CN103946709A - 基于l-fabp诊断急性事件后或外科手术后的肾损伤 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用于基于生物标记物L-FABP诊断与急性事件后或外科手术后相关的急性肾损伤的设备和方法。此外，还提供了用于预测个体在将来的急性事件后或在外科手术后患上肾损伤的风险的方法，以及相应的用途和试剂盒。

Description

基于L-FABP诊断急性事件后或外科手术后的肾损伤

发明领域

本发明提供了基于L-FABP和任选的进一步标记物的检测，在来自个体的血液样品中进行急性事件后或外科手术后的肾损伤的早期诊断的装置和方法。

肾损伤代表了在广泛的临床背景下发生的复杂疾病，通常带有严重且致命的并发症。肾疾病宽泛地归类为慢性肾疾病(CKD)和急性形式的肾损伤。CKD是通常由疾病，例如糖尿病、肾病、高血压和心血管疾病，导致的慢性疾病。

急性形式的肾损伤，如急性肾损伤(AKI)，进而可发生在急性事件，如事故、烧伤或外伤后的个体中。肾损伤也是外科手术后的主要并发症。

在患有急性形式的肾损伤的患者中，肾过滤废物的能力迅速降低，这种状况可随后发展成肾衰竭。在冠状动脉旁路手术后的AKI发生率在10至20%的范围(Mehta等人，Circulation 2006, 114: 2208 – 2216)。这些个体中的1-5%需要手术后的透析。手术后的AKI的发病机理是多因素的，并且充分确立了其与提高的死亡率和心脏手术后的长期死亡率的关联。(Brown等人，Annals of Thoracic Surgery 2008, 86: 4 – 11；Kourliouros等人，European Journal of Cardiothoracic Surgery 2009，待发表)。

可预防有风险的患者中的AKI。预防包括在手术期间和手术后仔细的流体平衡，避免低心肺分流术(CPB)灌注温度(Kourliouros等人)，在手术前避免或停止潜在的肾毒性药物，或在手术后应用药物，例如红细胞生成素(Song等人，American Journal of Nephrology 2009, 30: 253 – 260)。

目前，急性肾损伤仅通过评估血清肌酸酐水平诊断。血清肌酸酐浓度比基线高0.3 mg/dL (26.4 µmol/L)的绝对升高，或血清肌酸酐在48小时的时段中大于50%的提高是诊断急性肾损伤的指征。然而，血清肌酸酐的测定具有缺点，即急性肾损伤的诊断仅能够在急性肾损伤晚期阶段(在急性事件后约2天)诊断。

常被称作FABP1的标记物L-FABP (肝脂肪酸结合蛋白)是尤其在肝细胞中和人肾的近端小管中表达的游离脂肪酸的细胞内载体蛋白。

Kamijo等人(Urinary liver-type fatty acid binding protein as a useful biomarker in chronic kidney disease. Mol Cell Biochem. 2006 Mar; 284(1-2):175-82)报道了L-FABP的尿排泄可反映导致肾小管间质损伤的各种胁迫，并且可以是慢性肾疾病进展的有用临床标记物。

Portilla 等人(Kidney International (2008) 73, 465–472)在心脏手术后的小儿科群体中观察到L-FABP在发展出AKI的患者中增加，而在没有AKI的那些患者中则没有增加。血清L-FABP水平的显著增加只有早在心脏手术后12小时观察到。与此不同，在与对照水平相比时，相同患者亚组中测量的尿L-FABP水平在手术后首个4小时内高度增加。

此外，Portilla等人(Portilla等人，The American Journal of Pathology, Vol. 174, p. 1154-1159 (2009))通过在人L-FABP转基因小鼠中多种肾损伤诱导不同严重性程度的AKI。Portilla等人显示，即便在顺铂诱导的AKI损伤后2小时的尿L-FABP水平提高。然而，这些数据缺少在人中的临床确认。

Devarajan等人(Informa Healthcare (2008) 2, 387-398)讨论了在AKI中血浆和尿L-FABP水平之间的不相关，表明在AKI患者中心脏手术后4小时提高的尿L-FABP水平代表了L-FABP从近端小管增强的脱落而不是反映增加的高血清水平的过滤。

AKI可导致多种并发症，包括代谢性酸中毒、高钾水平、尿毒症、体液平衡改变和对其他器官系统的影响。AKI的管理包括支持性护理，例如肾替代疗法，以及对潜在病症的治疗。此外，AKI还可导致各种并发症，例如代谢性酸中毒、高钾水平、尿毒症、体液平衡改变。体液平衡的变化可导致心力衰竭(或可使心力衰竭恶化)。此外，它还影响其他器官系统。在肾损伤的严重病例中，可需要肾替代疗法(包括，例如血液透析或肾移植)。此外，AKI与提高的死亡率、更多的费用以及延长的重症监护(ICU)和住院时间相关。常规的AKI生物标记物肌酸酐和尿素没有检测出早期AKI。新的早期生物标记物的临床用途在快速扩增，例如在麻醉期间和在ICU中。新生物标记物可用于评估新技术和治疗剂对肾功能的作用，作为安全标记物以监测毒性，以及作为治疗效果的量度。

因此，高度需要在接受外科手术或急性事件的个体中的尽可能早的早期肾损伤诊断，这是因为早期诊断允许启动及时的治疗措施。

因此，可见本发明相关的一个技术问题是提供用于早期鉴定患有肾损伤或具有在将来的急性事件后或在外科手术后患上肾损伤的风险的个体的设备和方法。

发明内容

这些目标的至少一个通过提供在权利要求书和本文下述定义的主题而实现。

在第一个方面，本发明涉及用于诊断在急性事件后或在外科手术后的个体中的肾损伤的方法，其包括以下步骤：

a) 测定从个体分离的第一血液样品中的肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的水平，其中所述样品在急性事件后或外科手术后约10小时之内分离；和

b) 将步骤a)中测定的水平与参照水平比较；

其中至少等于或大于所述参照水平的L-FABP或其变体的水平指示肾损伤。

在第二方面，本发明涉及用于预测个体在将来的急性事件后或在外科手术后患上肾损伤的风险的方法，其包括以下步骤：

a) 测定从个体分离的第一血液样品中的L-FABP或其变体的水平，其中所述样品在所述事件后或外科手术后10小时之内分离；和

b) 将步骤a)中测定的水平与参照水平比较；

其中，等于或大于参照水平的L-FABP水平指示个体患上肾损伤的风险。

在第三方面，本发明涉及选择用于在急性事件后或在外科手术后而患有肾损伤或具有患上肾损伤的风险的个体的肾疗法的方法，其包括以下步骤：

a) 测定从个体的第一血液样品中的L-FABP或其变体的水平，其中所述样品在所述事件后或外科手术后10小时之内分离；和

b) 将步骤a)中测定的L-FABP水平与参照水平比较；

其中基于步骤b)的比较选择肾疗法。

在进一步的方面，本发明涉及相应的试剂盒、和设备及其用途。

发明详述

在第一个方面，本发明涉及用于诊断在急性事件后或在外科手术后的个体中的肾损伤的方法，其包括以下步骤：

a) 测定从个体分离的血液样品中的肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的水平，其中所述样品在急性事件后或外科手术后约10小时之内分离；和

b) 将步骤a)中测定的水平与参照水平比较；

其中至少等于或大于所述参照水平的L-FABP或其变体的水平指示肾损伤。

本发明的发明人意外地发现基于血液样品的L-FABP检测允许迄今未知的早期且强效的诊断(和预测)在急性事件后或在外科手术后(参见，例如实施例)的个体中的肾损伤。这样的早期诊断为医师提供非常有价值的信息，并且与基本上基于更不可靠或更晚的反应标记物水平的迄今已知的临床实践相比，提供了用于在更早的时间点进行治疗分层(treatment stratification)以及治疗性干预的基础。因此，现在可以更早地启动或调整旨在预防肾损伤发展或改善其恶化的治疗措施。在此方面，必须考虑到在发生肾损伤后，治疗性的选择(用于治疗的选择)显然比认识到患上肾损伤的风险或其发生可以预防性治疗的情况下明显更有限。这样的决定包括在改进风险效益评价方面重新考虑用于手术的指征，停止已知参与肾损伤(例如AKI)的药物，包括ACE抑制剂、血管紧张素受体阻断剂和NSIADs，以及潜在的抗生素和已知参与AKI的其他药物。此外，在手术期间，需要适当且认真的平衡的体液和血压。因此，本发明方法的目标在于预防肾损伤，从而提供改进的临床决策制订。

本发明的方法优选是先体外后体内或体外方法。此外，所述方法可包含上文明确提到的那些之外的步骤。例如，进一步的步骤可涉及样品预处理或对通过所述方法获得的结果的评估。所述方法手动进行或通过自动操作辅助。优选地，步骤(a)和(b)可完全或部分地通过自动操作辅助，例如通过用于步骤(a)或(b)中的测定的适合的机器人和传感设备，或基于步骤(b)中的比较的计算机实施的比较和/或诊断。

