CN102292637B - 用于检测或监测急性肾损伤的方法、装置和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
检测个体急性肾损伤的方法包括(a)将所述个体的体液样品与包括嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体和可检测标记的测定装置接触，以使得样品中的NGAL蛋白与NGAL抗体复合；和使用可检测的标记确定样品中的NGAL蛋白与测定装置中的NGAL抗体之间形成的复合物的量，其中装置中的NGAL抗体具有与超过两种NGAL蛋白表位结合的能力，并且所形成的复合物的量代表急性肾损伤的水平。确定个体样品中NGAL蛋白来源的方法包括确定样品中NGAL蛋白的单体、二聚体和异二聚体形式的相对量的步骤，从而使改进的诊断和更好的靶向治疗成为可能。
Description
发明领域
本发明涉及用于检测或监测急性肾损伤的方法、装置和试剂盒；特别是涉及这样的方法和试剂盒，其基于对嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)(亦称作人嗜中性粒细胞脂质运载蛋白(HNL))的测量。
发明背景
急性肾损伤(AKI)是严重的病症，其可在手术后发生，例如作为心脏手术或肾移植的并发症；作为体内引入诊断剂的副作用，例如X光造影剂、或肾中毒治疗剂等；和/或与其它医学病症相关联，例如糖尿病、败血病、出血性休克等。举例来说，急性肾损伤在高达30％的所有经历心脏手术的患者中发生，并且关联了高死亡率、更复杂的住院过程、透析依赖性、生活质量下降、以及更高的感染性并发症风险。尽管在急性肾衰竭早期引入治疗已经显示降低死亡率和/或缩短治疗方案，但通常很难在早期检测到急性肾衰竭。
在目前的临床实践中，AKI的标准诊断被称为RIFLE(增加(Rise)、损伤(Injury)、衰竭(Failure)、丧失(Loss)、末期肾病(End-stage renal disease))，其是基于血清肌酸酐的提升或者尿液输出的减少。血清肌酸酐是一般肾功能的可靠标志物，但它在肾功能的急性变化中是不可靠的并且是延迟的指标。幸运地是，已经发现了数种有希望的新生物标志物，包括HNL/NGAL(此后称为NGAL)、肾损伤分子-1、半胱氨酸蛋白酶抑制剂C、和IL-18。
NGAL蛋白作为急性肾损伤标志物的用途已经受到了大量的关注。NGAL是糖蛋白，最初被鉴定为嗜中性粒细胞特异性颗粒成分以及脂质运载蛋白家族的蛋白成员。该蛋白显示出以25-kDa的单体和45-kDa二硫键连接的同二聚体存在，它还可以通过分子间二硫桥与嗜中性粒细胞明胶酶(亦称为基质金属蛋白酶9，MMP-9)共价复合成135-kDa的异二聚体形式。NGAL由Xu等(Journal of Immunological Methods，171：245-252(1994))首次将描述为HNL，作为体内和体外的嗜中性粒细胞活性的特异性标志物；并被用做炎症的诊断标志物(Venge，美国专利号6,136,526，其在此引入作为参考)。
最近，Devarajan等人(美国专利公开号2004/0219603A1和2005/0272101A1)公开了NGAL作为肾小管细胞损伤和其他肾疾病和损伤的生物标志物的用途。BioBorto Diagnostics，Gentofte，Denmark最近提供了用于急性肾衰竭早期诊断的“NGAL ELISA Kit”、以及小鼠单克隆抗人NGAL抗体和小鼠单克隆抗大鼠NGAL抗体。此外，Dent等人(Critical Care，11(6)：R127(2007))描述了来自Biosite Inc.，San Diego，CA的TriageNGAL装置，利用与荧光纳米颗粒缀合的NGAL特异性单克隆抗体，用于作为急性肾损伤生物标志物测量NGAL。
然而，在检测和/或监测急性肾损伤方面的进一步提高是有需要的。
发明概述
因此，本发明提供用于检测急性肾损伤和用于对急性肾损伤治疗的效果进行监测的方法、装置和试剂盒。
在一个实施方案中，本发明涉及用于检测个体中急性肾损伤的方法，包括(a)将来自所述个体的体液样品与包括嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体和可检测标记的测定装置接触，以使得样品中的NGAL蛋白与NGAL抗体复合；和(b)使用可检测的标记来确定样品中的NGAL蛋白与测定装置中的NGAL抗体之间形成的复合物的量，其中装置中的NGAL抗体具有与超过两种NGAL蛋白表位结合的能力，并且其中所形成的复合物的量代表急性肾损伤的水平。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于检测个体中急性肾损伤的方法，包括(a)将来自所述个体的体液样品与多克隆嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体接触，和(b)使用可检测的标记来确定样品中的NGAL与多克隆NGAL抗体之间形成的复合物的量，其中复合物的量代表急性肾损伤的水平。
在另外的实施方案中，本发明涉及用于对急性肾损伤治疗的效果进行监测的方法，包括以下步骤：(a)将来自所述个体的第一体液样品与包括嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体和可检测标记的第一测定装置接触，以使得第一样品中的NGAL蛋白与NGAL抗体复合，(b)使用可检测的标记来确定第一样品中的NGAL蛋白与第一测定装置中的NGAL抗体之间形成的复合物的量，其中装置中的NGAL抗体具有与超过两种NGAL蛋白表位结合的能力，(c)将治疗开始后从所述个体获得的第二体液样品与包括NGAL抗体和可检测标记的第二测定装置接触，以使得第二样品中的NGAL蛋白与NGAL抗体复合，(d)使用可检测的标记来确定来自第二样品的NGAL与第二测定装置中的NGAL抗体之间形成的第二复合物的量，其中装置中的NGAL抗体具有与超过两种NGAL蛋白表位结合的能力，和(e)比较第一复合物的量与第二复合物的量，其中与第一复合物的量相比第二复合物量的降低表明治疗是有效的。
在另外的实施方案中，本发明涉及用于对急性肾损伤治疗的效果进行监测的方法，包括以下步骤：(a)将治疗前从所述个体获得的第一体液样品与多克隆嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体(NGAL)接触，(b)使用可检测的标记来确定来自第一样品的NGAL蛋白与多克隆NGAL抗体之间形成的第一复合物的量，(c)将治疗开始后从所述个体获得的第二体液样品与多克隆NGAL抗体接触，(d)使用可检测的标记来确定来自第二样品的NGAL与多克隆NGAL抗体之间形成的第二复合物的量，和(e)比较第一样品中的NGAL与多克隆NGAL抗体之间形成的第一复合物的量和第二样品中的NGAL与多克隆NGAL抗体之间形成的第二复合物的量，其中与第一复合物的量相比第二复合物的量降低表明治疗是有效的。
