CN103189745B - 肾损伤的生物标记物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及肾脏疾病的预防和治疗领域。可以根据长期透析的需要或期望调整肾脏疾病的治疗。例如，可以通过监测与慢性肾脏疾病的发展相关的尿生物标记物确定长期透析治疗的预后。例如，测量透明质酸、死亡受体5和/或转化生长因子β1的大约14日标准时间过程可以用来建立患者已经患有急性肾损伤时恢复与不恢复的风险。

Description

肾损伤的生物标记物

政府资助声明

本发明受美国政府支持在美国国家糖尿病消化与肾脏疾病研究所资助的基金编号5R01DK070910-03)下做出。美国政府在本发明中持有某些权利。

发明领域

本发明涉及肾脏疾病的预防和治疗领域。可以根据长期透析的需要或期望调整肾脏疾病的治疗。例如，可以通过监测与慢性肾脏疾病的发展相关的尿生物标记物确定长期透析治疗的预后。例如，测量透明质酸、死亡受体5和/或转化生长因子β1的大约14日标准时间过程可以用来建立患者已经患有急性肾损伤时恢复与不恢复的风险。

背景

慢性肾脏疾病(CKD)据信是发达国家面临的最大和增长最快的健康顾虑之一。单在美国，两千六百万人患有CKD并且另外两千多万人存在增加的风险。CKD导致透析和心脏病，从而相关的医疗成本总计达10亿美元。CKD的一个主要病因是急性肾损伤(AKI)，这也与大幅度增加的护理成本相关，尤其如果需要透析(或相关的肾支持技术)的话。

慢性肾脏疾病可以因许多不同因素而形成，但最值得注意地是，遗传素质和/或急性肾损伤。肾损伤的程度也与长期死亡率的递增性增加相关。例如，对于患有需要透析的严重AKI的患者，在出院后一年内发生的死亡可以高达64%。另外，目前使用的肾功能标记物如血清肌酸酐水平在区分肾脏疾病的长期转归方面表现不良。无论引发因素是什么，慢性肾脏疾病致使高比例的患者需要长期透析(即，例如，肾替代疗法或RRT)。这种治疗昂贵、费时且可能导致不利的副作用，包括但不限于，血管狭窄和/或血栓形成。

因此，允许早期鉴定AKI患者并随后对其分级并且还预测肾功能恢复的生物标记物的开发是本领域内具有巨大需要的临床工具。

概述

本发明涉及肾脏疾病的预防和治疗领域。可以根据长期透析的需要或期望调整肾脏疾病的治疗。例如，可以通过监测与慢性肾脏疾病的发展相关的尿生物标记物确定长期透析治疗的预后。例如，测量透明质酸、死亡受体5和/或转化生长因子β1的大约14日标准时间过程可以用来建立患者已经患有急性肾损伤时恢复与不恢复的风险。

在一个实施方案中，本发明构思了通过测量本发明的一种或多种肾损伤标记物诊断受试者、区别诊断受试者、对受试者进行风险分级、监测受试者、对受试者分类和确定受试者中治疗方案的方法和组合物，其中所述受试者患有肾功能损伤、肾功能降低和/或急性肾衰竭或存在这种风险。