优选地，所述肾损伤的诊断是通过实施进一步的步骤c) 基于步骤b)的比较结果诊断肾损伤。术语“肾损伤”是指肾功能的丧失，肾的亚细胞、细胞损害或组织损害，需要透析和/或与死亡相关的肾功能障碍。优选地，本发明的肾损伤是急性肾损伤(AKI)。AKI是本领域中熟知的。AKI优选定义为血清肌酸酐在手术后48小时内或72小时内提高至少0.3 mg/dl，或者定义为从基线提高至少50% (优选在手术后48小时内)。AKI还可以在特征性实验室发现的基础上诊断，例如升高的血液尿素氮和肌酸酐，或基于肾不能产生足够量的尿而诊断。AKI可以是肾的肾后性，内在或肾前性损伤。包含在如本文使用的术语AKI之内的AKI的进一步优选的定义已由Acute Kidney Injury Network (AKIN) (www.AKINet.org)公开，其公开了基于RIFLE分级的AKI的定义。用于诊断AKI的进一步的方法和标准已描述在Mehta等人，(2007) Critical Care (London, England) 11 (2): R31.doi:10.1186/cc5713. PMC 2206446. PMID 17331245)。

反之，慢性肾损伤可通过白蛋白的尿排泄诊断。

如本文使用的术语“肾功能”是本领域技术人员熟知的。它可以与“肾脏功能”交换使用，并且是指肾用于尿生产、控制和消除体内水分和体液，以及电解质和废物的体内平衡和过滤，以及红细胞生成素合成的能力。

在本发明的背景中，如本文使用的术语“急性事件”优选是指任何事故、烧伤、外伤或癌症。术语“事故”包括通过外力，包括跌落或物理暴力，而产生作用于身体的损害的任何且无法预料的且无计划的事件或环境。优选地，所述损害中断身体皮肤的完整性，例如伤口，优选可以与组织的撕裂、切伤、刺伤或破裂相关的伤口。优选地，所述伤口具有至少3、至少5、至少10、至少15、至少20厘米的直径。包含在本文之内的事故的实例包括由车辆引起的交通事故、运动事故和工作事故。如本文使用的术语“外伤”包括中断身体皮肤的完整性的损害，例如伤口，优选可以与组织的撕裂、切伤、刺伤或破裂相关的伤口。优选地，所述伤口具有至少3、至少5、至少10、至少15、至少20厘米的直径。

在本发明的背景中使用的术语“外科手术”，优选地，是指在身体上任何类型的介入式干预，包括内窥镜外科手术和涉及麻醉和/或呼吸辅助的干预。优选地，所述麻醉是局部麻醉，更优选地，所述麻醉是全身麻醉。术语“外科手术”还包括对内部器官(特别是对肝、肾、肠、胃、肺)的干预。术语“外科手术”还包括例如对四肢(腿、臂)和头部的干预。优选地，根据本发明的“外科手术”选自心脏手术或心肺手术。

术语“心脏手术”包括对心，具体地，对瓣膜或心肌的任何部分的干预。优选地，心脏手术是冠状动脉旁路移植(CABG)手术(通常也被称为“主动脉冠状动脉旁路”或“冠状动脉旁路手术”）。术语CABG是本领域已知的。CABG可以在患有冠状动脉狭窄的个体中进行，所述个体不能使用其他方法，例如经皮冠状动脉介入治疗(PCI)，成功地治疗。术语“心脏手术”进一步包括瓣膜置换术，这是将个体的缺陷瓣膜替换为替代的健康瓣膜的措施。瓣膜可受到一系列疾病的影响；例如，瓣膜可变成漏的(主动脉瓣关闭不全/反流)或部分阻断(主动脉瓣狭窄)。

术语“呼吸辅助”是通常已知的，并且包括心肺转流术(CPB)，这是在手术期间暂时接管心和肺的功能，维持身体的血液循环和含氧量的技术。CPB泵本身通常称作心肺机。因为对搏动心脏进行手术的难度，心肺转流术通常用于心脏手术中。

本文使用的术语“诊断”是指评估、测定、决定、鉴定、评价或分级个体在分离用于测定本发明的生物标记物(例如L-FABP)的水平的第一(和/或第二)样品时，是否显示与外科手术或急性事件相关的肾损伤的迹象或症状、患有和/或发展出所述肾损伤。如本领域技术人员所理解，这样的评估通常不预期对于所诊断的100%的个体都是正确的。然而，此术语需要所述评估对于统计学显著部分的个体(例如，在群组研究中的群组)是正确的。本领域技术人员可使用各种熟知的统计评估工具，例如测定置信区间，p-值测定、学生t检验、曼-惠特尼检验等，确定某部分是否是统计学显著的，而无需进一步的困扰工作。细节见于Dowdy和Wearden, Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983。优选的置信区间是至少90%，至少95%，至少97%，至少98%，或至少99%。p-值优选为0.1、0.05、0.01、0.005，或0.0001。

如本文使用的术语“与……相关”包括在一方面的肾损伤和在另一方面的外科手术或急性事件之间的时间、统计学和/或因果关系。

如本文使用的术语“个体”涉及动物，优选哺乳动物，且更优选人，例如男人或女人。优选地，所述个体是成人或儿童。优选地，进行外科手术或经历急性事件的个体，在所述急性事件或外科手术之前、当时和/或前后的时间，没有患有与提高的L-FABP水平相关的疾病或病症，优选与至少约13 ng/ml的L-FABP水平相关的疾病或病症，或更优选至少约15 ng/ml，最优选约17 ng/ml的L-FABP水平相关的疾病或病症。或者，与健康人群的至少约第80百分位，优选至少约第85百分位，优选至少约第90百分位，优选至少约第95百分位，优选至少约第99百分位的L-FABP水平相关的疾病或病症优选地从各自的ROC分析导出。优选地，与提高的L-FABP水平相关的疾病或病症是肝疾病，肝或肾损伤、癌症或慢性肾损伤。此外，所述个体优选在所述急性事件或外科手术前2个月内将不需要透析或曾经历透析。因此，所述个体优选没有患肝损伤、癌症或慢性肾损伤，并且所述个体在所述急性事件或外科手术前2个月不需要透析或曾经历透析。

除通常已知的方案之外，用于诊断个体的肝损伤的方法和标准可基于在急性事件或外科手术之前分离的样品中的L-FABP或肝酶(例如，谷氨酸脱氢酶、ALT、GOT、γ-GT)水平的测定。在急性事件或外科手术之前分离的样品中的L-FABP水平或肝酶与参照水平相比的升高指示肝损伤或肝疾病。

用于诊断慢性肾疾病的方法和标准通常是本领域中已知的。用于诊断慢性肾疾病的一种可能是检测的尿中的白蛋白分泌>30 mg/24h。

在用于诊断在急性事件后或外科手术后的个体中的肾损伤的方法的背景中，如本文使用的术语“参照水平”，优选地，是指允许评估如本文所指的个体是否患有肾损伤，优选急性肾损伤的水平。

优选地，参照水平的测定是基于从曾经历外科手术的参照个体或参照个体的组，和/或(i) 遭受急性事件或经历外科手术以及(ii) 诊断为在急性事件后或外科手术后患有肾损伤的参照个体或参照个体的组分离的生物标记物(如L-FABP)水平。

优选地，来自参照个体或参照个体的组的样品已经在急性事件或外科手术期间或之后分离，优选来自在所述急性事件后或所述外科手术后约10小时内分离的样品。优选地，在相对于急性事件或在外科手术后从参照个体或参照个体的组分离样品的时间点，与对其实施本发明方法的个体的样品的分离时间点相同，例如，如果在权利要求1的方法中，样品是在外科手术后5小时从个体分离的，则在来自外科手术后约5小时分离的参照个体或参照个体的组的样品中测定参照水平。

优选地，来自参照个体或参照个体的组的样品与来自测试个体的测试样品是在相对于所述急性事件或外科手术的相同时间段内分离，更优选地，在基本相同的时间点分离。

在本发明的优选实施方式中，参照水平从第二样品测定。

在本发明的另一个实施方式中，参照水平是基于从曾经历外科手术的参照个体或参照个体的组，和/或(i) 遭受急性事件或经历外科手术以及(ii) 诊断为在急性事件后或外科手术后没有患上肾损伤的参照个体或参照个体的组分离的生物标记物(如L-FABP)水平。

此外，参照水平的测定还可基于已知来自已知为生理健康的个体或个体的组的样品。

适用于个体的参照水平可依据不同的生理参数而改变，例如年龄、性别或亚群，还可以依据用于测定本文所涉及的多肽或肽的测试形式、样品和配体而改变。这些因素以及在测定参照水平时考虑这些因素的方式在本领域中通常是已知的。

