1部分
比较没有蛋白质(对照例1)、BSA(比较例1)或0.1％BPF(实施例1)添加至第一试剂时的正常值附近L-FABP浓度范围中的非特异性反应抑制效果。
1.操作
(1)实施例1
采用冷冻解冻的尿作为样品，通过使用包含390mmol/L式(1)的化合物(苯甲脒盐酸盐)和0.1％BPF的第一对照试剂以及第二试剂测定样品中的L-FABP。
(2)对照例1
采用冷冻解冻的尿作为样品，通过使用包含390mmol/L式(1)的化合物(苯甲脒盐酸盐)的第一对照试剂以及第二试剂测定样品中的L-FABP。
(3)比较例1
采用冷冻解冻的尿作为样品，通过使用包含390mmol/L式(1)的化合物(苯甲脒盐酸盐)和0.1％BSA的第一对照试剂以及第二试剂测定样品中的L-FABP。
2.结果
通过使用以标准溶液为样品建立的校正曲线将实施例1、对照例A和比较例1的各试验中测定的样品的净吸光度转换为L-FABP浓度。通过以使用基准方法获得的样品的L-FABP浓度(基准测定值)为x轴，以由各试验获得的L-FABP浓度(试验测定值)为y轴绘图，通过最小二乘法研究在正常值附近L-FABP浓度的试验测定值与基准测定值之间的相关性，并将其示于表1中。
[表1]
添加蛋白质 R2 回归方程
实施例1 0.1％BPF 0.891 y＝1.512x-1.232
对照例1 无 0.024 y＝0.500x+5.193
比较例1 0.1％BSA 0.007 y＝0.437x+9.774
对照例1中的测定值和基准测定值之间的R2低至0.024，由此确认对照例1的条件不适用于使用作为临床检查试样的尿作为样品的测定。比较例1中的测定值和基准测定值之间的R2为0.007，这比其中没有添加蛋白质的对照例还差。另一方面，实施例1中的测定值和基准测定值之间的R2为0.891，相关性是良好的。由上文证实，在使用乳胶比浊免疫测定的L-FABP的测定中，具有正常值附近L-FABP浓度的试样可以通过添加BPF准确测定。
[实施例2至5]确认BPF对具有正常值附近L-FABP浓度的试样的非特异性反应抑制效果，第2部分
比较390mmol/L式(1)的化合物(苯甲脒盐酸盐)和0.01％至1％BPF(实施例2至5)添加至第一试剂时的正常值附近L-FABP浓度范围中的非特异性反应抑制效果。
1.操作
对于试样，收集后在-30℃冷冻保存的部分尿(n＝10；基准方法中的测定值为0.6ng/mL至4.9ng/mL)仅解冻一次并用于测定。将表2中所示量的BPF添加至第一试剂。除了这些点之外，以与实施例1相同的方式进行实施例2。
2.结果
通过使用以标准溶液为样品建立的校正曲线将实施例2至5的试验中测定的样品的净吸光度转换为L-FABP浓度。通过以使用基准方法获得的样品的L-FABP浓度(基准测定值)为x轴，以由各试验获得的L-FABP浓度(试验测定值)为y轴绘图，通过最小二乘法研究在正常值附近L-FABP浓度的试验测定值与基准测定值之间的相关性，并将其示于表2中。
[表2]
BPF(％) R2
实施例2 0.01 0.924
实施例3 0.05 0.896
实施例4 0.5 0.926
实施例5 1 0.939
实施例2至5中的测定值和基准测定值之间的R2为0.896至0.939，相关性是良好的。
[实施例6至9]确认BPF对具有正常值附近L-FABP浓度的试样的非特异性反应抑制效果，第3部分
比较390mmol/L式(2)的化合物(2-氨基-2-噻唑啉盐酸盐)和0.01％至1％BPF(实施例6至9)添加至第一试剂时的正常值附近L-FABP浓度范围中的非特异性反应抑制效果。
1.操作
对于试样，收集后在-30℃冷冻保存的部分尿(n＝10；基准方法中的测定值为0.6ng/mL至4.9ng/mL)仅解冻一次并用于测定。将式(2)的化合物(2-氨基-2-噻唑啉盐酸盐)和表3所示量的BPF添加至第一试剂。除了这些点之外，以与实施例1相同的方式进行实施例3。
2.结果
通过使用以标准溶液为样品建立的校正曲线将实施例6至9的试验中测定的样品的净吸光度转换为L-FABP浓度。通过以使用基准方法获得的样品的L-FABP浓度(基准测定值)为x轴，以由各试验获得的L-FABP浓度(试验测定值)为y轴绘图，通过最小二乘法研究在正常值附近L-FABP浓度的试验测定值与基准测定值之间的相关性，并将其示于表3中。
[表3]
BPF(％) R2
实施例6 0.01 0.665
实施例7 0.05 0.606
实施例8 0.5 0.579
实施例9 1 0.673
实施例6至9中的测定值和基准测定值之间的R2为0.579至0.673。与没有添加BPF(对照例1)或添加0.1％BSA(比较例1)相比，相关性是良好的。
工业实用性
根据本发明，甚至在高灵敏免疫学测定方法中也可以抑制来源于反应体系的非特异性反应，因此可以提供更准确和灵敏的免疫学测定方法。例如，可以在尿L-FABP测定中准确测定正常值附近的试样(如2.2±2.3μg/gCR，根据Renapro(注册商标)L-FABP试验TMB的包装说明书)。
序列表
<110> 积水医疗株式会社
<120> 免疫测定方法以及用于所述方法的测定试剂
<130> 15P00236
<150> JP2015-035903
<151> 2015-02-25
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 638
<212> PRT
<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (1)..(638)