在一个实施方案中，本发明构思一种方法，所述方法包括：a)提供；i)显示急性肾损伤的至少一种症状的患者；和ii)从该患者获得的生物流体样品，其中所述样品包含至少一种肾生物标记物；b)测量样品中包含至少一种肾生物标记物值的患者值；和c)基于所述患者值，预测患者的肾恢复概率。在一个实施方案中，预测的肾恢复在距急性肾损伤发作的至少60日内发生。在一个实施方案中，样品在距肾损伤发作的至少14日内获得。在一个实施方案中，样品在距肾损伤发作的1日内获得。在一个实施方案中，预测包括使患者值与阈值相关联。在一个实施方案中，预测性阈值包括尿透明质酸值。在一个实施方案中，尿透明质酸预测性阈值是大约12μg/mg肌酸酐。在一个实施方案中，尿透明质酸值的预测性阈值包括至少0.70的接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)值。在一个实施方案中，这种预测性阈值包括透明质酸值和至少一种临床指标值。在一个实施方案中，尿透明质酸值和至少一种临床指标值的预测性阈值包括至少0.75的接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)值。在一个实施方案中，这种预测性阈值包括尿转化生长因子β1值。在一个实施方案中，尿转化生长因子β1值的预测性阈值是大约274pg/mg肌酸酐。在一个实施方案中，转化生长因子β1值的预测性阈值包括至少0.70的接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)值。在一个实施方案中，这种预测性阈值包括尿转化生长因子β1值和至少一种临床指标值。在一个实施方案中，尿转化生长因子β1和至少一种临床指标值的预测性阈值包括至少0.74的接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)值。在一个实施方案中，这种预测性阈值包括尿死亡受体5值。在一个实施方案中，尿死亡受体5值的预测性阈值是大约2.7ng/mg肌酸酐。在一个实施方案中，尿死亡受体5值的预测性阈值包括至少0.70的接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)值。在一个实施方案中，这种预测性阈值包括尿死亡受体5值和临床指标值。在一个实施方案中，尿死亡受体5值和所述至少一种临床指标值的预测性阈值包括至少0.76的接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)值。在一个实施方案中，这种预测性阈值包括至少一种临床指标值。在一个实施方案中，这种临床指标值选自年龄、SOFA评分、查尔森合并症指数或APACHE II评分。在一个实施方案中，至少一种临床指标值包括至少0.71的接受者操作特征曲线下面积(AUCROC)值。在一个实施方案中，患者值包括至少两种临床指标值。在一个实施方案中，至少两种临床指标值包括至少0.74的联合接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)值。在一个实施方案中，至少两种临床指标值包括年龄和查尔森合并症指数。

在一个实施方案中，本发明构思一种用于评价肾状态的方法，所述肾状态确定受试者的风险分级，所述方法包括：a)提供；i)显示急性肾损伤的至少一种症状的患者；ii)从该患者获得的生物流体样品，其中所述样品包含至少一种肾生物标记物；b)测量样品中包含至少一种肾生物标记物值的患者值；并且c)使所述患者值与阈生物标记物值相关联，其中确定风险分级。在一个实施方案中，这种相关联还确定正向肾生物标记物值。在一个实施方案中，这种相关联还确定负向肾生物标记物值。在一个实施方案中，患者值包括透明质酸值和至少一种临床指标值。在一个实施方案中，患者值包括转化生长因子β1值。在一个实施方案中，患者值包括死亡受体5值。在一个实施方案中，患者值还包括至少一种临床指标值。在一个实施方案中，样品在距急性肾损伤发作的至少14日内获得。在一个实施方案中，风险分级包括修正(modified)的风险、损伤、衰竭、丧失(RIFLE)标准，所述标准选自包含I期、II期或III期的组。在一个实施方案中，I期包括风险类别。在一个实施方案中，II期包括损伤类别。在一个实施方案中，III期包括衰竭类别。在一个实施方案中，风险分级包括分配肾恢复可能性。在一个实施方案中，肾恢复可能性包括具有高于大约0.70的阈值的接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)的生物标记物值。在一个实施方案中，风险分级包括分配肾不恢复可能性。在一个实施方案中，肾不恢复可能性包括具有低于大约0.70的阈值的接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)的所述生物标记物值。在一个实施方案中，风险分级包括确定患者临床转归风险。在一个实施方案中，临床转归风险包括肾功能改善。在一个实施方案中，临床转归风险包括降低的肾功能。在一个实施方案中，降低的肾功能包括肾损伤。在一个实施方案中，肾损伤是进行性的。在一个实施方案中，临床转归风险包括丧失类别。在一个实施方案中，临床转归风险包括终末期肾衰竭类别。在一个实施方案中，临床转归风险发生的可能性与患者的接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)值相关。在一个实施方案中，丧失类别的可能性在大约0.5-0.3之间的AUC ROC值内增加。在一个实施方案中，丧失类别的可能性在0.5的AUC ROC值以上减少。在一个实施方案中，终末期肾衰竭类别的可能性在0.3的AUC ROC值以下增加。在一个实施方案中，终末期肾衰竭类别的可能性在大约0.3的AUCROC值以上减少。在一个实施方案中，风险分级包括确定肾功能未来降低的受试者风险。在一个实施方案中，受试者未来肾功能降低的风险在AUC ROC值0.5以下增加。在一个实施方案中，受试者未来肾功能降低的风险在AUC ROC值0.5以上减少。在一个实施方案中，未来降低的肾功能可能在体液样品从受试者获得的时间的180日内发生。在一个实施方案中，未来降低的肾功能可能在选自18个月、120日、90日、60日、45日、30日、21日、14日、7日、5日、96小时、72小时、48小时、36小时、24小时、12小时或更短的时间段内发生。在一个实施方案中，降低的肾功能在体液样品从受试者获得的时间0小时处发生，从而提供当前状况的诊断。

