CN102939541B - 手术后急性肾损伤的预测和识别 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在受试者中预测由手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险的方法，包括以下步骤：a)在受试者的尿样中测定肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)的量；b)比较在步骤a)中测定的量和参考量；和c)基于在步骤b)中进行的比较预测风险。此外，本发明涉及用于实施所述方法的设备和试剂盒。

Description

手术后急性肾损伤的预测和识别
本发明涉及诊断方法和工具(means)。特别地，其涉及预测个体中急性肾损伤(AKI)的风险的方法，所述个体将接受手术干预，优选心脏干预，特别是冠状旁路手术。同样地，本发明涉及预测已经历手术干预，优选心脏干预，特别是冠状旁路手术的个体中急性肾损伤的风险的方法，以及诊断已经历手术干预，优选心脏干预，特别是冠状旁路手术的患者中急性肾损伤的方法。此外，本发明涉及用于实施所述方法的设备，试剂盒和决定在手术干预后患有AKI的患者中合适疗法的方法。
本领域技术人员已知，急性肾损伤代表临床医学中的重大问题。5％的住院患者和多达30％的特护病房中的患者将发展出急性肾损伤。在AKI中，血清肌酸酐水平缓慢上升并且在肾损伤变得明显以前可达2-3天，一般由至少0.3mg/dl的肌酸酐增加或高于基线50％的增加指示(Devarajan，ExpertOpinionMedDiagn2008，2：387-398)。此论文的作者指出迫切需要急性肾损伤的早期指示物。
若干出版物报导了与AKI相关的多种肽标记物，例如Liangos等人(Biomarkers200914：423-431)已指出早在心肺手术后2小时，肽KIM-1和NGAL水平增加，指示AKI。作者报导KIM-1偏向在AKI组中增加，而NGAL不可区分AKI患者和没有AKI的患者。Han等人(ClinJ.AmSocNephrol2009，4873-882)使用相同的生物标记物得到类似的结果。Portilla等人在儿科人群和心脏手术4小时后可在发展出AKI的患者中观察到L-FABP的增加，但在没有AKI的患者中未观察到，见KidneyInternational(2008)73，465-472。
手术后AKI的发病机理似乎是多因素的，且其与提高的发病率和长期死亡率的联系是广为接受的(Brown等人AnnThoracSurg2008，86：4-11)。
在由于冠状动脉粥样硬化的位置或程度而不能实施经皮冠状干预的患者中偏向实施冠状旁路手术。此干预与显著的AKI风险相关，据描述此风险范围在10至20％之间，其中1至5％百分比的这些个体需要透析(Mehta，Circulation2006：1142208-16)。
在本发明申请人在2009年4月30日提交的，申请号为EP09159234.5的未预公布的专利申请“Meansandmethodsfordiagnosingaheartfailureassociatedkidneydamageinindividualsinneedofasuitabletherapy”中显示，患有心脏衰竭的患者在其尿中具有增加的L-FABP和KIM1水平，且这些肾小管损伤/修复标记物的浓度与NT-proBNP(与心脏衰竭明显相关的尿钠排泄的肽)的水平明显相关。
Kamijo等人(Urinaryliver-typefattyacidbindingproteinasausefulbiomarkerinchronickidneydisease.Mol.CellBiochem.2006；284)报导，L-FABP的尿排泄可反映导致肾小管间质损伤的多种胁迫，并可作为慢性肾病发展的有用的临床标记物。
通过在手术期间小心维持液体平衡，并避免AKI的其他诱发因素，例如在手术前中断ACE抑制剂、NSAID和其他已知导致肾损伤的药物，和小心使用利尿剂，特别是袢利尿剂，可在已知处于提高的风险的患者中预防AKI。详情总结在BritJ.ofHospitalMedicine，2008，69，450-454(详见表2和3)中。
识别急性肾损伤的早期证据是重要的，特别是在经常早期出院的低风险人群中。尽管如果早期诊断和治疗，许多案例是可逆转的，总体存活率仍保持在约50％，因为许多患有AKI的患者具有严重的潜在疾病，例如脓毒症、呼吸衰竭。死亡经常是由这些疾病导致的，而不是肾衰竭自身。在约10％的案例中需要透析或移植，由于及时治疗或由于肾功能缓慢恶化。如果治疗适当和及时，可完全逆转AKI。如上所述，肾功能也可能恶化为慢性肾衰竭。治疗可包括肺水肿和高钾血症的及时治疗；透析；药物方案的调整，限制水、钠和钾摄取，磷结合剂和聚磺苯乙烯钠。
因此，迫切需要预测在手术干预后，优选心脏干预后，更优选心血管干预后，特别是冠状旁路手术后个体患上AKI的风险的方法和工具。也需要提供基于在实施手术干预前得到的样品的分析来预测在手术治疗后个体患上AKI的风险的工具。
构成本发明的技术问题可被视为提供满足至少一个上述需求的工具和方法。本发明通过在权利要求书和下文中表征的实施方案解决此技术问题。
因此，本发明涉及预测在受试者中进行手术干预后受试者经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险的方法，所述方法基于比较在所述受试者的样品中，优选地在受试者的尿样中测定的肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体，又称尿肝型脂肪酸结合蛋白的量和至少一个参考量。
本发明的方法包括以下步骤中的至少一个和/或可包括以下步骤：a)测定受试者的样品中，优选尿样中肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体，优选尿肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)的量；b)比较在步骤a)中测定的量和参考量；c)基于在步骤b)中进行的比较预测风险。
因此，在一个实施方案中本发明提供了在受试者中预测受试者在手术干预后经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险的方法，包括以下步骤：
a)测定受试者的样品中，优选尿样中肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体，优选尿肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的量；
b)比较在步骤a)中测定的量和参考量；和
c)基于在步骤b)中进行的比较预测风险。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了在受试者中预测受试者在手术干预后经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险的方法，包括以下步骤：
a)测定受试者的样品中，优选尿样中肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体，优选尿肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的量；和
b)比较在步骤a)中测定的量和参考量；
由此预测受试者在手术干预后经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险。
在本发明的优选的实施方案中，除了L-FABP或其变体的量以外，在样品中，优选尿样中测定脂连蛋白或其变体的量，并基于标记物量与参考量的比较来预测风险。
在本发明的其他优选实施方案中，在尿样中测量选自白蛋白或其变体和中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(NGAL)或其变体的至少一种其他标记物的量，并基于标记物量与参考量的比较来预测风险。在此实施方案中，将测量除了L-FABP或其变体以外的来自上述组的仅一种额外的标记物的量，优选脂连蛋白或其变体的量，或除了L-FABP或其变体以外的两种额外的标记物的量，优选脂连蛋白或其变体的量。
优选地，在手术干预前预测风险。本发明也包括在手术干预后预测风险的情况。
此外，本发明涉及决定先前定义的受试者患者中的合适疗法的方法，监控疗法的方法，和用于实施本发明的方法的设备和试剂盒。
本发明的方法优选地为体外方法。此外，在适当情况下其可包括除了上面明确描述的步骤以外的步骤。例如，另外的步骤可涉及样品预处理或评估通过所述方法得到的结果。
优选地在各个受试者的尿样中测定在本发明上下文中测定的标记物(即L-FABP或其变体和任选地，脂连蛋白或其变体和任选地，白蛋白或其变体，和任选地，NGAL或其变体)的量。视情况而定，也可在各个受试者的血液、血浆或血清样品中测定(一个或多个)标记物。
可与术语“急性肾损伤AKI相关不良事件”互换使用的术语“与急性肾损伤AKI相关的不良事件”指本领域技术人员公知的在患有AKI的个体中发生的事件/并发症。所述术语优选地包含AKI自身、需要透析和死亡。在经历手术的患者的情况下，将急性肾损伤定义为在3天内至少0.3mg/dl的肌酸酐的增加。因为肌酸酐增加的延迟，经常较晚得出此最终诊断。肾功能损伤的早期症状是尿量的减少。血管内血容量减少可模仿急性肾损伤，在这种情况下应用液体导致利尿的快速恢复。如果少尿发展为无尿(无或很少的尿排泄)和取决于无尿的持续时间，出现血管内容量超负荷，这可与心脏衰竭的临床症状相关，特别是在已存在心功能障碍的个体中。如果利尿剂和液体限制无效，则需要透析。对于开始透析没有明确建议，但是使用超过100mg/dl的血液尿素浓度、高钾血症或酸中毒用于开始透析的决定。如果需要，可通过胸部X线、超声心动图、超声和可能的CT扫描支持决策。
本文中使用的术语“预测”和“预测风险”指评估概率，根据所述概率受试者在未来将患上AKI相关不良事件，优选AKI、需要透析和/或死亡。优选地所述预测基于对实施手术干预以前的患者样品的分析。本领域技术人员将理解，此类评估通常不旨在对100％的待诊断受试者正确。但是，所述术语要求统计显著部分的受试者可被诊断出患有所述疾病(例如，在同期组群研究中的同期组群)。无需本领域技术人员再费周折，可使用多种熟知的统计学评估工具确定一部分是否是统计显著的，例如确定置信区间，确定p值，Studentt检验，Mann-Whitney检验等等。详见Dowdy和Wearden，StatisticsforResearch，JohnWiley&Sons，NewYork1983。优选的置信区间是至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或至少99％。P值优选地为0.1、0.05、0.01、0.005或0.0001。
通常，在本申请别处说明的不良事件在3天内发生，例如1天、2天或3天，优选3天，如通过肌酸酐或GFR所确定的。
本文中使用的“监控”指保持追踪与AKI相关事件，特别是AKI自身或需要透析相关的各个个体的病理生理状态，疾病的出现和/或发展，或特定治疗对疾病发展的影响。本文中使用的诊断指分析和监控相关疾病。特别地，诊断的意思是分析器官的特定部分(例如肾的肾小球、肾小管和亨利袢)的病理学并评估损伤和修复(例如肾小管的情况)的程度。
本文中使用的术语“受试者”指动物，优选哺乳动物，和更优选地，人。但是，本发明设想受试者优选地应为表观健康的，特别是有关肾功能(基于肾小球滤过率(GFR)和/或血清肌酸酐)表观健康的。在本发明的上下文中，认为≥约60ml/min/1.73m2的GFR(即每1.73m2体表的滤过率)指示表观健康的受试者。在本发明的上下文中，认为≤1.3，优选≤1.2mg/dl的血清肌酸酐值指示表观健康的受试者。上面引用的血清肌酸酐的限制大体上对应检测方法的正常值的上限。
在本发明的上下文中，术语“表观健康”是本领域技术人员公知的，指未显示明显的潜在疾病症状的受试者。这里的疾病与损伤的肾功能相关，特别是有关GFR，例如基于肌酸酐清除率，特别是如上说明的肌酸酐上限。因此，受试者可能患有如下定义的损伤的肾功能，但优选地未显示明显症状使得所述损伤的肾功能可被诊断或评估出而无需内科医生的详细的诊断检查。特别地，在未显示明显的疾病症状的表观健康的受试者中诊断损伤的肾功能将需要专家(例如肾病学家)的诊断。在本发明的上下文中，术语“损伤的肾功能”也可指“肾病”。肾病的一个实例是“肾衰竭”。