在另外的实施方案中，本发明涉及用于检测个体中的急性肾损伤的试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包括测定装置，该测定装置包括嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体和可检测的标记，所述可检测的标记适用于确定体液样品中的NGAL与NGAL抗体之间形成的复合物的量，其中装置中的NGAL抗体具有与超过两种NGAL蛋白表位结合的能力。
在另一个实施方案中，试剂盒包括适于与体液样品接触的第一多克隆嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)抗体、适用于确定体液样品中的NGAL蛋白与第一多克隆NGAL抗体之间形成的复合物的量第二NGAL抗体、和适用于确定体液样品中的NGAL与第一多克隆NGAL抗体之间形成的复合物量的可检测标记。
在另外的实施方案中，本发明涉及用于检测个体中急性肾损伤的测定装置，包括固定于基材上并适于与体液样品接触的多克隆NGAL抗体、和适于对NGAL蛋白与固定的多克隆NGAL抗体的复合物进行结合的可检测标记。
由于本发明的这些方法、装置和试剂盒使用具有与超过两种NGAL蛋白表位结合能力的NGAL抗体，所述方法和试剂盒出人意料地显示出对作为生物标志物的NGAL的敏感性的改善，并因而在急性肾损伤的检测中显示出改善的敏感性。这种改善的敏感性可以提供对此类损伤的更早期的检测，从而会使得更早期的治疗应答成为可能。
在另外的实施方案中，本发明涉及用于确定来自个体的样品中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)蛋白来源的方法。在更具体的实施方案中，所述方法可以用于区分源自肾的NGAL和源自嗜中性粒细胞的NGAL。在一个具体实施方案中，此类方法包括(a)确定样品中NGAL蛋白的单体、二聚体和异二聚体形式的相对量，和(b)比较所确定的量，其中与二聚体NGAL蛋白相比单体和/或异二聚体NGAL蛋白的量占优势表明NGAL蛋白来源于个体的肾，而与单体或异二聚体NGAL蛋白相比二聚体NGAL蛋白的量相等或占优势则表明NGAL蛋白来源于个体的嗜中性粒细胞。NGAL蛋白的确定或来源将有助于病症的诊断，并且在其它之外特别是使得改善的、靶向治疗成为可能。
参考下列详细说明后将更充分地理解这些以及其他的优点和改善。
附图简述
参考附图后将更充分地理解详细说明，其中：
图1显示了如实施例1所述的血浆肌酸酐的手术前和手术后水平。男性和女性的正常上限水平分别是100μmol/L和90μmol/L。与男性和女性的正常水平相比，手术前的水平显著提升(p＜0.001)。
图2A和2B分别显示了如实施例1所述的，通过使用多克隆抗体的RIA测定和使用两种单克隆抗体的测定，所测量的尿液中NGAL的手术前和手术后水平。还显示了健康对象的水平。水平线标明上限97.5，健康对照的百分位数。手术前和手术后水平之间的总体差异由ANOVA来评估并显示于图上。对于这两种测定，在所有3个时间点手术后水平显著不同于手术前水平(p＜0.001)。
图3A-3C分别显示了如实施例1所述的，通过使用多克隆抗体的RIA测定、使用多克隆和单克隆抗体的ELISA测定、和使用两种单克隆抗体的测定，所测量的手术后2小时尿液NGAL水平与体外循环时间(ECC时间)之间关系的箱线图。统计学差异和中位值的倍数增加被标示出来。
图4A和4B分别显示了如实施例1所述的，通过使用多克隆抗体的RIA测定和使用两种单克隆抗体的测定，所测量的尿液NGAL水平与GFR(血浆半胱氨酸蛋白酶抑制剂C)之间的关系。显示了线性回归分析的结果。
图5显示了如实施例1所述的，通过使用多克隆NGAL抗体的RIA和使用两种单克隆抗体的测定，尿液中NGAL蛋白的测量之间的关系。线性回归分析：r2＝0.86，p＜0.0001，n＝331。插入部分显示在浓度下端两次测定之间的关系。
图6显示了在得自两位经历心脏手术的患者的尿液样品U1和U2中，如实施例2所述的NGAL的不同分子形式的Western印迹结果。
图7显示了如实施例2所述的，利用基于不同抗体的测定，对来自尿液SuperdexTM-75凝胶过滤的级分中NGAL的测量。峰1和峰2中的NGAL主要分子形式分别是二聚体和单体。插入部分是峰1的放大。
图8显示了如实施例2所述的，在指定时间所确定的由条件培养基中培养的HK-2细胞进行NGAL合成的时程。值是来自于3次独立实验的一式两份测定的平均值±SD。标志*和**分别代表p＜0.05和p＜0.01。
图9A和9B显示在完全培养基或补充了刺激物的完全培养基中生长的HK-2细胞所分泌的NGAL水平(图9A)，或在角质形成细胞无血清培养基(K-SFM)或补充了刺激物的K-SFM中生长的HK-2细胞所分泌的NGAL水平(图9B)。值是来自于3次独立实验的一式两份测定的平均值±SD。标志*、**和***分别代表p＜0.05、p＜0.01和p＜0.001。
图10在下栏显示通过Western印迹检测用条件培养基培养的HK-2细胞所分泌的NGAL，上栏显示在添加新鲜培养基(C)或添加补充了1ng/mLIL-β的培养基(S)后在指定时间点收集的HK-2细胞的NGAL mRNA表达。
在参考详细说明后将更充分的理解本发明的各个方面、特征和实施方案。
详细说明
NGAL最初从人嗜中性粒细胞分离，先前的工作表明测量血液中的NGAL是区分细菌和病毒引起的急性感染的优越方法。最近，已经研究了NGAL的排泄(例如在体液样品中如尿液)与急性肾损伤之间的密切联系。出人意料的是，利用单克隆-单克隆测定与使用多克隆抗体测定所进行的NGAL测量之间的比较显示，这些测定在临床表现方面有重要差异。该结果表明测定中抗体的选择是非常关键的，特别是具有与超过两种NGAL蛋白表位反应的能力的抗体的使用提供了敏感性提高的测定法，证明这些测定所鉴定的是在不同条件下排泄的不同NGAL变体。因此所述方法、装置和试剂盒使用具有与超过两种NGAL蛋白表位反应的能力的NGAL抗体。在这点上，此类NGAL抗体可以包括一种或多种多克隆NGAL抗体、和/或一种或多种多克隆NGAL抗体与一种或多种单克隆NGAL抗体的组合，如在下文进一步详细描述的。此外，NGAL抗体可以用于NGAL蛋白的捕获和/或具有可检测的标记。
用于检测个体中急性肾损伤的方法可应用于任何人类个体，尤其可用于具有急性肾损伤风险的个体。这类个体包括，但不限于：进行心脏手术或肾移植的那些、体内引入诊断剂(例如，X光造影剂、或肾中毒治疗剂等)的那些、和/或患有糖尿病、败血病、出血性休克等的那些。在具体实施方案中，所述个体是心脏手术患者，并且所述样品在心脏手术3小时内得自该心脏手术患者。在另外的实施方案中，对在心脏手术后接连相继的时间段所获得的相应样品重复所述检测方法，例如在手术后2小时和5小时、在手术后2小时和12小时、在手术后2、12和24小时，等)。
