CN107677809A - 急性肾损伤的检测试剂盒 - Google Patents
急性肾损伤的检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107677809A CN107677809A CN201710737470.XA CN201710737470A CN107677809A CN 107677809 A CN107677809 A CN 107677809A CN 201710737470 A CN201710737470 A CN 201710737470A CN 107677809 A CN107677809 A CN 107677809A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ngal
- monoclonal antibodies
- detection
- liquid
- magnetic particle
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 163
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 title claims abstract description 47
- 230000009692 acute damage Effects 0.000 title claims abstract description 39
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 128
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 claims abstract description 69
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims abstract description 26
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 102000013519 Lipocalin-2 Human genes 0.000 claims description 103
- 108010051335 Lipocalin-2 Proteins 0.000 claims description 103
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 claims description 40
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 claims description 38
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 claims description 38
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 23
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 claims description 10
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 claims description 9
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 claims description 9
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 9
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 claims description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 5
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 4
- 125000002088 tosyl group Chemical group [H]C1=C([H])C(=C([H])C([H])=C1C([H])([H])[H])S(*)(=O)=O 0.000 claims description 4
- QWXOJIDBSHLIFI-UHFFFAOYSA-N [3-(1-chloro-3'-methoxyspiro[adamantane-4,4'-dioxetane]-3'-yl)phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O1OC2(C3CC4CC2CC(Cl)(C4)C3)C1(OC)C1=CC=CC(OP(O)(O)=O)=C1 QWXOJIDBSHLIFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N [3-(3'-methoxyspiro[adamantane-2,4'-dioxetane]-3'-yl)phenyl] dihydrogen phosphate Chemical compound O1OC2(C3CC4CC(C3)CC2C4)C1(OC)C1=CC=CC(OP(O)(O)=O)=C1 XYIPYISRNJUPBA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 125000003700 epoxy group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 claims description 3
- UKWLRLAKGMZXJC-QIECWBMSSA-L disodium;[4-chloro-3-[(3r,5s)-1-chloro-3'-methoxyspiro[adamantane-4,4'-dioxetane]-3'-yl]phenyl] phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].O1OC2([C@@H]3CC4C[C@H]2CC(Cl)(C4)C3)C1(OC)C1=CC(OP([O-])([O-])=O)=CC=C1Cl UKWLRLAKGMZXJC-QIECWBMSSA-L 0.000 claims description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 19
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 15
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 abstract description 10
- 102000007592 Apolipoproteins Human genes 0.000 abstract description 7
- 108010071619 Apolipoproteins Proteins 0.000 abstract description 7
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 abstract description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 45
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 29
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 22
- 201000011040 acute kidney failure Diseases 0.000 description 15
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 description 13
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 11
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 11
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 11
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 10
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 9
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 8
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 8
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 8
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 7
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 7
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 6
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 6
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 6
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 6
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 5
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 4
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 4