本文中使用的术语“肾功能(kidneyfunction)”是本领域技术人员熟知的。其可与“肾功能(renalfunction)”互换使用，指肾的尿生产，控制和消除体内水分和体液，电解质和废物的体内平衡和过滤，和经常指促红细胞生成素合成的能力。
在本申请中使用的损伤的肾功能(肾衰竭)的首个暗示之一是在尿中存在蛋白质(微量或大量白蛋白尿)。
在肾衰竭中，肾功能不足，导致减少的尿产生，体内水分累积和体液紊乱，电解质和废物的累积(在健康的肾中通过过滤去除)。此外，经常观察到贫血，这是促红细胞生成素合成减少的后果。
使用基于血检和尿检的结果通过公式计算的值评估肾功能，一般是GFR(每分钟滤过肾的血容量)和/或肌酸酐清除率。
GFR是肾功能的最佳综合测量，以mL/min表示。在年轻健康成人中的正常GFR为约120至130mL/min/1.73m2并随年龄而减少，在70岁时为约75mL/min/1.73m2。用GFR＜60mL/min/1.73m2超过3个月定义慢性肾病。用于GFR测量的黄金标准是菊粉清除率。菊粉既不被肾小管吸收，也不由肾小管分泌，因此其是用于评估肾功能的理想标记物。但是其测量麻烦，因此大多数用于研究领域。
肌酸酐以恒定速率由肌肉代谢产生并自由滤过肾小球，并且其也由肾小管分泌。因为肌酸酐是被分泌的，在具有正常肾功能的人中肌酸酐清除率(CrCl)高估GFR约10至20％，在具有重度肾衰竭的人中高估达50％。
因为血清肌酸酐自身不足以评估肾功能，已经设计了若干公式使用肌酸酐和其他因素评估CrCl。可使用Cockcroft和Gault公式评估CrCl。其使用年龄、瘦体重和血清肌酸酐水平。其基于以下假设，即每日肌酸酐生产是28mg/kg/天，随年龄具有0.2mg/年的减少。
急性肾损伤(AKI)，以及慢性肾病(CKD)是本领域技术人员公知的，被通常认为指肾衰竭，通过GFR或肌酸酐清除率确定。
CKD被认为是肾功能的丧失，其可在几个月或甚至几年的时间内恶化。恶化的肾功能的症状不特定。在CKD中，肾小球滤过率显著降低，导致肾通过水和溶质过滤排泄废产物的能力降低。在CKD早期，肌酸酐水平可能是正常的。CKD是不可逆转的。CKD的严重度可分为5个阶段，阶段1是最轻微的，通常导致很少的症状。阶段5构成包括差的预期寿命的严重疾病，也被称为末期肾病(ESRD)，慢性肾衰竭(kidneyfailure)(CKF)或慢性肾衰竭(renalfailure)(CRF)。
急性肾损伤(AKI)，以前也称作急性肾衰竭(ARF)，是肾功能的快速丧失，其可源于多种原因，包括休克、低血容量、暴露于肾毒性化合物和尿道梗阻后的尿拥塞。与CKD相反，AKI是可逆转的。基于肌酸酐水平，尿指数如血尿素氮(BUN)，出现尿沉淀诊断AKI，也基于临床史诊断AKI。认为血清肌酸酐的进行性每日上升可诊断AKI。
AKI的特征在于肾小球滤过率在数小时至数天内的快速下降，特别是在3天内至少0.3mg/dl的下降。
AKI就其根本原因而言是异质性的，包括在肾灌注不足情况下出现的原因(肾前的)，在肾的主要区室中出现的原因(内在的或肾的)，和与尿路梗阻相关的原因(肾后的)。
AKI的肾前原因是使流到肾的有效血流量减少的原因。其包括全身性原因，例如低血容量、低血压和心脏衰竭，以及供给肾的血管的局部变化。后者包括肾动脉狭窄(肾动脉变窄)和肾静脉血栓形成(在肾静脉中形成血凝块)。更精确地，肾前原因包括血容量减少例如严重的出血，胃肠液损失(例如由腹泻导致)，肾液损失(例如由利尿剂导致)，血管外隔离(例如由烧伤或严重的血白蛋白减少导致)，或摄取减少(例如脱水)。改变的血液动力学也可能是肾前急性肾衰竭的原因，这包括低心输出量、全身性血管舒张、肾血管收缩、肾自身调节应答的损伤或肝肾综合征。
AKI的内在或肾的原因是在肾自身中出现的原因，包括分别由肾小球肾炎、急性肾小管坏死(ATN)和急性间质性肾炎(AIN)导致的肾小球、肾小管或间质的损伤。更精确地，内在或肾的原因包括肾动脉梗阻，肾小球或脉管系统的疾病，急性肾小管坏死(其包括感染，并且还包括药物例如造影剂、抗生素和化疗)，间质性肾炎和肾小管内梗阻。
AKI的肾后原因包括(输尿管、尿道和/或膀胱颈的)尿路梗阻。这可与良性前列腺增生、肾结石或梗阻的尿导管相关。
AKI的早期临床症状是少尿，具有低于400ml/天的减少的尿排出量，并伴随细胞外液超载。也可发现电解质和酸/碱异常，随后最终出现尿素和肌酸酐的增加。尽管可通过成像并特别地通过超声来诊断急性肾衰竭的肾后原因，急性肾衰竭的肾前和内在原因不能使用成像技术诊断。
假定在本发明的上下文中使用的标记物指示肾或其部分的特定种类的损害或损伤。假定L-FABP和NGAL是肾小管损伤的标记物。假定白蛋白和脂连蛋白是肾小球损伤的标记物。
在本发明的上下文中，术语“肾小管损害”指肾小管细胞的上皮损伤。优选地，肾小管损害是现有的心功能障碍和/或心血管疾病(包括冠状动脉疾病和心脏衰竭)的后果或在上述疾病以后出现。本发明优选地指慢性肾小管损伤。认为在肾小管损害中，肾小管细胞在心脏衰竭后变得局部缺血，但也认为肾小管完全或至少绝大部分或大部分地维持了其在肾内的功能。这表明肾功能未受伤害或仅受较低程度的伤害，使得诊断不出CKD或AKI。在肾小管损害中，肾小管细胞可能变得功能异常(一般通过坏死)并死亡。但是，在局部缺血后甚至在坏死后，肾小管上皮再生是可能的，在本发明的上下文中将其称为“肾小管修复”。由于本发明优选地指慢性肾小管损伤，类似地其指慢性肾小管修复或慢性肾小管损害中的肾小管修复。
在本发明的上下文中，术语“肾小球损害”指肾小球细胞的上皮损伤。优选地，肾小球损害是现有的心功能障碍和/或心血管疾病(包括冠状动脉疾病和心脏衰竭)的后果或在上述疾病以后出现。本发明优选地指慢性肾小球损伤。认为在肾小球损害中，肾小球细胞在心脏衰竭后局部缺血，但也认为肾小球完全或至少绝大部分或大部分地维持了其在肾内的功能。这表明肾功能未受伤害或仅较低程度的伤害，使得诊断不出CKD或AKI。在肾小球损害中，肾小球细胞可能变得功能异常(一般通过坏死)并死亡。但是，在局部缺血后甚至在坏死后，肾小球上皮再生是可能的，在本发明的上下文中将其称为“肾小球修复”。由于本发明优选地指慢性肾小球损伤，类似地其指慢性肾小球修复或慢性肾小球损害中的肾小球修复。
随着CKD的进展出现肾衰竭(慢性肾衰竭)。肾衰竭也作为AKI(急性肾衰竭)的后果出现。肾衰竭的严重阶段需要透析，根据情况可通过肾移植治疗。急性肾衰竭是可逆转的。AKI也可进展为死亡。
在此上下文下，认为术语“肾病”优选地指肾的或影响肾的，更具体地影响肾去除废物和/或超滤能力的任何疾病、损伤或功能障碍。肾病的实例包括先天性疾病和获得性疾病。
术语“肝型脂肪酸结合蛋白”(L-FABP，本文中经常又称为FABP1，也称为肝脂肪酸结合蛋白)指肝型脂肪酸结合蛋白多肽及其变体。肝型脂肪酸结合蛋白是在人肾的近端小管中表达的游离脂肪酸的细胞内载体蛋白。有关人L-FABP的序列，见例如Chan等人：HumanliverfattyacidbindingproteincDNAandaminoacidsequence，Functionalandevolutionaryimplications，J.Biol.Chem.260(5)，2629-2632(1985)或GenBankAcc.NumberM10617.1。
由于优选地在各个受试者的尿样中测定L-FABP，在本发明的上下文中，其也可被称为“尿肝型脂肪酸结合蛋白”或“尿”L-FABP。
术语“L-FABP”也涵盖L-FABP的变体，优选人L-FABP的变体。此类变体与L-FABP至少具有相同的基本生物学和免疫学性质，即它们结合游离的脂肪酸和/或胆固醇和/或类视黄醇，和/或参与细胞内脂类运输。特别地，如果它们能够由本说明书中提及的相同的特别的测定检测出(例如通过使用特异性识别L-FABP的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定)，则它们共享相同的基本生物学和免疫学性质。此外，应当理解，由于至少一个氨基酸的替换、缺失和/或添加，根据本发明提及的变体应具有不同的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸序列仍优选地与人L-FABP的氨基酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％或99％同一性。在本文别处说明了如何测定同一性程度。变体可为等位基因变体或任意其他种类的特定同系物、旁系同源物或直向同源物。此外，本文提及的变体包括L-FABP或上述类型变体的片段，只要这些片段具有如上提及的基本免疫学和生物学性质。此类片段可为，例如L-FABP的降解产物。还包括由于翻译后修饰(例如磷酸化或十四烷基化)而不同的变体。术语“L-FABP”优选地不包括心脏FABP，脑FABP和肠FABP。
脂连蛋白是脂肪细胞分泌的多肽(若干已知的脂肪细胞因子之一)。在本领域中，经常将脂连蛋白称为Acrp30和apM1。最近显示脂连蛋白具有多种活性，例如抗炎症、抗动脉粥样硬化、预防代谢综合征和胰岛素敏化活性。脂连蛋白由单个基因编码，具有244个氨基酸，其分子量为约30kDa。成熟的人脂连蛋白蛋白涵盖全长脂连蛋白的氨基酸19至244。认为球状结构域涵盖全长脂连蛋白的氨基酸107-244。脂连蛋白多肽的序列是本领域熟知的，例如在WO/2008/084003中公开。
脂连蛋白是脂肪细胞分泌的最丰富的脂肪因子。脂肪细胞是内分泌细胞，其释放游离脂肪酸并生产除脂连蛋白以外的若干细胞因子，例如肿瘤坏死因子(TNF)α、瘦素和白介素。
一般猜测脂连蛋白使身体对胰岛素敏感。在患有糖尿病和代谢综合征的患者中观察到降低的脂连蛋白血液水平，并认为其在胰岛素抗性中起关键作用(见例如Han等人JournaloftheAmericanCollegeofCardiology，Vol.49(5)531-8)。
脂连蛋白自身缔合为较大的结构。3个脂连蛋白多肽结合在一起并形成同源三聚体。这些三聚体结合在一起形成六聚体或十二聚体。已知脂连蛋白在血浆中以多种多聚体复合物存在，并通过其胶原结构域结合以产生3种主要的寡聚形式：低分子量(LMW)三聚体，中分子量(MMW)六聚体和高分子量(HMW)12-至18-聚体脂连蛋白(Kadowaki等人(2006)Adiponectinandadiponectinreceptorsininsulinresistance，diabetes，andthemetabolicsyndrome.JClinInvest.116(7)：1784-1792；RexfordS.Ahima，Obesity2006；14：242S-249S)。已报导脂连蛋白具有若干生理作用，例如针对动脉粥样硬化的保护活性，提高胰岛素敏感性和预防肝纤维化。
本文使用的脂连蛋白优选地指总脂连蛋白，其涵盖低分子量脂连蛋白、中分子量脂连蛋白和高分子量脂连蛋白。术语高分子量脂连蛋白、低和中分子量脂连蛋白和总脂连蛋白是本技术人员理解的。优选地，所述脂连蛋白是人脂连蛋白。测定脂连蛋白的方法公开在例如US2007/0042424A1以及WO/2008/084003中。在尿样中测定脂连蛋白的量。
根据本发明提及的脂连蛋白还涵盖如上所讨论的人脂连蛋白的所述特别序列的等位基因变体和其他变体。特别地，设想变体多肽在氨基酸水平上优选地与人脂连蛋白具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％或99％同一性。2个氨基酸序列之间的同一性程度可通过本领域熟知的算法测定。优选地，通过比较在比较窗口中的2个最佳比对序列来测定同一性程度，其中为了最佳比对，较之参考序列(其不包含添加或缺失)，在比较窗口中的氨基酸序列片段可包含添加或缺失(例如，缺口或突出端)。通过测定在2个序列中出现相同氨基酸残基的位置数得到匹配的位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的总位置数并将结果乘以100得到序列同一性百分比来计算百分比。用于比较的序列的最佳比对可通过Smith和WatermanAdd.APL.Math.2：482(1981)的局部同源性算法，Needleman和WunschJ.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性比对算法，Pearson和LipmanProc.Natl.Acad.Sci.(USA)85：2444(1988)的寻找相似性的方法，这些算法的计算机实现(WisconsinGenetics软件包中的GAP，BESTFIT，BLAST，PASTA和TFASTA，GeneticsComputerGroup(GCG)，575ScienceDr.，Madison，WI)，或目测进行。如果已鉴定了用于比较的2个序列，优选使用GAP和BESTFIT测定其最佳比对，并因此测定同一性程度。优选地，使用缺口权重5.00和缺口权重长度0.3的默认值。上面提及的变体可为等位基因变体或任意其他种类的特定同系物、旁系同源物或直向同源物。基本类似地并也设想仍然由诊断工具或由针对各个全长肽的配体识别的蛋白水解降解产物。也涵盖较之人脂连蛋白的氨基酸序列具有氨基酸缺失、替换和/或添加的变体多肽，只要所述多肽具有脂连蛋白性质，特别是胰岛素敏化性质。