所述方法使用体液样品进行检测。在更具体的实施方案中，样品包括尿液、血液、血清、或血浆、或其纯化的组分。在更具体的实施方案中，样品是尿液。
在一个实施方案中，所述方法包括(a)将来自个体的体液样品与包括NGAL抗体和可检测标记的测定装置接触，以使得样品中的NGAL蛋白与NGAL抗体复合；和(b)使用可检测的标记来确定来自样品的NGAL蛋白与测定装置中的NGAL抗体之间形成的复合物的量，其中装置中的NGAL抗体具有与超过两种NGAL蛋白表位结合的能力，并且其中所形成的复合物的量代表急性肾损伤的水平。正如以上所述，具有与超过两种NGAL蛋白表位结合的能力的NGAL抗体可以由一或多种不同的NGAL抗体来提供。
可以用特定装置或技术进行校准，以确定所形成的复合物代表急性肾损伤的定性的量或定量的量。在具体的实施方案中，其中用放射免疫测定(RIA)进行测量，代表急性肾损伤的量是60ng/ml或更多NGAL蛋白。在另一个实施方案中，其中用酶联免疫吸附测定(ELISA)进行测量，代表急性肾损伤的量是100ng/ml或更多NGAL蛋白。
在一个实施方案中，所述方法使用多克隆NGAL抗体，例如由Xu etal，Journal of Immunological Methods，171：245-252(1994)所公开的，其援引加入本文。例如，如Xu等人所述，通过将总共72μg的纯化蛋白(在弗氏完全佐剂和不完全佐剂中均质化)多部位皮内注射入兔，从而在兔中激发出针对NGAL(HNL)的多克隆抗体。抗体的特异性可以通过在琼脂糖中的双向免疫扩散(Devereux et al.，Nucleic Acid Research，12(1)：387-394(1984))来进行评价，以及针对嗜中性颗粒的提取物和下列纯化蛋白来进行测试：组织蛋白酶G、弹性蛋白酶、髓过氧化物酶、溶菌酶、乳铁蛋白、嗜伊红粒细胞阳离子蛋白(ECP)和嗜酸性粒细胞蛋白X(EPX/EDN)。当然也可以使用其它的NGAL抗体。
在一个实施方案中，本发明的方法包括(a)将来自个体的体液样品与多克隆NGAL抗体接触，和(b)使用可检测的标记来确定样品的NGAL与多克隆NGAL抗体之间所形成的复合物的量，其中复合物的量代表急性肾损伤的水平。在具体实施方案中，例如，NGAL抗体包括多克隆抗体，并且通过常规的放射免疫测定技术来确定样品中的NGAL蛋白与NGAL抗体之间形成的复合物的量。此类技术是本领域公知的，还包括使用双放射性免疫测定技术，其中可以使用两种多克隆抗体或者可以使用一种多克隆抗体和一种单克隆抗体。在另一个实施方案中，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定样品中的NGAL蛋白与NGAL抗体之间形成的复合物的量，其中ELISA使用至少一种多克隆NGAL抗体。ELISA技术也是本领域公知的。在使用ELISA过程的具体实施方案中，测定装置包括多克隆NGAL抗体和单克隆NGAL抗体，其中一种NGAL抗体结合基质，而其它的NGAL抗体结合可检测的标记。在更具体的实施方案中，多克隆NGAL抗体结合至，即，固定于基质上。在另外的实施方案中，多克隆NGAL抗体结合至基质，而单克隆NGAL抗体结合可检测的标记。或者，ELISA可以使用包括两种不同多克隆NGAL抗体的测定装置，其中一种NGAL抗体结合基质，而其它NGAL抗体结合可检测的标记。可以使用本领域已知的其他测定技术，其中例如，将至少一种多克隆NGAL抗体固定到基质上，在更具体的实施方案中，将可检测的标记结合至另一NGAL抗体，其可以是单克隆NGAL抗体或第二多克隆NGAL抗体。
因此，本发明还涉及用于此类方法的装置和试剂盒。在一个实施方案中，本发明的测定装置包括固定于基质上并适于与体液样品接触的多克隆NGAL抗体、和适于对NGAL蛋白和固定的多克隆NGAL抗体的复合物进行结合的可检测标记。在具体实施方案中，可检测的标记可以与NGAL抗体(单克隆或多克隆)复合，用于结合与固定的多克隆NGAL抗体复合的NGAL蛋白。测定装置可以作为“护理点(point of care)”装置或试剂盒提供，便于医务人员的使用。
显见的是，通过对来治疗方案前和后或者期间的个体的多个样品进行分析，本发明可以进一步用于监测急性肾损伤的治疗。此类方法通常包括将来自个体的第一体液样品与所述的第一测定装置接触，并确定第一样品的NGAL蛋白与第一测定装置中的NGAL抗体之间形成的复合物的量，将治疗开始后得自所述个体的第二体液样品与所述的第二测定装置接触，并确定第二样品的NGAL与第二测定装置中的NGAL抗体之间形成的第二复合物的量，以及比较第一复合物的量与第二复合物的量。与第一复合物的量相比第二复合物的量降低表明治疗是有效的。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于确定来自个体的样品中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)的来源的方法。此类方法对于区分肾NGAL蛋白和嗜中性粒细胞NGAL蛋白特别有效。在一个实施方案中，所述方法包括(a)确定样品中NGAL蛋白的单体、二聚体和异二聚体形式的相对量，和(b)比较所确定的量，其中与二聚体NGAL蛋白相比单体和/或异二聚体NGAL蛋白的量占优势表明NGAL蛋白来源于所述个体的肾，而与单体或异二聚体NGAL蛋白相比二聚体NGAL蛋白的量相等或占优势表明NGAL蛋白来源于所述个体的嗜中性粒细胞。已经发现肾起源的NGAL蛋白基本上不含NGAL蛋白的二聚体形式，例如Western印迹所显示的。在具体实施方案中，样品包括尿液。在另一个具体实施方案中，通过将样品与包括单克隆NGAL抗体的测定装置接触来确定NGAL蛋白的相应量。在另一个实施方案中，通过将样品与包括多克隆NGAL抗体的测定装置接触来确定NGAL蛋白的相应量。可以使用如上所述的任意测定装置和技术、Western印迹、或其他常规技术和/或装置。
如下文实施例2所示，多克隆和单克隆抗体鉴别(即，与其复合)单体、二聚体和异二聚体的NGAL蛋白形式。但是，在来源于肾的NGAL中，结果基本上不含NGAL蛋白的二聚体形式，而在来自嗜中性粒细胞的NGAL蛋白的结果中NGAL的二聚体形式占优势。虽然不希望受到理论的约束，但是认为不同的NGAL′s暴露不同的表位，其然后被例如单克隆抗体差异性地识别。因此，所述比较可以区分肾来源的NGAL蛋白和嗜中性粒细胞来源的NGAL蛋白。
本发明的各个方面将在下面实施例中进行说明。
实施例1
本实施例描述了以下研究：使用具有与超过两种NGAL蛋白表位结合的能力的NGAL抗体的NGAL测定，并与只使用两种单克隆抗体的NGAL测定进行比较。
患者和样品