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000003907 kidney function Effects 0.000 description 4
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 4
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 208000009304 Acute Kidney Injury Diseases 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 101000945318 Homo sapiens Calponin-1 Proteins 0.000 description 3
- 101000652736 Homo sapiens Transgelin Proteins 0.000 description 3
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 3
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 208000033626 Renal failure acute Diseases 0.000 description 3
- 102100031013 Transgelin Human genes 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- -1 amino, sulfydryl Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 238000010612 desalination reaction Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 3
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 3
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 2
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 2
- 206010068676 Pneumoretroperitoneum Diseases 0.000 description 2
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 2
- 208000005727 Retropneumoperitoneum Diseases 0.000 description 2
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002872 contrast media Substances 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 2
- CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid Chemical compound CCS(O)(=O)=O CCIVGXIOQKPBKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 2
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 2
- 239000011229 interlayer Substances 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 2
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N monobenzene Natural products C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 230000010148 water-pollination Effects 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 2
- IHVODYOQUSEYJJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]amino]hexanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCCCCNC(=O)C(CC1)CCC1CN1C(=O)C=CC1=O IHVODYOQUSEYJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WGIAYBNWTYECJD-UHFFFAOYSA-N 1-ethoxypiperazine Chemical class CCON1CCNCC1 WGIAYBNWTYECJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WFCSWCVEJLETKA-UHFFFAOYSA-N 2-piperazin-1-ylethanol Chemical compound OCCN1CCNCC1 WFCSWCVEJLETKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012192 Cystatin C Human genes 0.000 description 1
- 108010061642 Cystatin C Proteins 0.000 description 1
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 description 1
- 101150071461 HAVCR1 gene Proteins 0.000 description 1
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 206010030302 Oliguria Diseases 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000255964 Pieridae Species 0.000 description 1
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002535 Polyethylene Glycol 1500 Polymers 0.000 description 1
- 206010061481 Renal injury Diseases 0.000 description 1
- 102000040739 Secretory proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091058545 Secretory proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000012998 acute renal failure Diseases 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 208000035850 clinical syndrome Diseases 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 238000010219 correlation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000002934 diuretic Substances 0.000 description 1
- 230000001882 diuretic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- KOGINMITGZVQBD-UHFFFAOYSA-N ethanesulfonic acid;piperazine Chemical compound CCS(O)(=O)=O.C1CNCCN1 KOGINMITGZVQBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 1
- 230000003862 health status Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000000302 ischemic effect Effects 0.000 description 1
- 208000037806 kidney injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 210000003024 peritoneal macrophage Anatomy 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 230000008085 renal dysfunction Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N thiolan-2-ylideneazanium;chloride Chemical compound Cl.N=C1CCCS1 ATGUDZODTABURZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
- G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
- G01N33/535—Production of labelled immunochemicals with enzyme label or co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or enzyme substrates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
- G01N33/54326—Magnetic particles