术语“白蛋白”指主要在血液中发现的球状蛋白质。它们达到3.5g/dl至4.5g/dl的浓度并占血浆蛋白质的约60％。白蛋白优选地为人白蛋白。成熟的人白蛋白包含585个氨基酸并具有约66,470Da的分子量。前蛋白原优选地具有由NCBI参考序列NP_000468.1所定义的氨基酸序列。白蛋白在维持血液的胶体渗透压，运输游离脂肪酸、甲状腺激素、未缀合的胆红素和许多药物中起重要作用。此外，其缓冲血液pH。
术语“白蛋白”涵盖白蛋白的变体，优选人白蛋白的变体。这些变体至少具有与白蛋白相同的基本生物学和免疫学性质，即它们维持血液的胶体渗透压，和/或运输游离脂肪酸，和/或运输甲状腺激素，和/或运输未缀合的胆红素，和/或缓冲血液pH。特别地，如果它们能够由本说明书中提及的相同的特别的测定检出(例如通过使用特异性识别白蛋白的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定)，则它们共享相同的基本生物学和免疫学性质。此外，应当理解，由于至少一个氨基酸的替换、缺失和/或添加，根据本发明提及的变体应具有不同的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸序列仍优选地与人白蛋白的氨基酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％或99％同一性。在本文别处说明了如何测定同一性程度。变体可为等位基因变体或任意其他种类的特定同系物、旁系同源物或直向同源物。此外，本文提及的变体包括白蛋白或上述类型变体的片段，只要这些片段具有如上提及的基本免疫学和生物学性质。此类片段可为例如白蛋白的降解产物。还包括由于翻译后修饰(例如磷酸化或十四烷基化)而不同的变体。
术语“中性粒细胞明胶酶相关蛋白”(NGAL)指下述蛋白质，其糖基化形式具有25kDa的分子量，并且其去糖基化形式具有约21kDa的分子量。其包含178个氨基酸并具有如Kjeldsen等人在1993年(JournalofBiologicalChemistry，268：10425-10432)中描述的氨基酸序列。有时发现其与人中性粒细胞明胶酶(基质金属蛋白酶9)形成的异源二聚体。一些证据指示，NGAL的结合阻止了基质金属蛋白酶9的降解(Yan等人，2001，JournalofBiologicalChemistry，276：37258-37265)。已知NGAL的表达在患有急性肾功能异常的患者中(特别是在肾局部缺血性损伤后)上调(Wagener等人，2006，Anesthesiology，105：485-491)。
术语“NGAL”也涵盖NGAL的变体，优选地，人NGAL的变体。这些变体至少具有与NGAL相同的基本生物学和免疫学性质，即它们阻止基质金属蛋白酶9的降解。特别地，如果它们能够由本说明书中提及的相同的特别的测定检出(例如通过使用特异性识别NGAL的多克隆或单克隆抗体的ELISA测定)，则它们共享相同的基本生物学和免疫学性质。此外，应当理解，由于至少一个氨基酸的替换、缺失和/或添加，根据本发明提及的变体应具有不同的氨基酸序列，其中所述变体的氨基酸序列仍优选地与人NGAL的氨基酸序列具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％，92％，95％，97％，98％或99％同一性。在本文别处说明了如何测定同一性程度。变体可为等位基因变体或任意其他种类的特定同系物、旁系同源物或直向同源物。此外，本文提及的变体包括NGAL或上述类型变体的片段，只要这些片段具有如上提及的基本免疫学和生物学性质。此类片段可为例如NGAL的降解产物。还包括由于翻译后修饰(例如磷酸化或十四烷基化)而不同的变体。
测定脂连蛋白或其变体、L-FABP或其变体、白蛋白或其变体、NGAL或其变体或在本说明书中提及的任意其他肽或多肽的量涉及测量量或浓度，优选地半定量或定量地测量。测量可直接或间接进行。直接测量涉及基于信号测量肽或多肽的量或浓度，所述信号是从肽或多肽自身得到的，并且所述信号强度与样品中存在的肽分子的量直接相关。此类信号——有时在本文中被称为强度信号——可通过例如测量肽或多肽的特定物理或化学性质的强度值得到。间接测量包括测量从第二组分(即不是肽或多肽自身的组分)或生物读出系统获得的信号，例如可测量的细胞应答、配体、标签或酶促反应产物。
根据本发明，可通过用于测定样品中肽量的所有已知方式实现测定肽或多肽的量。所述方式包括可能以多种夹层、竞争或其他测定形式利用经标记的分子的免疫测定设备和方法。所述测定将产生指示肽或多肽存在或不存在的信号。此外，信号强度优选地可与样品中存在的多肽的量直接或间接(例如成反比)相关。其他合适的方法包括测量肽或多肽的特异性的物理或化学性质，例如其精确的分子量或NMR谱。所述方法优选地包括生物传感器、与免疫测定偶联的光学设备、生物芯片、分析设备例如质谱仪、NMR分析仪或层析设备。此外，方法包括基于微板ELISA的方法，全自动或机器人免疫测定(例如在ElecsysTM分析仪上可实现)，CBA(酶促钴结合测定，例如在Roche-HitachiTM分析仪上可实现)，和乳胶凝集测定(例如在Roche-HitachiTM分析仪上可实现)。
优选地，测定肽或多肽的量包括以下步骤：(α)使能够引发细胞应答的细胞与所述肽或多肽接触足够的时间，所述细胞应答的强度指示肽或多肽的量，(β)测量细胞应答。为了测量细胞应答，将样品或处理的样品优选地加至细胞培养物并测量内部或外部细胞应答。细胞应答可包括可测量的报告基因的表达，或物质(例如肽、多肽或小分子)的分泌。表达或物质应生成与肽或多肽的量相关联的强度信号。
也优选地，测定肽或多肽的量包括以下步骤，所述步骤测量可从样品中的肽或多肽得到的特定强度信号。如上所述，此类信号可为在肽或多肽的特异性的质谱或NMR谱中观察到的、在肽或多肽特异性的m/z变量处观察到的信号强度。
测定肽或多肽的量可优选地包括以下步骤：(α)使肽接触特定配体，(任选地)去除未结合的配体，(β)测量结合的配体量。结合的配体将生成强度信号。根据本发明，结合包括共价和非共价结合。根据本发明的配体可为与本文描述的肽或多肽结合的任意化合物，例如肽、多肽、核酸或小分子。优选的配体包括抗体，核酸，肽或多肽例如肽或多肽的受体或结合伙伴(partner)及其包含肽的结合结构域的片段，和适配体，例如核酸或肽适配体。制备此类配体的方法是本领域熟知的。例如，合适的抗体或适配体的鉴定和产生也由商业供应方提供。本领域技术人员熟悉开发具有更高亲和力或特异性的此类配体的衍生物的方法。例如，可在核酸、肽或多肽中引入随机突变。然后可根据本领域公知的筛选程序，例如噬菌体展示，检测这些衍生物的结合。本文中提及的抗体包括多克隆和单克隆抗体二者，以及其能够结合抗原或半抗原的片段，例如Fv，Fab和F(ab)2片段。本发明也包括单链抗体和人源化的杂合抗体，其中将展示出期望的抗原特异性的非人供体抗体的氨基酸序列与人接受体抗体的序列组合。供体序列通常将至少包括供体的抗原结合氨基酸残基，但也可包含供体抗体的其他结构和/或功能相关的氨基酸残基。此类杂合体可通过本领域熟知的若干方法制备。优选地，配体或试剂特异性结合肽或多肽。根据本发明的特异性结合的意思是，配体或试剂应基本不与待分析的样品中存在的另一种肽、多肽或物质结合(“交叉反应”)。优选地，应当以比任意其他相关肽或多肽高至少3倍，更优选至少10倍和甚至更优选至少50倍的亲和力结合特异性结合的肽或多肽。可以容忍非特异结合，只要其仍可被明确地区分和测量，例如根据其在蛋白质印迹上的大小，或通过其在样品中相对高的丰度。配体的结合可通过本领域公知的任意方法测量。优选地，所述方法是半定量或定量的。合适的方法描述如下。
优选地，术语“抗体”指结合选自肽的抗体，所述肽选自L-FABP或其变体，脂连蛋白或其变体，白蛋白或其变体和NGAL或其变体。
首先，可直接测量配体的结合，例如通过NMR或表面等离子共振。
第二，如果配体也充当目的肽或多肽的酶促活性的底物，可测量酶促反应产物(例如，可通过测量被切割的底物的量(例如在蛋白质印迹上)测量蛋白酶的量)。备选地，配体可自身展示出酶促性质，并且“配体/肽或多肽”复合物或与肽或多肽结合的配体可分别与合适的底物接触，通过生成强度信号允许检测。为了测量酶促反应产物，优选地底物量是饱和的。也可在反应前用可检测的标记物来标记底物。优选地，使样品与底物接触足够的时间。足够的时间指用于生产可检测的，优选可测量的量的产物所必需的时间。可测量出现给定(例如可检测的)量的产物所必需的时间而非测量产物的量。
第三，配体可与允许检测和测量配体的标记物共价或非共价连接。可通过直接或间接方法进行标记。直接标记涉及将标记物直接(共价或非共价地)与配体耦合。间接标记涉及第二配体与第一配体的(共价或非共价)结合。第二配体应与第一配体特异性结合。所述第二配体可与合适的标记物耦合，和/或可作为结合第二配体的第三配体的靶(受体)。第二、第三或甚至高阶配体的用途经常用于增加信号。合适的第二和更高阶配体可包括抗体、第二抗体和众所周知的链霉抗生物素-生物素系统(VectorLaboratories，Inc.)。配体或底物也可用本领域公知的一个或多个标签“标记”。然后此类标签可作为更高阶配体的靶。合适的标签包括生物素、地高辛、His标签、谷胱甘肽-S-转移酶、FLAG、GFP、myc标签、甲型流感病毒血凝素(HA)、麦芽糖结合蛋白，等等。在肽或多肽的情况下，标签优选地在N-端和/或C-端。合适的标记物是可通过适当的检测方法检测的任意标记物。典型的标记物包括金颗粒，乳胶珠，9，10-二氢吖啶酯(acridanester)，鲁米诺，钌，酶促活性标记物，放射性标记物，磁性标记物(例如“磁珠”，包括顺磁性和超顺磁性标记物)，和荧光标记物。酶促活性标记物包括例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，荧光素酶，及其衍生物。用于检测的合适底物包括二氨基联苯胺(DAB)，3，3′-5，5′-四甲基联苯胺，NBT-BCIP(4-氯化硝基四氮唑蓝和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐，可从RocheDiagnostics获得预制的储液)，CDP-StarTM(AmershamBiosciences)，ECFTM(AmershamBiosciences)。合适的酶-底物组合可导致有色的反应产物，荧光或化学发光，这可根据本领域公知的方法测量(例如使用光敏胶片或合适的摄像系统)。关于测量酶促反应，类似地应用以上给出的标准。典型的荧光标记物包括荧光蛋白(例如GFP及其衍生物)，Cy3，Cy5，TexasRed，荧光素，和Alexa染料(例如Alexa568)。其他荧光标记物可从例如MolecularProbes(Oregon)获得。也设想使用量子点作为荧光标记物。典型的放射性标记物包括35S，125I，32P，33P等等。放射性标记物可通过任意已知和适当的方法检测，例如光敏胶片或磷成像仪。根据本发明的合适的测量方法也包括沉淀(特别是免疫沉淀)、电化学发光(生成电的化学发光)、RIA(放射免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、夹层酶免疫试验、电化学发光夹层免疫测定(ECLIA)、解离增强镧系元素荧光免疫测定(DELFIA)、邻近闪烁分析(SPA)、比浊法、浊度法、乳胶增强的比浊法或浊度法、或固相免疫测试。可单独使用本领域公知的其他方法(例如凝胶电泳、2维凝胶电泳、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、蛋白质印迹和质谱)，或与上述标记或其他检测方法组合使用。
