KR20190006614A - 급성 신장 손상의 발견 또는 감시 방법, 장치 및 키트 - Google Patents
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Abstract
개인의 체액 샘플을, 호중구 젤라티나제관련 리포칼린 항체 및 검출가능한 표지를 포함하는 검사 장치와 접촉시켜 상기 샘플 내의 NGAL 단백질을 NGAL 항체와 착화시키는 단계, 및 상기 샘플으로부터 얻은 NGAL 단백질과 상기 검사 장치 내의 NGAL 항체 간에 형성된 착화합물의 양을 상기 검출가능한 표지를 사용하여 결정하는 단계를 포함하고, 상기 검사 장치 내의 NGAL 항체는 2개 이상의 NGAL 단백질 항원결정인자와의 결합능을 가지며, 상기 형성된 착화합물의 양은 급성 신장 손상의 정도를 나타내는 것인, 개인의 급성 신장 손상 검출 방법이 제공된다. 샘플 내의 단량체, 이량체, 이형이량체 형태의 상대적인 양을 결정하는 단계, 및 상기 결정된 양들을 비교하는 단계를 포함하는 개인의 샘플 내의 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(NGAL) 단백질의 기원 결정 방법이 제공됨으로써, 향상된 진단 및 보다 나은 표적 치료가 가능하다.
Description
본 발명은 급성 신장 손상의 발견 또는 감시 방법, 장치 및 키트, 그리고 보다 상세하게는, 인간 호중구 리포칼린(human neutrophil lipocalin(HNL))이라고도 알려져 있는, 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin(NGAL))의 측정에 기반하는 방법 및 키트에 관한 것이다.
급성 신장 손상(acute kidney injury(AKI))은, 예를 들면 심장 수술 또는 신장 이식 합병증처럼, 수술 이후에, 예를 들면 엑스레이 조영제 또는 신장 독성을 갖는 치료제와 같은 진단 시약의 생체 내 투입의 부작용, 및/또는 기타 다른 의학적 상태, 예를 들면 당뇨병, 패혈증, 출혈 쇼크 등과 같은 것으로 인하여 발생하는 심각한 상태이다. 예를 들면, 심장 수술을 받은 모든 환자의 최대 30%에서 급성 신장 손상이 일어날 수 있으며, 이는 높은 치사율과 많은 병원 내 합병증, 신장 투석 의존성, 삶의 질 저하, 감염성 합병증에 대한 높은 위험을 수반한다. 급성 신장 손상의 초기 단계에서의 치료의 시작이 치사율을 낮추고 및/또는 치료 기간을 단축시킨다고 알려져는 있지만, 급성 신장 손상을 초기 단계에서 감지하는 것이 때로는 어려운 일이다.
현행 임상 진료에서의 급성 신장 손상의 표준 진단은 RIFLE(발생, 손상, 부전, 상실, 말기 단계 신장병)로 지칭되며, 이는 혈청 크레아티닌 상승 아니면 소변 배출 감소에 기초한다. 혈청 크레아티닌은 신장의 일반적 기능에 대한 신뢰할 만한 지표이지만 신장 기능이 급속하게 변하는 동안에는 지연되고 신뢰할 수 없는 지표이다. 다행히, HNL/NGL(이하에서는 NGAL로 약칭함), 신장 손상 분자-1, 시스타틴 C(cystatin C), 그리고 IL-18을 포함하는 몇 가지 유력한 신규 바이오마커(biomarker)가 발견되었다.
급성 신장 손상의 마커로서의 NGAL 단백질의 용도에 대한 수많은 연구가 집중되었다. NGAL은 당단백이며, 애초에는 호중구 특이적 과립 성분으로 알려졌다. 이 단백질은 25 kDa의 단량체와 45 kDa의 디설파이드 결합으로 연결된 동형이량체로 존재하며, 또한 135 kDa의 디설파이드 분자간 가교를 통하여 호중구성 젤라티나제(메트릭스 메탈로프로티나제9, MMP-9)와 공유 결합성 결합을 이루기도 하는 것으로 알려졌다. 처음에는 NGAL은 생체 내 그리고 생체 외에서의 호중구 활성에 대한 특이적 마커로서, Xu et al, Journal of Immunological Methods, 171:245-252 (1994)에서 HNL로 지칭되었으며, 본 명세서의 참증으로 인용된 벤지(Venge)의 미합중국 특허 제 6,136,526호에는 염증 진단 마커로서의 용도가 개시되었다.
보다 최근에는, 데바라얀(Devarajan) 등의 미합중국특허공개 제2004/0219603 A1호와 제2005/0272101 A1호는, NGAL의 신장 세뇨관 세포 손상 또는 기타 다른 신장 질환 및 손상의 바이오마커로서의 용도를 개시하였다. 덴마크 젠톺테(Gentofte)의 BioBroto Diagnostics사는 최근에 급성 신부전의 초기 진단용 "NGAL ELISA Kit"와 마우스 단클론성 항-인간 NGAL 항체(Mouse Monoclonal anti-human NGAL antibody)와 마우스 단클론성 항-라트 NGAL 항체(Mouse Monoclonal anti-rat NGAL antibody)를 시판하기 시작했다. 또한 Dent et al., Critical Care, 11(6):R127 (2007)에서, 급성 신장 손상에 대한 바이오마커로서 NGAL 측정용, 형광체 나노 입자에 연계시킨 NGAL 특이적 단클론성 항체를 이용하는 미합중국 캘리포니아, 샌디에고에 있는 Biosite Inc.사의 NGAL 제형 Triage®를 설명하고 있다.
그러나 급성 신장 손상을 진단하고 감지하는 보다 개량된 기술의 개발이 요구되고 있다.
따라서 본 발명은 급성 신장 손상 검출, 및 급성 신장 손상의 치료 효과 감시를 위한 방법, 장치 및 키트를 제공한다.
**하나의 실시태양에 있어서, 본 발명은 (a) 개인의 체액(body fluid) 샘플(sample)을, 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL) 항체 및 검출가능한 표지(detectable label)를 포함하는 검사 장치(assay device)와 접촉(contacting)시켜 상기 샘플 내의 NGAL 단백질을 NGAL 항체와 착화(complexing)시키는 단계, 및 (b) 상기 샘플으로부터 얻은 NGAL 단백질과 상기 검사 장치 내의 NGAL 항체 간에 형성된 착화합물(complex)의 양을 상기 검출가능한 표지를 사용하여 결정하는 단계를 포함하고, 상기 검사 장치 내의 NGAL 항체는 2개 이상(more than)의 NGAL 단백질 항원결정인자(epitope)와의 결합능을 가지며, 상기 형성된 착화합물의 양은 급성 신장 손상의 정도를 나타내는 것인, 개인의 급성 신장 손상 검출 방법에 대한 것이다.
또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 (a) 개인의 체액 샘플을, 다클론성 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(NGAL) 항체와 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 샘플으로부터 얻은 NGAL과 상기 다클론성 NGAL 항체 간에 형성된 착화합물의 양을 검출가능한 표지를 사용하여 결정하는 단계를 포함하고, 상기 형성된 착화합물의 양은 급성 신장 손상의 정도를 나타내는 것인, 개인의 급성 신장 손상 검출 방법에 대한 것이다.
추가적인 실시태양에 있어서, 본 발명은 (a) 개인의 제1 체액 샘플을, 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(NGAL) 항체 및 검출가능한 표지를 포함하는 제1 검사 장치와 접촉시켜 상기 제1 체액 샘플 내의 NGAL 단백질을 NGAL 항체와 착화시키는 단계, (b) 상기 제1 체액 샘플으로부터 얻은 NGAL 단백질과 상기 제1 검사 장치 내의 NGAL 항체 간에 형성된 제1 착화합물의 양을 상기 검출가능한 표지를 사용하여 결정하는 단계, 상기 제1 검사 장치 내의 NGAL 항체는 2개 이상의 NGAL 단백질 항원결정인자와의 결합능을 가지고, (c) 치료 개시 후 얻은 상기 개인의 제2 체액 샘플을, NGAL 항체 및 검출가능한 표지를 포함하는 제2 검사 장치와 접촉시켜 상기 제2 체액 샘플 내의 NGAL 단백질을 NGAL 항체와 착화시키는 단계, (d) 상기 제2 체액 샘플으로부터 얻은 NGAL 단백질과 상기 제2 검사 장치 내의 NGAL 항체 간에 형성된 제2 착화합물의 양을 상기 검출가능한 표지를 사용하여 결정하는 단계, 상기 제2 검사 장치 내의 NGAL 항체는 2개 이상의 NGAL 단백질 항원결정인자와의 결합능을 가지며, 그리고 (e) 상기 제1 착화합물의 양과 상기 제2 착화합물의 양을 비교하는 단계를 포함하고, 상기 제1 착화합물의 양과 비교하여 상기 제2 착화합물의 양의 감소는 상기 치료가 효과적이라는 것을 나타내는 것인, 급성 신장 손상의 치료 효과 감시 방법에 대한 것이다.
또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 (a) 치료 전에 얻은 개인의 제1 체액 샘플을, 다클론성 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(NGAL) 항체와 접촉시키는 단계, (b) 상기 제1 체액 샘플으로부터 얻은 NGAL 단백질과 상기 다클론성 NGAL 항체 간에 형성된 제1 착화합물의 양을 검출가능한 표지를 사용하여 결정하는 단계, (c) 치료 개시 후 얻은 상기 개인의 제2 체액 샘플을, 다클론성 NGAL 항체와 접촉시키는 단계, (d) 상기 제2 체액 샘플으로부터 얻은 NGAL 단백질과 상기 다클론성 NGAL 항체 간에 형성된 제2 착화합물의 양을 검출가능한 표지를 사용하여 결정하는 단계, 및 (e) 상기 제1 샘플으로부터 얻은 NGAL 단백질과 상기 다클론성 NGAL 항체 간에 형성된 상기 제1 착화합물의 양과, 상기 제2 샘플으로부터 얻은 NGAL 단백질과 상기 다클론성 NGAL 항체 간에 형성된 상기 제2 착화합물의 양을 비교하는 단계를 포함하고, 상기 제1 착화합물의 양과 비교하여 상기 제2 착화합물의 양의 감소는 상기 치료가 효과적이라는 것을 나타내는 것인, 급성 신장 손상의 치료 효과 감시 방법에 대한 것이다.
또 다른 추가적인 실시태양에 있어서, 본 발명은 개인의 급성 신장 손상 검출 키트에 대한 것이다. 하나의 실시태양에 있어서, 상기 키트는, 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(NGAL) 항체를 포함하는 검사 장치, 및 체액 샘플 내의 NGAL과 NGAL 항체 간에 형성된 착화합물의 양을 결정하는데 사용하기 위한 검출가능한 표지를 포함하고, 상기 검사 장치 내의 NGAL 항체는 2개 이상의 NGAL 단백질 항원결정인자와의 결합능(binding capacity)을 가진다.