本研究包括在Uppsala University Hospital接受心脏手术的总共59位成人患者。患者的年龄范围为27-85，平均年龄为63，患者包括42位男性和17位女性。心脏手术包括23例冠状动脉旁路移植术、15例主动脉瓣置换、4例二尖瓣修复、3例组合步骤、8例左心室辅助装置移植、和6例其他步骤。
在手术前和心脏手术后各个时间点(2、24、48和72小时)收集尿液和血液样品。将尿液样品在4℃ 3,000rpm立即离心15分钟。将血液在4℃3,000rpm离心15分钟获得EDTA-血浆。所有样品上清立即保存于-20℃的等分试样中。此外，从健康雇员和学生收集另外101份尿液样品，用做正常对照。
尿液NGAL水平的测定
通过3种不同的测定来检测NGAL水平。通常根据Xu等(上文)的教导，第一种测定技术使用基于多克隆的RIA。第二种测定技术使用基于多克隆-单克隆的ELISA。第三种测定技术使用基于单克隆-单克隆的测定。因此，前两种技术是根据本发明的，而第三种技术是用于比较目的。
更具体地，对Xu等先前的描述做一些改变，来进行基于多克隆抗体的放射免疫测定(RIA)。将50μL样品或标准品溶液(2μg/L到128μg/L)与50μL I125标记的NGA和50μL特异性抗体(用RIA测定缓冲液适当稀释)连续混合。室温下温育所述混合物3小时。此后，添加500μL固相二抗包被的纤维素悬液(AA-SAC1，IDS LTD，England)，并在4℃温育1小时。通过在3400rpm离心15分钟，分离并沉淀与抗兔IgG抗体包被的纤维素结合的NGAL抗体复合物。倾析后，测量放射性。测定中和测定之间的变异系数(CV)分别小于6％和10％。通过RIA测定装置测量到的尿液NGAL浓度结果被称为NGAL RIA。
在本研究中开发出基于多克隆和单克隆抗体的ELISA装置。简单来说，将用碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(0.05M Na2CO3-NaHCO3，pH 9.6，InvitrogenCorporation，UK)稀释的抗NGAL单克隆抗体(100μL/孔，1μg/mL)在4℃包被微量滴定板(Nunc Maxsorp，Agogent，Denmark)过夜。通过用包含2％牛血清白蛋白(200μL/孔，Sigma-Aldrich，Steinhein，Germany)的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液在37℃封闭其他结合位点1小时。一式两份添加100μL标准品(0.1ng/ml到6.4ng/ml)用测定溶液(PBS，包含0.2％牛血清白蛋白，0.1％Tween-20，0.05％CTAB和0.02％NaN3)稀释的稀释样品。随后，每孔添加100μL稀释的兔抗NGAL多克隆抗体，并在室温下温育1小时，然后是100μL稀释的辣根过氧化物酶缀合的抗体(GE Healthcare，UK)，室温下再温育1小时。在室温下用3，3′，5，5′-四甲基联苯胺溶液(100μL/孔，Sigma-Aldrich，Steinhein，Germany)将板的酶反应显色20分钟，通过添加100μL/孔1MH2SO4终止反应。在所有步骤之间，利用Microplate Washer(Anthos fluido，Salzburg，Austria)，将板用洗涤缓冲液(包含0.05％Tween-20的PBS)洗涤四次。通过微板读数器(SPECTRAmax 250，GMI，Inc.，USA)测量450nm处的吸光度，利用空白孔的540nm作为参照读数。平均测定中的CV是2.8％(范围是0.5％到4.7％)，测定之间的CV是6.3(范围是2.1到10.4％)。平均回收率是99％(范围是93到105％)。通过ELISA测量到的尿液NGAL浓度结果被称为NGAL ELISA。
根据制造商的说明在双单克隆测定法中进行NGAL的测定。测定中和测定之间的变异系数(CV％)小于6％。通过该装置测量到的尿液NGAL浓度结果被称为NGAL Mono-mono。
在Uppsala University Hospital的常规临床化学系(Department of ClinicalChemistry)的Architect装置上测量尿肌酸酐水平，用于校正尿液稀释物中NGAL尿液水平的变异。因此，NGAL的尿液水平表示为单位是μg/mmol肌酸酐的NGAL。所有测量一式两份，实验室研究者不清楚样品来源和临床结果直至研究结束。
尿液NGAL的Western印迹
按照Towbin等先前的描述(Proc.Natl.Acad.Sci. USA，76：4350-4(1979))进行Western印迹。简单来说，将20μL尿液样品用于Nu-PAGE4-12％Bis-Tris Gel(Invitrogen Corporation，USA)。在SDS-PAGE后，通过使用Nu-PAGETransfer Buffer(Invitrogen Corporation，USA)在25V 1小时将蛋白转移到PVDF膜。利用封闭液(GE Healthcare，UK)将PVDF膜的其他结合位点封闭1小时。将印迹与小鼠抗NGAL单克隆抗体温育1小时，然后与过氧化物酶缀合的二抗(GE Healthcare，UK)温育45分钟。根据制造商(Amersham ECLTM Western Blotting System，GE Healthcare，UK)的说明，使用增强的化学发光来检测免疫印迹。
其他测定法
在Uppsala University Hospital的临床化学系使用常规步骤测量肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的血浆水平。
统计分析
通过Medcalc 9.5(MedCalc Software，Mariakerke，Belgium)和STATISTICA 8.0(StatSoft，Inc.，Tulsa，USA)进行不配对和配对比较、线性回归分析、单向方差分析(ANOVA)的Mann-Whitney′s和Wilcoxon′s非参数检验。统计显著性被设定为p＜0.05。
结果
手术前以及手术后直至78小时的血浆肌酸酐水平在图1中给出，显示在所述时间段没有差异。临床结果表明，3位受试者具有急性肾损伤的症状，手术后血浆肌酸酐升高＞50％。
尿液NGAL水平
使用3种经描述的技术测量得自健康受试者和经历心脏手术的患者的尿液的NGAL水平。使用RIA和Mono-mono技术测定的结果分别显示于图2A和2B。手术前水平类似于正常对照。手术后两小时，水平显著增加(p＜0.0001)，约一半患者具有高于正常值上限的水平。当用RIA检测时，中位数的增加倍数是18.7，当用ELISA和Mono-mono测定法检测时，分别是15.6和11.4倍增加。24小时后，所述水平再次降低，但仍然高于手术前水平。在整个手术后期间水平保持显著更高(p＜0.0001)。在第72小时，对RIA、ELISA和Mono-mono测定法来说，增加倍数分别是6.8、8.5和5.9。利用所有3种测定法观察到随时间的类似模式。