如上文所述，可基于给定生物标记物的均值或平均值，通过应用标准统计学方法，计算对于个体的群组的参照水平。具体地，测试，例如以评估病症为目标的方法，是否准确，最好由其受试者工作特征(ROC)描述(特别地参见Zweig 1993, Clin. Chem. 39:561-577)。ROC曲线是在所观察的整个数据范围内从连续改变的判定阈获得的所有敏感性/特异性对的标绘图。诊断方法的临床性能取决于其准确性，即其正确地将个体分配至特定预后或诊断的能力。ROC标绘图通过标绘在适合进行区别的整个阈值范围的敏感性对1-特异性的标绘图，指出两种分配之间的重叠。Y轴是敏感性或真阳性分数，其定义为真阳性测试结果的数量与真阳性的数量加上假阴性测试结果的数量的和的比例。在疾病或病症的存在下，这也已被称作阳性(positivity)。它仅从受到影响的亚组计算。X轴是假阳性分数或1-特异性，其定义为假阳性结果的数量与真阴性的数量加上假阳性结果的数量的和的比例。它是特异性的指标，并且完全从没有受到影响的亚组计算。因为真阳性和假阳性分数完全分离地计算，通过使用来自两个不同亚组的测试结果，ROC曲线独立于事件在群组中的流行程度。ROC曲线上的每个点代表对应于具体判定阈的敏感性/-特异性对。具有完全区分(在两种区别结果中没有重叠)的测试具有通过左上角的ROC曲线，其中真阳性分数是1.0或100% (完全敏感性)，且假阳性分数是0 (完全特异性)。对于没有区分(对于两组的相同分配结果)的测试的理论曲线是从左下角至右上角的45°对角线。大多数曲线在这两种极端情况之间。如果ROC曲线完全落在45°对角线以下，通过将“正性”的标准从“大于”转变为“小于”或反之而将其容易地补救。定量地，曲线越接近左上角，测试的整体准确性越高。取决于期望的置信区间，可从ROC曲线推导出允许用于诊断或预测给定事件，分别具有敏感性和特异性的适当平衡的阈值。

因此，待用于本发明上述方法的参照水平，即允许区分患有与急性事件或外科手术相关的肾损伤的个体与没有患上与急性事件或外科手术相关的肾损伤的个体的阈值，优选基于如上文所述的对个体和群体的ROC分析而确定。取决于对于诊断方法期望的敏感性和特异性，ROC曲线允许推导出适合的阈值。可理解，最优敏感性是期望用于排除没有患上与急性事件或外科手术相关的肾损伤的个体(即排出)，而最优特异性是预计用于患上与急性事件或外科手术相关的肾损伤的个体(即划入)。

在诊断急性事件后或外科手术后的个体中的肾损伤的背景中，优选的L-FABP参照水平是至少约13 ng/ml，更优选至少约15 ng/ml，最优选约17 ng/ml。或者，参照水平对应于与健康人群的至少约第80百分位，优选至少约第85百分位，优选至少约第90百分位，优选至少约第95百分位，优选至少约第99百分位，所述百分位可以是特异性，例如从各自的ROC分析导出。

如本文使用的术语“比较”包括将待分析样品包含的肽或多肽水平与本说明书中其他部分指定的适合参照水平的水平进行比较。可理解，本文使用的比较是指相应参数或数值的比较，例如将绝对数量与绝对参照数量进行比较，而将浓度与参照浓度进行比较，或者将得自于测试样品的强度信号与参照样品的相同类型的强度信号进行比较，或将量的比例与量的参照比例进行比较。本发明的方法的步骤(b)中所涉及的比较可以手动进行或由计算机辅助进行。对于计算机辅助的比较，可通过计算机程序将测定量的数值与对应于存储在数据库中的适合的参照的数值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即自动提供适合的输出格式的期望评估。

优选地，来自个体的样品中的L-FABP水平至少等于或大于参照水平，支持、辅助或证明与急性事件或外科手术相关的肾损伤或很可能有肾损伤的诊断。反之亦然，来自个体的样品中的L-FABP水平低于参照水平，支持、辅助或证明可排除与急性事件或外科手术相关的肾损伤或非常不太可能有肾损伤的诊断。

本发明的背景中已显示，L-FABP的测定允许肾损伤的早期评估，即甚至在可通过测定上文所述的血清肌酸酐增加诊断肾损伤之前。因此，L-FABP是比肌酸酐更早的肾损伤标记物。

术语“肝型脂肪酸结合蛋白”(L-FABP，本文中也常称作FABP1，也指肝脂肪酸结合蛋白)是指是肝型脂肪酸结合蛋白的多肽或其变体。肝型脂肪酸结合蛋白是表达在人的肾近端小管中的游离脂肪酸的细胞内载体蛋白。关于人L-FABP的序列，参见例如Chan等人，Human liver fatty acid binding protein cDNA and amino acid sequence, Functional and evolutionary implications, J. Biol. Chem. 260 (5), 2629-2632 (1985)，或GenBank登录号M10617.1。术语“L-FABP”还包括L-FABP的变体，优选人L-FABP的变体。这样的变体可具有与L-FABP至少相同的基本生物和免疫性质，即它们结合游离脂肪酸和/或胆固醇和/或类维生素A，和/或参与细胞内脂质运输。具体地，如果它们可通过本说明书中所提及的相同的特异性测定检测，例如通过使用特异性识别L-FABP的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定，则它们共有相同的基本生物和免疫性质。此外，可理解根据本文所述的变体应具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸序列仍，优选地，至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%，或99%与人L-FABP的氨基酸序列相同，优选在成熟L-FABP蛋白序列的整个长度上。变体可以是等位变体，或任何其他物种特异性同源物、旁系同源物或直系同源物。此外，本文涉及的变体包括L-FABP或上述类型的变体的片段，只要这些片段具有如上文所述的基本免疫和生物性质。这样的片段可以是，例如L-FABP的降解产物。进一步包括的是由于翻译后修饰，例如磷酸化、糖基化或十四烷基化，而不同的变体。优选地，术语“L-FABP”不包括心FABP、脑FABP和肠FABP。

优选地，在个体的样品中或在个体的第二样品中额外地测定肌酸酐、NGAL、KIM-1、胱抑素C和脂联素的水平。

如本文使用的肌酸酐通过肌肉代谢以恒定的速率产生，并且自由地过滤通过肾小球，并且也由肾小管分泌。因为肌酸酐被分泌，肌酸酐清除率(CrCl)在具有正常肾功能的人中高估GFR约10至20%，在具有晚期肾衰竭的人中则至多达50%。通常通过酶促或显色测试系统，测定血清或尿中的肌酸酐。根据AKI的定义，必须在干预或手术后数日测定肌酸酐的水平以诊断急性肾损伤。

如本文使用的术语“嗜中性粒细胞明胶酶相关蛋白”是指在其糖基化形式中具有25 kDa的分子量，且在其去糖基化形式中具有约21 kDa的分子量的蛋白。它包含178个氨基酸，并且具有如Kjeldsen等人在1993年所述的氨基酸序列(Journal of Biological Chemistry, 268: 10425-10432)。它有时作为与人嗜中性粒细胞明胶酶(基质金属蛋白酶9)的异二聚体而发现。已知NGAL的表达在患有急性肾功能障碍的患者中，特别是在肾缺血损伤后上调(Wagener等人，2006, Anesthesiology, 105: 485-491)。如本文使用的术语“NGAL”还包括NGAL的变体，优选人NGAL的变体。这样的变体可具有与NGAL至少相同的基本生物和免疫性质，即它们防止基质金属蛋白酶9的降解。具体地，如果它们可通过本说明书中所提及的相同特异性测定检测，例如通过使用特异性识别NGAL的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定，则它们共有相同的基本生物和免疫性质。此外，可理解根据本发明所述的变体应具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸序列仍，优选地，至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%，或99%与人NGAL的氨基酸序列相同。如何确定同一性的程度是本领域技术人员熟知的。变体可以是等位变体，或任何其他物种特异性同源物、旁系同源物或直系同源物。此外，本文涉及的变体包括NGAL或上述类型的变体的片段，只要这些片段具有如上文所述的基本免疫和生物性质。这样的片段可以是，例如NGAL的降解产物。进一步包括的是由于翻译后修饰，例如磷酸化、糖基化或十四烷基化，而不同的变体。