또 다른 실시태양에 있어서, 상기 키트는, 체액 샘플과 접촉시키기 위한 제1 다클론성 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(NGAL) 항체, 체액 샘플 내의 NGAL 단백질과 상기 제1 다클론성 NGAL 항체 간에 형성된 착화합물의 양을 결정하는데 사용하기 위한 제2 NGAL 항체, 및 체액 샘플 내의 NGAL 단백질과 상기 제1 다클론성 NGAL 항체 간에 형성된 착화합물의 양을 결정하는데 사용하기 위한 검출가능한 표지를 포함한다.
추가적인 실시태양에 있어서, 본 발명은 기질(substrate)에 고정되고 체액 샘플과 접촉시키기 위한 다클론성 NGAL 항체, 및 NGAL 단백질과 상기 고정된 다클론성 NGAL 항체의 착화합물에 결합하기 위한 검출가능한 표지를 포함하는, 개인의 급성 신장 손상 검출 검사 장치에 대한 것이다.
본 발명의 이러한 방법, 장치 및 키트가 2개 이상의 NGAL 단백질 항원결정인자와의 결합능을 갖는 NGAL 항체를 사용하고 있기 때문에, 놀랍게도, 상기 방법 및 키트는 바이오마커(biomarker)로서의 NGAL에 대한 향상된 감도(sensitivity)를 보이고, 따라서 급성 신장 손상 검출에 있어서 향상된 감도를 보인다. 이러한 향상된 감도에 의하여, 이러한 손상의 조기 검출 및 결과적으로 조기 치료 효과를 얻을 수 있다.
추가적인 실시태양에 있어서, 본 발명은 개인의 샘플 내의 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(NGAL) 단백질의 기원(origin) 결정 방법에 대한 것이다. 보다 구체적인 실시태양에 있어서, 상기 방법은 신장 유래의 NGAL과 호중구 유래의 NGAL 간을 구별하는데 사용될 수 있다. 하나의 구체적인 실시태양에 있어서, 이러한 방법은 (a) 샘플 내의 단량체(monomeric), 이량체(dimeric), 이형이량체(heterodimeric) 형태의 상대적인 양을 결정하는 단계, 및 (b) 상기 결정된 양들을 비교하는 단계를 포함하고, 이량체 NGAL 단백질과 비교하여 단량체 및/또는 이형이량체 NGAL 단백질의 양이 많다는 것은 NGAL 단백질이 개인의 신장으로부터 기원한다는 것을 나타내며, 단량체 및/또는 이형이량체 NGAL 단백질의 양과 비교하여 이량체 NGAL 단백질의 양이 많다는 것은 NGAL 단백질이 개인의 호중구로부터 기원한다는 것을 나타낸다. 상기 NGAL 단백질의 기원에 대한 결정은 상태 진단(condition diagnosis)을 돕고, 무엇보다도, 향상되고 표적화된 치료를 가능하게 한다.
이러한 것들 및 추가적인 장점 및 향상된 점들이 다음의 상세한 설명을 통하여 보다 완전히 이해될 것이다.
발명의 상세한 설명은 도면을 통하여 보다 완전히 이해될 것이다.
도 1은, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 수술 전후의 혈장 크레아티닌(plasma creanitine) 농도를 보여 준다. 남성 및 여성에 대한 상부 정상 농도(upper normal level)는 각각 100μmol/L 및 90μmol/L이다. 남성 및 여성 모두에 대한 정상 농도와 비교하여, 수술 전 농도가 현저히 상승하였다(p<0.001).
도 2a 및 2b는, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 다클론성 항체를 사용하는 RIA 분석법 및 2개의 단클론성 항체를 사용하는 분석법에 의해 측정한 소변 내의 수술 전후의 NGAL 농도를 보여 준다. 또한, 건강한 대상의 농도도 나타나 있다. 수평선은 건강한 대조군의 퍼센티지, 즉 상부 97.5%를 나타낸다. 수술 전후 농도의 전반적인 차이는 ANOVA에 의해 평가된 것이고, 도면에 나타나 있다. 두가지 모두의 분석법에 대해, 모든 3개의 시간에서 수수 후 농도가 수술 전 농도에 비해 현저히 달라졌다(p<0.001).
도 3a 내지 3c는, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 수술 후 2시간에서의 소변 NGAL 농도와, 다클론성 항체를 사용하는 RIA 분석법, 다클론성 및 단클론성 항체를 사용하는 ELISA 분석법, 및 2개의 단클론성 항체를 사용하는 분석법에 의해 각각 측정된 체외순환시간(extracorporeal circulation time (ECC time)) 간의 관계에 대한 박스플롯(box plot)을 보여 준다. 통계적 차이 및 메디안(median)의 4배 증가가 나타나 있다.
도 4a 및 4b는, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 소변 NGAL 농도와, 다클론성 항체를 사용하는 RIA 분석법 및 2개의 단클론성 항체를 사용하는 분석법에 의해 각각 측정된 GFR(혈장 시스타틴(cystatin) C) 간의 관계를 보여 준다. 선형회귀분석 결과가 나타나 있다.
도 5는, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 소변에서, 다클론성 NGAL 항체를 사용하는 RIA를 사용한 NGAL 단백질 측정과 2개의 단클론성 항체를 사용하는 분석법 간의 관계를 보여 준다. 선형회귀분석: r2=0.86, p<0.0001, n=331. 삽입도는 농도의 하부 말단부에서의 2가지 분석법 간의 관계를 보여 준다.
도 6은, 실시예 2에 기재된 바와 같이, 심장 수술을 받는 2명의 환자로부터 얻은 소변 샘플 U1 및 U2에서 다른 분자 형태의 NGAL에 대한 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 결과를 보여 준다.
도 7은, 실시예 2에 기재된 바와 같이 다른 항체 기반의 분석법들을 사용한, 소변의 SuperdexTM-75 겔 여과(gel filtration)로부터 얻은 분획(fraction) 내의 NGAL 측정값을 보여 준다. 피크(peak) 1과 피크 2에서 NGAL의 주요 분자 형태는 각각 이량체 및 단량체이다. 삽입도는 피크 1의 확대도이다.
도 8은, 실시예 2에 기재된 바와 같이, 조정 배지(conditioned medium) 내에서 배양된 HK-2 세포에 의한 NGAL 합성에 대하여 지시된 시간에서 결정된 시간 경과(time course)를 보여 준다. 측정값들은, 3개의 독립적인 실험에 대한 중복 분석으로부터 얻은 평균값±SD이다. * 및 ** 표시는 각각 p<0.05 및 p<0.01을 나타낸다.
도 9a 및 9b는, 완전 배지(complete medium) 또는 자극인자들(stimuli)로 보충된 완전 배지(도 9a), 또는 케라티노사이트 무혈청 배지(Keratinocyte Serum Free Medium (K-SFM)) 또는 자극인자들로 보충된 완전 배지(도 9b)에서 성장한 HK-2 세포로부터 분비된 NGAL의 농도를 보여 준다. 측정값들은, 3개의 독립적인 실험에 대한 중복 분석으로부터 얻은 평균값±SD이다. *, ** 및 *** 표시는 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001을 나타낸다.
도 10은, 하부 패널에서, 조정 배지로 배양된 HK-2 세포로부터 분비된 NGAL의 웨스턴 블롯팅에 의한 검출을 보여 주고, 상부 패널에서, 신선한 배지(C) 또는 1 ng/mL의 IL-β로 보충된 배지(S)를 첨가한 후 지정된 시간에서 수확한 HK-2 세포의 NGAL mRNA 발현을 보여 준다.
본 발명의 다양한 측면, 특징 및 실시태양이 발명의 상세한 설명을 통하여 보다 완전하게 이해될 것이다.
도 1은, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 수술 전후의 혈장 크레아티닌(plasma creanitine) 농도를 보여 준다. 남성 및 여성에 대한 상부 정상 농도(upper normal level)는 각각 100μmol/L 및 90μmol/L이다. 남성 및 여성 모두에 대한 정상 농도와 비교하여, 수술 전 농도가 현저히 상승하였다(p<0.001).
도 2a 및 2b는, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 다클론성 항체를 사용하는 RIA 분석법 및 2개의 단클론성 항체를 사용하는 분석법에 의해 측정한 소변 내의 수술 전후의 NGAL 농도를 보여 준다. 또한, 건강한 대상의 농도도 나타나 있다. 수평선은 건강한 대조군의 퍼센티지, 즉 상부 97.5%를 나타낸다. 수술 전후 농도의 전반적인 차이는 ANOVA에 의해 평가된 것이고, 도면에 나타나 있다. 두가지 모두의 분석법에 대해, 모든 3개의 시간에서 수수 후 농도가 수술 전 농도에 비해 현저히 달라졌다(p<0.001).
도 3a 내지 3c는, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 수술 후 2시간에서의 소변 NGAL 농도와, 다클론성 항체를 사용하는 RIA 분석법, 다클론성 및 단클론성 항체를 사용하는 ELISA 분석법, 및 2개의 단클론성 항체를 사용하는 분석법에 의해 각각 측정된 체외순환시간(extracorporeal circulation time (ECC time)) 간의 관계에 대한 박스플롯(box plot)을 보여 준다. 통계적 차이 및 메디안(median)의 4배 증가가 나타나 있다.
도 4a 및 4b는, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 소변 NGAL 농도와, 다클론성 항체를 사용하는 RIA 분석법 및 2개의 단클론성 항체를 사용하는 분석법에 의해 각각 측정된 GFR(혈장 시스타틴(cystatin) C) 간의 관계를 보여 준다. 선형회귀분석 결과가 나타나 있다.
도 5는, 실시예 1에 기재된 바와 같이, 소변에서, 다클론성 NGAL 항체를 사용하는 RIA를 사용한 NGAL 단백질 측정과 2개의 단클론성 항체를 사용하는 분석법 간의 관계를 보여 준다. 선형회귀분석: r2=0.86, p<0.0001, n=331. 삽입도는 농도의 하부 말단부에서의 2가지 분석법 간의 관계를 보여 준다.
도 6은, 실시예 2에 기재된 바와 같이, 심장 수술을 받는 2명의 환자로부터 얻은 소변 샘플 U1 및 U2에서 다른 분자 형태의 NGAL에 대한 웨스턴 블롯팅(Western blotting) 결과를 보여 준다.