肽或多肽的量也可优选地如下测定：(α)使包含如上所述的肽或多肽的配体的固相支持物与包含肽或多肽的样品接触，和(β)测量结合至支持物的肽或多肽的量。优选地选自核酸、肽、多肽、抗体和适配体的所述配体优选地以固定化的形式存在于固体支持物上。制造固体支持物的材料是本领域熟知的，尤其包括可商购的柱材料、聚苯乙烯珠、乳胶珠、磁性珠、胶体金属颗粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝酸纤维素条、膜、薄片、duracytes、反应托盘的孔和壁、塑料管等。配体或试剂可结合至许多不同的载体。熟知的载体实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁。用于本发明的目的，载体的本质可为可溶或不溶的。用于固定/固定化所述配体的合适方法是众所周知的，包括但不限于离子相互作用、疏水相互作用、共价相互作用等。也设想使用“悬浮阵列”作为根据本发明的阵列(Nolan2002，TrendsBiotechnol.20(1)：9-12)。在此类悬浮阵列中，载体(例如微珠或微球)以悬浮形式存在。阵列由可能被标记的、携带不同配体的不同微珠或微球组成。生产此类阵列的方法，例如基于固相化学和光不稳定保护性基团的方法是众所周知的(US5,744,305)。
本文中使用的术语“量”涵盖多肽或肽的绝对量，所述多肽或肽的相对量或浓度，以及与其相关或可从其得到的任意数值或参数。此类数值或参数包含通过直接测量从所述肽得到的来自所有特异性物理或化学性质的强度信号值，例如在质谱或NMR谱中的强度值。此外，涵盖通过在本说明书中别处说明的间接测量而得到的所有数值或参数，例如，从生物读出系统测定的应答肽的应答水平，或从特异性结合的配体得到的强度信号。应当理解，也可通过所有标准数学运算得到与上述量或参数相关的数值。
本文中使用的术语“比较”涵盖比较待分析样品中包含的肽或多肽的量与在本说明书别处说明的合适的参考源的量。应当理解，本文中使用的比较指对应参数或数值的比较，例如，绝对量与绝对参考量比较，而浓度与参考浓度比较，或从检测样品得到的强度信号与参考样品的同类型强度信号比较，或量的比率与参考量的比率比较。在本发明方法的步骤(c)中提及的比较可人工进行，或通过计算机辅助进行。对于计算机辅助的比较，通过计算机程序可比较测定量的数值与数据库中储存的合适参考所对应的数值。计算机程序也可评估比较结果，即自动提供合适的输出形式的期望的评估。
基于步骤a)中测定的量与合适的参考量的比较，预测个体患上与AKI相关的不良事件的风险是可能的。应当理解，在步骤(b)中，比较在本发明方法的步骤(a)中测定的L-FABP或其变体和视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体的量和在本申请别处说明的L-FABP或其变体和视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体的参考量。
本文中使用的术语“参考量”在本发明的此实施方案中指允许诊断个体是否不具有在手术后患上AKI相关不良事件的增加的风险(一般地，此受试者是生理上健康的受试者)，或不健康的受试者是否具有在手术后患上AKI相关不良事件的增加的风险的多肽的量。
因此，参考量一般将来源于已知生理上健康的受试者，或已知患有肾病的受试者(其可为表观健康的)，或将经历或已经历CABG的受试者，或已知患有肾病且将经历或已经历CABG的受试者。
因此，本文中使用的术语“参考量”也(either)指允许预测受试者患上与AKI相关的不良事件，特别是AKI自身，需要血液透析和/或死亡的风险的量，并且其中各个标记物的量可在受试者将要经历的手术干预，优选冠状动脉疾病相关干预，特别是CABG干预前测定。与参考量的比较允许预测或估计在受试者中受试者/个体患上与AKI相关的不良事件，特别是AKI自身，需要血液透析和/或死亡的风险。优选地在测定本发明的标记物以前已确立个体需要手术干预。
L-FABP或其变体和视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体的参考量可来源于在本发明上面定义的将经历或已经历手术干预，特别是CABG的受试者，并且其中已确定了受试者的结果，即发生AKI，需要血液透析和/或死亡。可在手术干预前测定用于建立参考量的各个肽的量。在本发明的另一个实施方案中，在手术干预后一个或多个时间测定标记物，例如在终止干预后立即测定，或在1，2，3，4，5，6，8，10，12，16，18或24h后测定。
在本发明的所有实施方案中，通过本领域技术人员公知的方法测定其中使用的各个标记物的一个或多个量(L-FABP或其变体和视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体)。
一般地，为了测定根据本发明的各个实施方案的允许建立期望诊断的各个量/量或量的比率，在合适的患者组中测定各个肽或多个肽的(“阈值”、“参考量”)、量/量或量的比率。根据待建立的诊断，患者组可例如仅包含健康个体，或可包含健康个体和患有待测定的病理生理状态的个体，或可仅包含患有待测定的病理生理状态的个体，或可包含患有待通过各个标记物使用有效的分析方法来辨别的多种病理生理状态的个体。收集得到的结果并通过本领域技术人员公知的统计学方法分析。然后根据期望的患上疾病的概率建立得到的阈值并与特定阈值相联系。例如，选择健康和/或非健康患者集合的中位值，第60位、第70位、第80位、第90位、第95位或甚至第99位百分位来建立阈值、参考值或量的比率可为有用的。
可建立诊断标志物的参考值，可简单地比较患者样品中的标志物的量与参考值。诊断和/或预后试验的灵敏度和特异性不只是取决于试验的分析“质量”，它们还取决于构成异常结果的定义。在实践中，通常通过绘制变量对其在“正常”和“疾病”群体中的相对频率来计算接受者操作特征曲线，或“ROC”曲线。对本发明的任意特别的标志物而言，患有和不患疾病的受试者的标志物量的分布将可能重叠。在此类情况下，试验不能绝对地以100％准确度区分正常和疾病，重叠的面积指示试验不能区分正常和疾病的区域。选择阈值，高于阈值(或低于阈值，取决于标志物如何随疾病而变化)则认为试验是异常的，低于阈值则认为试验是正常的。ROC曲线下的面积是感知的测量将允许正确鉴定病况的概率的度量。甚至在测试结果不一定给出准确的数字时，可以使用ROC曲线。只要可以对结果排序，就可以创造ROC曲线。例如，“疾病”样品的测试的结果可根据程度排序(例如1＝低，2＝正常，和3＝高)。此排序可与在“正常”群体中的结果相关联并创造ROC曲线。这些方法是本领域熟知的。见例如Hanley等人Radiology143：29-36(1982)。
在某些实施方案中，选择标志物和/或标志物组以展示至少约70％的灵敏度，更优选地至少约80％的灵敏度，甚至更优选地至少约85％的灵敏度，仍然更优选地至少约90％的灵敏度，和最优选地至少约95％的灵敏度，并与至少约70％的特异性，更优选地至少约80％的特异性，甚至更优选地至少约85％的特异性，仍然更优选地至少约90％的特异性，和最优选地至少约95％的特异性组合。在特别优选的实施方案中，灵敏度和特异性都为至少约75％，更优选地至少约80％，甚至更优选地至少约85％，仍然更优选地至少约90％，和最优选地至少约95％。在此上下文中术语“约”指给定测量的+/-5％。
在其他实施方案中，使用阳性似然比、阴性似然比、优势比或风险比作为试验预测风险或诊断疾病的能力的量度。在阳性似然比的情况下，数值1指示阳性结果在“患病”和“对照”组的受试者中同样可能；数值大于1指示阳性结果更可能在患病组中；数值小于1指示阳性结果更可能在对照组中。在阴性似然比的情况下，数值1指示阴性结果在“患病”和“对照”组的受试者中同样可能；数值大于1指示阴性结果更可能在测试组中；数值小于1指示阴性结果更可能在对照组中。在某些优选的实施方案中，优选地选择标志物和/或标志物组以展示至少约1.5或更高或约0.67或更低，更优选地至少约2或更高或约0.5或更低，仍然更优选地至少约5或更高或约0.2或更低，甚至更优选地至少约10或更高或约0.1或更低，和最优选地至少约20或更高或约0.05或更低的阳性或阴性似然比。在此上下文中术语“约”指给定测量的+/-5％。
在优势比的情况下，数值1指示阳性结果在“患病”和“对照”组的受试者中同样可能；数值大于1指示阳性结果更可能在患病组中；数值小于1指示阳性结果更可能在对照组中。在某些优选的实施方案中，优选地选择标志物和/或标志物组以展示至少约2或更高或约0.5或更低，更优选地至少约3或更高或约0.33或更低，仍然更优选地至少约4或更高或约0.25或更低，甚至更优选地至少约5或更高或约0.2或更低，和最优选地至少约10或更高或约0.1或更低的比值比。在此上下文中术语“约”指给定测量的+/-5％。
在风险比的情况下，数值1指示终点(例如死亡)的相对风险在“患病”和“对照”组中相等；数值大于1指示风险在患病组中更高；数值小于1指示风险在对照组中更高。在某些优选的实施方案中，优选地选择标志物和/或标志物组以展示至少约1.1或更高或约0.91或更低，更优选地至少约1.25或更高或约0.8或更低，仍然更优选地至少约1.5或更高或约0.67或更低，甚至更优选地至少约2或更高或约0.5或更低，和最优选地至少约2.5或更高或约0.4或更低的风险比。在此上下文中术语“约”指给定测量的+/-5％。
尽管在本文中描述了示例组，可从这些示例组中替换、添加或减少一个或多个标志物而仍然提供临床有用的结果。组可包含疾病的特异性标志物(例如，在细菌感染中增加或减少，但在其他疾病状态下不增加或减少的标志物)和/或非特异性标志物(例如，由于炎症增加或减少的标志物，不管原因是什么；由于止血作用中的变化而增加或减少的标志物，不管原因是什么，等等)。尽管某些标志物在本文描述的方法中不能单独确定，变化的特别的“指纹”图式可有效充当疾病状态的特异性指示物。如上所讨论的，变化的图式可从单个样品中得到，或可任选地考虑组内一个或多个成员中的暂时变化(或组应答值的暂时变化)。
为了检验选择的参考值是否对患有目的疾病的患者产生足够安全的诊断，可例如使用以下公式确定对于给定参考值的本发明的方法的效率(E)：
E＝(TP/TO)x100；
其中TP＝真阳性并且TO＝总测试数＝TP+FP+FN+TN，其中FP＝假阳性；FN＝假阴性并且TN＝真阴性。E具有以下范围的值：0＜E＜100。优选地，产生足够安全的诊断的测试的参考值提供的E值为至少约50，更优选地至少约60，更优选地至少约70，更优选地至少约80，更优选地至少约90，更优选地至少约95，更优选地至少约98。
通过本领域技术人员公知的确立的方法进行患者是健康的或患有某些病理生理状态的诊断。所述方法根据个体的病理生理状态而不同。
在本申请中展示了建立期望的诊断的算法，请参考涉及对应实施方案的段落。
因此，本发明也包含确定指示生理和/或病理状态和/或某些病理状态的阈值量的方法，包括以下步骤：在合适的患者组中测定合适的标志物的量，收集数据并通过统计学方法分析数据，并建立阈值。
本文中使用的术语“约”指给定测量或值的+/-20％，优选地+/-10％，优选地，+/-5％。
发明人惊讶地发现如本发明所展示的他们的结果和在现有技术，即Portilla等人KidneyInternational2008，l.c.中公开的结果之间的差异，Portilla等人发现患有AKI的患者较之未患上AKI的患者具有较低水平的L-FABP或其变体，脂连蛋白或其变体和NGAL或其变体。这个惊人的发现表明，在干预后立即测定时，这些标志物似乎不能用于预测AKI(其可通过在3天内超过0.3mg/dl的肌酸酐的增加指示)，而用于使用白蛋白或其变体，脂连蛋白和NGAL预测需要透析。事实上，检测的大部分患者具有尿中增加的肾损伤标志物的证据，但此增加令人惊讶地与肾功能的降低无关。尽管Portilla等人的数据(在经历心肺旁路手术的儿童的研究中建立)似乎显示，在手术前测量的L-FABP浓度不能用于预测AKI，且手术后L-FABP浓度的增加与AKI相关，本发明的发明人相反地发现，在成人中，优选在患有心血管疾病的患者中，在手术前测量的L-FABP浓度预测未来的AKI。