如本文使用的术语“肾损伤分子-1”(KIM-1)是指在其细胞外部分中包含独特的6-半胱氨酸Ig结构域和粘蛋白结构域的1型膜蛋白。大鼠3-2 cDNA序列的KIM-1包含307个氨基酸的开放读码框。人cDNA克隆85的蛋白序列也包含一个Ig、粘蛋白、跨膜和细胞质结构域，每个均如同大鼠KIM-1。两种蛋白的Ig结构域内的所有6个半胱氨酸都是保守的。在Ig结构域中，大鼠KIM-1和人cDNA克隆85在蛋白质水平上显示68.3%的相似性。与大鼠KIM-1相比，在克隆85中的粘蛋白结构域更长且细胞质结构域更短，相似性分别为49.3%和34.8%。克隆85被称作人KIM-1 (关于KIM-1蛋白的结构，参见，例如Ichimura等人，J Biol Cem, 273 (7), 4135-4142 (1998)，特别是图1)。重组人KIM-1显示与重组大鼠-或小鼠-KIM-1没有交叉反应性或干扰。KIM-1 mRNA和蛋白以高水平表达在再生近端小管上皮细胞中，已知所述细胞修复和再生缺血后肾中的损伤区域。在去分化且在肾上皮损伤后经历复制的细胞中，KIM-1是上调的上皮细胞粘附分子(CAM)。在急性肾损伤(AKI)后不久，在尿中容易检测到KIM-1的蛋白水解加工结构域(Expert Opin. Med. Diagn. (2008) 2 (4): 387-398)。根据本发明所述的KIM-1进一步包括上文讨论的人KIM-1的具体序列的等位变体或其他变体。具体地，预计变体多肽在氨基酸水平上与人KIM-1优选至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%，或99%相同。可通过本领域中已知的算法测定两条氨基酸序列之间同一性的程度。优选地，通过比较在比较窗口中的两个最佳比对序列测定同一性的程度，其中对于最佳比对，与参照序列(其不包含添加或缺失)相比，在所述比较窗口内的氨基酸序列的片段可包含添加或缺失(例如，缺口或悬端)。所述百分比的计算是通过测定在两条序列中都出现相同氨基酸残基的位置的数量以产生匹配位置的数量，由匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数并将结果乘以100，从而获得序列同一性的百分比。用于比较的序列的最佳比对可通过以下进行：局部同源性算法(Smith和Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981))；同源性比对算法(Needleman和Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970))；检索类似性算法(Pearson和Lipman Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 85: 2444 (1988))；这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)；或目视检查。假定已鉴定用于比较的两条序列，优选采用GAP和BESTFIT测定其最佳比对，并由此测定同一性的程度。优选地，使用对于缺口权重为5.00，和对于缺口权重长度为0.30的默认值。上述变体可以是等位变体，或任何其他物种特异性同源物、旁系同源物或直系同源物。基本相似并且也预计到的是仍由针对各自全长多肽的诊断性配体识别的蛋白水解降解产物。还包括与人KIM-1的氨基酸序列相比，具有氨基酸缺失、取代和/或添加的变体多肽，只要所述多肽具有KIM-1性质。

如本文使用的术语“胱抑素C”是由几乎所有有核细胞生产的13 kDa的小蛋白。其生产速率是恒定的，并且不受炎症过程、性别、年龄和肌肉量的影响。在正常肾中，胱抑素C在肾小球膜自由地过滤，并且随后被近端小管细胞近乎完全重吸收并降解。因此，胱抑素C的血浆浓度几乎完全通过肾小球滤过率(GFR)确定，使胱抑素C成为GFR的指标。胱抑素C具有相对肾功能的常规临床量度的优势。它比血浆肌酸酐、Cockcroft-Gault估算的肌酸酐清除率更准确，并且比24小时肌酸酐清除率更可靠。已显示，在发生AKI的患者中，胱抑素C比血清肌酸酐更早地增加，比血清肌酸酐早1至2天。

如本文使用的胱抑素C还包括胱抑素C的变体，优选人胱抑素C的变体。这样的变体具有与胱抑素C至少相同的基本生物和免疫性质。具体地，如果它们可通过本说明书中所涉及的相同特异性测定检测，例如通过使用特异性识别胱抑素C的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定，则它们共有相同的基本生物和免疫性质。此外，可理解根据本发明所述的变体应具有由于至少一个氨基酸取代、缺失和/或添加而不同的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸序列仍，优选地，至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%，或99%与人胱抑素C的氨基酸序列相同。如何确定同一性的程度是本领域技术人员熟知的。变体可以是等位变体，或任何其他物种特异性同源物、旁系同源物或直系同源物。此外，本文涉及的变体包括胱抑素C或上述类型的变体的片段，只要这些片段具有如上文所述的基本免疫和生物性质。这样的片段可以是，例如胱抑素C的降解产物。进一步包括的是由于翻译后修饰，例如磷酸化、糖基化或十四烷基化，而不同的变体。

如本文使用的脂联素是由脂肪细胞分泌的多肽(多种已知的脂肪细胞因子之一)。在本领域中，脂联素通常也被称作Acrp30和apM1。近期已显示脂联素具有多种活性，例如抗炎、抗动脉粥样硬化、预防代谢综合征和胰岛素增敏活性。脂联素由单个基因编码，并且具有244个氨基酸，其分子量约30 kDa。成熟人脂联素蛋白包括全长脂联素的氨基酸19至244。认为球状结构域包含全长脂联素的氨基酸107-244。如本文使用的脂联素多肽的序列是本领域中熟知的，并且例如公开在WO/2008/084003。

如本文使用的脂联素，优选涉及总脂联素，其包括低分子量脂联素、中分子量脂联素和高分子量脂联素。术语高分子量脂联素、低和中分子量脂联素和总脂联素是技术人员理解的。优选地，所述脂联素是人脂联素。用于测定脂联素的方法，例如，公开在US 2007/0042424 A1和WO/2008/084003中。脂联素的量可以在尿样品中测定。

根据本发明所述的脂联素进一步包括上文讨论的人脂联素的具体序列的等位变体或其他变体。具体地，预计变体多肽在氨基酸水平上优选与人脂联素至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、92%、95%、97%、98%，或99%相同。可通过本领域中已知的算法测定两条氨基酸序列之间同一性的程度。优选地，通过比较在比较窗口中的两个最佳比对序列测定同一性的程度，其中对于最佳比对，与参照序列(其不包含添加或缺失)相比，在所述比较窗口内的氨基酸序列的片段可包含添加或缺失(例如，缺口或悬端)。所述百分比的计算是通过测定在两条序列中都出现相同氨基酸残基的位置的数量以产生匹配位置的数量，由匹配位置的数量除以比较窗口中的位置的总数并将结果乘以100，从而获得序列同一性的百分比。用于比较的序列的最佳比对可通过以下进行：局部同源性算法(Smith和Waterman Add. APL. Math. 2:482 (1981))；同源性比对算法(Needleman和Wunsch J. Mol. Biol. 48:443 (1970))；检索类似性算法(Pearson和Lipman Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 85: 2444 (1988))；这些算法的计算机化执行(Wisconsin Genetics软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA，和TFASTA，Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)；或目视检查。假定已鉴定用于比较的两条序列，优选采用GAP和BESTFIT测定其最佳比对，并由此测定同一性的程度。优选地，使用对于缺口权重为5.00，和对于缺口权重长度为0.30的默认值。上述变体可以是等位变体，或任何其他物种特异性同源物、旁系同源物或直系同源物。基本相似并且也预计到的是仍由针对各自全长多肽的诊断性配体识别的蛋白水解降解产物。还包括与人脂联素的氨基酸序列相比，具有氨基酸缺失、取代和/或添加的变体多肽，只要所述多肽具有脂联素性质，特别是胰岛素致敏性质。

优选地，与第二样品中的L-FABP水平相比，在第一样品中L-FABP水平提高，更优选地，L-FABP水平的显著提高是用于诊断发生急性事件或经历外科手术的个体中的肾损伤(或其风险)的指征。

优选地，除L-FABP外，将第一样品中选自肌酸酐、NGAL、KIM-1、胱抑素C和脂联素的标记物的显著提高的水平与各自的参照水平进行比较，并且提高的标记物水平和提高的L-FABP水平是用于诊断个体中的与急性事件或外科手术相关的肾损伤(或其风险)的指征。

优选地，相对于各自的参照水平，来自测试个体的样品中(或在L-FABP情况下来自测试个体的样品，并且在两个不同的样品中测定)的基本相同水平的L-FABP和或提高水平的L-FABP和选自肌酸酐、NGAL、KIM-1、胱抑素C和脂联素的至少一种标记物是用于诊断与急性事件或外科手术相关的肾损伤(或用于预测其风险)的指征。

术语“样品”是指体液的样品，所述体液选自血液，即全血、血浆或血清，或尿，或分离细胞的样品，或来自组织或器官的样品。可通过熟知的技术分离体液的样品。组织或器官样品可通过，例如活组织检查，而分离自任何组织或器官。分离的细胞可通过分离技术，例如分离或细胞分选，而从体液或组织或器官分离。优选地，细胞-、组织-或器官样品从表达或生产本文所述肽的那些细胞、组织或器官分离。

在本发明背景中测定的标记物(即L-FABP或其变体，并且任选地和肌酸酐、NGAL、KIM-1、胱抑素C和脂联素或其变体)的水平将优选地在各自个体的全血样品、血浆和血清中测定。也可在各自的对象的尿样品中测定除L-FABP之外的标记物，视情况而定。

在本发明的优选实施方式中，在外科手术的情况下，额外地在第二血液样品中测定L-FABP水平，所述第二样品在第一样品之前分离，优选在外科手术或急性事件之前或期间分离，并且相对于第二血液样品，在第一血液样品中的L-FABP水平的升高指示肾损伤。

根据本发明的“第一样品”是，优选地，在急性事件后或外科手术后分离，即在个体经历手术后分离。可分离至少一个进一步的样品(例如，第三样品)，从而进一步监测L-FABP水平至此的变化。可分离这样进一步的样品，优选地在第一样品后1-10小时，1-8小时，且更优选地，在第一样品后2-4小时。任选地，进一步的样品在第一样品后1或2或3或4天后分离。

所述“第二样品”可以是分离以用于监测与在第一样品中各自标记物的水平相比，L-FABP水平的变化的样品。优选地，第二血液样品在第一样品之前或与第一样品同时分离。第二样品可以在外科手术或急性事件之前或期间分离。具体预期，第二样品已经在外科手术之前或在急性事件完成之前分离。