与体外循环时间(ECC)的关系
当用RIA技术(r2＝0.30，p＜0.0001)和ELISA技术(r2＝0.16，p＝0.006)检测尿液时，发现ECC-时间与手术后2小时获得的NGAL水平之间的显著正相关。但是，利用Mono-mono技术未发现这类相关性。当通过ECC-时间分组为大于或小于90分钟时，手术后2小时样品的RIA结果增加12.6倍(p＝0.006)。ELISA结果增加6.5倍(p＝0.027)，Mono-mono结果增加5.2倍(p＝0.07)，如图3A-3C所示。
尿液NGAL水平与肾功能的关系
检测肌酸酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C的血浆水平作为肾功能的指标。如上所示，在大部分受试者中肌酸酐水平保持不变，只有3位受试者具有手术后急性肾损伤的症状(定义为＞50％的增加)。使用半胱氨酸蛋白酶抑制剂-C水平计算肾小球滤过率(GFR)。在单变量分析中，GFR与NGAL(RIA)(r2＝0.28，p＜0.001)和NGAL(Mono-mono)(r2＝0.25，p＜0.001)有关，如图4A和4B所示。还分析了尿液NGAL与血浆肌酸酐之间的关系。根据与基准相比手术后72小时期间血浆肌酸酐的百分比增加将受试者分为两组(＜120％或＞119％)。与未显著提高的NGAL(Mono-mono)水平(结果未显示)相比，在肌酸酐水平增加＞119％(p＝0.03)的组中手术后2小时的NGAL(RIA)水平显著更高。
3种NGAL测定之间的相关性
NGAL(RIA)和NGAL(Mono-mono)之间的总相关性显示于图5(r2＝0.86，p＜0.0001，n＝331)。不同时间点的相关性在表1给出，显示r2′s为0.952-0.996的良好相关性，但除了手术后2小时获得的结果。在这个时间点，r2是0.680，显著低于剩余的(p＜0.0001)。在看起来健康的受试者群组中NGAL(RIA)和NGAL(Mono-mono)之间的关系是r2＝0.887，其也显著不同于2小时结果(p＝0.001)。所有331个结果的Passing-Bablok回归分析显示具有显著的直线离差(p＜0.01)的等式：HNL(RIA)＝0.6553+0.5358×NGAL(Mono-mono)，这还适用于NGAL(Mono-mono)测定和NGAL(ELISA)测定的比较，NGAL(ELISA)＝0.0370+0.1135×NGAL(Mono-mono)。但是，NGAL(RIA)和NGAL(ELISA)测定的比较得到没有直线离差的等式NGAL(ELISA)＝-0.002192+0.2002×NGAL(RIA)。
尿液中NGAL的分子形式
心脏手术前后尿液中发现的NGAL主要形式分别具有25(单体)、45(同二聚体)和90-130kDa(与MMP-9的复合物)的表观分子量。手术前后这些不同形式的存在发生变化。测定同二聚体和单体之间的比例(基于Western印迹扫描)。显示同二聚体的相对存在增加直至手术后24小时(p＝0.02)，随后该比例具有减少的倾向。
讨论
本文提供的结果标明NGAL测定中抗体选择非常重要，以使得可以鉴定不同疾病条件下分泌到尿液中的众多不同NGAL变体。尤其是，使用具有与超过两种NGAL蛋白表位反应的能力的NGAL抗体的测定法提供提高的敏感性。
本研究包括经历心脏手术的成人患者。急性肾损伤是可能影响这些患者的最严重的手术后并发症之一。在本研究中，血浆肌酸酐保持不变，只有3位受试者具有＞50％的升高(作为急性肾损伤的症状)。尽管如此，仅仅在手术结束后2小时就在约一半的患者中发现尿液NGAL水平的10-100倍增加。此外，在整个观察期NGAL水平保持升高。通过检测半胱氨酸蛋白酶抑制剂C或肌酸酐的血浆水平，总体尿液NGAL水平显示与肾功能的较弱但显著的相关性，这支持NGAL是肾功能异常的更早期和更灵敏标记物的观点。实际上肌酸酐升高＞50％的患者中有2/3在手术后2小时具有高度增加的NGAL水平。从本研究显见的是，在一半患者中NGAL的主要增加发生在手术后的早期，但这种增加只是暂时的，然后在接下来几天逐渐增加(涉及全部患者)。因此，尽管不希望受到理论限制，但是这类模式可能反映涉及NGAL尿分泌到尿液中的不同机制。早期阶段可能反映来自不同来源(诸如肾上皮细胞和聚集性嗜中性粒细胞)的预先形成的NGAL的分泌，而延迟的分泌可能反映在肾中的从头合成。不同时间尿液中存在许多不同的NGAL分子大小的变异程度的发现也表明涉及不同的机制。
3种不同测定法的比较显示显著差异。总的说来，所述测定法是高度相关的，但有一些明显的例外。这些例外显示集中于手术后2小时获得的样品，表明以下事实：这些情况下3种测定法测量NGAL的不同分子变体。这些差异通过以下事实进一步例证：使用多克隆抗体的RIA和ELISA测定结果显示比Mono-mono测定更密切的与临床变量(诸如体外循环时间的长度和肾功能)的关系。因此这些结果显示鉴定尿液中所有形式的NGAL对测定的临床表现是重要的。RIA是基于多克隆的测定，其可能满足分子的全部可用表位，而基于单克隆-单克隆的测定只满足挑选的表位，其中一些可能通过复合物形成和其他分子改变被隐藏或不被隐藏。基于多克隆-单克隆的ELISA测定具有稍微位于这两种极端之间的特征，其可以通过以下事实解释：这种配置允许识别比双单克隆测定更多的表位，但稍微少于纯粹基于多克隆的测定。总之，所述结果证实了当检测尿液时NGAL是手术后肾损伤的有效早期生物标志物，并新近证明了测定的抗体配置对测定的临床表现有影响，因为具有受限抗体特异性的测定法鉴定不出一些形式的NGAL。
实施例2
本实施例描述了在确定NGAL蛋白来源时，确定NGAL单体、二聚体和异二聚体形式的研究。
尿液样品和凝胶过滤分离
总共收集了手术前以及心脏手术后2h和24h时间点的33份尿液样品。立即将尿液样品在4℃、3,000rpm离心15分钟，并于-20℃储存于等分试样中。使用FPLC系统(Amersham PharmaciaBiotech AB，Uppsala，Sweden)，在SuperdexTM75HR 10/30预包装柱上对一份手术后2h尿液样品进行凝胶过滤。收集250L的级分并保存于-20℃。洗脱缓冲液是PBS。如下所述使用RIA和ELISA确定级分中的NGAL。
用于NGAL定量的灵敏ELISA