- G01N33/5434—Magnetic particles using magnetic particle immunoreagent carriers which constitute new materials per se
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明涉及一种急性肾损伤的检测试剂盒,包括第一检测液和第二检测液,第一检测液中含有磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体,第二检测液中含有碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体。第一抗NGAL单克隆抗体和第二抗NGAL单克隆抗体分别针对不同的NGAL表位。该急性肾损伤的检测试剂盒基于NGAL(中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白)作为诊断检测的标志物进行检测,能够在急性肾损伤发生的早期快速检测诊断,检测的灵敏度较高、特异性较高。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测领域,特别是涉及一种急性肾损伤的检测试剂盒。
背景技术
急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是由各种原因引起的肾功能在短时间(几小时至几天)内突然下降而出现的临床综合征,是威胁重症患者生命的常见疾病。通常50%以上的重症监护的病人都有不同程度的肾损伤,急性肾功能衰竭死亡率处于危重病死亡率前列。在过去的几十年里人们对AKI发病机理的认识和医疗技术水平都有了很大的提高,但AKI的发病率和病死率仍然居高不下。导致这一局面的一个主要原因是缺乏有效的早期诊断标志物。传统的诊断指标(血肌酐sCr、排尿量等)受诸多因素影响,如由于受年龄、性别、肌肉的质量、肌肉新陈代谢、药物使用及水合作用等因素的影响,sCr水平变化很大。另外sCr水平往往在AKI发生几天后才有显著升高。因此,sCr虽然是可靠的肾功能标志蛋白并在AKI的诊断过程中起了重要的作用。但由于以上缺点,sCr不是理想的AKI早期诊断标志蛋白。另外根据排尿量指标进行AKI诊断常常由于手术后一些病人的少尿症、利尿药物的使用及复杂操作过程等因素的影响而不能很好的、有效的反映肾功能损伤情况。敏感性和特异性均无法满足临床早期诊断的需求。目前,寻找特异、敏感、稳定的早期诊断标志物,从而达到早诊断、早防治AKI,成为降低重症患者病死率的关键。
科研工作者不断寻找AKI早期诊断标志物,目前多种具有临床应用潜力的AKI标志蛋白被相继报导,如中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL,neutrophil gelatinase-associatedlipocalin)、肾损伤分子-1(kidney injury molecμLe-1)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C(cystatin C)及白细胞介素-18(IL-18)等。其中NGAL为lipocalin(载脂蛋白)家族的一个新成员,在1993年于中性粒细胞内的过氧化物酶颗粒中被发现,其分子量为25kDa的分泌蛋白,在包括肾小管在内的一些组织器官的中性粒细胞和上皮细胞中表达。
中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白NGAL(neutrophil gelatinase-associatedlipocalin)为lipocalin(载脂蛋白)家族的一个新成员,在1993年于中性粒细胞内的过氧化物酶颗粒中被发现,其分子量为25kDa的分泌蛋白,在包括肾小管在内的一些组织器官的中性粒细胞和上皮细胞中表达。NGAL生理状态下是一种生长因子,主要参与了早期肾脏上皮的发生、生长。在正常组织包括肾脏,肺,胃及结肠的上皮组织中表达量较低。肾脏缺血再灌注损伤后,近曲小管上皮大量表达NGAL,且NGAL在肾脏中的表达会因不同原因的肾损伤而显著升高,并释放到尿液和血浆中。NGAL水平可在损伤的两个小时内,尿液和血液中NGAL水平将显著增加,比胱抑素C水平的升高提早24小时以上,而血清肌酐水平的升高则更晚。因此通过检测NGAL水平有助于在急性肾功能损伤发生后立即对肾功能进行评估并做出及时的处理,以降低死亡率。研究表明,NGAL不但可以作为早期诊断急性肾损伤AKI的诊断标志物,同时还能反应肾脏的损伤程度,因此NGAL是诊断AKI最有效的诊断标志物之一。
研究表明:健康人群尿液中NGAL平均浓度为5.3ng/mL(范围0.7ng/mL~9.6ng/mL),血浆中NGAL平均浓度63ng/mL(范围37ng/mL~106ng/mL)。肾损伤后NGAL水平急剧上升,重症监护室患者尿液中NGAL浓度可达到110ng/mL~40,000ng/mL,血浆中NGAL平均浓度25ng/mL~3491ng/mL。尿NGAL水平高于350ng/mL或血浆NGAL水平高于400ng/mL,急性肾功能衰竭阳性预测值约为90%。综上,NGAL的浓度波动范围整体相对较小,如何高灵敏度和高特异性的检测样本中的NGAL含量成为检测的关键。
NGAL的检测最初采用western blotting法,此方法在早期NGAL的定量研究过程中起过很重要的作用,但由于该方法灵敏度和精确性低、操作复杂、重复性差等缺点,现在已很少用于NGAL的定量研究。常用的检测NGAL的方法如胶体金法、免疫增强比浊法、胶乳免疫比浊法或酶联免疫检测法等。其中胶体金法,灵敏度较低,易出现假阳性,其结果易受主观因素的影响。免疫增强比浊法、胶乳免疫比浊法易受脂血的影响。酶联免疫检测法灵敏度低,主要是定性检测。其中化学发光酶免疫分析常用的发光标记物辣根过氧化物酶(HRP)虽然可以用于定量检测一些蛋白,但是HRP的底物发光是反应动力学复杂,重复性较差,不适宜检测浓度波动范围相对较小蛋白检测。
综上,传统的基于NGAL为诊断标志物的急性肾损伤的检测试剂盒灵敏度较低、特异性较差。
发明内容
基于此,有必要提供一种检测灵敏度较高、特异性较高的基于NGAL为诊断标志物的急性肾损伤的检测试剂盒。
一种急性肾损伤的检测试剂盒,包括第一检测液和第二检测液,所述第一检测液中含有磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体,所述第二检测液中含有碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体,其中,所述第一抗NGAL单克隆抗体和所述第二抗NGAL单克隆抗体分别针对不同的NGAL表位。
在一个实施方式中,所述第一抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-4F6分泌得到,所述杂交瘤细胞株NGAL-4F6的保藏号为CCTCC NO:C2016216。
在一个实施方式中,所述第二抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-2D8分泌得到,所述杂交瘤细胞株NGAL-2D8的保藏号为CCTCC NO:C2016215。
在一个实施方式中,所述磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体中,所述第一抗NGAL单克隆抗体与所述磁微粒的质量比为0.005~0.5:1。
在一个实施方式中,所述碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体中,所述碱性磷酸酶与所述第二抗NGAL单克隆抗体的摩尔比为1:0.5~4。
在一个实施方式中,所述第一检测液中还包括浓度为10mmol/L~100mmol/L的HEPES、质量分数为0.1%~30%的稳定剂、质量分数为0.2%~2%的无机盐、质量分数为0.2%~20%的蔗糖、质量分数为0.01%~1%的表面活性剂和质量分数为0.01%~1%的抑菌剂,所述第一检测液的pH值为6.5~8.5。
在一个实施方式中,所述第二检测液中还包括浓度为10mmol/L~200mmol/L的Tris-HCl、质量分数为0.2%~2%的无机盐和质量分数为0.01%~1%的抑菌剂,所述第二检测液的pH值为7.0~8.5。
在一个实施方式中,所述磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体中,所述磁微粒选自经羧基修饰的磁微粒、经甲苯磺酰基修饰的磁微粒、经氨基修饰的磁微粒、经巯基修饰的磁微粒、经环氧基修饰的磁微粒和经羟基修饰的磁微粒中的至少一种。
在一个实施方式中,还包括底物液,所述底物液能够与所述碱性磷酸酶反应产生信号变化。
在一个实施方式中,所述底物液选自AMPPD发光底物液、CSPD发光底物液、CDP-Star发光底物液和APS-5发光底物液中的至少一种。
上述急性肾损伤的检测试剂盒,包括第一检测液和第二检测液,第一检测液中含有磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体,第二检测液中含有碱性磷酸酶(AlkalinePhosphatase,AP或ALP)标记的第二抗NGAL单克隆抗体。其中,第一抗NGAL单克隆抗体和第二抗NGAL单克隆抗体分别针对不同的NGAL表位。检测时,向待测样品中加入第一检测液和第二检测液,待测样品中的NGAL能够夹心于第一抗NGAL单克隆抗体和第二抗NGAL单克隆抗体之间,根据碱性磷酸酶的发光信号即可测定待测样品中NGAL的含量。急性肾损伤的检测试剂盒至少具有以下有益效果:(1)该急性肾损伤的检测试剂盒基于NGAL(中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白)作为诊断检测的标志物进行检测,能够在急性肾损伤发生的早期快速检测诊断。(2)第一抗NGAL单克隆抗体上包被磁微粒,第二抗NGAL单克隆抗体上标记碱性磷酸酶,且第一抗NGAL单克隆抗体和第二抗NGAL单克隆抗体分别针对不同的NGAL表位,避免NGAL上的表位被屏蔽。(3)采用碱性磷酸酶(AP)标记第二抗NGAL单克隆抗体,与HRP相比,碱性磷酸酶(AP)具有稳定性更好、灵敏度更高的优点,碱性磷酸酶(AP)组份单一,基本没有自身发光,本底低,信噪比高等,反应动力学没有HRP底物复杂,影响因素少,使得检测结果更稳定,重复性好。该急性肾损伤的检测试剂盒检测的相关性好可测定线性范围宽且敏度较高、特异性较高。
附图说明
图1为测试例二中得到的NGAL的含量与发光值的对应关系曲线;