优选地，与第二样品中的L-FABP水平相比，在第一样品中L-FABP水平提高，更优选地，L-FABP水平的统计学上显著提高是用于诊断个体的肾损伤，或个体将来在急性事件后或外科手术后患上肾损伤的风险的指征。如本文使用的，第一样品中L-FABP水平相对于第二样品的比较通过减去或除以(比例计算)各自的水平而进行。优选地，通过计算第一样品中L-FABP水平相比于第二样品中所述水平的比例测定所述提高。

在优选的实施方式中，第一样品中L-FABP水平相比于第二样品中所述水平的被认为是统计学上显著的增加是至少约2.5倍，更优选至少约3倍，最优选至少约3.5倍的增加。或者，所述增加对应于从第一和第二样品的可能的L-FABP比例的各自ROC分析测定的至少约80%，更优选至少约90%，或更优选至少约95%的特异性。

表示肾衰竭的统计学增加可以依赖于分离第一样品的时间点，以及第一样品的分离相对第二样品的时机的选择。技术人员完全能够确定在不同时间点和取样间隔下的这样统计学显著的增加。分离第一样品和第二样品之间的优选时间间隔是至少约1小时，至少约2小时，至少约3小时，至少约4小时，至少约6小时，至少约8小时。

指示肾衰竭的统计学增加可以依赖于分离第一样品的时间点，以及第一样品的分离相对急性事件或外科手术的时机的选择，视情况而定。技术人员完全能够确定在不同时间点和取样间隔下的这样统计学显著的增加。第一样品分离和急性事件或外科手术之间的优选时间间隔是至少约1小时，至少约2小时，至少约3小时，至少约4小时，至少约6小时，至少约8小时。

如上文所述，在分离上述方法背景中所述的样品的时候，根据本发明的个体，优选地，已经历或将经历外科手术或经历急性事件。

术语“急性事件后或外科手术后”，优选是指在急性事件后或外科手术后约0.5小时之内，约1小时之内，约2小时之内，约4小时之内，约6小时之内，或约8小时之内分离样品。

在本发明的优选实施方式中，在急性事件后或外科手术后约10分钟之内，约20分钟之内，约30分钟之内，约40分钟之内，约50分钟之内，约1小时之内，约2小时之内，约4小时之内，约6小时之内，或约8小时之内分离第一血液样品。具体地，在急性事件后或外科手术后约10小时之内分离第一血液样品。

在本发明的背景中和短语“在外科手术后约10小时内分离样品”中，“外科手术后”的时间可以从以下时间计算：(i) 个体进入进行外科手术的房间，(ii) 第一医师完成个体的既往病历的时间，(iii) 开始外科手术，例如实施麻醉时，(iv) 外科手术已完成，(v) 优选地，在呼吸辅助停止时，(vi) 个体从进行外科手术的房间转出，(vi) 个体在完成外科手术后到达重症监护室，(vii) 个体到达病房，或(vii) 个体离开进行手术的公共机构、办事处或医院。

在本发明的优选实施方式中，在已经在第一样品之前分离的第二样品中测定至少一种生物标记物的水平，优选所述生物标记物是L-FABP和任选地额外的上述标记物。如果第一样品中的至少一种生物标记物的水平等于或大于第二样品中的水平，这是肾损伤的指征，并且优选反之亦然，即如果第一样品中的至少一种生物标记物的水平等于或低于第二样品中的水平，这是个体没有患上肾损伤的指征。

优选地，测试个体中分离第一样品和第二样品之间的时间段，以及用于分离样品的时间点，对应于在用于计算参照水平的对照个体中分离第一样品和第二样品之间的时间段，和对应用于分离的样品的时间点。

在测试个体中分离第一样品和急性事件或外科手术之间的时间段，以及用于分离样品的时间点，对应于在用于计算参照水平的对照个体中分离第一样品和急性事件或外科手术之间的时间段，和对应用于分离的样品的时间点，视情况而定。

本说明书中所述的肽或多肽的水平的测定是指测量，优选半定量或定量测量所述水平或浓度。测量可直接或间接完成。直接测量是指基于得自于肽或多肽本身的信号以及与样品中存在的肽分子数量直接相关的强度，测量肽或多肽的水平或浓度。这样的信号(本文中有时称作信号强度)可以通过，例如测量肽或多肽的特异物理或化学性质的强度信号而获得。间接测量包括测量从第二组分(即不是肽或多肽本身)的组分或生物读出系统，例如可测量的细胞反应、配体、标记物或酶促反应产物的信号。

根据本发明，可通过用于测定样品中肽水平的任何已知方式获得肽或多肽的水平。所述方式包括利用各种夹心、竞争或其他测定形式的标记分子的免疫测定和方法。这样的测定是，优选地，基于检测试剂，例如特异性识别待测定的肽或多肽的抗体。检测试剂应该能够直接或间接地产生表明肽或多肽是否存在的信号。此外，所述信号强度能够，优选地，与样品中存在的多肽水平直接或间接(例如反向比例)相关。进一步适合的方法包括测量对于肽或多肽特异性的物理或化学性质，例如其精确分子量或NMR图谱。所述方法包括，优选地，生物传感器，与免疫测定偶联的光学设备，生物芯片，分析设备，例如质谱仪，NMR-分析仪，或色谱设备。进一步，方法包括基于微型平板ELISA的方法、全自动或机器人免疫测定(可得自例如ElecsysTM analyzers)、CBA (酶促钴结合测定，可得自例如Roche-HitachiTM analyzers)，和胶乳凝集测定(可得自例如Roche-HitachiTM analyzers)。

优选地，肽或多肽水平的测定包括以下步骤：(a) 使能够激发细胞反应的细胞接触所述肽或多肽足够的时间段，所述细胞反应的强度指示所述肽或多肽水平，(b) 测量所述细胞反应。为了测量细胞反应，将样品或处理的样品，优选地，添加到细胞培养物，并且测量内部或外部的细胞反应。细胞反应可包括报告基因的可测量的表达，或物质的分泌，例如肽、多肽或小分子。表达或物质应产生与所述肽或多肽的水平相关的强度信号。

还优选地，肽或多肽的水平的测定包含测量可从样品中的肽或多肽获得的特异性强度信号的步骤。如上文所述，这样的信号可以是在质谱中观察到的对于肽或多肽特异性的m/z变量下观察到的信号强度，或对于肽或多肽特异性的NMR谱观察到的信号强度。

肽或多肽的水平的测定可以，优选地，包含以下步骤(a) 使多肽与特异性配体接触，(b) (任选地) 除去未结合的配体，(c) 测量结合配体的水平。结合的配体可产生强度信号。根据本发明的结合包括共价和非共价结合。根据本发明的配体可以是与本文所述肽或多肽结合的任何化合物，例如，肽、多肽、核酸或小分子。优选的配体包括抗体、核酸、肽或多肽，例如包含对于肽的结合结构域的所述肽或多肽及其片段的受体或结合配偶体，以及适体，例如核酸或肽适体。优选的配体是结合L-FABP，或结合选自肌酸酐、NGAL、KIM-1、胱抑素C和脂联素的标记物的配体。

制备这样的配体的方法是本领域中已知的。例如，商业供应者也提供适合的抗体或适体的鉴定和生产。本领域技术人员熟悉开发这些配体的具有更高亲和力或特异性的衍生物的方法。例如，可在核酸、肽或多肽中引入随机突变。随后，可根据本领域中已知的筛选方案，例如噬菌体展示，测试这些衍生物的结合。如本文所述的抗体包括多克隆抗体和单克隆抗体及其片段，例如能够结合抗原或半抗原的Fv、Fab和F(ab)₂片段。本发明还包括单链抗体和人源化杂交抗体，其中将展示期望的抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人受体抗体的序列组合。供体序列通常将包含供体的至少抗原结合氨基酸残基，但也可包含供体抗体的其他结构和/或功能上相关的氨基酸残基。这样的杂交体可通过本领域中熟知的多种方法制备。优选地，所述配体或试剂特异性结合肽或多肽，优选L-FABP，或选自肌酸酐、NGAL、KIM-1、胱抑素C和脂联素的标记物。本发明所述的特异性结合是指配体或试剂不应与存在于待分析的样品中的另一种肽、多肽或物质(如I-FABP或H-FABP)实质上结合(“交叉反应”)。优选地，特异性结合的肽或多肽应比任何其他相关肽或多肽高至少3倍，更优选高至少10倍且甚至更优选高至少50倍的亲和力结合。如果它仍可明确地区分并测量，例如，根据其在Western杂交上的大小，或通过其在样品中相对更高的丰度，则可耐受非特异性结合。可通过本领域中已知的任何方法测量配体的结合。优选地，所述方法是半定量或定量的。用于测量多肽或肽的进一步的适合方法描述在下文中。