도 7은, 실시예 2에 기재된 바와 같이 다른 항체 기반의 분석법들을 사용한, 소변의 SuperdexTM-75 겔 여과(gel filtration)로부터 얻은 분획(fraction) 내의 NGAL 측정값을 보여 준다. 피크(peak) 1과 피크 2에서 NGAL의 주요 분자 형태는 각각 이량체 및 단량체이다. 삽입도는 피크 1의 확대도이다.
도 8은, 실시예 2에 기재된 바와 같이, 조정 배지(conditioned medium) 내에서 배양된 HK-2 세포에 의한 NGAL 합성에 대하여 지시된 시간에서 결정된 시간 경과(time course)를 보여 준다. 측정값들은, 3개의 독립적인 실험에 대한 중복 분석으로부터 얻은 평균값±SD이다. * 및 ** 표시는 각각 p<0.05 및 p<0.01을 나타낸다.
도 9a 및 9b는, 완전 배지(complete medium) 또는 자극인자들(stimuli)로 보충된 완전 배지(도 9a), 또는 케라티노사이트 무혈청 배지(Keratinocyte Serum Free Medium (K-SFM)) 또는 자극인자들로 보충된 완전 배지(도 9b)에서 성장한 HK-2 세포로부터 분비된 NGAL의 농도를 보여 준다. 측정값들은, 3개의 독립적인 실험에 대한 중복 분석으로부터 얻은 평균값±SD이다. *, ** 및 *** 표시는 각각 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001을 나타낸다.
도 10은, 하부 패널에서, 조정 배지로 배양된 HK-2 세포로부터 분비된 NGAL의 웨스턴 블롯팅에 의한 검출을 보여 주고, 상부 패널에서, 신선한 배지(C) 또는 1 ng/mL의 IL-β로 보충된 배지(S)를 첨가한 후 지정된 시간에서 수확한 HK-2 세포의 NGAL mRNA 발현을 보여 준다.
본 발명의 다양한 측면, 특징 및 실시태양이 발명의 상세한 설명을 통하여 보다 완전하게 이해될 것이다.
NGAL은 본래 인간 호중구로부터 분리되었고, 종래의 연구에 따르면 혈액 내 NGAL의 측정값은 세균 및 바이러스에 의한 급성 감염을 구별해 내기 위한 훌륭한 수단이다. 보다 최근에는, 예를 들어 소변과 같은 체액 샘플 내에서 NGAL의 분비와 급성 신장 손상 간의 밀접한 관계가 연구되고 있다. 놀랍게도, 단클론성-단클론성 분석법과 다클론성 항체를 사용하는 분석법에 의한 NGAL 측정값을 비교하면, 이러한 분석법들의 임상 수행(clinical performance)에 있어서 중요한 차이를 보였다. 상기 결과는, 분석에 있어서 항체의 선택이 매우 중요하다는 사실에 대한 증거이고 특히 2개 이상의 NGAL 단백질 항원결정인자와 반응하는 능력을 갖는 항체의 사용으로 향상된 감도의 분석법을 제공한다는 것은 이러한 분석법에 의해 다양한 조건 하에서 분비된 NGAL의 서로 다른 변이체(variant)를 식별할 수 있다는 증거가 된다. 따라서 본 발명의 방법, 장치 및 키트는 2개 이상의 NGAL 단백질 항원결정인자와 반응하는 능력을 갖는 NGAL 항체를 사용한다. 이와 관련하여, 이러한 NGAL 항체는 하나 이상의 다클론성 NGAL 항체, 및/또는 하나 이상의 다클론성 NGAL 항체와 하나 이상의 단클론성 NGAL 항체의 조합을 포함할 수 있는데, 이에 대해 다음에 상세히 기술된다. 또한, 상기 NGAL 항체(들)는 NGAL 단백질 및/또는 검출가능한 표지를 포획하기 위해 사용될 수 있다.
상기 개인의 급성 신장 손상 검출 방법은 어떠한 개인, 특히 급성 신장 손상의 위험이 있는 개인에 대해서도 적용될 수 있다. 이러한 개인에는, 심장 수술을 받거나 신장 이식한 사람, 진단약제, 예를 들어 X-선 조영제, 신독성(nephrotoxic) 치료제 및 이와 유사한 약제를 생체 내로 주입한 사람, 및/또는 당뇨병, 패혈증, 출혈쇼크 또는 이와 유사한 질병을 앓는 사람이 포함되지만, 이에 제한되지 아니한다. 구체적인 실시태양에 있어서, 상기 개인은 심장 수술 환자이고 상기 샘플은 심장 수술 후 3시간 이내에 상기 심장 수술 환자로부터 얻는다. 추가적인 실시태양에 있어서, 상기 검출 방법은 심장 수술 후 연속적으로 이후의 시간 간격, 예를 들면 수술 후 2시간 및 5시간 후, 수술 후 2시간 및 12시간 후, 수술 후 2시간, 12시간 및 24시간 후, 또는 이와 유사한 시간에서 얻은 각 샘플에 대해 반복된다.
상기 방법은 검출용 체액 샘플을 사용한다. 보다 구체적인 실시태양에 있어서, 상기 샘플은 소변(urine), 혈액, 혈청, 또는 혈장, 또는 이들의 정제된 구성성분(component)를 포함한다. 보다 구체적인 실시태양에 있어서, 상기 샘플은 소변이다.
하나의 실시태양에 있어서, 상기 방법은 (a) 개인의 체액 샘플을, NGAL 항체 및 검출가능한 표지를 포함하는 검사 장치와 접촉시켜 상기 샘플 내의 NGAL 단백질을 NGAL 항체와 착화시키는 단계, 및 (b) 상기 샘플으로부터 얻은 NGAL 단백질과 상기 검사 장치 내의 NGAL 항체 간에 형성된 착화합물의 양을 상기 검출가능한 표지를 사용하여 결정하는 단계를 포함하고, 상기 검사 장치 내의 NGAL 항체는 2개 이상의 NGAL 단백질 항원결정인자와의 결합능을 가지며, 상기 형성된 착화합물의 양은 급성 신장 손상의 정도를 나타낸다. 앞에서 논의한 바와 같이, 2개 이상의 NGAL 단백질 항원결정인자와의 결합능을 갖는 NGAL 항체는 하나 이상의 다른 NGAL 항체에 의해 제공될 수 있다.
급성 신장 손상을 나타내는 형성된 착화합물의 정성적 또는 정량적 양을 결정하기 위하여 특정 장치 또는 기술을 사용하는 교정을 수행할 수 있다. 구체적인 실시태양에 있어서, 측정이 방사면역측정법(radioimmunoassay (RIA))에 의해 이루어지는 경우, 급성 신장 손상을 나타내는 양은 NGAL 단백질이 60 ng/mL 이상인 경우이다. 또 다른 실시태양에 있어서, 측정이 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA))에 의해 이루어지는 경우, 급성 신장 손상을 나타내는 양은 NGAL 단백질이 100 ng/mL 이상인 경우이다.
하나의 실시태양에 있어서, 상기 방법은, 예를 들어 본 명세서에 참조로써 포함되는 Xu et al., Journal of Immunological Methods, 171:245-252 (1994)에 의해 개시된 바와 같이, 다클론성 NGAL 항체를 사용한다. 예를 들면, Xu 등에 의해 기재된 바와 같이, 프로인트 완전 및 불완전 항원보강제(Freund's complete and incomplete adjuvant) 내에 균질화된 총 72 μg의 정제된 단백질을 래빗(rabbit)에 다중 부위 피부내 주사(multi site intracutaneous injection)함으로써, NGAL에 대한 다클론성 항체(HNL)가 래빗에서 성장한다(raised). 상기 항체의 특이성(specificity)은 아가로스(agarose) 내에서의 이중 면역확산(double immunodiffusion)(Devereux et al., Nucleic Acid Research, 12(1):387-394 (1984))에 의해 평가되고 호중성 과립(neutrophil granule) 및 다음의 정제된 단백질: 카텝신 G(cathepsin G), 엘라스타제(elastase), 마이엘로페록시다제(myeloperoxidase), 라이조자임(lysozyme), 락토페린(lactoferrin), 호산구 단백질(eosinophil protein (ECP)) 및 호산구 단백질 X(eosinophil protein X (EPX/EDN))의 추출물에 대해 테스트된다.
하나의 실시태양에 있어서, 본 발명에 따른 방법은 (a) 개인의 체액 샘플을, 다클론성 NGAL 항체와 접촉시키는 단계, 및 (b) 상기 샘플으로부터 얻은 NGAL과 상기 다클론성 NGAL 항체 간에 형성된 착화합물의 양을 검출가능한 표지를 사용하여 결정하는 단계를 포함하고, 상기 형성된 착화합물의 양은 급성 신장 손상의 정도를 나타낸다. 구체적인 실시태양에 있어서, 예를 들면, 상기 NGAL 항체는 다클론성 항체를 포함하고 상기 샘플 내의 NGAL 단백질과 NGAL 항체 간에 형성된 착화합물의 양은 종래의 방사면역측정법 기술에 의해 결정된다. 이러한 기술은 당업계에 주지되어 있고, 2개의 다클론성 항체가 사용되거나 하나의 다클론성 항체와 하나의 단클론성 항체가 사용될 수 있는 이중 방사면역측정법의 사용도 포함한다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 샘플 내의 NGAL 단백질과 NGAL 항체 간에 형성된 착화합물의 양은, 적어도 하나의 다클론성 NGAL 항체를 사용하는 효소면역측정법(enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA))에 의해 결정된다. ELISA 기술도 역시 당업계에 주지되어 있다. ELISA 방법을 사용하는 구체적인 실시태양에 있어서, 상기 검사 장치는 다클론성 NGAL 항체 및 단클론성 NGAL 항체를 포함하는데, 상기 NGAL 항체들 중 하나는 기질에 결합하고 다른 하나는 상기 검출가능한 표지에 결합한다. 보다 구체적인 실시태양에 있어서, 상기 다클론성 NGAL 항체는 상기 기질에 결합, 즉 고정된다. 추가적인 실시태양에 있어서, 상기 다클론성 NGAL 항체는 기질에 결합하고 단클론성 NGAL 항체는 상기 검출가능한 표지에 결합한다. 그 대신에, 상기 ELISA는 2개의 다른 다클론성 NGAL 항체를 포함하는 검사 장치를 사용할 수도 있는데, 상기 NGAL 항체들 중 하나는 기질에 결합하고 다른 하나는 상기 검출가능한 표지에 결합한다. 당업계에 알려진 다른 검사(분석) 기술도 사용될 수 있는데, 예를 들면, 적어도 하나의 다클론성 NGAL 항체가 기질에 고정되고, 보다 구체적인 실시태양에 있어서는, 상기 검출가능한 표지가 또 다른 NGAL 항체에 결합하는데, 상기 NGAL 항체는 단클론성 NGAL 항체이거나 제2 다클론성 NGAL 항체일 수 있다.