图2为测试五中实施例1的试剂盒与对照试剂盒检测18份NGAL临床样本相关性对比图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂,下面结合具体实施例及附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施,本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进,因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
一实施方式的急性肾损伤的检测试剂盒,包括第一检测液和第二检测液。第一检测液中含有磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体,第二检测液中含有碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体。其中,第一抗NGAL单克隆抗体和第二抗NGAL单克隆抗体分别针对不同的NGAL表位。
该急性肾损伤的检测试剂盒基于NGAL(中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白)作为诊断检测的标志物,能够在急性肾损伤发生的早期快速检测诊断。检测时,向待测样品中加入第一检测液和第二检测液,待测样品中的NGAL能够夹心于第一抗NGAL单克隆抗体和第二抗NGAL单克隆抗体之间,根据碱性磷酸酶的发光信号即可测定待测样品中NGAL的含量,检测方便快捷、操作简单。
具体地,第一抗NGAL单克隆抗体和第二抗NGAL单克隆抗体分别针对不同的NGAL表位,例如第一抗NGAL单克隆抗体和第二抗NGAL单克隆抗体分别通过两株不同的杂交瘤细胞分泌得到。NGAL通过不同的表位分别与第一抗NGAL单克隆抗体和第二抗NGAL单克隆抗体结合从而形成夹心结构,避免NGAL上的表位被屏蔽,检测灵敏度高,特异性好,提高检测的可测定线性范围。
在一个实施方式中,第一抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-4F6分泌得到。可分泌第一抗NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株NGAL-4F6于2016年12月14日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国.武汉.武汉大学,保藏号为CCTCC No:C2016216,分类命名:杂交瘤细胞株NGAL-4F6。
在一个实施方式中,第二抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-2D8分泌得到。可分泌第二抗NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株NGAL-2D8于2016年12月14日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国.武汉.武汉大学,保藏号为CCTCC No:C2016215,分类命名:杂交瘤细胞株NGAL-2D8。
经人的NGAL免疫小鼠后,筛选获得的杂交瘤细胞株NGAL-4F6和杂交瘤细胞株NGAL-2D8,两株杂交瘤细胞株分泌的抗体效价高。用磁微粒包被杂交瘤细胞株NGAL-4F6分泌的第一抗NGAL单克隆抗体,得到磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体。用碱性磷酸酶标记杂交瘤细胞株NGAL-2D8分泌的第二抗NGAL单克隆抗体,得到碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体。实验结果表明,上述磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体与碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体配合能够高灵敏度、高特异性的检测待测样品中的NGAL。
在其他实施方式中,还可以是第一抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-2D8分泌得到,而第二抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-4F6分泌得到。
具体地,第一检测液中含有磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体,通过磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体,将第一抗NGAL单克隆抗体固化,提高第一抗NGAL单克隆抗体与待测样品中的NGAL结合的稳定性。第二检测液中含有碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体,在第二抗NGAL单克隆抗体上标记碱性磷酸酶,通过碱性磷酸酶产生发光信号,快速测定待测样品中NGAL的含量。检测时,向待测样品中加入第一检测液和第二检测液后,第一检测液和第二检测液配合,形成磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体-待测样品中的NGAL-碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体(抗体-抗原-抗体)稳定的夹心结构,且第一抗NGAL单克隆抗体和第二抗NGAL单克隆抗体分别针对不同的NGAL表位,提高检测的灵敏度和特异性。
具体地,第一检测液中,磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体的浓度为0.1mg/mL~5mg/mL。第一抗NGAL单克隆抗体与磁微粒的质量比为0.005~0.5:1。磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体浓度适宜,准确测定待测样品中的NGAL的含量。
具体地,第二检测液中,碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体的浓度为0.5μg/mL~10μg/mL。含有碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体浓度适宜,准确测定待测样品中的NGAL的含量。
具体地,碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体中,碱性磷酸酶与第二抗NGAL单克隆抗体的摩尔比为1:0.5~4。碱性磷酸酶与第二抗NGAL单克隆抗体的摩尔比合适,线性较好。
在一个实施方式中,第一检测液中包括浓度为0.1mg/mL~5mg/mL的第一抗NGAL单克隆抗体、浓度为10mmol/L~100mmol/L的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、质量分数为0.1%~30%的稳定剂、质量分数为0.2%~2%的无机盐、质量分数为0.2%~20%的蔗糖、质量分数为0.01%~1%的表面活性剂和质量分数为0.01%~1%的抑菌剂。
具体地,第一检测液中的HEPES具有较好的缓冲能力,使得第一检测液的pH维持在7.0左右,使得磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体不易变性。
具体地,稳定剂能够促进磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体在第一检测液中分散避免产生团聚,提高检测的准确度。
在一个实施方式中,稳定剂可以选自牛血清蛋白(BSA)、酪蛋白和明胶中的至少一种。
具体地,无机盐能够调节离子浓度,使得第一检测液中的磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体不易变性。
在一个实施方式中,第一检测液中的无机盐可以选自氯化钠、氯化钾、氯化镁和氯化锌中的至少一种。
具体地,蔗糖能够增加第一检测液的黏度,促进磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体与待测样品中的NGAL形成稳定的结合。
具体地,第一检测液中的表面活性剂能够降低液体的表面张力,促进磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体在第一检测液中溶解。
在一个实施方式中,表面活性剂选自吐温-20和TritonX-100中的至少一种。
具体地,第一检测液中的抑菌剂能够抑制细菌的生长,使得第一检测液中的磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体具有长期稳定性。
在一个实施方式中,抑菌剂选自叠氮钠和PC-300中的至少一种。
在一个实施方式中,第一检测液中包括浓度为0.1mg/mL~5mg/mL的磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体、浓度为40mmol/L~60mmol/L的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、质量分数为0.5%~2%的BSA、质量分数为0.5%~2%的氯化钠(NaCl)、质量分数为1%~10%的蔗糖、质量分数为0.01%~1%的吐温-20和质量分数为0.01%~1%的PC-300。上述配方的第一检测液在检测时,抗干扰性能力强,检测液稳定。
具体地,第一检测液的pH值为6.5~8.5。研究过程中发现,磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体在pH值为6.5~8.5条件下性质稳定,因而采用第一检测液的pH值为6.5~8.5提高检测的准确性。
在一个实施方式中,第二检测液中包括浓度为0.5μg/mL~10μg/mL的碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体、浓度为10mmol/L~200mmol/L的Tris-HCl、质量分数为0.2%~2%的无机盐和质量分数为0.01%~1%的抑菌剂。
具体地,第二检测液中的Tris-HCl具有较好的缓冲能力,使得第二检测液的pH维持在7.5左右,使得碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体不易变性。