在一个实施方案中，本发明构思一种方法，所述方法包括：a)提供受试者，所述受试者包含至少一种先前存在的肾病风险因子；和b)基于至少一种先前存在的肾病风险因子，选择所述受试者用于风险分级。在一个实施方案中，先前存在的风险因子包含肾生物标记物。在一个实施方案中，肾生物标记物选自尿透明质酸、尿转化生长因子1β或尿死亡受体5。在一个实施方案中，风险分级包括修正的风险、损伤、衰竭、丧失(RIFLE)标准，所述标准选自包含I期、II期、或III期的组。在一个实施方案中，I期包括风险类别。在一个实施方案中，II期包括损伤类别。在一个实施方案中，III期包括衰竭类别。在一个实施方案中，风险分级包括衰竭类别。在一个实施方案中，风险分级包括终末期肾病类别。在一个实施方案中，风险类别包括大约0.6-0.7之间的AUC ROC值。在一个实施方案中，损伤类别包括大约0.5-0.6之间的AUC ROC值。在一个实施方案中，衰竭类别包括大约0.4-0.5之间的AUC ROC值。在一个实施方案中，丧失类别包括大约0.3-0.4之间的AUC ROC值。在一个实施方案中，终末期肾病类别包括低于0.3的AUC ROC值。在一个实施方案中，肾病选自肾前性疾病、内在性肾病或肾后性急性肾衰竭疾病。在一个实施方案中，受试者进一步包含至少一种医学状况，所述医学状况选自正在接受或已经接受过大血管手术、冠状动脉搭桥或其他心脏手术；受试者患有先前存在的充血性心力衰竭、先兆子痫、子痫、糖尿病、高血压、冠状动脉病、蛋白尿、肾功能不全、低于正常范围的肾小球滤过、肝硬化、高于正常范围的血清肌酸酐或败血症。在一个实施方案中，受试者进一步包含暴露于至少一种化合物，所述化合物选自非甾体抗炎药、环孢菌素、他克莫司、氨基糖苷类、膦甲酸、乙二醇、血红蛋白、肌红蛋白、异环磷酰胺、重金属、甲氨蝶呤、不透射线性造影剂或链佐星。在一个实施方案中，基于对选自肾功能、肾功能降低或急性肾衰竭的损伤的现有诊断，就风险分级选择所述受试者。