在成人中的这个发现——其与在儿童中的发现相反——具有临床重要性，因为这允许在干预和AKI出现前采取适当的决定。在这方面必须考虑，在AKI出现以后的疗法选择(用于治疗的选择)比识别出患上AKI的风险并可预防地治疗其出现的情况下明显更少。此类决定包括关于改善风险利益评估重新考虑手术需要，中止已知促使AKI的药物，包括ACE抑制剂，血管紧张素受体阻断剂和NSIAD，和已知促进AKI的可能的抗生素和其他药物。此外在手术期间需要适当和频繁的液体和血压平衡。因此本发明的方法把AKI的预防作为目标，因此提供了改善的临床决策。
因此，本发明的方法特别用于成人。在优选的实施方案中，风险预测的方法，推荐或决定合适疗法的方法和监控疗法的方法应用于成人；在另一个优选的实施方案中，这些描述的方法不应用于儿童。
令人惊讶地发现，当在干预前进行测定时，L-FABP或其变体的量是与AKI相关的未来事件的良好预测物。也发现当在干预前测定时，脂连蛋白的量可对由L-FABP或其变体提供的信息增加互补信息。通过在干预前测定白蛋白或其变体和/或NGAL或其变体的量可增加其他信息。
大手术干预，特别是大心血管手术干预与显著的死亡率和发病率相关，包括发展出急性肾损伤(AKI)。AKI可不经透析解决，或如果持续可能需要透析，或甚至可能与未来的慢性肾病相关。目前，在具有正常肾功能(通过在检测的正常范围内的肌酸酐水平或高于60ml/min的GFR评估)的患者中不能预测发展出AKI或甚至需要透析的风险。但是，由于本发明，可使用L-FABP甚至在手术以前鉴定处于风险的患者。仅在手术前，优选在风险/利益分析过程中的风险评估，允许重新考虑手术需要，中止促进AKI的药物(尽管其由于潜在的疾病而需要)和在手术期间采取适当措施(维持血压，避免暂时的血容量减少和本领域技术人员公知的其他措施)。
L-FABP是尿生物标志物，其在局部缺血后的肾的近端小管上皮细胞中表达。由于脂连蛋白似乎是“肾小球健康”的指示物，组合测定这些标志物揭示了肾致病过程的相关信息。
在本发明的其他实施方案中，除了L-FABP和脂连蛋白以外还测定白蛋白和/或NGAL。NGAL是肾小管损伤的标志物，白蛋白是肾小球损伤的标志物，这允许收集补充信息。
有利地，如在实例中证明的本发明方法的高特异性和灵敏度所反映的，已发现作为生物标志物的L-FABP或其变体的量，特别是在样品中，优选受试者的尿样中存在的L-FABP或其变体的量以可靠和有效的方式预测了个体在手术干预后患上与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险。
也已发现作为生物标志物的脂连蛋白或其变体的量，特别是在受试者的尿样中存在的脂连蛋白或其变体的量以可靠和有效的方式预测了个体在手术干预后患上与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险。L-FABP或其变体和脂连蛋白或其变体给出了有关个体患有与急性肾损伤相关的不良事件的风险的互补信息。
AKI可进展为需要透析和甚至死亡(在本发明的上下文中，二者都被考虑为与急性肾损伤相关的不良事件)。在本发明的优选实施方案中，L-FABP或其变体和/或脂连蛋白或其变体的量，优选二者的组合可用于预测个体在手术干预后或由于手术干预而发展出需要透析的风险。
“需要透析”发生在患有肾衰竭，在本发明的上下文中为急性肾衰竭(AKI)的个体中，其中肾衰竭的程度(通过GFR和/或肌酸酐清除率测定)损伤了肾功能，导致尿产生和电解质和废物的去除(在健康身体的肾中通过过滤去除)不符合身体的需要，并可严重影响个体健康，特别是导致不可逆转的健康伤害。一个实例是贫血，通常观察到是作为促红细胞生成素合成减少的后果。
在本发明的上下文中术语“手术干预”指在动物，优选哺乳动物，特别是人的身体上任意类型的侵入性干预，优选通过手术方法，优选包括大手术。可能因为血管疾病、创伤、出血性病症、肿瘤例如良性或恶性肿瘤、感染或其他原因而需要手术干预。手术可具有短或长的持续时间，可与已存在的或手术程序自身期间的体液或血液损失相关。可进行或不进行局部或全身麻醉实施手术程序。所述术语也可包括微创手术，尽管在本申请中引用的在手术后出现的并发症较少在微创手术后观察到。
在本发明的上下文中使用的术语“大手术”指需要麻醉和/或呼吸辅助的任意手术。
术语“手术干预”也包括例如对四肢(腿、手臂)和头的干预。
术语优选地包括对内部器官(例如肝、肾、肠、胃、肺，等等)的干预。甚至更优选地，所述术语包括对心(例如对瓣膜或心肌的任意部分)的干预，又称心血管手术。
经历心血管手术的患者经常患有心脏衰竭，这是由于心血管疾病，和最重要地，已存在的肾病的结果，或在上述疾病之后发生。
特别地，术语指对心血管的干预(又称心血管手术)，特别是旁路移植术。
在冠状动脉旁路移植术(CABG)中，通常使用动脉作为冠状动脉左前降支的有蒂的移植物，绕开不适于用支架术进行血管成形术的具有重度狭窄或阻塞的先天的冠状动脉。所述术语及其含义是本领域技术人员公知的。
本领域技术人员公知，原则上任何手术干预可导致AKI相关不良事件。认为此现象优选地是由于在各个个体中存在未识别出的肾病(意思是所述个体表观健康)，其诱导患上AKI相关不良事件的较高的可能性。优选地，所述未识别出的肾病在手术干预前存在。肾病经常是局部缺血和/或坏死过程的结果，一般地在导致无法满足肾的代谢需求的损伤的血液供应后。局部缺血和坏死过程转而经常由心血管疾病，优选冠状动脉疾病(CAD)所导致。
因此，没有显示明显的肾病病征和症状(如通过GFR和/或肌酸酐值所指示的)，并在本发明的意义上表观健康的个体在经历心血管手术后患上AKI相关不良事件的概率增加，特别是在CAD和/或心脏衰竭的情况下。
在本发明的上下文中使用的术语“心血管疾病”是本领域技术人员公知的，涉及在冠状血管和心脏自身中观察到的任意功能障碍，并特别包括冠状动脉疾病CAD。
术语“心血管手术”指在心血管疾病的情况下实施的手术。在优选的实施方案中，所述术语涉及在CAD的情况下实施的手术，其可又称为“CAD手术”。
在本发明的上下文中使用的“冠状动脉疾病”(CAD)是本领域技术人员公知的，涉及流经冠状动脉的血流伤害，多数情况下是由于动脉粥样硬化过程，一般称为粥样化，这可导致局部缺血、心绞痛、急性冠脉综合征(不稳定的心绞痛、心肌梗死MI)和心源性猝死。治疗包括减少局部缺血和恢复或改善冠状血流的药物和方法。通常，CAD是由于在大和中型冠状动脉中的粥样化沉积(动脉粥样硬化)。在较少情况下，CAD是由于冠状动脉痉挛。极少的原因包括冠状动脉栓塞、剥离、动脉瘤和血管炎。在本发明的上下文中，CAD也包括心脏衰竭。
根据本发明的方法，较之参考量，在受试者的样品，优选尿样中测量的增加的L-FABP或其变体的量指示肾的肾小管损伤。较之参考量，在受试者的样品中测量的增加的NGAL或其变体的量指示肾的肾小管损伤。较之参考量，增加的脂连蛋白或其变体的量指示肾的肾小球损伤。较之参考量，增加的白蛋白或其变体的量指示肾的肾小球损伤。较之参考量，增加的L-FABP或其变体的量和/或增加的NGAL或其变体的量，和增加的脂连蛋白或其变体的量和/或增加的白蛋白或其变体的量的组合指示进行性的肾的肾小管和肾小球损伤。
在本发明的上下文中，一个实施方案涉及如下情况，即在实施手术干预以前，即在手术干预前至少或至多约4周，优选干涉前至少或至多约2周，或在手术干预前至少或至多约7天，或至少或至多约3天，或至少或至多约1天，或至少或至多约20h，或至少或至多约12h，或至少或至多约6h测定标志物的量。如果在标志物的量测定以后出现急性事件，优选地应再次测定标志物的量。
在本发明优选的实施方案中，使用以下用于标志物的参考量，其中优选在手术干预前采集的样品中测定标志物的量。将每种标志物的量关于肌酸酐标准化(“相对。。。的肌酸酐”)，以消除各个个体的尿量变异导致的不准确性。
急性肾损伤和AKI中需要透析是大手术，特别是心脏手术后的已知的并发症，在手术后72小时(或3天)内发生。计算这些并发症的平均风险是本领域技术人员公知的。(McIlroyD.R.等人ClinJ.AmSocNephrol5：211-219，2010)。平均风险特别取决于潜在疾病、并存病和干预类型，这些构成计算平均风险的基础。在本发明的上下文中使用的术语“高风险”、“更高风险”、“极高风险”涉及如下情况，其中风险相对平均风险增加。在本发明的上下文中使用的术语“低风险”、“更低风险”、“极低风险”涉及如下情况，其中风险相对平均风险降低。
L-FABP：
相对L-FABP或其变体的肌酸酐的参考量≤约3.6μg/g，优选地≤约3.2μg/g，更优选地≤约2.9μg/g，指示个体处于患上AKI的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
相对L-FABP或其变体的肌酸酐的参考量≥约10.8μg/g，优选地≤约29.5μg/g，更优选地≥约32.3μg/g，指示个体处于患上AKI的高风险，优选地处于更高风险，更优选地处于极高风险中(包括)。
相对L-FABP或其变体的肌酸酐的参考量≤约4.2μg/g，优选地≤约3.2μg/g，更优选地≤约2.8μg/g，指示个体处于患上需要透析的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
相对L-FABP或其变体的肌酸酐的参考量≥约35.4μg/g，优选地≤约36.2μg/g，更优选地≥约37.2μg/g，指示个体处于患上需要透析的高风险，优选地处于更高风险，更优选地处于极高风险中(包括)。
脂连蛋白：
如果额外测定脂连蛋白或其变体的量，指示患上AKI/需要透析的风险是处于患上AKI/需要透析的低风险和高风险的参考值如下：
相对脂连蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≤约3.6μg/g，优选地≤约3.2μg/g，更优选地≤约2.8μg/g，指示个体处于患上AKI的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
相对脂连蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≥约15.6μg/g，优选地≤约17.6μg/g，更优选地≥约30.0μg/g，指示个体处于患上AKI的高风险，优选地处于更高风险，更优选地处于极高风险中(包括)。
相对脂连蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≤约8.8μg/g，优选地≤约3.2μg/g，更优选地≤约1.2μg/g，指示个体处于患上需要透析的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
相对脂连蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≥约30.4μg/g，优选地≤约135.2μg/g，更优选地≥约171.6μg/g，指示个体处于患上需要透析的高风险，优选地处于更高风险，更优选地处于极高风险中(包括)。
脂连蛋白提供了独立于L-FABP的信息。
白蛋白：
如果额外测定白蛋白或其变体的量，指示患上AKI/需要透析的风险是处于患上AKI/需要透析的低风险和高风险的参考值如下：
相对白蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≤约6μg/g，优选地≤约4μg/g，更优选地≤约2μg/g，指示个体处于患上AKI的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
相对白蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≥约128μg/g，优选地≤约142μg/g，更优选地≥约160μg/g，指示个体处于患上AKI的高风险，优选地处于更高风险，更优选地处于极高风险中(包括)。
相对白蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≤约8μg/g，优选地≤约4μg/g，更优选地≤约2μg/g，指示个体处于患上需要透析的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
相对白蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≥约54μg/g，优选地≤约128μg/g，更优选地≥约142μg/g，指示个体处于患上需要透析的高风险，优选地处于更高风险，更优选地处于极高风险中(包括)。