具体地,无机盐能够调节离子浓度,使得第二检测液中的碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体不易变性。
在一个实施方式中,第二检测液中的无机盐可以选自氯化钠、氯化钾、氯化镁和氯化锌中的至少一种。
具体地,抑菌剂能够抑制细菌的生长,使得第二检测液中的碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体具有长期稳定性。
在一个实施方式中,第二检测液中的抑菌剂选自叠氮钠和PC-300中的至少一种。
在一个实施方式中,第二检测液中包括浓度为0.5μg/mL~10μg/mL的碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体、浓度为50mmol/L~100mmol/L的Tris-HCl、质量分数为0.01%~1%的吐温-20和质量分数为0.01%~1%的PC-300。上述配方的第二检测液在检测时,抗干扰性能力强,检测液稳定。
具体地,第二检测液的pH值为7.0~8.5。研究过程中发现,碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体在pH值为7.0~8.5条件下性质稳定,因而采用第二检测液的pH值为7.0~8.5提高检测的准确性。
进一步地,第一检测液的pH值小于第二检测液的pH值。
在一个实施方式中,磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体中,磁微粒选自经羧基修饰的磁微粒、经甲苯磺酰基修饰的磁微粒、经氨基修饰的磁微粒、经巯基修饰的磁微粒、经环氧基修饰的磁微粒和经羟基修饰的磁微粒中的至少一种。
具体地,经羧基修饰的磁微粒包括经亲水性羧基修饰的磁微粒和经疏水性羧基修饰的磁微粒。
经羧基、甲苯磺酰基、氨基、巯基、环氧基或羟基修饰活化后的磁微粒具有亲水性好、低吸附、本底低的优点,对抗体活性损伤小。
本实施方式中,磁微粒为经羧基修饰的磁微粒。
在一个实施方式中,磁微粒为磁珠,磁珠的粒径为1.0μm~3.0μm。
在一个实施方式中,碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体中,第二抗NGAL单克隆抗体与待测液中的NGAL结合后,碱性磷酸酶能够在底物液的作用下产生信号变化,根据信号的变化计算待测液中的NGAL的含量。
在一个实施方式中,该急性肾损伤的检测试剂盒还包括发光底物,底物能够与碱性磷酸酶反应产生信号变化。底物液例如液可以选自AMPPD发光底物液、CSPD发光底物液、CDP-Star发光底物液和APS-5发光底物液中的至少一种。
在一个实施方式中,该急性肾损伤的检测试剂盒还包括NGAL标准品,NGAL标准品用于制备标准曲线,从而计算待测样品中的NGAL含量。
在其他的实施例中,上述急性肾损伤的检测试剂盒也可以不包括底物液和NGAL标准品,使用者自行配制即可。
上述急性肾损伤的检测试剂盒基于NGAL(中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白)作为诊断检测的标志物进行检测,能够在急性肾损伤发生的早期快速检测诊断。第一抗NGAL单克隆抗体上包被磁微粒,第二抗NGAL单克隆抗体上标记碱性磷酸酶,且第一抗NGAL单克隆抗体和第二抗NGAL单克隆抗体分别针对不同的NGAL表位,避免NGAL上的表位被屏蔽。采用碱性磷酸酶(AP)标记第二抗NGAL单克隆抗体,与HRP相比,碱性磷酸酶(AP)具有稳定性更好、灵敏度更高的优点,碱性磷酸酶(AP)组份单一,基本没有自身发光,本底低,信噪比高等,反应动力学没有HRP底物复杂,影响因素少,使得检测结果更稳定,重复性好。该急性肾损伤的检测试剂盒检测的相关性好可测定线性范围宽且敏度较高、特异性较高。
以下为具体实施例。
实施例中采用药物和仪器如非特别说明,均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如文献、书本中所述的条件或者试剂盒生产厂家推荐的方法实现。
实施例1
该急性肾损伤的检测试剂盒中包括第一检测液、第二检测液、底物液以及NGAL标准品。其中第一检测液中含有浓度为0.5mg/mL磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体(磁微粒与第一抗NGAL单克隆抗体的质量比为10μg:1mg)、浓度为50mmol/L的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、质量分数为1%的BSA、质量分数为1%的氯化钠(NaCl)、质量分数为5%的蔗糖、质量分数为0.1%的吐温-20和质量分数为0.1%的PC-300,余量的超纯水,第一检测液的pH值为7.0。第二检测液中含有浓度为1μg/mL的碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体(碱性磷酸酶与第二抗NGAL单克隆抗体的摩尔比为1:1)、浓度为100mmol/L的Tris-HCl、浓度为1mmol/L的MgCl2、浓度为1mmol/L的ZnCl2、浓度为100mmol/L的NaCl和质量分数为0.5%的PC-300,余量的超纯水,第二检测液的pH值为7.6。第一抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-4F6(保藏号为CCTCC No:C2016216)分泌得到。第二抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-2D8(保藏号为CCTCC No:C2016215)分泌得到。底物液为APS-5发光底物液,NGAL标准品为人源的NGAL蛋白。
上述急性肾损伤的检测试剂盒的制备方法包括以下步骤:
一、杂交瘤细胞株的建立
1、NGAL免疫小鼠
将NGAL(NGAL-Ag1,菲鹏生物)稀释到1.0mg/mL,与弗氏完全佐剂(Sigma-Aldrich公司,货号:F5881)等体积混合,并充分乳化,得到油状乳液。将该乳液以0.2mL的剂量皮下施给BALB/c小鼠(广东省医学实验动物中心:广东省佛山市南海黄岐鄱阳路119号,6周龄雌性,5只)背部位点。第一次免疫14天后腹腔增强免疫,即等量抗原与弗氏不完全佐剂(Sigma-Aldrich公司,F5506)等体积混合,增强免疫到四针后,采尾血,分离血清,用间接ELISA法测定效价,效价高于1:10000即可用于融合。
融合前3天,用相同剂量抗原与等体积0.9%氯化钠注射液混合腹腔注射追加免疫,免疫方法同上。
2、杂交瘤细胞系的制备
(1)饲养细胞的制备
以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。在融合前1天,BALB/c鼠拉颈处死,75%酒精全身浸泡,超净台内,无菌操作下用剪刀剪开腹部皮肤,暴露腹膜。用注射器腹腔注入RPMI 1640基础培养液5mL,反复冲洗,回收冲洗液,1000rpm,离心5分钟,留沉淀,用RPMI1640筛选培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液中)重悬,调整细胞浓度1×105个/mL,加入96孔板,150μL/孔,37℃,5%CO2培养过夜。
(2)免疫脾细胞的制备
小鼠末次免疫后三天,在无菌条件下取出脾脏,置于平皿中,RPMI 1640基础培养液冲洗一次,放于小烧杯的尼龙网上磨碎过滤,制成细胞悬液。离心,弃上清,RPMI 1640基础培养液重悬,如此重复三次,计数。
(3)骨髓瘤细胞的制备
小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0(菲鹏生物股份有限公司保存)经8-氮鸟嘌呤筛选后,培养至对数生长期,取两大瓶制成细胞悬液,离心,弃上清,用RPMI 1640基础培养液重悬,如些重复三次,计数。
(4)细胞融合及HAT选择杂交瘤
将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10比例混合,在50mL塑胶离心管内用RPMI 1640基础培养液洗1次,1200rpm,离心8分钟。弃上清,将细胞混匀,缓慢加入1mL 50%的PEG1500融合,融合1分钟后加入15mL的RPMI 1640基础培养液终止细胞融合。1000rpm,离心5分钟。弃上清,用50mL的RPMI 1640筛选培养液轻轻混悬,平分于10块铺有饲养细胞的96孔板,50μL/孔,37℃,5%CO2培养。培养至第六天,换HT培养液(含HT的RPMI 1640完全培养液)两次。
(5)抗体的检测
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释PK2-NGAL蛋白使其终浓度为2μg/mL。每孔0.1mL加入96孔聚苯乙烯板,37℃孵育2小时或4℃过夜。次日,用含10%小牛血清或1%脱脂奶粉的0.02M pH7.2PBS,0.15mL/孔,37℃封闭2小时,用于检测。上述杂交瘤细胞重组融合后第七天,取细胞上清稀释不同倍数后取0.1mL于上述96孔检测板中,37℃30分钟,PBST洗五次后加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG(菲鹏生物股份有限公司生产,货号GRCGAMS001),37℃30分钟同上洗后,每孔加入100μL含0.1%(M/V)邻苯二胺,0.1%(V/V)双氧水,pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液,37℃15分钟,加入稀硫酸溶液,每孔50μL,测450nm吸收值。RPMI 1640完全培养液作为阴性对照,共检测有杂交瘤细胞的384孔,最终获得32株稳定分泌抗人NGAL的细胞株。细胞培养上清效价2.28×103以上。
3.单克隆抗体的制备