首先，配体的结合可直接测量，例如，通过NMR或表面等离子共振。其次，如果配体也充当目标肽或多肽的酶促活性的底物，则可以测量酶促反应产物(例如，可通过例如在Western杂交上测量切割的底物水平，而测量蛋白酶的水平)。或者，配体本身可展示酶促性质，并且“配体/肽或多肽”复合物或被肽或多肽结合的配体可分别与允许通过产生强度信号而检测的适合的底物接触。对于酶促反应产物的测量，优选底物水平是饱和的。还可以在反应前使用可检测的标记物标记底物。优选地，样品接触底物足够的时间段。足够的时间段是指产生可检测，优选可测量水平的产物所必需的时间。可测量出现给定(例如，可检测)水平的产物所需的时间，而不是测量产物的水平。第三，配体可以与允许检测和测量所述配体的标记物共价或非共价偶联。标记可以通过直接或间接的方法完成。直接标记包括标记物直接(共价或非共价)与配体偶联。间接标记包括第二配体与第一配体的结合(共价或非共价)。第二配体应特异性结合第一配体。第二配体可以与适合的标记物偶联和/或是结合至所述第二配体的第三配体的目标(受体)。通常使用第二、第三或甚至更高级别的配体以增加信号。适合的第二和更高级别的配体可包括抗体、第二抗体和熟知的链霉亲和素-生物素系统(Vector Laboratories, Inc.)。也可使用本领域中已知的一个或多个标签将配体或底物“标签化”。这样的标签可随后成为更高级别配体的目标。适合的标签包括生物素、地高辛、His-标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc-标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白等。在肽或多肽的情况下，所述标签优选在N-末端和/或C-末端。适合的标记物是可通过适当的检测方法检测的任何标记物。典型的标记物包括金颗粒、胶乳颗粒、二氢吖啶酯、鲁米诺、钌、酶促活性标记物、放射性标记物、磁性标记物(“例如磁珠”，包括顺磁性和超顺磁性标记物)，和荧光标记物。酶促活性标记物包括，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶及其衍生物。用于检测的适合的底物包括二氨基联苯胺(DAB)、3,3'-5,5'-四甲基联苯胺、NBT-BCIP (4-硝基蓝四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐，可作为即用型储液而得自Roche Diagnostics)、CDP-Star™ (Amersham Biosciences)、ECF™ (Amersham Biosciences)。适合的酶-底物组合可产生有色的反应产物、荧光或化学发光，其可根据本领域中已知的方法测量(例如，使用光敏感的膜或适合的摄像系统)。对于酶促反应的测量，近似地应用上文给出的标准。典型的荧光标记物包括荧光蛋白(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德州红、荧光素和Alexa染料(例如Alexa 568)。进一步的荧光标记物可得自，例如Molecular Probes (Oregon)。还预期到量子点作为荧光标记物的用途。典型的放射性标记物包括35S、125I、32P、33P、14C、3H等。放射性标记物可以通过任何已知且适当的方法检测，例如光敏感的膜或磷光显像仪，或通过闪烁计数。根据本发明适合的测量方法还包括沉淀法(特别是免疫沉淀)、电化学发光(电产生的化学发光)、RIA (放射免疫测定)、ELISA (酶联免疫吸附测定)，夹心酶免疫测试、电化学发光夹心免疫测定(ECLIA)、解离增强镧系荧光免疫测定(DELFIA)、闪烁亲近测定(SPA)，FCM (流式细胞术)，FRET (荧光共振能量转移)、-比浊法、浊度法，胶乳增强比浊法或浊度法，或固相免疫试验。本领域中已知的进一步方法(例如，凝胶电泳、2D凝胶电泳、SDS聚丙烯酸凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western杂交和质谱)可单独使用，或与标记或上文所述的其他检测方法组合使用。

肽或多肽的水平还优选如下测定：(a) 使包含用于上文指定的肽或多肽的配体的固体支持物接触包含所述肽或多肽的样品，和(b) 测量与所述支持物结合的肽或多肽的水平。所述配体，优选地选自核酸、肽、多肽、抗体和适体，优选地以固定的形式存在于固体支持物上。用于制造固体支持物的材料是本领域中熟知的，并且包括尤其是商购可得的柱材料、聚苯乙烯珠、胶乳珠、磁珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅芯片和表面，硝酸纤维素条、膜、片，duracytes、反应盘的孔和壁，塑料管等。配体或试剂可结合至很多不同的载体。熟知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和改性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。出于本发明的目的，载体的性质可以是可溶的或不溶的。用于固定/固化配体的适合的方法是熟知的并且包括但不限于离子、疏水、共价相互作用等。还预期使用“悬浮液阵列（array）”作为根据本发明的阵列(Nolan 2002, Trends Biotechnol. 20(1):9-12)。在这样的悬浮液阵列中，载体，例如微珠或微球，存在于悬浮液中。所述阵列由带有不同配体的不同的微珠或微球组成，它们可能是标记的。生产这些阵列(例如基于固相化学或光不稳定保护集团)的方法是普遍已知的(US 5,744,305)。

如本文使用的术语“水平”包括样品中多肽或肽的绝对量，样品中多肽或肽的相对水平如浓度，以及与其相关或可由其导出的任何数值或参数。这样的数值或参数包括来自通过直接测量而从所述肽获得的所有特异性物理或化学性质的强度信号数值，例如在质谱或NMR谱中的强度数值。此外，包括从本说明书他处指定的间接测量获得的所有数值或参数，例如从生物读出系统测定的响应所述肽的响应水平，或从特异性结合配体获得的强度信号。可理解，也可通过所有标准数学运算获得与上述水平或参数相关的数值。

如本文中使用的表述“将第一样品中的水平与第二样品中的水平进行比较”，在本发明的背景中包括将第一样品中的L-FABP水平与第二样品中的标记物的水平进行比较。术语“第一样品”和“第二样品”在本文上述中说明。

如本文使用的术语“比较”是指相应参数或数值的比较，例如将绝对水平与绝对参照水平进行比较，而将浓度与参照浓度进行比较，或者将得自于测试样品的强度信号与参照样品的相同类型的强度信号进行比较。本发明的方法的步骤(b)中所涉及的比较可以手动进行或由计算机辅助进行。对于计算机辅助的比较，可通过计算机程序将测定水平的数值与对应于存储在数据库中的适合的参照的数值进行比较。计算机程序可进一步评估比较的结果，即自动提供适合的输出格式的期望评估。基于在步骤a)中测定的水平与参照水平的比较，可评估个体是否患有与急性事件或外科手术相关的肾损伤。因此，选择参照水平，使得比较的水平中的差异或类似性允许诊断肾损伤，并且，由此鉴定那些患有(划入)还是没有(排出)与急性事件或外科手术相关的肾损伤的个体。同样，在基于步骤a)中测定的水平与参照水平的比较而预测个体患上肾损伤的风险的方法中，可预测个体是否有在将来患上与急性事件或外科手术相关的肾损伤的风险。因此，选择参照水平，使得比较的水平中的差异或类似性允许预测所述风险，并且，由此用于鉴定具有患上肾损伤的显著风险(划入)或不具有显著风险(排出)的那些个体。

如上文所述，在优选的实施方式中，肾损伤的诊断是优选地基于第一样品中L-FABP水平与在第一样品之前分离的第二样品中的L-FABP水平的比较。基于这样的系列样品测量的诊断例如可用于展示高于健康个体的水平特征但低于上述指示肾损伤的参照水平的标记物(例如L-FABP)水平的个体。

在本发明的背景中，如本文使用的术语“约”是指给定测量或数值的+/- 20%，优选+/-10%，优选+/-5%。

在本发明的第二方面，提供了用于预测个体在将来的急性事件后或外科手术后患上肾损伤的风险的方法，其包括以下步骤：

a) 测定从个体分离的第一血液样品中的L-FABP或其变体的水平，其中所述样品在所述事件后或外科手术后10小时之内分离；和

b) 将步骤a)中测定的水平与参照水平比较； 其中，等于或大于参照水平的L-FABP水平表示个体患上肾损伤的风险。

优选地，所述方法进一步包括基于步骤b)的比较预测个体风险的步骤。

除非不同地说明，上文提供的解释和定义加以必要的变更而应用于所述用于预测个体在将来的急性事件后或外科手术后患上肾损伤的风险的方法。

如本文使用的表述“预测个体在将来的急性事件后或外科手术后患上肾损伤的风险”是指评估个体在将来，即在分离形成评估基础的样品后的预测窗口内，患上肾损伤的可能性。根据本发明，所述预测时间窗口，即术语“将来”的含义优选地是在外科手术后或急性事件后约1小时，至多达约2小时，至多达约4小时，至多达约6小时，至多达约8小时，至多达约10小时，至多达约12小时，至多达约1天，至多达约2天，至多达约3天，至多达约4天，至多达约5天，至多达约6天，或至多达约1周，根据具体情况而定。优选地，所述术语涉及预测与在个体人群中发生肾损伤的平均风险相比，是否有升高的肾损伤风险，而不是给出风险的精确可能性。

在本发明的背景中术语“外科手术后”，外科手术后的时间可以从以下时间计算：(i) 个体进入进行外科手术的房间，(ii) 第一医师完成个体的既往病历的时间，(iii) 开始外科手术，例如实施麻醉时，(iv) 外科手术已完成，(v) 个体从进行外科手术的房间转出，(vi) 个体在完成外科手术后到达重症监护室，(vii) 个体到达病房，或(vii) 个体离开进行手术的公共机构、办事处或医院，(ix) 且最优选地，个体的呼吸辅助停止。