使用了用于NGAL定量的基于不同抗体的6种ELISA，即1)Mab697-多克隆(如实施例1所述的单克隆-多克隆ELISA)、2)Mab764-Mab765、3)Mab764-多克隆、4)多克隆-Mab765、5)多克隆-多克隆、和Mab-697-Mab765。这5种ELISA的基本方案与实施例1所述的相同，除了用于测定的具体抗体之外。简单来说，用针对人NGAL％的兔多克隆或小鼠单克隆抗体(Mab697和Mab764)(Diagnostics Development，Uppsala，Sweden)来包被96孔微量滴定板(Nunc Maxsorp，Agogent，Danmark)。将样品和标准品(范围是0.039-5μg/L)(100μL/孔)在室温下(RT)温育60min(尿液样品和凝胶过滤级分)或90min(细胞培养上清液)。随后，添加100μL/孔稀释的生物素化的针对人NGAL的兔多克隆抗体或小鼠单克隆抗体(Mab765)，并在RT温育60min，然后添加100μL/孔稀释的缀合了抗生蛋白链菌素的辣根过氧化物酶(GE Healthcare，United Kingdom)(室温30min)。在所有步骤之间，利用Microplate Washer(Anthos fluido，Salzburg，Austria)，在洗涤缓冲液(包含0.05％Tween-20的PBS)中将板洗涤四次。由3，3′，5，5′-四甲基联苯胺溶液(100μL/孔)(Sigma-Aldrich，Steinhein，Germany)作为底物在室温15min来使酶反应可视化，并通过添加1M H2SO4(100μL/孔)终止该反应。通过分光光度计(SPECTRAmax 250，GMI，Inc.，USA)读取450nm处的吸光度。
用于NGAL定量的基于多克隆抗体的RIA
如上所述进行RIA。简单来说，将50μL样品或标准品(2μg/L-128μg/L)与50μLI125标记的NGAL和50μL特异性抗体混合。室温下温育所述混合物3h。此后，添加500μL固相二抗包被的纤维素悬液(AA-SAC1，IDSLTD，United Kingdom)，并在4℃温育1h。通过离心沉淀与抗兔IgG抗体包被的纤维素结合的NGAL抗体复合物。倾析后，测量放射性。
HK-2培养和NGAL蛋白的表达
HK-2(人肾2，CRL-2190)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)。它是源自正常肾的人肾近端肾小管上皮细胞系。通过用人乳头状瘤病毒16(HPV-16)E6/E7基因转导来使该细胞永生化。在补充了0.05mg/ml牛垂体提取物(BPE)和5ng/ml人重组表皮生长因子(EGF)(Invitrogen-GibcoUnited Kingdom))的完全生长培养基(Keratinocyte Serum Free Medium(K-SFM))中，或在不完全生长培养基中，于37℃含5％CO2的潮湿空气中培养细胞。此外，细胞的培养中使用特异性的刺激物包括细胞因子(IL-1β或TNF-α)(Sigma-Aldrich，Steinhein，Germany)和LPS(Invitrogen-GibocoUnited Kingdom)。在24孔板(FALCONUSA)中每孔接种0.5×105个细胞和1ml完全生长培养基。传代培养48h后，去除完全生长培养基，用PBS(Invitrogen-GibocoUnited Kingdom)将单层细胞(约90％铺满)洗涤两次。将细胞用条件培养基培养72h的时间段。在2h、12h、24h、48h和72h分别收集培养基上清液用于NGAL定量。
通过RT-PCR评价NGAL基因表达
在2h、4h、6h、8h、12h和24h收集正常培养的和1ng/mL IL-1β诱导的HK-2细胞用于分离总RNA。根据制造商的方案使用RNeasyMiniKit(QIAGEN，United Kingdom)提取RNA。利用200ng总RNA通过SuperScript III反转录酶(Invitrogen，United Kingdom)合成第一链cDNA。在PCR仪(PTC-200)(Bio-Rad，USA)中使用Taq DNA聚合酶(Invitrogen，UnitedKingdom)进行聚合酶链反应(PCR)。根据文献选择了用于NGAL(5′-TCACCTCCGTCCTGTTTAGC-3′和5′-CGAAGTCAGCTCCTTGGTTC-3′)和β-肌动蛋白(5′-TTCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3′和5′-GTGTTGAAGGTCTCAAACATGAT-3′)的特异性寡核苷酸引物的序列，并由Thermo SCIENTIFIC(Germany)合成。初始变性条件是94℃2min。如下进行PCR扩增：94℃变性30sec，随后是60℃(对于NGAL)或59℃(对于β-肌动蛋白)30sec退火步骤，和72℃30sec延伸。对于这两种基因进行总共30个循环，然后是72℃最终延伸10min。通过2％琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，并通过溴乙锭染色进行检测。通过参照50-bp DNA ladder(DirectLoadTM DNA Marker)(Sigma-Aldrich，Steinhein，Germany)验证了PCR产物的预期大小(对于NGAL和β-肌动蛋白来说分别是242bp和119bp)。
Western印迹
按照描述获得嗜中性颗粒释放产物。在72-h时间点收集HK-2条件培养基上清液，并补充0.1mM PMSF(Sigma-Aldrich，Steinhein，Germany)和CompleteTM蛋白酶抑制剂混合片剂(Roche，Mannheim，Germany)。使用AmiconUltra-4离心过滤装置(10,000MW)(Millipore，USA)浓缩上清液。根据制造商的说明进行SDS-PAGE和Western印迹。简单来说，在非还原性条件下将25μL尿液或浓缩的条件上清液或嗜中性粒细胞释放产物应用于Nu-PAGE4-12％Bis-Tris Gel(Invitrogen，USA)。通过使用Nu-PAGETransfer Buffer(Invitrogen，USA)在25V、1小时将蛋白转移到Hybone-PPVDF膜(GE Healthcare，United Kingdom)。利用封闭液(GE Healthcare，United Kingdom)将PVDF膜的其他结合位点封闭1h。在室温下将印迹与兔多克隆抗体或小鼠单克隆抗体(Mab 697、Mab 699、Mab 763、Mab 764、或Mab 765)或抗人NGAL的混合物温育过夜，然后与缀合了过氧化物酶的二抗(GE Healthcare，United Kingdom)温育1h。根据制造商(Amersham ECLTMWestern Blotting System，GE Healthcare，United Kingdom)的指示，使用增强的化学发光来检测免疫印迹。
统计分析