따라서, 본 발명은 또한 이러한 방법에 대한 장치 및 키트에 대한 것이다. 하나의 실시태양에 있어서, 본 발명에 따른 검사 장치는 기질에 고정되고 체액 샘플과 접촉시키기 위한 다클론성 NGAL 항체, 및 NGAL 단백질과 상기 고정된 다클론성 NGAL 항체의 착화합물에 결합하기 위한 검출가능한 표지를 포함한다. 상기 검출가능한 표지는, 구체적인 실시태양에 있어서, 상기 고정된 다클론성 NGAL 항체와 착화합물을 형성하는 NGAL 단백질과 결합하기 위해 단클론성 또는 다클론성 NGAL 항체와 착화될 수 있다(착화합물 형성). 상기 검사 장치에는 "현장 진료(point of care)" 장치 또는 키트가 제공될 수 있어서, 의료진에 의한 사용을 용이하게 할 수 있다.
명백해지는 바와 같이, 치료 전후 또는 도중에 개인으로부터 얻은 다수의 샘플에 대한 분석에 의해, 본 발명은 추가로 급성 신장 손상의 치료를 감시하기 위해 이용될 수 있다. 이러한 방법은 일반적으로 개인의 제1 체액 샘플을, 전술한 바와 같이, 제1 검사 장치와 접촉시키는 단계, 상기 제1 체액 샘플으로부터 얻은 NGAL 단백질과 상기 제1 검사 장치 내의 NGAL 항체 간에 형성된 착화합물의 양을 결정하는 단계, 치료 개시 후 얻은 상기 개인의 제2 체액 샘플을, 전술한 바와 같이, 제2 검사 장치와 접촉시키는 단계, 상기 제2 체액 샘플으로부터 얻은 NGAL 단백질과 상기 제2 검사 장치 내의 NGAL 항체 간에 형성된 제2 착화합물의 양을 결정하는 단계, 그리고 상기 제1 착화합물의 양과 상기 제2 착화합물의 양을 비교하는 단계를 포함한다. 상기 제1 착화합물의 양과 비교하여, 상기 제2 착화합물의 양이 감소한 것은 상기 치료가 효과적이라는 것을 의미한다.
또 다른 실시태양에 있어서, 본 발명은 개인의 샘플 내의 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(NGAL) 단백질의 기원(origin) 결정 방법에 대한 것이다. 이러한 방법은 특히 신장 NGAL 단백질과 호중구 NGAL 단백질 간의 구별에 유효하다. 하나의 실시태양에 있어서, 상기 방법은 (a) 샘플 내의 단량체(monomeric), 이량체(dimeric), 이형이량체(heterodimeric) 형태의 상대적인 양을 결정하는 단계, 및 (b) 상기 결정된 양들을 비교하는 단계를 포함하고, 이량체 NGAL 단백질과 비교하여, 단량체 및/또는 이형이량체 NGAL 단백질의 양이 많다는 것은 NGAL 단백질이 개인의 신장으로부터 기원한다는 것을 나타내며, 단량체 또는 이형이량체 NGAL 단백질과 비교하여, 이량체 NGAL 단백질의 양이 동일 또는 많다는 것은 NGAL 단백질이 개인의 호중구로부터 유래한다는 것을 나타낸다. 신장 유래의 NGAL 단백질은, 예를 들어 웨스턴 블롯팅에 의해 나타난 바와 같이, 이량체 형태의 NGAL 단백질이 실질적으로 없다고 밝혀졌다. 구체적인 실시태양에 있어서, 상기 샘플은 소변을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에 있어서, 상기 샘플 내의 각 NGAL 단백질의 양은 상기 샘플을 단클론성 NGAL 항체를 포함하는 검사 장치와 접촉시킴으로써 결정된다. 또 다른 실시태양에 있어서, 상기 샘플 내의 각 NGAL 단백질의 양은 상기 샘플을 다클론성 NGAL 항체를 포함하는 검사 장치와 접촉시킴으로써 결정된다. 전술한 검사 장치들 및 기술들, 웨스턴 블롯팅, 또는 다른 종래의 기술들 및/또는 장치들 중 어느 것도 사용될 수 있다.
아래 실시예 2에 실증된 바와 같이, 다클론성 및 단클론성 항체는 상기 단량체, 이량체 및 이형이량체 NGAL 단백질 형태를 식별한다(즉, 이들과 착화합물을 형성한다). 그러나 신장으로부터 유래한 NGAL에서의 결과에 의하면 이량체 형태의 NGAL 단백질이 실질적으로 없는 반면에, 호중구로부터 유래한 NGAL 단백질의 결과에서는 이량체 형태의 NGAL이 지배적으로 많다. 이론에 구애되지 않길 바라면서, 다른 NGAL은 다른 항원결정인자를 노출시키고, 따라서, 예를 들어 단클론성 항체에 의해 서로 다르게 결합된다. 따라서 기재된 바와 같은 비교에 의해 신장 유래 NGAL 단백질을 호중구 유래 NGAL 단백질과 구별할 수 있다.
본 발명의 다양한 측면이 다음의 실시예에서 예시될 것이다.
실시예 1
본 실시예는, 2개 이상의 NGAL 단백질 항원결정인자와 결합능이 있는 NGAL 항체를 사용하는 NGAL 결정(측정)에 대한 연구 및 단지 2개의 단클론성 항체를 사용하는 NGAL 측정과의 비교에 대해 기술한다.
환자 및 샘플
웁살라 대학 병원에서 심장 수술을 받는 총 59명의 성인 환자가 본 연구에 포함되었다. 환자들의 연령은 27세 내지 85세이고 평균연령은 63세이었으며 42명의 남성과 17명의 여성으로 이루어져 있다. 상기 심장 수술은 23건의 관상동맥우회술, 15건의 대동맥판막교체(aortic valve replacement), 4건의 승모판재건술(mitral repair), 3건의 복합수술(combined procedure), 8건의 좌심실 보조장치 이식(left ventricle assist device implantation), 및6건의 다른 시술들이었다.
수술 전 및 심장 수술 후 다양한 시간(2, 24, 48 및 72시간)에서 소변 및 혈액 샘플을 수집하였다. 상기 소변 샘플을 즉시 3,000 rpm 및 4℃에서 15분간 원심분리하였다. 3,000 rpm 및 4℃에서 15분간 혈액을 원심분리하여 EDTA-혈장을 얻었다. 모든 샘플의 상등액(supernatant)을 즉시 분주하여 -20℃에서 저장하였다. 추가로, 또 다른 101개의 소변 샘플을 건강한 직원 및 학생으로부터 수집하여 정상 대조군(normal control)으로 사용하였다.
소변의 NGAL 농도 분석
NGAL의 농도를 세 가지 다른 분석법으로 측정하였다. 첫번째 분석 기법은, 전술한 Xu 등의 방법에 따라, 다클론성기반 RIA를 사용하였다. 두번째 분석 기법은, 다클론성-단클론성기반 ELISA를 사용하였다. 세번째 분석 기법은 단클론성-단클론성기반 분석법을 사용하였다. 따라서 앞의 두가지 분석 기법은 본 발명에 따른 것이고, 세번째 분석 기법은 비교 목적으로 사용한 것이다.
보다 상세하게, 상기 다클론성 항체기반 방사면역측정법(RIA)을, Xu 등이 개시한 방법에 약간의 변경을 가하여 수행하였다. 샘플 또는 표준용액(2 μg/L 내지 128 μg/L) 중 어느 한 용액 50 μL를, RIA 분석 완충용액에 적절히 희석시킨 I125-표지 NGAL 및 50 μL의 특정 항체와 순차적으로 혼합하였다. 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 배양하였다. 이후, 고체상 제2 항체로 코팅된 셀룰로스 현탁액(solid phase second antibody coated cellulose suspension)(AA-SAC1, IDS LTD., England) 500 μL를 첨가하였고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 항-래빗 IgG 항체로 코팅된 셀룰로스(anti-rabbit IgG antibody coated cellulose)에 결합된 NGAL 항체 착화합물을 분리하였고 3400 rpm에서 15분간 원심분리하여 펠렛으로 만들었다. 경사(傾瀉)(decantation) 후, 방사능을 측정하였다. 분석내 및 분석간(intra- and inter-analysis) 분산계수(coefficient of variation (CV))는 각각 6% 및 10% 미만이었다. 상기 RIA 분석 장치에 의해 측정된 소변 NGAL 농도의 결과는 NGAL RIA로 나타내었다.
본 연구에서 상기 다클론성 및 단클론성 항체기반 ELISA 장치를 개발하였다. 요약하면, 미량적정판(microtitre plate)(Nunc Maxorp, Agogent, Denmark)을, 탄산염-중탄산염 완충용액(0.05M Na2CO3-NaHCO3, pH 9.6, Invitrogen Corporation, UK) 내에서 희석시킨 항NGAL 단클론성 항체(100 μL/well, 1μg/mL)로 4℃에서 하룻밤 동안 코팅하였다. 추가적인 결합 부위(binding site)를, 37℃에서 1시간 동안 탄산염-중탄산염 완충용액을 함유하는 2% 소혈청 알부민(200 μL/well, Sigma-Aldrich, Steinhein, Germany)을 사용하여 차단하였다. 100 μL의 표준용액(0.1 ng/mL 내지 6.4 ng/mL) 또는 분석용액(assay solution)(PBS 함유 0.2% 소혈청 알부민, 0.1% Tween-20, 0.05% CTAB 및 0.02% NaN3)에 희석시킨 희석 샘플을 두번(in duplicate) 첨가하였고 실온에서 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 100 μL의 희석된 래빗 항NGAL 다클론성 항체를 웰(well)마다 첨가하였고 실온에서 1시간 동안 배양한 후, 100 μL의 호스래디쉬 페록시다제-접합 항체(horseradish peroxidase-conjugated antibody)(GE Healthcare, UK)를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 실온에서 20분간 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 용액(100 μL/well, Sigma-Aldrich, Steinhein, Germany)를 사용하여 상기 미량적정판 효소 반응을 시각화하였고, 100 μL/well의 1M H2SO4를 첨가하여 상기 효소 반응을 정지시켰다. 마이크로플레이트 세척기(microplate washer)(Anthos fluido, Salzburg, Austria)를 사용하여 모든 단계 사이에서 상기 미량적정판을 세척 완충용액(wash buffer)(PBS 함유 0.05% Tween-20) 내에서 4회 세척하였다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)(SPECTRAmax 250, GMI, Inc., USA)에 의해 블랭크 웰(blank well) 내에 540 nm에서 기준값으로 하여 450 nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다. 평균 분석내 CV는 2.8%(0.5% 내지 4.7% 범위)이었고 분석간 CV는 6.3(2.1 내지 10.4% 범위)이었다. ELISA에 의해 측정된 소변 NGAL 농도 결과는 NGAL ELISA로 나타내었다.