在用于预测个体患上肾损伤的方法的背景中，如本文使用的术语“参照水平”，优选地，是指允许预测个体在将来的急性事件后或外科手术后患上肾损伤的风险的水平。优选地，参照水平的测定是基于从至少一个参照个体或从参照群体分离的生物标记物(优选L-FABP)水平，所述参照群体：

- 具有急性事件或经历外科手术且在预测时间窗口内发生肾损伤，或

- 具有急性事件或经历外科手术且在预测时间窗口内没有发生肾损伤，或

- 不具有急性事件或没有经历外科手术且在预测时间窗口内没有发生肾损伤。

优选地，来自参照个体或参照个体的组的样品已经在急性事件期间或之后，或外科手术期间或之后分离，优选来自在所述急性事件后或所述外科手术后约10小时内分离的样品，根据具体情况而定。优选地，来自从中导出参照水平的参照个体(或参照个体的组)的样品与来自测试个体的测试样品是在关于所述急性事件或外科手术的相同时间段内分离，更优选地，在基本相同的时间点分离。此外，参照水平的测定还可基于已知来自已知为生理健康的个体或个体的组的样品。

在本发明的另一个实施方式中，额外地测定第二血液样品中的L-FABP水平，所述第二血液样品在第一样品之前分离，优选在外科手术之前或期间分离。第一血液样品中的L-FABP水平等于或大于第二血液样品的水平指示患上肾损伤的(显著或高)风险。反之亦然，第一血液中L-FABP水平低于第二血液样品的水平表示个体不具有患上肾损伤的(低或可忽略的)风险。

通常，为了测定允许建立根据本发明各个实施方式的期望预测的各个水平或水平比例，("阈值"，“参照水平”)，在上文定义的适当参照个体中测定各个肽或多个肽的水平或水平比例。收集所得结果并通过本领域技术人员已知的统计学方法进行分析。随后，根据在将来患病的期望可能性确定所得的阈值数值，并关联到具体阈值数值。例如，为了建立阈值数值，选择健康和/或非健康个体集体的中值、第60、第70、第80、第90、第95或甚至第99百分位作为参照水平，是有用的。

为了测试所选择的参照水平是否产生关于患者具有在将来患上肾损伤的风险的足够安全的预测，可例如使用以下等式测定本发明的方法对于给定的参照数值的功效(E)：

E = (TP / TO) x 100；

其中，TP = 真阳性且TO = 测试的总数 = TP + FP + FN + TN，其中FP = 假阳性；FN = 假阴性，且TN = 真阴性。E具有以下数值范围：0 < E < 100)。优选地，测试的参照水平产生足够安全的诊断，前提是E的数值是至少约50，更优选至少约60，更优选至少约70，更优选至少约80，更优选至少约90，更优选至少约95，更优选至少约98。

在本发明预测方法的背景中，对于指示个体将来具有患上肾损伤(优选AKI)的风险的L-FABP的优选参照水平是至少约13 ng/ml，或更优选至少约15 ng/ml，最优选约17 ng/ml。或者，参照水平对应于与参照人群的至少约第80百分位，优选至少约第85百分位，优选至少约第90百分位，优选至少约第95百分位，优选至少约第99百分位，所述百分位可以是特异性，例如从各自的ROC分析导出。

优选地，高于参照水平的L-FABP-水平的测定水平指示在将来患上肾损伤的提高的或高风险。例如，提高或高风险可以是有至少约50%，至少约60%，至少约70%，至少约80%，至少约90%，至少约95%，至少约99%的可能性，所述个体在将来(即，在预测时间窗口内)将发生肾损伤。

在另一个实施方式中，额外地在从所述个体分离的第一和/或第二样品中测定选自肌酸酐、NGAL、KIM-1、胱抑素C和脂联素的标记物的水平。

优选地，相比于第二样品中的L-FABP水平，第一样品中的L-FABP的水平提高，更优选地，水平显著提高，伴随相比于第一样品中的L-FABP水平，在另一个样品中选自肌酸酐、NGAL、KIM-1、胱抑素C和脂联素的标记物的水平提高，且更优选水平显著提高，是诊断个体中与急性事件或外科手术相关的肾损伤(或其风险)的指征。

在本发明的另一个实施方式中，所述方法进一步包括选择或调整用于在急性事件后或在外科手术后患上肾损伤或具有患上肾损伤的风险的个体的肾疗法的步骤。

可理解，上文和下文对术语的定义和解释加以必要的变更而应用于本说明书和后附权利要求书中描述的所有实施方式(除非不同地说明)。

在本发明的第三方面，提供了选择用于在急性事件后或在外科手术后患上肾损伤或具有患上肾损伤的风险的个体的肾疗法的方法，其包括以下步骤：

a) 测定从个体的第一血液样品中的L-FABP或其变体的水平，其中所述样品在所述事件后或外科手术后10小时之内分离；和

b) 将步骤a)中测定的水平与参照水平比较；

其中基于步骤b)的比较选择肾疗法。

所述肾疗法尤其包括施用或避免肾毒性药物或治疗。

此外，还设计一旦已经作出肾损伤的诊断和/或摄入流体，就监测血压。在血压升高的情况下，应施用降低血压的药物，或者在血压降低的情况下，应应用提高血压的方法或药物。此外，在已经确定肾损伤诊断的个体中，仔细的流体平衡是重要的。

在本发明的优选实施方式中，在诊断为具有肾损伤或具有在将来患上肾损伤的风险的患者中，通过减少或终止施用肾毒性药物或治疗，通过增加、减少或终止摄入或排泄流体，或通过调整治疗以降低或升高血压来调整肾疗法。

在本发明方法的优选实施方式中，所述方法进一步包括推荐疗法的步骤。

如本文使用的术语“推荐”是指确定可应用于个体的疗法的提议。然而，可理解优选所述术语不包括应用的实际疗法，无论是什么疗法。所推荐的疗法取决于通过本发明方法提供的诊断结果。优选地，一旦以做出肾损伤的诊断或预测，则应避免肾毒性药物。具体地，还设计一旦已经作出肾损伤的诊断或预期，就监测血压。在血压升高的情况下，应施用降低血压的药物，或者在血压降低的情况下，应应用提高血压的方法或药物。

此外，本发明设计了适合用于实施本发明的方法的试剂盒，包含用于生物标记物L-FABP的结合配体的设备。此外，所述试剂盒可进一步包括生物标记物L-FABP和/或用于实施所述方法的仪器。所述试剂盒可进一步包括用于L-FABP的定量测定的设备。

如本文使用的术语“试剂盒”是指上述组分的集合，优选单独地提供或在单个容器内提供。所述容器还包含用于实施本发明方法的说明书。这些说明书可以是手册的形式，或者可通过计算机程序代码提供，其在计算机或数据处理设备上执行时，能够进行本发明方法中所述的比较并且据此确定诊断。所述计算机程序代码可以提供在数据储存介质或设备上，例如光学存储介质(例如光盘)，或直接地在计算机或数据处理设备上提供。此外，所述试剂盒可优选地包含标准品、参照样品和对照样品。

本发明的另一个实施方式是结合抗体的L-FABP或其变体用于诊断急性事件后或外科手术后的个体中的肾损伤，或用于预测个体在将来的急性事件后或外科手术后患上肾损伤的风险的体外用途，其中检测血液样品中的L-FABP水平，所述样品在所述急性事件后或所述外科手术后约10小时内分离。

本发明的另一个实施方式是结合抗体的L-FABP或其变体用于选择、决定或调整用于在急性事件后或外科手术后患有肾损伤，与在将来的急性事件后或外科手术后患上肾损伤的风险相关的个体的肾疗法的体外用途，其中检测血液样品中的L-FABP水平，所述样品在所述急性事件后或所述外科手术后约10小时内分离。

此外，本发明涉及适合用于实施本发明用于诊断或预测与急性事件或外科手术相关的肾损伤的方法的设备，其包括：

a) 分析单元，其包含特异性结合L-FABP的结合配体，所述单元适合用于测定在来自个体的第一和第二样品中的L-FABP水平；和

b) 评价单元，其用于将第一样品中的测定水平与第二样品中的水平进行比较，从而可诊断与急性事件或外科手术相关的AKI，所述单元包括具有第一样品中的L-FABP水平相比于第二样品的比例的数据库，所述比例优选地来自已知已发生与急性事件或外科手术相关肾损伤的个体或个体的组，或更优选地来自已知没有发生与急性事件或外科手术相关的肾损伤的个体或个体的组，和用于实施比较步骤的计算机实现的算法。