通过STATISTICA 8.0(StatSoft，Inc.，Tulsa，USA)和Medcalc 9.5(MedCalc Software，Mariakerke，Belgium)进行斯氏t-检验和单向方差分析(ANOVA)。结果表示为平均值±SD和具有四分位数间距的中位数。p＜0.05被认为是显著的。
结果
通过Western印迹检测尿液中的NGAL分子形式
使用针对NGAL的一种兔多克隆抗体和五种小鼠单克隆抗体鉴定存在于得自心脏手术患者的尿液中的NGAL分子形式。通过Biacore实验证实所述五种单克隆抗体与不同的表位反应。如图6所示，在两种代表性的尿液样品(U1和U2)中，发现抗体性能之间的显著差异。3个主要条带被多克隆抗体正常识别，经鉴定为NGAL的单体和二聚体形式以及NGAL的复合异二聚体形式。这3种形式还被Mab764和765检测到。但是，利用这两种抗体之一还观察到其他条带。但是，与这两种单克隆抗体相比，多克隆抗体看起来对二聚体具有更强的亲和力以及对异二聚体有较弱的亲和力。在检测所有3种分子形式方面Mab764和765具有非常类似的性能。Mab764和Mab765对NGAL从高到低的亲和力分别是单体、异二聚体、和二聚体形式。还显示出Mab763、699和697对异二聚体形式具有强亲和力，而对二聚体和单体形式的亲和力较弱。但是，多克隆抗体与Mab765和697在检测受刺激的嗜中性粒细胞上清液中的单体和二聚体形式的能力方面看起来非常类似。
RIA和5种ELISA测量尿液中NGAL的表现
RIA和5种ELISA的表现特征显示于表1：
表1.通过不同的测定法测量从经历心脏手术的患者收集的尿液样品的HNL/NGAL
值表示为中位数和四分位数间距。在手术前和手术后2h组之间进行斯氏t-检验，在手术前和手术后2h和24h组中进行ANOVA。
测量手术前以及手术后2h和24h所获得尿液的NGAL水平，通过测定法获得的NGAL中值水平显示于表1。在7种测定法中，通过RIA测量的手术前和手术后2h NGAL中值水平是最高的。另一方面，通过基于Mab697的ELISA(ELISA 1和ELISA 6)获得的水平显著低于其他测定法。表1显示手术前和手术后2h水平的差异以及24小时期间的总体差异。对所有测定法都观察到手术前和手术后高度显著的差异。当通过ELISA 3(Mab764-多克隆)、ELISA 5(多克隆-多克隆)和ELISA 4(多克隆-Mab765)测量时，手术前对手术后2h的中值水平的倍数增加是最高的并且＞70，当通过ELISA 2(Mab764-Mab765)、ELISA 1(Mab 697-多克隆)或ELISA 6(Mab697-Mab765)测量时，是23-34倍。
尿液凝胶过滤后通过不同的测定法测量NGAL
基于Western印迹结果，通过下列两组实验来研究所述测定法在检测NGAL不同形式方面的表现。在SuperdexTM 75HR柱上进行1份手术后2h尿液样品的凝胶过滤。通过RIA和五种ELISA测量级分的NGAL水平，显示于图7。通过五种ELISA分别获得对应于单体和二聚体形式洗脱体积的两个峰，而用RIA则只有一个峰。后者可能归因于RIA的敏感性不高。利用RIA获得峰2的最高NGAL水平，利用ELISA 1(基于Mab697-多克隆的ELISA)获得最低水平。除了ELISA 1之外的所有ELISA测定测量到峰1的类似水平，即二聚体NGAL(图2插入部分)。ELISA 1测量到二聚体NGAL的更高水平。
当在应激条件下生长时，NGAL在HK-2细胞中被上调
利用角化细胞无血清培养基(K-SFM)，补充了0.05mg/mL牛垂体提取物(BPE)或5ng/mL人重组表皮生长因子(EGF)的K-SFM，或ATCC推荐的完全生长培养基(补充了0.05mg/mL BPE和5ng/mL EGF的K-SFM)，培养HK-2细胞不同的时间长度，然后在标准条件下培养48h。在72h时段内通过ELISA 4在不同的时间点(2h、12h、24h、48h和72h)测定培养上清液中的NGAL水平。培养12h到72h后，K-SFM培养上清液中的NGAL水平高于其他3种培养基(图8)。在完全生长培养基生长的细胞中发现最低的水平。该结果还表明与在补充了rEGF的K-SFM中生长的细胞相比，在补充BPE的K-SFM中生长的细胞上清液中NGAL水平更高。总的说来，这些结果显示了在应激条件下(其中细胞被剥夺必需的生长因子)NGAL产生的上调。
HK-2细胞中NGAL被IL-β、LPS和TNF-α上调
HK-2细胞在完全生长培养基中生长48h，随后细胞在补充了IL-β(1ng/mL，人)、LPS(125ng/mL，肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia))或TNF-α(20ng/mL，人)的完全生长培养基条件下进一步生长不同的时间长度。如图9A所示，IL-β诱导上清液中NGAL水平高度显著地升高(增加8.9-到41.9-倍)。与TNF-α和LPS的温育也诱导上清液中NGAL的一些升高(分别为2.2和1.6倍)，但显著低于IL-β(p＜0.001)。还用补充了IL-β、TNF-α或LPS的K-SFM培养HK-2细胞。利用IL-β(1.3-到12.8-倍增加)观察到NGAL的显著升高，但用TNF-α或LPS没有观察到NGAL显著升高(图9B)。但是，与在完全生长培养基中生长的细胞相比，这些升高是显著更低的(p＜0.001)。
HK-2细胞产生的NGAL分子形式
使用混合的单克隆抗体(Mab697、Mab764和Mab765)作为检测抗体，通过Western印迹检测HK-2细胞分泌的NGAL分子形式。图10(下栏)显示的结果表明，在完全培养基中或K-SFM中应激条件下或补充了细胞因子(IL-β或TNF-α)或LPS的培养基中生长的HK-2细胞分泌的主要NGAL形式是单体形式。用IL-β刺激后NGAL的异二聚体形式也是明显的，而与人嗜中性粒细胞上清液中的发现不同，不存在二聚体形式(图6)。在图10中，用IL-β温育后在HK-2中显示NGAL的mRNA水平。该结果显示表达增加，说明HK-2细胞有效合成NGAL。
讨论
NGAL最初分离自人嗜中性粒细胞，先前我们已经证明测量血液中的NGAL是区分细菌或病毒引起的急性感染的优越方式。后续研究发现，在一定条件下NGAL还可能在其他细胞(诸如肾、肝和上皮组织)中表达，并且尿液和血浆中的NGAL测量可以作为急性肾损伤的生物标志。实施例1显示NGAL测定法的抗体配置对该测定法的临床表现有影响。在AKI患者的尿液中鉴定出NGAL的数种形式。该实施例进一步显示，单体形式和某种程度上异二聚体形式是肾小管上皮细胞产生的主要形式，而二聚体形式似乎是嗜中性粒细胞独有的(参见图6)。嗜中性粒细胞也产生单体形式。本研究一个有趣的发现是所用抗体在对这些不同形式识别方面的差异，因为源于嗜中性粒细胞的单体和二聚体形式被所有单克隆抗体以及多克隆抗体鉴别。与此相反，Mab697几乎完全不能识别尿液中的这些形式。此外，Mab765显示与嗜中性粒细胞上清液中这些形式的强反应，但对尿液中的二聚体形式只有弱识别。虽然不希望受到理论束缚，但是认为其原因是不同NGAL形式表位暴露的差异以及由此造成的分子结构差异。