제조사의 지시에 따라, 이중 단클론성 분석에 대한 NGAL 분석을 수행하였다. 분석내 및 분석간 분산계수(CV)는 6% 미만이었다. 이 장치로 측정된 소변 NGAL 농도 결과는 NGAL Mono-mono로 나타내었다.
웁살라 대학병원 임상화학과의 아키텍트 기기(Architect instrument)에서 소변 크레아티닌 농도를 측정하였고 다양한 소변 희석에 대한 소변 NGAL 농도를 보정하기 위해 사용하였다. 따라서 소변 NGAL 농도는 "μg NGAL/mmol 크레아티닌"으로서 표시되었다. 모든 측정은 두번 수행하였고 실험실 연구자에게는 샘플 공급원 및 임상 결과에 대해 연구 종료시까지 알리지 아니하였다.
소변 NGAL에 대한 웨스턴 블롯팅
Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:4350-4 (1979)에 기재된 바에 따라 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 요약하면, 20 μL의 소변 샘플을 Nu-PAGE® 4-12% Bis-Tris Gel(Invitrogen Corporation, USA)에 적용하였다. SDS-PAGE 이후에, 25V에서 1시간 동안 Nu-PAGE® 이동 완충용액(Transfer Buffer)(Invitrogen Corporation, USA)을 사용하여, 상기 단백질을 PVDF 막(membrane) 위로 옮겼다. 1시간 동안 차단 용액(GE Healthcare, UK)을 사용하여 상기 PVDF 막의 추가적인 결합 부위를 차단하였다. 마우스 항NGAL 단클론성 항체를 1시간 동안 사용하여 상기 블롯들(blots)을 배양한 후 페록시다제접합 제2 항체(peroxidase-conjugated second antibody)(GE Healthcare, UK)를 사용하여 45분간 배양하였다. 제조업체(Amersham ECLTM Western Blotting System, GE Healthcare, UK)의 지시에 따라 증강 화학발광(enhanced chemoluminescence)을 사용하여 면역블롯을 검사하였다.
추가 분석
혈장의 크레아티닌 및 시스타틴-C의 농도를 웁살라 대학병원 임상화학과에서 상례적인 절차에 따라 측정하였다.
통계적 분석
비대응 및 대응 비교(unpaired and paired comparison), 선형회귀분석, 일원(one-way) 분산분석(analysis of variance (ANOVA))을 위해 만-휘트니(Mann-Whitney) 및 윌콕슨(Wilcoxon)의 비모수 검정(non-parametric test)을 Medcalc 9.5(MedCalc Software, Mariakerke, Belgium) 및 STATISTICA 8.0(StatSoft, Inc., Tuls, USA)를 사용하여 수행하였다. 통계적 유의도(statistical significance)는 p<0.05로 설정하였다.
결과
수술 전 및 수술 후 78시간에서의 혈장 크레아니틴 농도가 도 1에 나타나 있고 상기 시간 간격 사이에 차이점이 없다. 상기 임상 결과는, >50%의 수술 후 혈장 크레아니틴 상승을 보이면서 3명의 대상자가 급성 신장 손상의 징후를 보였다는 것을 의미한다.
소변 NGAL 농도
건강한 대상자 및 심장 수술을 받는 환자로부터 얻은 소변 내의 NGAL 농도를 전술한 3가지 기법을 사용하여 측정하였다. 상기 RIA 기법 및 Mono-mono 기법을 사용하여 얻은 결과를 각각 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 수술 전의 농도는 정상 대조군과 유사하였다. 수술 후 2시간에, 약 절반의 환자들이 정상 대조군의 상한을 초과하는 농도를 가지면서 상기 농도가 현저히 증가하였다(p<0.0001). 메디안의 배수 증가(fold increase)는, 상기 RIA로 측정하였을 때 18.7배 증가하였고, 상기 ELISA 및 Nono-mono로 측정하였을 때 각각 15.6배 및 11.4배 증가하였다. 24시간 후, 상기 농도는 다시 감소하였지만, 여전히 수술 전보다 높았다. 상기 농도는 수술 후 전체 기간 동안 현저히 더 높게 유지되었다(p<0.0001). 72시간에서, 상기 배수 증가는 상기 RIA, ELISA 및 Mono-mono에서 각각 6.8, 8.5 및 5.9이었다. 3가지 기법 모두에서 시간에 따라 유사한 패턴을 보였다.
체외순환(ECC) 시간에 대한 관계
상기 RIA 기법(r2=0.30, p<0.0001) 및 ELISA 기법(r2=0.16, p<0.006)에 의해 소변 내에서 측정하였을 때, ECC 시간과 수술 후 2시간 후 얻은 NGAL 농도 간에 현저한 양의 상관관계(positive correlation)를 발견하였다. 그러나 이러한 상관관계는 상기 Mono-mono 기법에 의한 경우에는 나타나지 아니하였다. ECC 시간에 의해 90분 초과 또는 미만으로 하위그룹으로 나누면, 상기 RIA 결과는 상기 수술 후 2시간 샘플(p=0.006)에서 12.6배로 증가하였다. 도 3a 내지 3c에 나타난 바와 같이, 상기 ELISA 결과는 6.5배 증가하였고(p=0.027) 상기 Mono-mono 결과는 5.2배 증가하였다(p=0.07).
소변 NGAL 농도와 신장 기능 간의 관계
혈장 크레아티닌 및 시스타틴-C 농도를 신장 기능의 지표로서 측정하였다. 앞에서 보인 바와 같이, 오직 세명의 대상자에서만 >50% 증가로 정의된 바대로 수술 후 급성 신장 손상의 징후를 보였을 뿐 대부분의 대상자에게서 상기 크레아티닌 농도는 변하지 않은 채 유지되었다. 시스타틴-C 농도를 사용하여 사구체 여과율(glomerular filtration rate (GFR))을 계산하였다. 도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, 단변량 분석에서, GFR은 NGAL (RIA)(r2=0.28, p<0.001) 및 NGAL (Mono-mono)(r2=0.25, p<0.001)과 관계가 있었다. 소변 NGAL 및 혈장 크레아티닌 간의 관계도 분석하였다. 기저선(baseline)과 비교하여 수술 후 72 시간 동안의 혈장 크레아티닌의 퍼센트 증가에 따라(<120% 또는 >119%) 대상자들을 두 그룹으로 나누었다. 수술 후 2시간에서의 NGAL (RIA) 농도는, 현저하게 증가하지 아니한 NGAL (Mono-mono) 농도(결과는 보이지 않음)에 비하여, 크레아티닌 농도가 >119%(p=0.03) 증가한 그룹에서 더 현저하게 높았다.
3개의 NGAL 분석 간의 상관관계
NGAL (RIA) 및 NGAL (Mono-mono) 간의 총괄 상관관계가 도 5에 나타나 있다(r2=0.86, p<0.0001, n=331). 다른 시간에서의 상관관계가 표 1에 나타나 있고, 수술 후 2시간에서 얻은 결과를 예외로 하면, r2이 0.952-0.996 범위에서 매우 좋은 상관관계를 보이고 있다. 이 시간에서 상기 r2은 0.680이었고 나머지보다 현저히 더 낮았다(p<0.0001). 외견상 건강한 대상자들 집단(cohort)에서 NGAL (RIA) 및 NGAL (Mono-mono) 간의 관계는 r2=0.887이었고 2시간에서의 결과와는 현저히 달랐다(p=0.001). 모두 331개의 결과에 대한 패싱-배블록(Passing-Bablok) 회귀분석에 의하면 선형성으로부터 심각한 편차(p<0.01)를 보이는 HNL (RIA)=0.6553+0.5358×NGAL (Mono-mono)라는 식으로 표현되는데, NGAL (Mono-mono)와 비교하는 경우에도 이러한 결과가 나왔고 NGAL (ELISA) 분석에서는 NGAL (ELISA)=0.0370+0.1135×NGAL (Mono-mono)이었다. 그러나 상기 NGAL (RIA) 및 NGAL (Mono-mono) 분석을 비교한 결과, 선형성으로부터 편차가 없는 NGAL (ELISA)=-0.002192+0.2002×NGAL (RIA)를 얻었다.
소변 내 NGAL의 분자 형태
심장 수술 전후의 소변 내에서 발견되는 NGAL의 주요 형태의 겉보기(apparent) 분자량은 각각 25(단량체), 45(동형이량체(homodimer)), 및 90-130 kDa(MMP-9과의 착화합물)이었다. 이러한 다른 형태들의 존재는 수술 전후로 변하였다. 웨스턴 블롯 스캐닝에 기반한 상기 동형이량체 및 상기 단량체 간의 비율을 검사하였다. 동형이량체의 상대적 비율은 수술 후 24시간까지 증가하였고(p=0.02) 이후로 상기 비율이 감소하는 추세인 것으로 나타났다.
논의
본 실시예에 나타난 결과에 따르면, 다양한 조건하에 소변 내에 분비된 NGAL의 다양한 다른 변이체(variant)들을 식별하기 위하여 상기 NGAL 분석에서 항체의 선택이 매우 중요하다는 것을 알 수 있다. 상세하게는, 2개 이상의 NGAL 단백질 항원결정인자와 반응할 수 있는 능력을 갖는 NGAL 항체를 사용하는 분석법이 향상된 감도를 제공한다.