<220>
<221> PEPTIDE
<222> (419)..(607)
<400> 1
Met Gly Lys Ile Ile Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Cys Val
1 5 10 15
Ala Ile Met Asp Gly Thr Thr Pro Arg Val Leu Glu Asn Ala Glu Gly
20 25 30
Asp Arg Thr Thr Pro Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Gln Asp Gly Glu Thr
35 40 45
Leu Val Gly Gln Pro Ala Lys Arg Gln Ala Val Thr Asn Pro Gln Asn
50 55 60
Thr Leu Phe Ala Ile Lys Arg Leu Ile Gly Arg Arg Phe Gln Asp Glu
65 70 75 80
Glu Val Gln Arg Asp Val Ser Ile Met Pro Phe Lys Ile Ile Ala Ala
85 90 95
Asp Asn Gly Asp Ala Trp Val Glu Val Lys Gly Gln Lys Met Ala Pro
100 105 110
Pro Gln Ile Ser Ala Glu Val Leu Lys Lys Met Lys Lys Thr Ala Glu
115 120 125
Asp Tyr Leu Gly Glu Pro Val Thr Glu Ala Val Ile Thr Val Pro Ala
130 135 140
Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Arg Ile
145 150 155 160
Ala Gly Leu Glu Val Lys Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala
165 170 175
Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly Thr Gly Asn Arg Thr Ile Ala Val
180 185 190
Tyr Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe Asp Ile Ser Ile Ile Glu Ile Asp
195 200 205
Glu Val Asp Gly Glu Lys Thr Phe Glu Val Leu Ala Thr Asn Gly Asp
210 215 220
Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe Asp Ser Arg Leu Ile Asn Tyr Leu
225 230 235 240
Val Glu Glu Phe Lys Lys Asp Gln Gly Ile Asp Leu Arg Asn Asp Pro
245 250 255
Leu Ala Met Gln Arg Leu Lys Glu Ala Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu
260 265 270
Leu Ser Ser Ala Gln Gln Thr Asp Val Asn Leu Pro Tyr Ile Thr Ala
275 280 285
Asp Ala Thr Gly Pro Lys His Met Asn Ile Lys Val Thr Arg Ala Lys
290 295 300
Leu Glu Ser Leu Val Glu Asp Leu Val Asn Arg Ser Ile Glu Pro Leu
305 310 315 320
Lys Val Ala Leu Gln Asp Ala Gly Leu Ser Val Ser Asp Ile Asp Asp
325 330 335
Val Ile Leu Val Gly Gly Gln Thr Arg Met Pro Met Val Gln Lys Lys
340 345 350
Val Ala Glu Phe Phe Gly Lys Glu Pro Arg Lys Asp Val Asn Pro Asp
355 360 365
Glu Ala Val Ala Ile Gly Ala Ala Val Gln Gly Gly Val Leu Thr Gly
370 375 380
Asp Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly
385 390 395 400
Ile Glu Thr Met Gly Gly Val Met Thr Thr Leu Ile Ala Lys Asn Thr
405 410 415
Thr Ile Pro Thr Lys His Ser Gln Val Phe Ser Thr Ala Glu Asp Asn
420 425 430
Gln Ser Ala Val Thr Ile His Val Leu Gln Gly Glu Arg Lys Arg Ala
435 440 445