尿液中NGAL不同分子形式的存在以及抗体表位识别的差异还表现在所用测定法对尿液中NGAL定量的巨大差异。尽管测定中使用相同的校准物，但不仅手术前的水平明显不同，而且手术后的相对变化也明显不同。很明显使用单独的多克隆抗体或多克隆抗体结合Mab764或Mab765的ELISA的倍数增加是最高的。这两种mab还是Western印迹中识别尿液中大部分形式的那些抗体。但是，这两种mab的组合识别较少，表明其他的分子形式被多克隆抗体识别。根据凝胶过滤实验，看起来各种形式识别方面的这些差异主要与单体NGAL识别的差异有关，因为只有一种测定法似乎有区别地识别二聚体形式。所述差异不能用测定法的总体分析性能来解释，因为所有的都显示类似的敏感性、不精密性、回收率(recovery)等。
基于人NGAL的分级分泌(CNGAL/CCr)、小鼠的原位杂交、以及NGAL是急性期蛋白的事实，先前的报道声称尿液中的NGAL积聚可能来自于局部肾合成(其包括尿NGAL的主要组分)，和远端器官和免疫细胞。但是，这类结果被与NGAL的肾处理(就肾小球滤过率，肾小管重吸收和尿液稀释而言)有关的若干不确定性和以下事实(原位杂交在小鼠中进行并且这类技术很难反映细胞产生蛋白的能力)所削弱。但是，我们的发现实际上支持以下观点：人肾小管上皮细胞具有产生NGAL的能力，因为mRNA表达和蛋白产生被若干与在应激或炎性条件下存活的肾(诸如体外循环期间观察到的)有关的数个条件所诱导。我们发现细胞因子IL-1R是最有效的刺激物，其与使用肺上皮细胞系的其他研究相容。先前的许多研究在心脏手术期间和心脏手术后观察到高水平的嗜中性粒细胞分泌蛋白和细胞因子诸如IL-β和TNF-α。因此当前结果证明NGAL以许多不同的形式存在于尿液中，并且用于定量尿液中导致这种多样性的NGAL的测定法是有益的。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种优越的鉴定来源于肾小管上皮细胞的NGAL的测定法，因为所述NGAL的分子结构似乎与来自嗜中性粒细胞的NGAL结构稍有不同。因此这类测定法在AKI的检测方面更特异和更灵敏，主要有利于具有患受损的肾功能风险的患者。
已经参照具体实施方案描述了本发明的方法、装置和试剂盒，并且实施例显示了本发明的具体方面。但是，应理解本领域普通技术人员能够完成本发明的其他实施方案、方面、变化和改变，而不脱离要求的本发明范围。
序列表
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Claims (5)
1.嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体在制备用于通过如下方法检测心脏手术3小时内的患者中急性肾损伤的测定装置中的用途，所述方法包括
(a)从所述心脏手术3小时内的患者中获得尿液样品；
(b)将来自所述患者的尿液样品与包括嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体和可检测标记的测定装置接触，以使得样品中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白与嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体复合；和
(c)使用可检测的标记来确定样品中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白与测定装置中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体之间形成的复合物的量，其中所述装置中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体具有与超过两种嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白表位结合的能力，并且其中所形成的复合物的量代表急性肾损伤的水平；
其中所述测定装置包括
(i)多克隆嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体和单克隆嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体，或
(ii)两种不同的多克隆嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体，
一种其中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体结合基质，而其余的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体结合可检测的标记。
2.权利要求1的用途，其中对在心脏手术后接连相继的时间段所获得的相应样品重复步骤(b)和(c)。
3.权利要求1的用途，其中所述测定装置包括多克隆嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体和单克隆嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体，所述多克隆嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体结合基质，所述单克隆嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体结合可检测的标记。
4.权利要求1的用途，其中所述测定装置包括两种不同的多克隆嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体，一种其中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体结合基质，而其余的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体结合可检测的标记。
5.权利要求1的用途，其中通过酶联免疫吸附测定来确定样品中的嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白与嗜中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白抗体之间形成的复合物的量。
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