选6-8周健壮的BALB/c小鼠,每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷;10天后腹腔注射1×106个杂交瘤细胞。接种细胞7~10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状况与腹水征象,待腹水尽可能多,而小鼠频于死亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中,一般一只小鼠可获5~10mL腹水。收集腹水,离心取上清,用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤。将所得的滤液在1mL/min的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G亲和层析柱(GE公司)。然后用PBS以1mL/min的流速洗涤未被蛋白G吸附的物质直至在OD280nm下的吸附值达到基线为止。再用0.1M的甘氨酸洗脱液(pH2.5)洗脱并回收该抗体。所回收的抗体立即用0.1M Tris(pH8.8)中和,跑胶测浓度。上述可分泌抗人NGAL杂交瘤腹水抗体效价2.77×106以上。
4.单克隆抗体表位鉴定
用0.06M pH9.6碳酸缓冲溶液稀释纯化好的待鉴定单抗使其终浓度为1μg/mL。每孔0.1mL加入96孔聚苯乙烯板,37℃孵育2小时或4℃过夜。次日,用含10%小牛血清或1%脱脂奶粉的0.02M pH7.2PBS,0.15mL/孔,37℃封闭2小时,加入2000倍稀释的辣根过氧化酶标记的NGAL表位鉴定抗原,37℃30分钟,PBST洗5次,拍干,每孔加入100μL含0.1%(M/V)邻苯二胺,0.1%(V/V)双氧水,pH5.0柠檬酸磷酸缓冲液,37℃15分钟,加入稀硫酸溶液,每孔50μL,测450nm吸收值,根据反应区分表位。筛选获得两株分别针对不同的NGAL表位的细胞株,其中一株可分泌第一抗NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株NGAL-4F6,于2016年12月14日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国.武汉.武汉大学,保藏号为CCTCC No:C2016216,分类命名:杂交瘤细胞株NGAL-4F6。另一株可分泌第二抗NGAL单克隆抗体的杂交瘤细胞株NGAL-2D8,于2016年12月14日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国.武汉.武汉大学,保藏号为CCTCC No:C2016215,分类命名:杂交瘤细胞株NGAL-2D8。
二、制备磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体
1)将0.2mL的1mg/mL第一抗NGAL单克隆抗体(由杂交瘤细胞株NGAL-4F6分泌)装入透析袋,在活化缓冲液(15mmol/L的MES:2-(N-吗啡啉)乙磺酸)中透析至pH 6.0。
2)取10mg粒径为3.0μm的羧基化磁微粒(JSR MagnosphereTM MS300/Carboxyl)悬浮液,磁分离去上清,用清洗缓冲液(15mmol/LMES+0.1%Tween20,pH 6.0)洗涤4次,每次1mL,最后加800μL活化缓冲液(15mmol/L的MES),超声分散。
3)分别称取1mg EDC,1mgNHS用0.1mL活化缓冲液(预冷)溶解至10mg/mL。将溶好的NHS和EDC先后加入清洗好并定容的磁珠中,混合比例为:800μL磁珠+100μLNHS+100μLEDC混合均匀后旋转孵育器上25度,20rmp反应30min。
4)活化好的磁珠用1mL清洗缓冲液清洗一次,加入1mL清洗缓冲液重悬。
5)将透析后的第一抗NGAL单克隆抗体加入清洗好并重悬的磁珠,混合均匀后旋转孵育器上4度,20rmp反应16h~24h,得到磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体。
6)将磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体用1mL清洗缓冲洗两次,洗的过程中超声重悬。
7)将洗好的磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体用1mL封闭液(清洗缓冲液+1%BSA)重悬,并超声,旋转孵育器上25度,20rmp反应2h。
8)将封闭完成的磁珠用1mL存储液(50mM Tris+1%BSA,PH7.5)重悬,终浓度10mg/mL固体含量,+2~+8℃保存备用。
三、制备碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体(采用采用SMCC/2-IT标记法)
1)脱盐柱处理:取2只2mL的Thermo 7K MWCO脱盐柱,标为第一脱盐柱和第二脱盐柱。第一脱盐用第一缓冲液平衡6次,第二脱盐柱用第二缓冲液平衡6次,备用。其中第一缓冲液包含0.1mol/L的PB(磷酸盐)+100mmol/L的NaCl+1mmol/L的EDTA,pH=7.5。第二缓冲液包含0.1mol/LPB+1mmol/L的MgCl2+1mmol/L的ZnCl2+100mmol/L的NaCl+1mmol/L的EDTA,pH=7.3。
2)抗体处理:将4mg/mL的第二抗NGAL单克隆抗体(由杂交瘤细胞株NGAL-2D8分泌)装入透析袋,用透析液透析4h,每小时换液一次。透析液中含有0.1mol/L PB+100mmol/L的NaCl+0.1%TW-20+1mmol/L的EDTA,pH=8.5。
碱性磷酸酶处理:将碱性磷酸酶稀释至16mg/mL加入透析袋中透析,透析液中含有0.1mol/LPB+1mmol/L的MgCl2+1mmol/L的ZnCl2+100mmol/L的NaCl+0.1%TW-20,pH=7.6,透析4h每小时换液一次。
3)称取所需重量的LC-SMCC(交联剂)溶于相应体积的纯化水中,配成40mmol/L。称取所需重量的2-IT(2-Iminothiolane HCl,2-亚氨基硫烷盐酸盐)溶于相应体积的纯化水中,配成10mmol/L。
4)将处理好的SMCC/2-IT按标记比例(碱性磷酸酶:SMCC摩尔比约为1:12,第二抗NGAL单克隆抗体:2-IT摩尔比约为1:15),取所需体积加入到碱性磷酸酶、抗体的中,反应15min,然后分别加入1M甘氨酸封闭10min。
5)反应时间结束后,将已经活化好的抗体、碱性磷酸酶分别用已经处理好第一脱盐柱和第二脱盐柱进行脱盐。
6)将5)中得到的两份溶液进行混匀,放置在4度,反应16h~24h;
7)取出已经交联完成溶液,平衡值室温,加入纯化水溶解的12.5mg/mL NEM(N-乙基马来酰亚胺)10μL,室温反应30min.
8)将7)溶液透析脱盐,透析液中含有0.1mol/L Tris+1mmol/L的MgCl2+1mmol/L的ZnCl2+100mmol/L的NaCl+0.5%PC-300,pH=7.6。透析4h每小时换液一次,透析后补加50%甘油混匀,-20℃保存。
四、制备第一检测液
将磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体溶解在缓冲液中得到第一检测液,其中第一检测液中包括0.5mg/mL的磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体、50mmol/L的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、质量分数为1%的BSA、质量分数为1%的氯化钠(NaCl)、质量分数为5%的蔗糖、质量分数为0.1%的吐温-20和质量分数为0.1%的PC-300,余量的超纯水。第一检测液的pH值为7.0。
五、制备第二检测液
将碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体溶解在缓冲液中得到第二检测液,其中第二检测液中包括1μg/mL的碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体、浓度为100mmol/L的Tris-HCl、浓度为1mmol/L的MgCl2、浓度为1mmol/L的ZnCl2、浓度为100mmol/L的NaCl和质量分数为0.5%的PC-300,余量的超纯水,第二检测液的pH值为7.6。
六、制备NGAL校准品
用定标缓冲液(40mmol/L Tris-HCl,0.5%BSA,1%NaCl,pH8.0)将NGAL(NGAL-Ag1,菲鹏生物)配置成浓度分别为1500ng/mL、300ng/mL、60ng/mL、12ng/mL、2.4ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0ng/mL,每瓶0.5mL分装冻干,4度保存备用。
实施例2
该急性肾损伤的检测试剂盒中包括第一检测液、第二检测液以及NGAL标准品。其中第一检测液中含有浓度为0.5mg/mL磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体(磁微粒与第一抗NGAL单克隆抗体的质量比为30μg:1mg)、浓度为60mmol/L的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、质量分数为2%的BSA、质量分数为2%的氯化钠(NaCl)、质量分数为10%的蔗糖、质量分数为1%的吐温-20和质量分数为0.1%的PC-300,余量的超纯水,第一检测液的pH值为7.0。第二检测液中含有浓度为1μg/mL的碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体(碱性磷酸酶与第二抗NGAL单克隆抗体的摩尔比为1:4)、浓度为100mmol/L的Tris-HCl、浓度为1mmol/L的MgCl2、浓度为1mmol/L的ZnCl2、浓度为100mmol/L的NaCl和质量分数为0.5%的PC-300,余量的超纯水,第二检测液的pH值为7.6。第一抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-4F6(保藏号为CCTCC No:C2016216)分泌得到。第二抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-2D8(保藏号为CCTCC No:C2016215)分泌得到。NGAL标准品为人源的NGAL蛋白。
实施例3