白蛋白提供了独立于L-FABP的信息。
NGAL：
如果额外测定NGAL或其变体的量，指示患上AKI/需要透析的风险是处于患上AKI/需要透析的低风险和高风险的参考值如下：
相对NGAL或其变体的肌酸酐的参考量≤约7.0μg/g，优选地≤约5.5μg/g，更优选地≤约3.5μg/g，指示个体处于患上AKI的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
相对NGAL或其变体的肌酸酐的参考量≥约12μg/g，优选地≤约13μg/g，更优选地≥约14μg/g，指示个体处于患上AKI的高风险，优选地处于更高风险，更优选地处于极高风险中(包括)。
相对NGAL或其变体的肌酸酐的参考量≤约9.0μg/g，优选地≤约7.5μg/g，更优选地≤约1.5μg/g，指示个体处于患上需要透析的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
相对NGAL或其变体的肌酸酐的参考量≥约15.0μg/g，优选地≤约20.5μg/g，更优选地≥约26.5μg/g，指示个体处于患上需要透析的高风险，优选地处于更高风险，更优选地处于极高风险中(包括)。
NGAL提供了独立于L-FABP的信息。
在本发明的一个实施方案中，在手术终止时或手术终止后测定标志物L-FABP或其变体，脂连蛋白或其变体，白蛋白或其变体和NGAL或其变体中的一种或多种。借此可测定患上AKI和/或需要透析的风险。在手术结束时(即在手术终止后几分钟到至多约1小时内)，和/或可在其后间隔(例如手术终止后约2h、4h、5h、6h、10h、12h、16h、24h)测定一种或多种标志物。
在手术终止时或手术终止后测定的白蛋白或其变体的量当在手术后立即测定时，允许区分处于未来出现急性肾损伤的风险中的个体和没有风险的个体。当在手术后测定时，白蛋白或其变体的量也允许区分处于未来需要透析的风险中的个体和没有风险的个体。尽管白蛋白或其变体的量在手术终止后迅速降低，在手术终止后约6至24h，优选地约6至12h测定白蛋白或其变体的量仍然能够区分处于AKI和透析二者风险中的患者和没有风险的患者。
当在手术后，优选在手术终止后约6h时测定时，白蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≤约8μg/g，优选地≤约5μg/g，更优选地≤约4μg/g，指示个体处于患上AKI的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
当在手术后，优选在手术终止后约12h时测定时，白蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≤约8μg/g，优选地≤约4μg/g，更优选地≤约2μg/g，指示个体处于患上AKI的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
当在手术后，优选在手术终止后约6h时测定时，白蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≤约8μg/g，优选地≤约6μg/g，更优选地≤约4μg/g，指示个体处于患上需要透析的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
当在手术后，优选在手术终止后约12h时测定时，白蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≤约10μg/g，优选地≤约4μg/g，更优选地≤约2μg/g，指示个体处于患上需要透析的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
在手术终止时或手术终止后测定的脂连蛋白或其变体的量当在手术后测定时，脂连蛋白或其变体的量允许区分处于未来需要透析的风险中的个体和没有风险的个体。尽管脂连蛋白或其变体的量在手术终止后迅速增加，在手术终止后约6至24h，优选地约6至12h测定脂连蛋白的量仍然能够区分处于透析风险中的患者和没有风险的患者。
当在手术后，优选在手术终止后约6h时测定时，脂连蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≤约65μg/g，优选地≤约48μg/g，更优选地≤约24μg/g，指示个体处于患上需要透析的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险，甚至更优选地处于甚至更低的风险中(排除)。
当在手术后，优选在手术终止后约12h时测定时，脂连蛋白或其变体的肌酸酐的参考量≤约72μg/g，优选地≤约62μg/g，更优选地≤约47μg/g，指示个体处于患上需要透析的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险，甚至更优选地处于甚至更低的风险中(排除)。
在手术终止时或手术终止后测定的L-FABP或其变体的量在发展出AKI的患者中比在未发展出AKI的患者中的低，可能是因为已经存在的肾病。不立即在手术终止后，而是在手术终止后约6至24h，优选地约6至12h测定脂连蛋白或其变体的量能够区分处于需要透析的风险中的患者和没有风险的患者。
当在手术后，优选在手术终止后约6h时测定时，L-FABP或其变体的肌酸酐的参考量≤约10μg/g，优选地≤约5μg/g，更优选地≤约0μg/g，指示个体处于患上需要透析的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
当在手术后，优选在手术终止后约12h时测定时，L-FABP或其变体的肌酸酐的参考量≤约10μg/g，优选地≤约5μg/g，更优选地≤约2μg/g，指示个体处于患上需要透析的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
在手术终止时或手术终止后测定的NGAL或其变体的量允许区分处于未来需要透析的风险中的个体和没有风险的个体。在手术终止后约6至24h，优选地约6至12h测定NGAL的量或其变体的量能够区分处于需要透析的风险中的患者和没有风险的患者。
当在手术后，优选在手术终止后约6h时测定时，NGAL或其变体的肌酸酐的参考量≤约20μg/g，优选地≤约15μg/g，更优选地≤约10μg/g，指示个体处于患上需要透析的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
当在手术后，优选在手术终止后约12h时测定时，NGAL或其变体的肌酸酐的参考量≤约30μg/g，优选地≤约20μg/g，更优选地≤约10μg/g，指示个体处于患上需要透析的低风险，优选地处于更低风险，更优选地处于极低风险中(排除)。
本发明也涉及在处于受试者的手术干预后经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险下的受试者中推荐或决定受试者中的合适疗法的方法，所述受试者处于受试者中的手术干预后经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中，所述方法基于通过比较在所述受试者的样品中测定的肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的量与至少一个参考量来预测与AKI相关的不良事件的风险。
本发明的此方法至少包括以下步骤之一和/或可包括以下步骤：a)在样品中，优选受试者的尿样中测定肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体，优选尿肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的量；b)比较在步骤a)中测定的量和参考量；c)基于在步骤b)中进行的比较预测风险；d)基于在步骤c)中得到的信息，推荐或决定开始合适疗法或避免合适疗法。
本发明也提供了推荐或决定受试者中的合适疗法的方法，所述受试者处于受试者中的手术干预后经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中，所述方法包括以下步骤：
a)在受试者的样品中，优选尿样中测定肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体，优选地尿肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体；
b)比较在步骤a)中测定的量和参考量；和
c)基于在步骤b)中进行的比较预测风险。
d)基于在步骤c)中得到的信息，推荐或决定开始合适疗法或避免合适疗法。
在本发明的另一个实施方案中，本发明也提供了推荐或决定受试者中的合适疗法的方法，所述受试者处于受试者中的手术干预后经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中，所述方法包括以下步骤：
a)在受试者的样品中，优选尿样中测定肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体，优选尿肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的量；和
b)比较在步骤a)中测定的量与参考量；
由此预测受试者经历手术干预后与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险，并基于预测推荐开始或避免合适疗法。
在本发明优选的实施方案中，除了L-FABP或其变体的量以外，在尿样中测定脂连蛋白或其变体的量，并基于标志物的量与参考量的比较建立推荐。
在本发明的另一个优选实施方案中，在尿样中测量选自白蛋白或其变体和中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(NGAL)或其变体中至少一种另外的标志物的量，并基于标志物的量与参考量的比较建立推荐。在此实施方案中，将测量除了L-FABP或其变体之外的上述组中的仅一种另外的标志物，和优选地脂连蛋白或其变体的量，或测量除了L-FABP或其变体之外的两种另外的标志物，和优选地，脂连蛋白或其变体的量。
在前面公开的推荐或决定合适疗法的方法中，优选地在手术前测定各个标志物。在本发明的另一个实施方案中，在手术干预已经终止后测定标志物，例如在终止干预后立即测定，或在1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、18或24h后测定。
在本发明的其他实施方案中，合适的疗法是施用药物和/或生活方式的推荐，所述药物和/或生活方式可有效抑制肾病的进一步发展。
有利地，本发明的方法允许在手术干预前和/或手术干预后鉴定具有增加的AKI风险的患者。通过测定患者中增加的AKI风险，可在具有增加的在手术程序后患上AKI的风险的患者中控制促进AKI的已知风险因素。这些风险因素的控制包括在手术期间和手术后的小心的液体平衡。如果在手术期间使用心肺旁路，必须避免低输注温度。也必须避免肾毒性药物(例如非甾体抗炎药物和磺胺类药)。此外，可能需要施用促红细胞生成素(Song等人，2009，AmericanJournalofNephrology，253-260)。在干预前和/或干预后预测患者在所述手术干预后的急性肾损伤的风险的概率对决定考虑中的患者是否适于考虑中的手术程序有影响。
本文中使用的术语“敏感的(susceptible)”的意思是，对受试者应用的疗法将抑制或减轻糖尿病或其伴随症状的发展。应当理解，疗法敏感性的评估不会对所有(100％)研究的受试者正确。但是，设想可至少确定统计上显著的部分，所述部分可成功应用所述疗法。可通过本文别处说明的技术测定一部分是否是统计上显著的。
此外，本发明涉及在受试者中监控疗法的方法，所述受试者处于由于受试者中的手术干预所导致的急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中，所述方法基于通过比较在多个时点(至少2个不同的时点)在所述受试者的样品中测定的肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)，优选地尿L-FABP或其变体的量与至少一个参考量，来预测与AKI相关的不良事件的风险。