본 연구는 심장 수술을 받는 성인 환자를 포함하였다. 급성 신장 손상은 이러한 환자들에게 영향을 끼칠 수 있는 가장 심각한 수술 후 합병증의 하나이다. 본 연구에서, 오직 3명의 대상자가 급성 신장 손상의 징후로서 >50% 상승한 것 외에는, 혈장 크레이티닌의 평균 농도가 유지되었다. 이럼에도 불구하고, 수술 종료 후 불과 2시간 만에, 약 절반의 환자에서 소변 내 NGAL 농도가 10-100배 증가하였다. 더욱이, 상기 NGAL 농도는 전체 관찰 기간 동안 상승한 채로 유지되었다. 혈장 시시타틴 C 또는 크레아티닌 농도에 의해 측정된 바와 같이, 전반적인 소변 NGAL 농도는 신장 기능과 관련하여 약하지만 유의성 있는 관계를 보여 주었고, 이는 NGAL이 신장 기능장애에 대해 보다 민감한 조기 마커(earlier marker)라는 견해를 뒷받침한다. 실제로, 크레아티닌이 >50% 상승한 3명의 환자 중 2명은 수술 후 2시간 후에 NGAL 농도가 크게 증가하였다. 본 연구로부터, NGAL의 주요한 증가는 환자 중 절반에 있어서 수술 후 조기에 발생한다는 점이 명백하지만, 이러한 증가는 단지 일시적이고 이어서 모든 환자에 있어서 점진적인 증가가 발생한다. 따라서 이론에 구애됨이 없이, 이러한 패턴은 소변 내의 NGAL 분비에 있어서 다른 메커니즘들을 반영하는 것일 수 있다. 상기 초반(early phase)은 신장 상피 및 축적 호중구(accumulating neutrophil)와 같은 다른 출처(source)로부터 수행된 NGAL의 분비를 반영하는 것일 수 있는 반면에, 지연된 분비(delayed excretion)는 신장에서의 신생 합성(de novo synthesis)을 반영하는 것일 수 있다. 또한, 다른 시간에서 소변 내에 다양한 다른 분자 크기의 NGAL이 발생한다는 정도의 변화에 대한 발견은 다른 메커니즘이 수반된다는 사실을 암시한다.
상기 3가지 다른 분석법들의 비교에 의하여 현저한 차이가 있음을 보였다. 종합하면, 상기 분석법들은 고도로 상관관계를 맺고 있지만, 일부 명백한 예외도 있다. 이러한 예외는 수술 후 2시간에 얻은 샘플들에 집중된 것으로 밝혀졌는데, 이는, 이러한 상황하에서 상기 3가지 분석법들은 다른 NGAL 분자 변이체를 부분적으로 측정한다는 사실을 암시한다. 이러한 차이점은, 체외 순환 시간 및 신장 기능과 같은 임상 변수들에 대해 상기 RIA 및 ELISA 분석법의 결과가 상기 Mono-mono 분석법보다 더 밀접한 관계를 보였다는 사실에 의해 추가로 입증되었다. 따라서 이러한 결과는 소변 내 모든 형태의 NGAL 식별이 상기 분석법의 임상 수행에 중요하다는 사실을 보여 준다. 상기 RIA는 다클론성-기반의 분석법인데, 분자 내의 모든 가능한 항원결정인자에 접근할 수 있는 반면에, 상기 단클론성-단클론성 기반의 분석법은 오직 선택된 항원결정인자에만 접근할 수 있으며, 상기 항원결정인자들 중 일부는 착화합물 형성 및 분자 변화(molecular alteration)에 의해 숨겨질 수도 있고 그렇지 아니할 수도 있다. 상기 다클론성-단클론성-기반의 ELISA 분석법은 이러한 2개의 극단(extreme)의 중간적인 특성을 갖는데, 이는, 이러한 구성(configuration)에 의해 이중 단클론성 분석법에 비해 보다 많은 항원결정인자를 인식하지만 순수하게 다클론성-기반의 분석법 보다는 더 적게 항원결정인자를 인식한다는 사실에 의해 설명될 수 있다. 요약하면, 전술한 결과는, 소변 내에서 측정될 때 NGAL이 수술 후 신장 손상에 대한 유용한 조기 바이오마커라는 사실을 확인해 주고 상기 분석법의 항체 구성(antibody configuration)이 상기 분석법의 임상 수행에 대해 큰 영향을 준다는 사실을 새롭게 보여주는데, 이는 NGAL의 일부 형태는 제한된 항체 특이도를 갖는 분석법에 의해 식별되지 아니할 수 있기 때문이다.
실시예 2
본 실시예는 NGAL 단백질의 기원을 결정(determination)하는데 있어서 단량체, 이량체 및 이형이량체 형태에 관한 NGAL 결정(determination)에 대한 연구이다.
소변 샘플 및 겔 여과(gel filtration)에 의한 분리
수술 전 및 수술 후 2시간 및 24시간의 시점에서 총 33개의 소변 샘플을 수집하였다. 상기 소변 샘플을 즉시 3000 rpm, 4℃에서 15분 동안 원심분리하고 분주하여 -20℃에서 저장하였다. 수술 후 2시간에서 얻은 소변 샘플 하나를 FPLC 시스템을 사용하는 SuperdexTM 75 HR 10/30 칼럼(Amersham Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden)에서 겔 여과하였다. 250 L의 분획들(fractions)을 수집하여 -20℃에서 저장하였다. 용리(elution) 완충용액은 PBS이었다. 전술한 RIA 및 ELISA 방법을 사용하여 상기 분획들 내의 NGAL을 결정하였다.
NGAL 정량을 위한 고감도(sensitive) ELISA
NGAL 정량을 위하여 다른 항체들에 기반한 여섯 ELISA, 즉 1) Mab697-polyclonal(실시예 1에 기재된 단클론성-다클론성 ELISA), 2) Mab764-Mab765, 3) Mab764-polyclonal, 4) polyclonal-Mab765, 5) polyclonal-polyclonal, 및 6) Mab697-Mab765를 사용하였다. 상기 분석에 사용된 특정 항체를 제외하고는, 이러한 ELISA들의 기본 프로토콜은 실시예 1에 기재된 바와 동일하다. 간단히, 96-웰 미량적정판(Nunc Maxsorp, Agogent, Denmark)을 인간 NGAL(Diagnostics Development, Uppsala, Sweden)에 대한 래빗 다클론성 또는 마우스 단클론성 항체(Mab697 및 Mab764)로 코팅하였다. 샘플 및 표준용액(0.039 - 5 μg/L)(100 μL/well)을 실온(RT)에서 60분(소변 샘플 및 겔 여과 분획) 또는 90분(세포 배양 상등액) 동안 배양하였다. 이어서, 인간 NGAL에 대한 희석된 비오틴화(biotinylated) 래빗 다클론성 항체 또는 마우스 단클론성 항체(Mab765) 100 μL/well을 첨가하였고 실온에서 60분간 배양한 후, 100 μL/well의 희석된 스트렙타비딘접합 호스래디쉬 과산화효소(GE Healthcare, United Kingdom)(30분, 실온)를 첨가하였다. 마이크로플레이트 세척기(microplate washer)(Anthos fluido, Salzburg, Austria)를 사용하여 모든 단계 사이에서 상기 미량적정판을 세척 완충용액(wash buffer)(PBS 함유 0.05% Tween-20) 내에서 4회 세척하였다. 실온에서 15분간 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘 용액(100 μL/well, Sigma-Aldrich, Steinhein, Germany)를 사용하여 상기 미량적정판 효소 반응을 시각화하였고, 1M H2SO4(100 μL/well)를 첨가하여 상기 효소 반응을 정지시켰다. 분광광도계(spectrophotometer)(SPECTRAmax 250, GMI, Inc., USA)를 사용하여 450 nm에서 흡광도(absorbance)를 측정하였다.
NGAL 정량을 위한 다클론성 항체 기반의 RIA
전술한 바와 같이, RIA를 수행하였다. 간단히 말하면, 샘플 또는 표준용액(2 μg/L - 128 μg/L) 중 어느 한 용액 50 μL를 I125-표지(labelled) NGAL 및 50 μL의 특정 항체와 혼합하였다. 상기 혼합물을 실온에서 3시간 동안 배양하였다. 이후, 고체상 제2 항체로 코팅된 셀룰로스 현탁액(solid phase second antibody coated cellulose suspension)(AA-SAC1, IDS LTD., United Kingdom) 500 μL를 첨가하였고 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 항-래빗 IgG 항체로 코팅된 셀룰로스(anti-rabbit IgG antibody coated cellulose)에 결합된 NGAL-항체 착화합물을 원심분리하여 펠렛으로 만들었다. 경사(傾瀉)(decantation) 후, 방사능을 측정하였다.
HK-2 배양 및 NGAL 단백질의 발현
HK-2(인간 신장 2(human kidney 2), CRL-2190)를 미국세포주·균주은행(American Type Culture Collection (ATCC))으로부터 구매하였다. 이것은 정상 신장으로부터 얻은 인간 신장근위세뇨관 상피세포주(human renal proximal tubular epithelial cell line)이다. 인간 파필로마 바이러스 16(human papilloma virus 16(HPV-16)) E6/E7 유전자를 사용하여 형질도입(transduction)함으로써 상기 세포를 불멸화하였다(immortalized). 상기 세포를, 5% CO2를 함유하는 습윤 분위기(humid atmosphere) 및 37℃에서 완전 성장 배지(0.05 mg/mL의 소 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract(BPE)) 및 5 ng/mL의 인간 재조합 표피성장인자(EGF)(Invitrogen-Gibco®, United Kingdom)로 보충된 케라티노사이트 무혈청 배지(Keratinocyte Serum Free Medium(K-SFM)) 또는 불완전 성장 배지 내에서 배양하였다. 추가로, 사이토카인(cytokine)(IL-1β 또는 TNF-α)(Sigma-Aldrich, Steinhein, Germany) 및 LPS(Invitrogen-Gibco®, United Kingdom)을 포함하는 특정 자극인자들(stimuli)을 사용하여 상기 세포를 배양하였다. 24-웰 플레이트(FALSCON®, USA)에, 웰 당 0.5×105개의 세포 및 1 mL의 완전 성장 배지를 접종하였다. 48시간의 계대배양(subculture) 후에, 상기 완전 성장 배지를 제거하였고 단일층(monolayer)을 PBS(Invitrogen-Gibco®, United Kingdom)로 2회 세척하였다. 상기 세포를 조정 배지를 사용하여 72시간 동안 배양하였다. NGAL 정량을 위해 2시간, 12시간, 24시간, 48시간 및 72시간에서 각각 배지 상등액(media supernatant)을 수확하였다.