该急性肾损伤的检测试剂盒中包括第一检测液、第二检测液。其中第一检测液中含有浓度为0.5mg/mL磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体(磁微粒与第一抗NGAL单克隆抗体的质量比为5μg:1mg)、浓度为40mmol/L的HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)、质量分数为10%的BSA、质量分数为2%的氯化钠(NaCl)、质量分数为10%的蔗糖、质量分数为1%的吐温-20和质量分数为0.1%的PC-300,余量的超纯水,第一检测液的pH值为7.0。第二检测液中含有浓度为1μg/mL的碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体(碱性磷酸酶与第二抗NGAL单克隆抗体的摩尔比为1:0.5)、浓度为100mmol/L的Tris-HCl、浓度为1mmol/L的MgCl2、浓度为1mmol/L的ZnCl2、浓度为100mmol/L的NaCl和质量分数为0.5%的PC-300,余量的超纯水,第二检测液的pH值为7.6。第一抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-4F6(保藏号为CCTCCNo:C2016216)分泌得到。第二抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-2D8(保藏号为CCTCCNo:C2016215)分泌得到。
测试例一
包被浓度以及标记比例
使用不同浓度的第一抗NGAL单克隆抗体包被磁性微球,第一抗NGAL单克隆抗体与磁性微球的质量比分别为5μg/mg、10μg/mg、20μg/mg、30μg/mg。使用NGAL标准品作为检测样本,加入足量的含有碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体。用Thermo ScientificTMLuminoskanTM Ascent化学发光分析仪读值,分别测定不同浓度下的RLU值,并统计标准曲线的相关性,结果如表1所示。
表1:不同包被比例的RLU值
从表1可以看出:(1)随着包被浓度的上升,RLU值有明显上升,但是本底变化不大。5μg/mg~30μg/mg的范围内,相关性均较好。综合考虑选择10μg/mg为较好的包被浓度。
然后使用不同标记比例(摩尔比)的碱性磷酸酶(购自BBI,货号:ALPI12G)标记第二抗NGAL单克隆抗体,标记比例分别为1:0.5、1:1、1:2、1:4(碱性磷酸酶与第二抗NGAL单克隆抗体的摩尔比)。使用NGAL标准品作为检测样本,加入足量的含有磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体。用Thermo ScientificTM LuminoskanTM Ascent化学发光分析仪读值,分别测定不同浓度下的RLU值,并统计标准曲线的相关性,结果如表2所示。
表2:不同标记比例的RLU值
从表2可以看出:(1)随随着标记比例的提高,RLU值有明显上升,但是本底变化不大。1:0.5~4的范围内,相关性均较好。综合考虑选择1:1为较好的标记比例。
测试例二
制定标准工作曲线
在反应容器中分别加入50μL NGAL校准品(浓度分别为30000ng/mL、10000ng/mL、3000ng/mL、1500ng/mL、300ng/mL、60ng/mL、12ng/mL、2.4ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL、0ng/mL),然后加入50μL的实施例1试剂盒中的第一检测液和50μ实施例1试剂盒中的第二检测液,反应10min,用50mmol/LTris+0.05%吐温-20,pH 7.5,洗5次。加入100μLAPS-5发光底物液(北京市华信行生物科技有限公司,货号:APSUB-2-500)反应5min,用ThermoScientificTM LuminoskanTM Ascent化学发光分析仪读值。不同浓度的标准品的发光值如表3所示。
表3:不同浓度的标准品的发光值
校准品浓度ng/mL | RLU |
0 | 621 |
0.5 | 1124 |
1 | 1742 |
2.4 | 3152 |
12 | 14085 |
60 | 70125 |
300 | 314589 |
1500 | 1386425 |
3000 | 2041263 |
10000 | 2548651 |
30000 | 2621856 |
分别计算不同线性宽度下的相关性,结果如表4。
表4:不同线性宽度下的相关性
线性宽度ng/mL | 相关性 |
0~1500 | 0.9996 |
0.5~1500 | 0.9996 |
1~1500 | 0.9996 |
0~3000 | 0.9882 |
0.5~3000 | 0.8733 |
1~3000 | 0.7408 |
不论选哪一个范围,线性相关性均较好。综合考虑选择0ng/mL~1500ng/mL线性范围,得检测用的校准曲线,(如图1所示),图1曲线上每个点代表一个含量的标准品,其中x轴表示NGAL的含量,y轴表示发光值。从图中可以看出,用实施例1的试剂盒检测NGAL,建立的NGAL的含量与发光值建立的标准曲线线性关系好、线性范围宽。
测试例三
分析灵敏度测定
用实施例1的试剂盒检测20次定标缓冲液(40mmol/L Tris-HCl,0.5%BSA,1%Nacl,pH8.0)。定标缓冲液中不含NGAL,以定标缓冲液的数据作为检测的基准线。记录发光值结果见表5。
表5:分析灵敏度实验数据
然后根据平均值MEAN和标准偏差SD,计算MEAN+2SD,利用校准曲线换算过来的浓度即试剂盒分析灵敏度为0.6269ng/mL。说明实施例1的试剂盒检测灵敏度高。
测试例四
精密度测定
用实施例1的试剂盒检测2个浓度NGAL抗原(12ng/mL、300ng/mL),在一日内每份样本重复检测10次,结果见表6。
表6:精密度实验数据
结果显示变异系数(CV)均小于5%,说明实施例1的试剂盒检测精密度高。
测试例五
临床相关性检测
使用实施例1的试剂盒,采用Thermo ScientificTM LuminoskanTM Ascent化学发光分析仪对80份临床尿液样本检测,通过中生Thermo ScientificTLuminoskanTM Ascent化学发光分析仪读值,并带入标准曲线计算NGAL含量。同样的样本用雅培尿中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)再次检测,将实施例1的试剂盒的检测结果与对照组的结果进行相关性分析,结果如图2所示。结果显示实施例1的试剂盒的检测结果与对照试剂盒的结果相关性很高。说明实施例1的试剂盒检测灵敏度高、特异性高。
测试例六
将实施例1的急性肾损伤的检测试剂盒中的第一检测液和第二检测液进行37度6天热破实验,选取校准品4个浓度点进行检测,结果如表7。
表7:实施例1试剂盒稳定性分析
校准品浓度(ng/mL) | 4度保存RLU | 37度6天RLU | 跌幅 |
2.4 | 3114 | 2860 | -8.14% |
12 | 14677 | 12894 | -12.15% |
60 | 71264 | 66605 | -6.54% |
300 | 326483 | 309495 | -5.20% |
从表7可以看出,热破后波动均在15%以内,稳定性合格。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种急性肾损伤的检测试剂盒,其特征在于,包括第一检测液和第二检测液,所述第一检测液中含有磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体,所述第二检测液中含有碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体,其中,所述第一抗NGAL单克隆抗体和所述第二抗NGAL单克隆抗体分别针对不同的NGAL表位。
2.根据权利要求1所述的急性肾损伤的检测试剂盒,其特征在于,所述第一抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-4F6分泌得到,所述杂交瘤细胞株NGAL-4F6的保藏号为CCTCCNO:C2016216。
3.根据权利要求1所述的急性肾损伤的检测试剂盒,其特征在于,所述第二抗NGAL单克隆抗体由杂交瘤细胞株NGAL-2D8分泌得到,所述杂交瘤细胞株NGAL-2D8的保藏号为CCTCCNO:C2016215。
4.根据权利要求1所述的急性肾损伤的检测试剂盒,其特征在于,所述磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体中,所述第一抗NGAL单克隆抗体与所述磁微粒的质量比为0.005~0.5:1。
5.根据权利要求1所述的急性肾损伤的检测试剂盒,其特征在于,所述碱性磷酸酶标记的第二抗NGAL单克隆抗体中,所述碱性磷酸酶与所述第二抗NGAL单克隆抗体的摩尔比为1:0.5~4。
6.根据权利要求1所述的急性肾损伤的检测试剂盒,其特征在于,所述第一检测液中还包括浓度为10mmol/L~100mmol/L的HEPES、质量分数为0.1%~30%的稳定剂、质量分数为0.2%~2%的无机盐、质量分数为0.2%~20%的蔗糖、质量分数为0.01%~1%的表面活性剂和质量分数为0.01%~1%的抑菌剂,所述第一检测液的pH值为6.5~8.5。
7.根据权利要求1所述的急性肾损伤的检测试剂盒,其特征在于,所述第二检测液中还包括浓度为10mmol/L~200mmol/L的Tris-HCl、质量分数为0.2%~2%的无机盐和质量分数为0.01%~1%的抑菌剂,所述第二检测液的pH值为7.0~8.5。
8.根据权利要求1所述的急性肾损伤的检测试剂盒,其特征在于,所述磁微粒包被的第一抗NGAL单克隆抗体中,所述磁微粒选自经羧基修饰的磁微粒、经甲苯磺酰基修饰的磁微粒、经氨基修饰的磁微粒、经巯基修饰的磁微粒、经环氧基修饰的磁微粒和经羟基修饰的磁微粒中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的急性肾损伤的检测试剂盒,其特征在于,还包括底物液,所述底物液能够与所述碱性磷酸酶反应产生信号变化。
10.根据权利要求9所述的急性肾损伤的检测试剂盒,其特征在于,所述底物液选自AMPPD发光底物液、CSPD发光底物液、CDP-Star发光底物液和APS-5发光底物液中的至少一种。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710737470.XA CN107677809A (zh) | 2017-08-24 | 2017-08-24 | 急性肾损伤的检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201710737470.XA CN107677809A (zh) | 2017-08-24 | 2017-08-24 | 急性肾损伤的检测试剂盒 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN107677809A true CN107677809A (zh) | 2018-02-09 |