本发明的此方法至少包括以下步骤之一和/或可包括以下步骤：a)在多个时点(至少2个不同的时点)在受试者的样品，优选尿样中测定肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的量；b)比较在步骤a)中测定的量和参考量；c)基于在步骤b)中进行的比较预测风险；d)基于在步骤c)中得到的信息监视疗法。
本发明也提供了在受试者中监控疗法的方法，所述受试者处于由于受试者中的手术干预所导致的急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中，所述方法包括以下步骤：
a)在多个时点(至少2个不同的时点)在受试者的尿样中测定肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的量；
b)比较在步骤a)中测定的量和参考量；和
c)基于在步骤b)中进行的比较预测风险。
d)基于在步骤c)中得到的信息，推荐或决定开始合适疗法或避免合适疗法。
在本发明的另一个实施方案中，本发明提供了在受试者中监控疗法的方法，所述受试者处于由于受试者中的手术干预所导致的急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中，所述方法包括以下步骤：
a)在多个时点(至少2个不同的时点)在受试者的尿样中测定肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的量；
b)比较在步骤a)中测定的量和参考量；
由此预测受试者在手术干预后经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险，并基于预测推荐开始或避免合适疗法。
在本发明优选的实施方案中，除了L-FABP或其变体的量以外，在尿样中测定脂连蛋白或其变体的量，并基于标志物的量与参考量的比较进行监视。
在本发明的另一个优选实施方案中，在尿样中测量选自白蛋白或其变体和中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(NGAL)或其变体的至少一种另外的标志物的量，并基于标志物的量与参考量的比较建立推荐。在此实施方案中，将测量除了L-FABP或其变体之外的上述组中的仅一种额外的标志物和优选地脂连蛋白或其变体的量，或测量除了L-FABP或其变体之外的两种额外的标志物和优选地脂连蛋白或其变体的量。
本文中使用的“监控”涉及保持追踪与AKI相关事件，特别是AKI自身或需要透析相关的各个个体的病理生理状态，疾病的出现和/或发展，或特定治疗对疾病发展的影响。监视的意思是优选地在约1天、约2天、约3天、约5天、约7天、约10天、约12天、约14天后控制。
在一个实施方案中，本发明提供了诊断受试者中急性肾损伤AKI的方法，包括以下步骤：
a)测定肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的量，优选地测定受试者的尿样；
b)比较在步骤a)中测定的量和参考量；和
c)基于在步骤b)中进行的步骤诊断AKI。
本发明也提供了在受试者中诊断急性肾损伤AKI的方法，包括以下步骤：
a)测定肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体的量，优选地测定受试者的尿样；和
b)比较在步骤a)中测定的量和参考量；
其中基于在步骤b)中进行的步骤诊断AKI。
此外，本发明也设想了适于实施本发明的方法的试剂盒和设备。
此外，本发明涉及用于预测受试者由手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险的设备，包含：
a)用于在受试者的样品，优选尿样中测定肝型脂肪酸结合蛋白，优选地尿肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体以及视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体的量的工具；
b)用于比较在步骤a)中测定的量和参考量的工具；和
c)基于在步骤b)中进行的比较预测风险，和
由此所述设备适于诊断肾损伤。
此外，本发明涉及用于预测受试者由手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险的试剂盒，包含：
a)用于在受试者的样品，优选尿样中测定肝型脂肪酸结合蛋白，优选地尿肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)或其变体以及视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体)的量的工具；
b)用于比较在步骤a)中测定的量和参考量的工具；和
c)基于在步骤b)中进行的比较预测风险，和
由此所述试剂盒适于诊断肾损伤。
本文中使用的术语“设备”指至少包含彼此有效连接的上述工具的工具系统，从而允许预测受试者中由手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险，和/或基于受试者中与AKI相关的不良事件的风险的预测，在处于由受试者的手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中的受试者中推荐或决定合适疗法，和/或在处于由受试者的手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中的受试者中监控疗法。用于测定(L-FABP)以及视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体的量的优选的工具，并且上文中公开了用于进行比较的工具和本发明的方法。如何以有效的方式连接工具将取决于设备包括的工具类型。例如，当应用自动测定肽量的工具时，可通过例如计算机程序处理由所述自动操作工具得到的数据以得到期望的结果。优选地，在此类情况下工具由单个设备构成。所述设备可相应地包括用于测量应用的样品中的肽或多肽的量的分析单元，和用于处理用于评估的得到的数据的计算机单元。备选地，当使用例如检测条的工具用于测定肽或多肽的量时，用于比较的工具可包含分配测定量与参考量的对照条或表。检测条优选地与本文提及的特异性结合肽或多肽的配体连接。条或设备优选地包含检测所述肽或多肽与所述配体结合的工具。公开了用于检测的优选工具和涉及以上本发明方法的实施方案。在此类情况下，工具是这样有效连接的，即系统用户汇集量的测定结果并根据手册中提供的说明和解释汇集其诊断或预后值。在此类实施方案中所述工具可为单独的工具，并优选地作为试剂盒包装在一起。本领域技术人员将知道如何连接工具，无需再费周折。优选的设备是不需要专科临床医生的特定知识就可应用的设备，例如仅需要加载样品的检测条或电子设备。结果可以以需要临床医生解释的原始数据输出给出。然而优选地，设备的输出是经过处理，即评估的原始数据，其解释不需要临床医生。更优选的设备包含依照本发明的方法在上文提及的分析单元/设备(例如与配体偶联的生物传感器、阵列、固相支持物，所述配体特异性识别L-FABP或其变体以及视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体，等离子表面共振设备，NMR光谱分析仪，质谱仪等)或评估单元/设备。
本文中使用的术语“试剂盒”指上述工具的集合，优选地，单独提供或在单个容器内提供。任选地，如本发明定义的，试剂盒可额外包含用于解释任意测量的结果的用户手册，所述结果涉及预测受试者由手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险，和/或基于受试者与AKI相关的不良事件的风险的预测，在处于由受试者的手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中的受试者中推荐或决定合适疗法，和/或在处于由受试者的手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险下的受试者中监控疗法。特别地，此类手册可包含有关哪种测定量对应哪类诊断的信息。这在本说明书的别处详细概述。另外，此类用户手册可提供有关正确使用试剂盒的组分用于测定各个生物标志物的量的说明。
本发明也涉及试剂盒或设备用于测定受试者样品中的L-FABP或其变体以及视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体的用途，和/或工具用于测定L-FABP或其变体以及视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体的用途，和/或工具用于比较L-FABP或其变体以及视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体与至少一种参考量的用途，用于：预测受试者由手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险，和/或在处于由受试者中的手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中的受试者中推荐或决定合适疗法，和/或在处于由受试者中的手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中的受试者中监控疗法，其中所有用途都基于受试者中与AKI相关的不良事件的风险的预测。
优选地，基于在手术干预前采集的样品预测由手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险。
本发明也涉及L-FABP或其变体的抗体以及视情况而定，脂连蛋白或其变体的抗体和/或NGAL或其变体的抗体和/或白蛋白或其变体的抗体，和/或用于测定L-FABP或其变体的量的工具以及视情况而定，用于测定脂连蛋白或其变体的量的工具和/或用于测定NGAL或其变体的量的工具和/或用于测定白蛋白或其变体的量的工具，和/或用于比较L-FABP或其变体以及视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体的量与至少一种参考量的工具用于制造诊断组合物的用途，所述诊断组合物用于预测受试者中由手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险，和/或在处于由受试者中的手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中的受试者中推荐或决定合适疗法，和/或在处于由受试者中的手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中的受试者中监控疗法，其中所有用途都基于受试者中与AKI相关的不良事件的风险的预测。
优选地，基于在手术干预前采集的样品预测由手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险。
本发明也涉及L-FABP或其变体的抗体以及视情况而定，脂连蛋白或其变体的抗体和/或NGAL或其变体的抗体和/或白蛋白或其变体的抗体，和/或用于测定L-FABP或其变体的量的工具以及视情况而定，用于测定脂连蛋白或其变体的量的工具和/或用于测定NGAL或其变体的量的工具和/或用于测定白蛋白或其变体的量的工具，和/或用于比较L-FABP或其变体以及视情况而定，脂连蛋白或其变体和/或NGAL或其变体和/或白蛋白或其变体与至少一种参考量的工具用于预测受试者中由手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险，和/或在处于由受试者中的手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中的受试者中推荐或决定合适疗法，和/或在处于由受试者中的手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中的受试者中监控疗法的用途，其中所有用途都基于受试者中与AKI相关的不良事件的风险的预测。
优选地，基于在手术干预前采集的样品预测由手术干预导致的与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险。