RT-PCR에 의한 NGAL 유전자 발현 평가
총 RNA 분리를 위해, 정상적으로 배양된 1 ng/mL의 IL-1β 유도(induced) HK-2 세포를 2시간, 4시간, 6시간, 8시간, 12시간 및 24시간에서 수확하였다. 제조사의 프로토콜에 따라 RNeasy® Mini Kit(QIAGEN, United Kingdom)을 사용하여 RNA를 추출하였다. 200 ng의 총 RNA를 가지고 SuperScript III 역전사효소(Invitrogen, United Kingdom)를 사용하여 일차-가닥(first-strand) cDNA를 합성하였다. DNA engine PCR machine(PTC-200)(BioRad, USA) 내에서 Taq DNA 중합효소(Invitrogen, United Kingdom)를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)을 수행하였다. NGAL(5'-TCACCTCCGTCCTGTTTAGC-3' 및 5'-CGAAGTCAGCTCCTTGGTTC-3') 및 β-액틴(5'-TTCTACAATGAGCTGCGTGTGG-3' 및 5'-GTGTTGAAGGTCTCAAACATGAT-3')에 대한 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머의 서열을 문헌에 따라 선택하였고 Thermo SCIENTIFIC(Germany)를 사용하여 합성하였다. 초기 변성(denaturation) 조건은 2분간 94℃였다. 94℃에서 30초간 변성 단계, 이후 (NGAL에 대해) 60℃에서 30초간 어닐링(annealing) 단계, (β-액틴에 대해) 72℃에서 30초간 신장(extension) 단계를 통하여 PCR 증폭을 수행하였다. 두 개의 유전자 모두에 대해 총 30 싸이클을 수행한 후 72℃에서 10분간 최종 신장 단계를 수행하였다. 2% 아가로스(agarose) 겔 전기영동에 의해 PCR 산물을 분리하였고, 에티디움 브로마이드 염색(ethidium bromide staining)에 의해 검출하였다. PCR 산물(NGAL 및 β-액틴에 대해 각각 242 bp 및 119 bp)의 예상 크기를 50-bp DNA 래더(ladder)(DirectLoadTM DNA Marker)(Sigma-Aldrich, Steinhein, Germany)를 기준으로 검증하였다.
웨스턴 블롯팅
전술한 바와 같이 호중구 과립 방출 산물(neutrophil granule release products)를 얻었다. 72시간에서 HK-2 조정 배지 상등액을 수확하였고, 0.1 mM의 PMSF(Sigma-Aldrich, Steinhein, Germany) 및 CompleteTM 프로테아제 저해제 칵테일 태블릿(protease inhibitor cocktail tablet)(Roche, Mannheim, Germany)로 보충되었다. Amicon® Ultra-4 원심분리 여과 장치(10,000 MW)(Millipore, USA)를 사용하여 상기 상등액을 농축시켰다. 제조사의 지시에 따라 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였다. 간단히 말하면, 소변 또는 농축 조정 상등액(concentrated conditioned supernatant) 또는 호중구 방출 산물들 중 어느 하나(25 μL)를 비환원(non-reducing) 조건하에서 Nu-PAGE® 4-12% Bis-Tris Gel(Invitrogen, USA)에 적용하였다. Nu-PAGE® 이동 완충용액(Invitrogen, USA)을 사용하여 25V에서 1시간 동안 상기 단백질을 Hybone-P PVDF 막(GE Healthcare, United Kingdom) 상으로 옮겼다. 상기 PVDF 막의 추가적인 결합 부위를 차단 용액(GE Healthcare, United Kingdom)을 1시간 동안 사용하여 차단하였다. 래빗 다크론성 항체 또는 마우스 단클론성 항체(Mab 697, Mab 699, Mab 763, Mab 764, 또는 Mab 765) 또는 인간 NGAL에 대한 단클론성 항체들의 혼합물 중 하나를 사용하여 실온에서 하룻밤 동안 블롯들(blots)을 배양한 후, 페록시다제접합 제2 항체(GE Healthcare, United Kingdom)를 사용하여 1시간 동안 배양하였다. 제조업체(Amersham ECLTM Western Blotting System, GE Healthcare, United Kingdom)의 지시에 따라 증강 화학발광(enhanced chemoluminescence)을 사용하여 면역블롯을 검사하였다.
통계적 분석
STATISTICA 8.0(StatSoft, Inc., Tuls, USA) 및 Medcalc 9.5(MedCalc Software, Mariakerke, Belgium)를 사용하여 스튜던트 t-검정(Student's t-test) 및 일원 분산분석(ANOVA)을 수행하였다. 분석값들은 평균±SD 및 사분위수 범위(interquartile range)와 함께 메디안으로 나타내었다. p<0.05를 유의미한 것으로 평가하였다.
결과
웨스턴 블롯팅에 의한 소변 내 NGAL 분자 형태의 검출
NGAL에 대한 1개의 래빗 다클론성 항체 및 5개의 마우스 단클론성 항체를 사용하여 심장 수술 환자로부터 얻은 소변 내의 NGAL 단백질의 분자 형태를 식별하였다. 다른 항원결정인자에 반응시키는 Biacore 실험에 의해 상기 5개의 단클론성 항체를 나타내었다. 2개의 대표적인 소변 샘플(U1 및 U2)과 함께 도 6에 나타난 바와 같이, 상기 항체들의 성능 간에 주목할 만한 차이점을 발견하였다. 상기 다클론성 항체에 의해 3개의 주요 밴드(band)들이 정규적으로 식별되었고, 단량체 형태의 NGAL, 이량체 형태의 NGAL 및 착화합물 이형이량체 형태의 NGAL로서 식별되었다. 또한, 이러한 3개의 형태는 Mab764 및 Mab765에 의해 검출되었다. 그러나 추가적이 밴드도 다른 항체에 의해 나타났다. 그러나 상기 다클론성 항체는 상기 2개의 단클론성 항체와 비교하여 상기 이량체에 보다 강한 친화도(affinity)를 보였고 상기 이형이량체에 보다 약한 친화도를 보였다. 상기 Mab764 및 Mab765은 3개의 분자 형태 모두에 대한 검출에서 매우 유사한 성능을 보였다. NGAL에 대한 Mab764 및 Mab765의 친화도는 내림차순(높은 것부터)으로 각각 단량체, 이형이량체 및 이량체 형태이었다. 또한, Mab763, Mab699 및 Mab697은 이형이량체에 강한 친화도를 보인 반면, 이량체 및 단량체 형태에는 약한 친화도를 보이는 것으로 나타나 있다. 그러나 자극된(stimulated) 호중구 과립구의 상등액 내의 단량체 및 이량체 형태를 검출하는데 있어서, 상기 다클론성 항체 및 Mab765와 Mab697의 능력은 매우 유사해 보였다.
소변 내 NGAL 측정에 대한 RIA 및 5개의 ELISA의 성능
RIA 및 5개의 ELISA의 성능 특성이 표 1에 나타나 있다.
[표 1.] 다른 분석법에 의한 심장 수술을 받는 환자로부터 수집한 소변 샘플내의 HNL/NGAL의 측정
표 1의 값들은 메디안 및 사분위수 범위로서 나타나 있다. 상기 스튜던트 t-검정은 수술 전 및 수술 후 2시간 그룹 간에 수행되었고, 상기 ANOVA는 수술 전 및 수술 후 2시간과 24시간 그룹에 대해 수행되었다.
수술 전 및 수술 후 2시간과 24시간에서 얻은 소변 내의 NGAL 농도를 측정하였고, 상기 분석법들에 의해 얻은 NGAL의 메디안 농도를 표 1에 나타내었다. RIA에 의해 측정된 수술 전 및 수술 후 2시간에서의 NGAL 메디안 농도는 상기 7개의 분석들 중에서 가장 높았다. 반면에, Mab697-기반 ELISA(ELISA 1 및 ELISA 6)에 의해 얻은 농도는 다른 분석법들에 비해 현저히 낮게 나왔다. 표 1은 수술 전 및 수술 후 2시간에서의 농도차 뿐만 아니라 24시간 동안의 총괄 차이를 나타낸다. 모든 분석법에서 수술 전 및 수술 후 간에 매우 현저한 차이를 보였다. 수술 전 및 수술 후 2시간 간의 메디안 농도의 배수 증가가 가장 높았고, ELISA 3(Mab764-Polyclonal), ELISA 5(polyclonal-polyclonal) 또는 ELISA 4(polyclonal-Mab765)의 경우에 >70이었으며, RIA, ELISA 2(Mab764-Mab765), ELISA 1(Mab697-polyclonal) 또는 ELISA 6(Mab697-Mab765)의 경우에는 23배 내지 34배이었다.
소변의 겔 여과 후 다른 분석법에 의한 NGAL 측정
웨스턴 블롯팅 결과에 근거하여, 다음 2개의 실험을 수행하여 다른 형태의 NGAL 검출에 있어서 상기 분석법들의 성능(performance)을 조사하였다. 수술 후 2시간에서 1개의 소변 샘플에 대해 SuperdexTM 75 HR 칼럼 상에서 겔 여과를 수행하였다. 분획들(fractions) 내의 NGAL 농도를 RIA 및 5개의 ELISA에 의해 측정하였고 이를 도 7에 나타내었다. 상기 단량체 및 이량체 형태의 용리 부피(elution volume)에 대응하는 2개의 피크를 상기 5개의 ELISA에 의해 각각 얻었지만, 상기 RIA에 의해서는 1개의 피크만을 얻었다. 후자의 경우는 상기 RIA의 불충분한 감도에 기인하였을 것이다. 피크 2에서 가장 높은 NGAL 농도는 상기 RIA에 의해 얻었고 가장 낮은 농도는 ELISA 1(Mab697-Polyclonal)에 의해 얻었다. ELISA 1을 제외한 모든 ELISA 분석에서는 피크 1, 즉 이량체 NGAL(도 2 삽입도)에서 유사한 농도로 측정하였다. ELISA 1은 상기 이량체 NGAL에 대항 보다 높은 농도로 측정하였다.
스트레스 조건에서 성장했을 때 NGAL은 HK-2 세포 내에서 상향조절되었다(up-regulated)
0.05 mg/mL의 소 뇌하수체 추출물(BPE) 또는 5 ng/mL의 인간 재조합 표피성장인자(EGF), 또는 ATCC 추천 완전 성장 배지(0.05 mg/mL의 BPE 및 5 ng/mL의 EGF로 보충된 K-SFM)로 보충된 케라티노사이트 무혈청 배지(K-SFM)를 사용하여 HK-2 세포를 다른 시간 간격 동안 배양한 후, 표준 조건(standard condition)하에서 48시간 동안 배양하였다. 상기 배양액 상등액 내의 NGAL 농도를 72시간에 걸쳐 다른 시간(2h, 12h, 24h, 48h 및 72h)에서 ELISA 4에 의해 측정하였다. 배양에서 12h 내지 72h 후에, K-SFM 배양액 상등액 내의 NGAL 농도는 다른 3개의 배양 배지 내에서 보다 더 높았다(도 8). 가장 낮은 농도는 완전 성장 배니 내에서 성장한 세포에서 발견되었다. 또한 상기 결과는, rEGF(재조합 EGF)로 보충된 K-SFM 내에서 성장한 세포들과 비교하여, BPE로 보충된 K-SFM 내에서 성장한 세포들의 상등액 내의 NGAL 농도가 더 높다는 사실을 암시한다. 결국, 이러한 결과는, 상기 세포들로부터 필요 성장 인자를 없앤 스트레스 조건(stressful condition)하에서 NGAL 생산이 상향조절된다는 사실을 보여준다.