Family
ID=61136028
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201710737470.XA Pending CN107677809A (zh) | 2017-08-24 | 2017-08-24 | 急性肾损伤的检测试剂盒 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN107677809A (zh) |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108663511A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-10-16 | 苏州佑君环境科技有限公司 | 一种碱性磷酸酶抗原抗体专用稀释液 |
WO2019037043A1 (zh) * | 2017-08-24 | 2019-02-28 | 菲鹏生物股份有限公司 | 急性肾损伤的检测试剂盒 |
US20210030581A1 (en) * | 2018-01-29 | 2021-02-04 | The University Of Bath | Sensor for locating within a urinary drainage bag |
CN112904023A (zh) * | 2021-01-20 | 2021-06-04 | 宁波海壹生物科技有限公司 | 一种降钙素原化学发光免疫检测试剂盒 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102967714A (zh) * | 2012-12-10 | 2013-03-13 | 天津市协和医药科技集团有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测试剂盒 |
CN103946709A (zh) * | 2011-09-07 | 2014-07-23 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 基于l-fabp诊断急性事件后或外科手术后的肾损伤 |
CN104849469A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-08-19 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测ngal含量的试剂盒及其制备方法 |
CN105911296A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-08-31 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | Ⅳ型胶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 |
CN106645762A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-05-10 | 菲鹏生物股份有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
-
2017
- 2017-08-24 CN CN201710737470.XA patent/CN107677809A/zh active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN103946709A (zh) * | 2011-09-07 | 2014-07-23 | 霍夫曼-拉罗奇有限公司 | 基于l-fabp诊断急性事件后或外科手术后的肾损伤 |
CN102967714A (zh) * | 2012-12-10 | 2013-03-13 | 天津市协和医药科技集团有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白化学发光检测试剂盒 |
CN104849469A (zh) * | 2015-04-16 | 2015-08-19 | 广州市达瑞生物技术股份有限公司 | 一种检测ngal含量的试剂盒及其制备方法 |
CN105911296A (zh) * | 2016-06-30 | 2016-08-31 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | Ⅳ型胶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法 |
CN106645762A (zh) * | 2016-12-27 | 2017-05-10 | 菲鹏生物股份有限公司 | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2019037043A1 (zh) * | 2017-08-24 | 2019-02-28 | 菲鹏生物股份有限公司 | 急性肾损伤的检测试剂盒 |
US20210030581A1 (en) * | 2018-01-29 | 2021-02-04 | The University Of Bath | Sensor for locating within a urinary drainage bag |
CN108663511A (zh) * | 2018-05-25 | 2018-10-16 | 苏州佑君环境科技有限公司 | 一种碱性磷酸酶抗原抗体专用稀释液 |
CN112904023A (zh) * | 2021-01-20 | 2021-06-04 | 宁波海壹生物科技有限公司 | 一种降钙素原化学发光免疫检测试剂盒 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN107677809A (zh) | 急性肾损伤的检测试剂盒 | |
Grebenschikov et al. | A sensitive and robust assay for urokinase and tissue-type plasminogen activators (uPA and tPA) and their inhibitor type I (PAI-1) in breast tumor cytosols | |
CN106645762B (zh) | 中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白检测试剂盒 | |
CN103073642B (zh) | Crp单克隆抗体纳米乳胶微球组合物及制备工艺 | |
CN102072957B (zh) | 丙型肝炎病毒抗体诊断试剂盒及其制备方法 | |
CN103913579B (zh) | 一种降钙素原检测试剂盒 | |
JP5147709B2 (ja) | ヒトシスタチンcを評価するための比濁イムノアッセイ | |
DK163839B (da) | Fremgangsmaade til bestemmelse af antigener ved hjaelp af tre eller flere monoklonale antistoffer, og et proeveudstyr til brug ved fremgangsmaaden | |
CN106932589A (zh) | 测定人体血清视黄醇结合蛋白含量的试剂盒及其制备方法 | |
CN105699653A (zh) | 一种超敏感超顺磁性纳米免疫微球及其检测gp73抗原的方法 | |
EP2714744A1 (en) | Lysyl oxidase-like 2 assay and methods of use thereof | |
CN108982861A (zh) | 一种血管扩张型刺激磷蛋白检测试剂盒 | |
CN105277711A (zh) | 一种用于检测he4的酶联免疫试剂盒 | |
CN103308681A (zh) | 胰蛋白酶原-2检测试剂盒及制备方法 | |
KR20180093179A (ko) | 천식 또는 알레르기 질환 신속 진단용 키트 | |
CN107525938A (zh) | 急性肾损伤的检测试剂盒 | |
CN105717293B (zh) | 一种用于检测猪圆环病毒2型的试剂盒 | |
CN106404731A (zh) | 一种同时检测细菌性和病毒性脑膜炎的pct与crp双标记时间分辨荧光免疫分析方法 | |
CN102368068B (zh) | 检测肺炎衣原体IgM抗体的试剂盒 | |
CN103525769B (zh) | 可分泌抗视黄醇结合蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及应用 | |
RU2310853C1 (ru) | Способ и набор для иммуноферментного определения активности и ингибирования iga1-протеазы | |
KR100207351B1 (ko) | 항 인체 플라스민-알파2-플라스민 억제물질 복합체 항체, 하이브리도마 및 면역학적 측정방법 | |
CN103575878A (zh) | 一种水产品中氯霉素化学发光酶联免疫检测试剂盒及其检测方法 | |
Navarro et al. | Diagnosis of systemic candidiasis by enzyme immunoassay detection of specific antibodies to mycelial phase cell wall and cytoplasmic candidal antigens | |
CN111217910B (zh) | 单克隆抗体对及其在检测髓过氧化物酶蛋白中的应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180209 |