Ala Asp Asn Lys Ser Leu Gly Gln Phe Asn Leu Asp Gly Ile Asn Pro
450 455 460
Ala Pro Arg Gly Met Pro Gln Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala
465 470 475 480
Asp Gly Ile Leu His Val Ser Ala Lys Asp Lys Asn Ser Gly Lys Glu
485 490 495
Gln Lys Ile Thr Ile Lys Ala Ser Ser Gly Leu Asn Glu Asp Glu Ile
500 505 510
Gln Lys Met Val Arg Asp Ala Glu Ala Asn Ala Glu Ala Asp Arg Lys
515 520 525
Phe Glu Glu Leu Val Gln Thr Arg Asn Gln Gly Asp His Leu Leu His
530 535 540
Ser Thr Arg Lys Gln Val Glu Glu Ala Gly Asp Lys Leu Pro Ala Asp
545 550 555 560
Asp Lys Thr Ala Ile Glu Ser Ala Leu Thr Ala Leu Glu Thr Ala Leu
565 570 575
Lys Gly Glu Asp Lys Ala Ala Ile Glu Ala Lys Met Gln Glu Leu Ala
580 585 590
Gln Val Ser Gln Lys Leu Met Glu Ile Ala Gln Gln Gln His Ala Gln
595 600 605
Gln Gln Thr Ala Gly Ala Asp Ala Ser Ala Asn Asn Ala Lys Asp Asp
610 615 620
Asp Val Val Asp Ala Glu Phe Glu Glu Val Lys Asp Lys Lys
625 630 635

Claims (14)

1.一种利用抗L-FABP抗体检测样品中的L-FABP(肝脏型脂肪酸结合蛋白)的方法，其包括使以下成分彼此接触的步骤：
疑似包含L-FABP的样品，
具有固定的抗L-FABP抗体的颗粒，
分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物，和
由SEQ ID NO：1所示的来源于大肠杆菌(E.coli)的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位至第607位氨基酸组成的多肽或与所述多肽具有至少90％序列同一性的多肽。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物为选自式(1)表示的化合物或其盐或酯和式(2)表示的化合物或其盐中的一种或两种以上：
式(1)的化合物或其盐或酯
[化学式1]
[在式(1)中，R1为氢原子、羟基或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，R2至R6各自独立地表示氢原子、卤原子、可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基、羟基、羧基、氨基或-SR7(R7表示氢原子、羟基或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，并且当存在多个R7时，R7可以是彼此相同的基团或彼此不同的基团)]；和
式(2)的化合物或其盐
[化学式2]
[在式(2)中，R11至R14各自独立地表示氢原子、卤原子、可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基、氨基、可以经卤原子取代的苯基或-SR16(R16表示氢原子、羟基或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，并且当存在多个R16时，R16可以是彼此相同的基团或彼此不同的基团)，其中存在于同一分子中的R11和R12可以一起形成羰基，存在于同一分子中的R13和R14可以一起形成羰基，
R15为氢原子、卤原子、或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，
X11为氮原子或硫原子，
X12和X13各自独立地为碳原子或氮原子，
l1、l2、m1、m2和n各自独立地为0或1，
X11和X13之间的双虚线以及X12和X13之间的双虚线各自独立地为单键或双键，其中
l1、l2、m1、m2和n的值以及X11和X13之间的双虚线以及X12和X13之间的双虚线的键指示依照X11至X13的化合价确定的值和化学键]。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述式(2)表示的化合物或其盐为选自以下化合物或其盐中的一种或两种以上：
式(2)的化合物或其盐
[化学式3]