可理解，上文和下文对术语的定义和解释加以必要的变更而应用于本说明书和后附权利要求书中描述的所有实施方式(除非不同地说明)。

在上述设备的背景中，参照水平优选来自如上文定义的(参照)个体的样品。

如本文使用的术语“设备”是指包含彼此可操作地连接的上述单元，以允许根据本发明方法的诊断或监测的系统。可用于分析单元的优选检测试剂公开在本文其他地方。优选地，所述分析单元包含在固体支持物上的固定形式的检测试剂，所述固体支持物将接触包含水平待测定的生物标记物的样品。此外，所述分析单元还可包含检测器，其测定特异性结合所述生物标记物的结合配体的水平。测定的水平可转入评价单元。评价单元包含数据处理元件，例如计算机，带有用于实施测定水平和适合的参照(例如，参照水平，或在来自个体的第一或第二样品中的标记物的水平)之间的比较的实现算法。适合的参照可来自将用于产生参照水平的个体的样品，如上文其他部分所述。结果可作为参数诊断原始数据的输出值给出，优选作为绝对或相对水平。可理解，这些数据将需要临床医生的解释。然而，还预计到专家系统设备，其中所述输出值包括处理的诊断原始数据，其解释不需要专门的临床医生。

本说明书中引用的所有文献，就其全部公开内容和在本说明书中具体提到的公开内容，通过引用并入本文。

附图说明

图 1 ：

用于测定从两组个体分离的血液样品中的L-FABP水平的ROC分析，其中一组在心脏手术后发生AKI且另一组没有发生，其中所述样品在外科手术后2小时分离。AUC (曲线下面积)是0.70 (手术后2小时)。

图 2 ：

用于测定从两组个体分离的血液样品中的L-FABP水平的ROC分析，其中一组在心脏手术后发生AKI且另一组没有发生，其中所述样品在外科手术后4小时分离。AUC (曲线下面积)是0.70 (手术后4小时)。

图 3 ：

用于测定从两组个体分离的血液样品中的L-FABP水平的ROC分析，其中一组在心脏手术后发生AKI且另一组没有发生，其中所述样品在外科手术后24小时分离。AUC (曲线下面积)是0.80 (手术后24小时)。

图 4 ：

血浆或血清中L-FABP水平的比较。在相同的时间点采集32份人血液到2个分离的管中，分别处理成血清或EDTA-血浆，并测试L-FABP。Pearson相关性为r=0.999。图中的实线代表角平分线。

图 5 ：

在患有AKI和没有患上AKI (无AKI)的患者中，在心脏手术后血浆中的L-FABP的比较。长方形的末端分别显示第25或第75百分位，并且触须(whiskers)放置到第5或第95百分位。长方形内的线显示中值。使用Wilcoxon测试计算组之间差异的显著性水平。

图 6 ：

在没有患上AKI (无AKI)的患者和患有AKIN 1或AKIN 2或3的患者中，在心脏手术后血浆中的L-FABP的比较。在手术前的时间点，不同组的L-FABP水平没有区别。在手术后2小时，AKIN 1和AKIN 2或3的L-FABP水平与无AKI相比显著升高。在手术后4小时和24小时，AKIN 1和AKIN 2或3的L-FABP水平与无AKI相比显著升高。此外，AKIN 1显著不同于AKIN 2或3，显示肾损伤的严重性与血浆中L-FABP水平相关。

以下实施例仅用于说明本发明。它不应以任何方式限制本发明的范围。

实施例1

患者，材料和方法

研究描述107位患者接受心脏手术(旁路或瓣膜置换)。在手术前日(手术前)以及手术后2小时、4小时、24小时、3天且在一些病例中在手术后7天从所有患者采集血液样品。时间点0定义为呼吸辅助(即心肺机)关闭。在离心后，将EDTA-血浆或血清在-80°C贮存直至测试。

入选标准：使用心肺机的心脏手术，来自手术前日的样品，知情同意，>18岁。

排除标准：无知情同意，没有来自手术前日的样品，<18岁，怀孕。

样品测定

来自R&D Systems的试剂盒(商品号Z-001)用于血浆样品中的L-FABP的定量测定。测定使用形成夹心测定的两种L-FABP特异性小鼠单克隆抗体，描述在Kamijo, A.等人，J Lab Clin Med 2004, 143, 23-30。hL-FABP特异性单克隆抗体的产生描述在Kamijo, A.等人，AJP October 2004, Vol. 165, No. 4, 1243-1255。

分析

当其血清肌酸酐水平在手术后3天内比个体的手术前水平升高至少50%或0.3 mg/dL时，患者被回溯诊断为患有AKI (AKIN定义)。

使用非参数Wilcoxon测试，分析在上述5个时间点，AKI和无AKI组之间生物标记物水平的差异。使用ROC分析(受试者工作曲线拟合)计算敏感性和特异性。

结果

使用基于血清肌酸酐的AKIN标准，在接受心脏手术的107名患者中，检测到73名无AKI的患者，而34名患者在3天内发生AKI。

在其使用肌酸酐明显可见之前，分析来自血浆样品的L-FABP用于诊断AKI的适用性。从图5明显可见的是，基于血浆L-FABP的检测允许早至在手术后(post-OP) 2小时强效且非常早期诊断AKI。显著地，在本研究中，血浆L-FABP允许在已确立的肾功能测试，例如基于肌酸酐的测定之前很久，对具有急性肾损伤的提高风险的患者亚组进行早期鉴定。这种早期鉴定在本发明之前是不可能的。

在手术后早至2小时以及晚于该时间点，诊断为AKI的个体中的L-FABP在血浆中已相对于无AKI个体显著升高。

Claims (15)

1.用于诊断急性事件后或外科手术后的个体中的肾损伤的方法，其包括以下步骤：

a) 测定从个体分离的第一血液样品中的肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的水平，其中所述样品在所述急性事件后或所述外科手术后约10小时之内分离；和

b) 将步骤a)中测定的水平与参照水平比较；

其中至少等于或大于所述参照水平的L-FABP或其变体的水平表示肾损伤。

2.根据权利要求1的方法，其中所述急性事件选自事故、烧伤或外伤。

3.根据权利要求1或2的方法，其中所述外科手术选自心脏手术、心肺手术和与呼吸支持的使用相关的手术。

4.根据权利要求1-3中任一项的方法，其中L-FABP的参照水平是至少约13 ng/ml，或对应于健康人群至少约80%百分位的L-FABP水平。

5.根据权利要求1-4中任一项的方法，其中额外地在从所述个体分离的所述第一样品和/或第二样品中测定选自肌酸酐、NGAL、KIM-1、胱抑素C和脂联素的标记物的水平。

6.根据权利要求1-5中任一项的方法，其中所述血液样品选自全血、血浆和血清。

7.根据权利要求1-6中任一项的方法，其中在外科手术的情况下，额外地测定第二血液样品中的L-FABP水平，所述第二血液样品在所述第一样品之前分离，优选在所述外科手术或所述急性事件之前或期间分离，所述第一样品的L-FABP水平相比于第二血液样品的L-FABP水平增加至少约2.5倍指示肾损伤。

8.根据权利要求1-7中任一项的方法，其中所述第一血液样品在所述急性事件后或所述外科手术后约2小时、约4小时、约6小时、约8小时和约10小时的间隔内分离。

9.用于预测个体在将来的急性事件后或在外科手术后患上肾损伤的风险的方法，其包括以下步骤：

a) 测定从个体分离的第一血液样品中的L-FABP或其变体的水平，其中所述样品在所述事件后或外科手术后10小时之内分离；和

b) 将步骤a)中测定的水平与参照水平比较；

其中，等于或大于参照水平的L-FABP水平表示个体患上肾损伤的风险。

10.根据权利要求9的方法，其中L-FABP的参照水平是至少约13 ng/ml，或对应于参照人群至少约80%百分位的L-FABP水平。

11.选择用于在急性事件后或在外科手术后患有肾损伤或具有患上肾损伤的风险的个体的肾疗法的方法，其包括以下步骤：

a) 测定从个体的第一血液样品中的L-FABP或其变体的水平，其中所述样品在所述事件后或外科手术后10小时之内分离；和

b) 将步骤a)中测定的水平与参照水平比较；

其中基于步骤b)的比较选择肾疗法。

12.根据权利要求11的方法，其中所述肾疗法选自调整肾毒性药物或治疗的施用，调整流体的摄取或排泄和调整血压。

13.试剂盒，其用于诊断在急性事件后或外科手术后的个体中的肾损伤，或用于预测个体在将来的急性事件后或外科手术后患上肾损伤的风险，或用于选择用于在急性事件后或在外科手术后患有肾损伤或具有患上肾损伤的风险的个体的肾疗法，其包括：用于测定L-FABP或其变体的水平的一种或多种配体，优选进一步包含L-FABP或其变体。

14.结合抗体的L-FABP或其变体的体外用途，其用于在从个体分离的样品中诊断急性事件后或外科手术后的个体中的肾损伤，或用于预测个体在将来的急性事件后或外科手术后患上肾损伤的风险，其中检测血液样品中的L-FABP或其变体水平，所述样品在所述急性事件后或所述外科手术后约10小时内分离。

15.适合用于实施权利要求1-12的方法的设备，其包括：

a) 分析单元，其包含结合抗体的L-FABP，所述单元适合用于测定在来自个体的第一样品和第二样品中的L-FABP水平；和

b) 评价单元，其用于将第一样品中的测定水平与第二样品中的水平进行比较，从而可诊断与急性事件或外科手术相关的肾损伤，所述单元包括具有第一样品与第二样品中的L-FABP水平比例的数据库，和用于实施比较步骤的计算机实现的算法。