在本说明书中引用的所有参考以其全部公开内容和在本说明书中特别提及的公开内容一并引入作为参考。
以下实施例仅举例说明本发明。其无论如何不应被视为限制本发明的范围。
图：
图1：在手术前从实施例1中描述的患者中得到的样品的尿LFABP的ROC分析，进行关于临床终点急性肾损伤的分析(是或否)。
图2：在手术前从实施例1中描述的患者中得到的样品的尿LFABP的ROC分析，进行关于需要透析的分析(是或否)。
图3：在手术前从实施例1中描述的患者中得到的样品的脂连蛋白的ROC分析，进行关于临床终点急性肾损伤的分析(是或否)。
图4：在手术前从实施例1中描述的患者中得到的样品的脂连蛋白的ROC分析，进行关于需要透析的分析(是或否)。
图5：在手术前从实施例1中描述的患者中得到的样品的白蛋白的ROC分析，进行关于临床终点急性肾损伤的分析(是或否)。
图6：在手术前从实施例1中描述的患者中得到的样品的白蛋白的ROC分析，进行关于需要透析的分析(是或否)。
图7：在手术前从实施例1中描述的患者中得到的样品的NGAL的ROC分析，进行关于临床终点急性肾损伤的分析(是或否)。
图8：在手术前从实施例1中描述的患者中得到的样品的NGAL的ROC分析，进行关于需要透析的分析(是或否)。
图9：在手术终止后约6h时从实施例1中描述的患者中得到的样品的白蛋白的ROC分析，进行关于临床终点急性肾损伤的分析(是或否)。
图10：在手术终止后约12h时从实施例1中描述的患者中得到的样品的白蛋白的ROC分析，进行关于临床终点急性肾损伤的分析(是或否)。
图11：在手术终止后约6h时从实施例1中描述的患者中得到的样品的白蛋白的ROC分析，进行关于需要透析的分析(是或否)。
图12：在手术终止后约12h时从实施例1中描述的患者中得到的样品的白蛋白的ROC分析，进行关于需要透析的分析(是或否)。
图13：在手术终止后约6h时从实施例1中描述的患者中得到的样品的脂连蛋白的ROC分析，进行关于需要透析的分析(是或否)。
图14：在手术终止后约12h时从实施例1中描述的患者中得到的样品的脂连蛋白的ROC分析，进行关于需要透析的分析(是或否)。
图15：在手术终止后约6h时从实施例1中描述的患者中得到的样品的尿L-FABP的ROC分析，进行关于需要透析的分析(是或否)。
图16：在手术终止后约12h时从实施例1中描述的患者中得到的样品的尿L-FABP的ROC分析，进行关于需要透析的分析(是或否)。
图17：在手术终止后约6h时从实施例1中描述的患者中得到的样品的NGAL的ROC分析，进行关于需要透析的分析(是或否)。
图18：在手术终止后约12h时从实施例1中描述的患者中得到的样品的NGAL的ROC分析，进行关于需要透析的分析(是或否)。
实施例
在以下实施例中，使用以下检测测定各个肽的量：
使用CMICCo.，Ltd，日本的L-FABPELISA-试剂盒测定L-FABP。检测是基于ELISA两步测定。首先用检测试剂盒提供的预处理溶液处理L-FABP标准物或尿样，并转移至含有测定缓冲液的L-FABP抗体包被的微量板中并孵育。在此孵育中，反应溶液中的L-FABP与固定化的抗体结合。洗涤后，加入第二抗体-POD缀合物作为第二抗体并孵育，由此在固定化的抗体和缀合物抗体之间形成L-FABP抗原夹层。孵育后，洗板并加入酶反应的底物，根据L-FABP抗原量显色。基于光密度测定L-FABP浓度。测定具有从3ng/ml至400ng/ml的测量范围。
使用ALPCOdiagnostics(美国)的EIA检测测定脂连蛋白(多聚体)，基于“夹层”形式ELISA的原理进行。在试剂盒中使用的特异性抗体是针对2个独立表位的抗人脂连蛋白单克隆抗体(MoAb)。如下所述预处理样本，直接或间接地选择性测定总脂连蛋白和脂连蛋白的各个多聚体。此试剂盒将脂连蛋白多聚体分为4部分：
1)总脂连蛋白部分：“总-Ad”-直接在板上测定
2)高分子脂连蛋白部分(相当于12聚体-18聚体)：“HMW-Ad”-直接在板上测定
3)中等分子脂连蛋白部分(相当于6聚体)：通过从MMW-Ad+HMW-Ad的组合的浓度中减去HMW-Ad的浓度得到“MMW-Ad”的推断值
4)低分子脂连蛋白部分(相当于包括结合白蛋白的脂连蛋白的三聚体)：通过从总Ad浓度中减去MMW-Ad+HMW-Ad的组合浓度得到“LMWAd”的推断值。微滴定板的孔已用抗人脂连蛋白单克隆抗体包被。在首次孵育中在标准物和预处理的样本中的脂连蛋白被抗体捕获。随后，洗涤步骤去除所有未结合的物质。之后加入已用生物素标记的抗人脂连蛋白抗体并与孔中固定的脂连蛋白结合。之后加入已用生物素标记的抗人脂连蛋白抗体并与孔中固定化的脂连蛋白结合。在第二次孵育和之后的洗涤步骤后，加入HRP标记的链霉抗生物素。在第三次孵育和之后的洗涤步骤后，加入底物溶液。最后，在允许显色后加入终止试剂。通过微量板阅读器阅读显色强度。板阅读器读出的吸光度值与样品中的脂连蛋白浓度成比例。检测试剂盒在0.075ng/ml至4.8ng/ml的范围内有效。
通过BioportoDiagnostics，Denmark的NGAL快速ELISA试剂盒测定NGAL。测定是在用针对人NGAL的单克隆抗体包被的微孔中进行的ELISA。用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的单克隆抗体检测结合的NGAL，通过与形成颜色的底物孵育使测定显色。测定使用快速的两步程序：
第一步.在包被的微孔中用HRP缀合的检测抗体孵育等分试样的校准物、稀释样品和任意对照。只有NGAL将结合包被抗体和检测抗体二者，而未结合的物质通过洗涤去除。
第二步.对每个检测孔加入含有四甲基联苯胺(TMB)的生色的过氧化物酶底物。与结合的检测抗体连接的HRP与底物反应生成有色产物。化学终止酶促反应，在ELISA阅读器中阅读450nm处的颜色强度。颜色强度(吸光度)是最初加入各个孔的NGAL浓度的函数。校准物的结果用于构建校准曲线，通过校准曲线读出检测样本中的NGAL浓度。
使用CobasTina-quant白蛋白检测(RocheDiagnostics)通过免疫比浊法测定白蛋白。检测原理是特异性抗白蛋白抗体识别白蛋白与白蛋白形成复合物，在凝集后测定所述复合物。测定在尿中具有3ng/ml至400ng/ml的测量范围。
指定的检测也优选地在本发明的一般上下文中使用，用于测定各个肽。
为了优化预测并发症出现或不出现的可能性的参考值，构建接受者操作曲线(ROC曲线)。在本发明的上下文中并发症是定义的急性肾损伤或需要透析。测定并发症出现或不出现的可能性的时点优选地是在手术前。此时点允许采取所有合适的措施以避免此类并发症，包括不进行手术的可能性，如在本发明中已概述的。手术后或甚至更晚的用于避免或减轻此类并发症的措施受更多限制，但是考虑到透析风险，此类信息将提供合适的时间用于准备此类并发症，例如透析设备的可用性、运输至合适的单元、更密集的监视等等。
实施例1：
在干预前、后和干预后6、12和24小时，评估了共126位肌酸酐在正常范围内、经历选择性冠状旁路手术的患者(中位数年龄63岁)的肾损伤标志物的存在。
89位患者没有发展出AKI，在37位患者中识别出AKI(通过至少0,3mg/dl的肌酸酐的增加指示)，12位患者发展出需要透析并且9位在手术后30天内死亡。
测量以下尿肾标志物：白蛋白、脂连蛋白L-FABP和NGAL。
结果显示在ROC曲线1-18中(见上)。
在手术前采集的样品中的L-FABP量良好预测了手术后需要透析(见图2)。可达到约60％的敏感性同时保持约80％的选择性。因此，对超过一半最后需要透析的所有患者正确地预测了手术后需要透析。
重要的是要理解急性肾损伤，特别是之后透析的急性肾损伤可能是由于干预以前的疾病或干预自身的并发症引起的。在本研究中，尿L-FABP鉴定出处于增加的急性肾损伤和透析风险中的患者亚组，所述亚组不能被其他肾功能检测(例如基于肌酸酐测定)识别。此鉴定能在干预前进行。在干预前的风险评估允许采取预防措施，所述措施如果在导致急性肾损伤的事件出现后将是无效或低效的。此类措施特别包括小心的体液平衡，避免肾毒性药物和如果使用心肺旁路的话，避免低输注温度。
实施例2：
患者计划接受心血管旁路移植术。手术前患者的尿L-FABP量为36.0μg/g肌酸酐。因此，小心监控患者的体液平衡并避免心肺旁路的低输注温度。患者从手术中恢复，没有肾损伤的病征或症状。
实施例3：
患者计划接受心血管旁路移植术。手术前患者的尿L-FABP量为3.1μg/g肌酸酐。尽管没有采取预防措施，患者从手术中恢复，没有肾损伤的病征或症状。

Claims (11)

1.在心血管手术前得到的受试者的样品中测定肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)的量的工具在制造用于预测受试者在心血管手术后经历与急性肾损伤(AKI)相关的不良事件的风险的试剂盒中的用途，所述预测包括比较在心血管手术前得到的受试者的样品中测定的肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)的量与参考量；和
由此预测受试者在心血管手术后经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险；其中所述样品是尿样。
2.根据权利要求1的用途，其中所述试剂盒还包含在样品中测量脂连蛋白的量的工具，并且所述预测还包含基于标记物的量与各个参考量的比较预测所述风险。
3.根据权利要求1的用途，其中所述试剂盒还包含在样品中测量选自白蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(NGAL)的至少一种其他标记物的量的工具，并且所述预测还包含基于标记物的量与各个参考量的比较预测所述风险。
4.根据权利要求2的用途，其中所述试剂盒还包含在样品中测量选自白蛋白和中性粒细胞明胶酶相关脂笼蛋白(NGAL)的至少一种其他标记物的量的工具，并且所述预测还包含基于标记物的量与各个参考量的比较预测所述风险。
5.根据权利要求1至4中任一项的用途，其中当在实施心血管手术前测定时，相对L-FABP的肌酸酐的参考量<约3.6μg/g指示个体处于患上AKI的低风险，并且相对L-FABP的肌酸酐的参考量>约10.8μg/g指示个体处于患上AKI的高风险。
6.根据权利要求1至4中任一项的用途，其中当在实施心血管手术前测定时，相对L-FABP的肌酸酐的参考量<约4.2μg/g指示个体处于患上需要透析的低风险，并且相对L-FABP的肌酸酐的参考量>约35.4μg/g指示个体处于患上需要透析的高风险。
7.根据权利要求1至4中任一项的用途，其中当在实施心血管手术前测定时，相对脂连蛋白的肌酸酐的参考量<约3.6μg/g指示个体处于患上AKI的低风险，并且相对脂连蛋白的肌酸酐的参考量>约15.6μg/g指示个体处于患上AKI的高风险。
8.根据权利要求1至4中任一项的用途，其中当在实施心血管手术前测定时，相对脂连蛋白的肌酸酐的参考量<约8.8μg/g指示个体处于患上需要透析的低风险，并且相对脂连蛋白的肌酸酐的参考量>约30.4μg/g指示个体处于患上需要透析的高风险。
9.在心血管手术前在受试者的样品中测定肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)的量的工具在制造用于在处于心血管手术后经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中的受试者中推荐合适疗法的试剂盒中的用途，所述推荐包括比较在受试者的样品中测定的肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)的量与参考量；和
由此预测受试者在心血管手术后经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险，并基于所述预测推荐开始或避免合适疗法，其中所述样品是尿样。
10.抗L-FABP抗体在制造用于在心血管手术前预测受试者在心血管手术后经历与急性肾损伤(AKI)相关的不良事件的风险的诊断组合物中的用途。
11.抗L-FABP抗体在制造用于在心血管手术前在处于心血管手术后经历与急性肾损伤AKI相关的不良事件的风险中的受试者中推荐或决定合适疗法的诊断组合物中的用途。
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