IL-β, LPS 및 TNF-α에 의해 NGAL은 HK-2 세포 내에서 상향조절되었다
HK-2 세포를 완전 성장 배지에서 48시간 동안 배양하였고, 이후에 IL-β(1 ng/mL, 인간), LPS(125 ng/mL, 폐렴간균(Klebsiella pneumonia)) 또는 TNF-α(20 ng/mL, 인간) 중 하나로 보충된 완전 성장 배지의 존재하에서 다양한 시간 간격 동안에 상기 세포들을 추가로 성장시켰다. 도 9a에 나타난 바와 같이, IL-β는 상등액 내의 NGAL 농도를 매우 현저히 상승시켰다(8.9 내지 41.9배 증가). 또한, TNF-α 또는 LPS로 배양한 경우에는 상등액에서 NGAL의 농도가 어느 정도 상승하였지만(각각 2.2배 및 1.6배 증가), IL-β의 경우보다는 현저히 작았다(p<0.001). 또한, HK-2 세포를 IL-β로 보충된 K-SFM 으로 배양하였다. IL-β로 보충된 경우에 NGAL의 현저한 상승이 관찰되었지만(1.3배 내지 12.8배 증가), TNF-α 또는 LPS로 보충된 경우에는 그러하지 아니하였다(도 9b). 그러나 완전 성장 배지에서 성장한 세포와 비교하여, 이러한 상승은 현저히 작았다(p<0.001).
HK-2 세포에 의해 생산된 NGAL의 분자 형태
검출용 항체로서 혼합 단클론성 항체(Mab697, Mab764 및 Mab765)를 사용하는 웨스턴 블롯팅에 의해 HK-2 세포에 의해 분비된 NGAL의 분자 형태를 결정하였다. 도 10(아래 패널(panel))에 나타난 결과는, 완전 성장 배지 또는 K-SFM 내의 스트레스 조건하에서 또는 사이토카인(IL-β 또는 TNF-α) 또는 LPS로 보충된 배지 중 어느 하나에서 성장한 HK-2 세포에 의해 분비된 NGAL의 주된 형태는 단량체 형태라는 사실을 의미한다. 또한, IL-β로 자극한 후 이형이량체 형태의 NGAL도 명백히 존재한 반면에, 인간 호중구 상등액에서 찾은 사실(도 6)에 반하여 이량체 형태는 존재하지 아니하였다. 도 10에서, IL-β로 배양한 후 HK-2 세포 내의 NGAL의 mRNA 농도가 나타나 있다. 결과에 따르면, 증가된 발현이 상기 HK-2 세포에 의한 HGAL의 능동(active) 합성을 의미하는 것으로 나타나 있다.
논의
NGAL은 본래 인간 호중구로부터 분리되었고 본 발명자는 이전에 혈액 내 NGAL의 측정이 세균 또는 바이러스에 의한 급성 감염을 구분하기 위한 훌륭한 수단이라는 것을 보였다. 이후의 연구에 의하면, NGAL은 일정한 조건하에서 신장, 간 및 상피 조직과 같은 다른 세포 내에서도 발현될 수 있고 소변 및 혈장 내의 NGAL 측정이 급성 신장 손상의 바이오마커로서 역할할 수 있다는 사실을 발견하였다. 실시예 1은, NGAL 분석의 항체 구성이 상기 분석의 임상 수행에 대한 큰 역할을 한다는 사실을 보여주고 있다. 몇가지 형태의 NGAL을 AKI 환자의 소변 내에서 확인하였다. 이러한 실시예는 추가로, 단량체 형태 및 어느 정도는 이형이량체 형태가 세뇨관 상피세포에 의행 생산되는 지배적인 형태인 반면에, 이량체 형태는 호중구에 특이한 것으로 보인다(도 6 참조). 또한, 상기 단량체 형태는 호중구에 의해서도 생산된다. 본 연구에서 발견한 한 가지 흥미로운 사실은 채택한 항체에 의해 이러한 다른 형태들의 인식(recognition)에 차이점이 존재한다는 사실인데, 이는 호중구로부터 유래된 단량체 및 이량체 형태가 모든 단클론성 항체뿐만 아니라 다클론성 항체에 의해서도 식별되었기 때문이다. 이러한 사실은, Mab697이 소변 내의 이러한 형태를 거의 완전히 인식하지 못한다는 점과 대비된다. 또한, Mab765는 호중구 상등액 내에서 이러한 형태들과 강한 반응성을 보였지만 소변 내의 이량체 형태는 약하게 인식하였다. 이론에 구애됨이 없이, 다른 NGAL에 대한 항원결정인자의 노출의 차이, 따라서 분자 구조의 차이가 원인으로 여겨진다.
소변 내 다른 분자 형태의 NGAL의 존재 및 상기 항체들의 항원결정인자 인식의 차이 또한 채택된 분석법에 의한 소변 내 NGAL 정량에 있어서의 큰 차이에 의해 반영되었다. 상기 분석법들에 동일한 교정법이 사용되었음에도 불구하고, 수술 전 농도는 매우 달랐을 뿐만 아니라, 수술 후 상대적 변화도 매우 달랐다. 다클론성 항체만을 사용하였거나 Mab764 또는 Mab765 중 하나와 조합된 다클론성 항체를 사용한 ELISA의 경우에 배수 증가가 가장 높았음이 명백하다. 또한, 이러한 2가지 Mab는 웨스턴 블롯팅을 수행할 때 소변 내의 대부분 형태를 인식한 것들이었다. 그러나 이들 2가지 Mab의 조합은 인식율이 떨어졌는데, 이는 상기 다클론성 항체에 의해 추가적인 분자 형태가 선택되었음을 암시한다. 겔 여과 실험으로부터, 다양한 형태에 대한 이러한 인식의 차이는 주로 단량체 NGAL의 인식에서의 차이에 관련된 것으로 보이는데, 이는 오직 하나의 분석에서만 상기 이량체 형태를 다르게 인식한 것으로 보이기 때문이다. 상기 차이는 상기 분석법들의 전체적인 분석 성능에 의해 설명될 수 없는데, 이는 모두가 유사한 감도(sensitivity), 부정밀도(imprecision), 회복도(recovery), 등을 보여주었기 때문이다.
인간(CNGAL/CCr)에서 NGAL의 분획 분비(fractional excretion), 마우스에서의 동소혼성화(in-situ hybridization), 및 NGAL이 급성병기단백질(acute-phase protein)이라는 사실에 근거하여, 이전의 논문들은 소변 내 NGAL의 축적은, 소변의 NGAL의 주요 분획(major fraction)을 포함하는 국소적 신장 합성(local renal synthesis), 및 원위 기관들(distant organs)과 면역세포들로부터 유래하는 것이라고 주장하여 왔다. 그러나 사구체 여과율, 세뇨관 재흡수, 및 소변 희석(urine dilution)의 측면에서 신장의 NGAL 처리(handling)뿐만 아니라, 마우스에서 동소 혼성화가 수행된다는 사실 및 이러한 기법들이 단백질을 생산하는 세포의 능력을 잘 반영하지 못한다는 사실과 관련된 몇 가지 불확실성에 의해, 이러한 결론들이 설득력이 없다. 그러나 본 발명자의 발견들은, 체외순환 동안에 볼 수 있는 바와 같은 스트레스 또는 염증 상태하에서의 신장과 관련된 몇 가지 조건에 의해 mRNA 발현 및 단백질 생산이 유도되기 때문에 인간 세뇨관 상피 세포가 NGAL을 생산할 능력이 있다는 개념을 실제로 뒷받침한다. 본 발명자는 사이토카인 IL-1R이 가장 잠재적인 자극인자라는 것을 발견하였는데, 이는 폐 상피세포주를 사용한 다른 연구와 양립한다. 호중구 분비성 단백질(neutrophil secretory protein) 및 IL-β와 TNF-α와 같은 사이토카인은 심장 수술 동안 및 그 후에 고농도로 존재한다고 이전의 많은 연구에서 관찰되었다. 따라서 본 결과는, NGAL이 소변 내에 많은 다른 형태로 존재하고 이러한 다양성을 설명하는 소변 내 NGAL 정량 분석이 이롭다는 사실을 실증한다. 그러므로, 하나의 실시태양에 있어서, 본 발명은 세뇨관 상피로부터 유래하는 NGAL을 식별하는 검사(분석) 방법에 대한 것인데, 이는 NGAL의 분자 구조가 상기 호중구로부터 유래하는 NGAL의 구조와 약간 다르기 때문이다. 따라서 이러한 검사 방법들은 AKI의 검출에 있어서 보다 특이적이고 감도가 높으며 신장 기능이 손상될 위험이 있는 환자에게 매우 이롭다.
구체적인 실시태양 및 본 발명의 구체적인 측면을 실증하는 실시예를 참고하여 본 발명의 방법, 장치 및 키트를 기술하였다. 그러나 본 발명에 대한 추가적인 실시태양, 측면, 변형 및 변경이 본 발명의 범위를 벗어나지 아니한 채 당업자에 의해 이루어질 수 있다는 점을 이해해야 한다.
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Claims (3)
- 체액 시료 내의 NGAL 단백질과 특이결합(complex)을 형성하기 적합한 제1 NGAL 항체, 상기 체액 시료 내의 NGAL 단백질과 상기 제1 NGAL 항체 간에 형성된 특이결합의 양을 결정하는데 사용하기 적합한 제2 NGAL 항체, 및 상기 체액 시료 내의 NGAL 단백질과 상기 제1 NGAL 항체 간에 형성된 특이결합의 양을 결정하는데 사용하기 위한 검출가능한 표지를 포함하는, 시료 내 단량체, 이량체 및 이형이량체 형태의 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(NGAL)의 상대적 양을 결정하기 위한 키트.
- 제1항의 키트에 있어서, 상기 제1 및 제2 NGAL 항체는 2개의 다른 단클론성 NGAL 항체; 1개의 단클론성 NGAL 항체 및 1개의 다클론성 NGAL 항체; 또는 2개의 다클론성 NGAL 항체를 포함하는 것임을 특징으로 하는; 시료 내 단량체, 이량체, 이형이량체 형태의 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(NGAL)의 상대적 양을 결정하기 위한 키트.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 및 제2 NGAL 항체 중 하나는 상기 단량체, 이량체 및 이형이량체 형태의 NGAL과 착화합물을 형성하고, 상기 제1 및 제2 NGAL 항체 중 다른 나는 오직 상기 이형이량체 형태의 NGAL과 특이결합을 형성하는 것을 특징으로 하는, 시료 내의 단량체, 이량체, 이형이량체 형태의 호중구 젤라티나제관련 리포칼린(NGAL)의 상대적 양을 결정하기 위한 키트.
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