[在式(2)中，R11至R14各自独立地表示氢原子、卤原子、可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基、氨基、可以经卤原子取代的苯基或-SR16(R16表示氢原子、羟基或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基，并且当存在多个R16时，R16可以是彼此相同的基团或彼此不同的基团)，其中存在于同一分子中的R11和R12可以一起形成羰基，存在于同一分子中的R13和R14可以一起形成羰基，
R15为氢原子、卤原子、或可以带支链的具有1、2或3的碳数的烷基]，其中
在X11至X13、l1+l2、m1+m2、n(l1、l2、m1、m2和n各自独立地表示0或1)和双虚线的组合中，
(a)X11为硫原子，X12和X13为碳原子，l1+l2为2，m1+m2为2，n为0，X11和X13之间的双虚线以及X12和X13之间的双虚线为单键，
(b)X11为硫原子，X12和X13为碳原子，11+12为1，m1+m2为1，n为0，X11和X13之间的双虚线为单键，X12和X13之间的双虚线为双键，
(c)X11为氮原子，X12和X13为碳原子，11+12为2，m1+m2为2，n为1，X11和X13之间的双虚线以及X12和X13之间的双虚线为单键，
(d)X11为氮原子，X12和X13为碳原子，11+12为1，m1+m2为1，n为1，X11和X13之间的双虚线为单键，X12和X13之间的双虚线为双键，
(e)X11和X12为氮原子，X13为碳原子，l1+l2为1，m1+m2为1，n为0，X11和X13之间的双虚线为双键，X12和X13之间的双虚线为单键，或
(f)X11、X12和X13为氮原子，l1+l2为0，m1+m2为0，n为1，X11和X13之间的双虚线为单键，X12和X13之间的双虚线为双键。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物为苯甲脒或2-氨基-2-噻唑啉。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中
在使疑似包含L-FABP的样品、抗L-FABP抗体、分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物和由SEQ ID NO：1所示的来源于大肠杆菌的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位至第607位氨基酸组成的多肽或与所述多肽具有至少90％序列同一性的多肽彼此接触的步骤中，
在使所述疑似包含L-FABP的样品、所述化合物和所述多肽彼此接触的步骤之后是使所述样品与所述抗L-FABP抗体接触的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其中使所述疑似包含L-FABP的样品、所述化合物和所述多肽彼此接触的步骤中所述多肽的浓度为0.04mmol/L至1.36mmol/L。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述抗L-FABP抗体为具有彼此不同的识别位点的两种以上单克隆抗体。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述颗粒为乳胶颗粒。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其中将所述具有彼此不同的识别位点的两种以上抗L-FABP单克隆抗体分别固定在乳胶颗粒上，其中通过乳胶比浊免疫测定检测L-FABP。
10.根据权利要求7所述的方法，其中，用标记物质标记所述具有彼此不同的识别位点的两种以上单克隆抗体中的一种单克隆抗体，同时将另外的一种或多种单克隆抗体固定在一个或多个固相上，其中通过免疫色谱检测L-FABP。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中所述样品为尿、全血、血清或血浆。
12.一种用于利用抗L-FABP抗体检测样品中的L-FABP的颗粒免疫测定的试剂，其包含：抗L-FABP抗体；分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物；和由SEQ ID NO：1所示的来源于大肠杆菌的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位至第607位氨基酸组成的多肽或与所述多肽具有至少90％序列同一性的多肽。
13.一种避免利用颗粒免疫测定检测样品中正常值附近的L-FABP的方法中的非特异性反应的方法，其中疑似包含L-FABP的样品和测定试剂的混合液体包含分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物和由SEQ ID NO：1所示的来源于大肠杆菌的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位至第607位氨基酸组成的多肽或与所述多肽具有至少90％序列同一性的多肽。
14.一种使利用颗粒免疫测定检测样品中正常值附近的L-FABP的方法中的测定值稳定化的方法，其中疑似包含L-FABP的样品和测定试剂的混合液体包含分子中具有NH2-C＝N-局部结构的化合物和由SEQ ID NO：1所示的来源于大肠杆菌的热激蛋白(HSP)DnaK氨基酸序列的第419位至第607位氨基酸组成的多肽或与所述多肽具有至少90％序列同一性的多肽。
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