在一个实施方案中，本发明构思一种用于诊断受试者中肾损伤的方法。在一个实施方案中，该方法还包括评价肾状态以评估受试是不是已经患有肾功能损伤、降低的肾功能或ARF。在这些实施方案中，分析量值(例如，HA、DR5、和TGFβ1的测量浓度)与肾状态变化的出现或不出现相关。在一个实施方案中，诊断方法包括诊断肾功能损伤的出现或不出现。在一个实施方案中，分析量值与这种损伤的出现或不出现相关联。在一个实施方案中，诊断方法包括诊断肾功能降低的出现或不出现。在一个实施方案中，分析量值与造成肾功能降低的损伤出现或不出现相关。在一个实施方案中，诊断方法包括诊断ARF的出现或不出现。在一个实施方案中，分析量值与造成ARF的损伤出现或不出现相关联。在一个实施方案中，诊断方法包括诊断受试者为需要肾替代疗法。在一个实施方案中，分析量值与需要肾替代疗法相关联。在一个实施方案中，诊断方法包括诊断受试者为需要肾移植。在一个实施方案中，分析量值与需要肾移植相关联。

在一个实施方案中，测量浓度的每一个可以与阈值比较。在一个实施方案中，测量的浓度可以各自与阈值比较，其中鉴定到“正向肾损伤标记物”，或“负向肾损伤标记物”。

在一个实施方案中，本发明构思一种包括监测受试者中肾状态的方法。在一个实施方案中，这种监测与受试者中肾状态变化的出现或不出现相关联。在一个实施方案中，肾状态降低。在一个实施方案中，受试者正患有肾功能损伤。在一个实施方案中，受试者正患有急性肾衰竭。在一个实施方案中，受试者因预先存在一种或多种已知的肾前性、内在性肾或肾后性ARF风险因子而存在肾功能损伤的风险。在一个实施方案中，测量的浓度可以与阈值比较。在一个实施方案中，测量的浓度可以各自与阈值比较，其中鉴定到“正向肾损伤标记物”，或“负向肾损伤标记物”。

在一个实施方案中，本发明构思一种用于对受试者中的肾损伤分类的方法。在一个实施方案中，这种方法包括评价受试者中的肾状态。在一个实施方案中，肾状态决定选自肾前性损伤、内在性肾损伤或肾后性损伤的肾损伤。在一个实施方案中，肾状态决定选自急性肾小管损伤、急性肾小球肾炎、急性肾小管间质性肾炎、急性血管性肾病或浸润疾病的肾损伤。在一个实施方案中，肾状态赋予受试者将进展至特定RIFLE期的可能性。在一个实施方案中，分析量值(例如，HA、DR5和TGFβ1的测量浓度)。在一个实施方案中，测量的浓度与特定的损伤分级和/或损伤子分类相关。在一个实施方案中，测量的浓度可以与阈值比较。在一个实施方案中，测量的浓度高于阈值，其中分配特定的分级。在一个实施方案中，测量的浓度低于阈值，其中可以分配不同的分级。

在一个实施方案中，本发明构思一种方法，所述方法包括a)提供；i)患者，其中所述患者显示急性肾损伤；ii)源自该患者的至少两份尿样；b)检测到尿样中持续性升高的的透明质酸；c)预测该患者需要长期透析。在一个实施方案中，样品在因严重肾损伤后启动替换疗法后的第1和第14日收集。在一个实施方案中，该方法还包括诊断患有慢性肾脏疾病的患者。在一个实施方案中，诊断在肾损伤后至少60日。在一个实施方案中，该方法还包括将患者纳入慢性肾脏疾病预防计划。

在一个实施方案中，本发明构思一种方法，所述方法包括a)提供；i)患者，其中所述患者显示急性肾损伤，其中所述患者存在形成慢性肾脏疾病的风险；ii)源自该患者的至少两份尿样；b)检测到尿样中持续性升高的的透明质酸；c)治疗该患者以防止慢性肾脏疾病。在一个实施方案中，治疗在肾脏疾病后第14日启动。

在一个实施方案中，本发明构思一种方法，所述方法包括a)提供；i)已经患有急性肾损伤的患者；ii)从患者获得多个尿透明质酸水平和肌酸酐水平，其中所述水平随时间推移获得；b)构建尿透明质酸水平的时间过程，其中将时间过程针对尿肌酸酐水平归一化；和c)预测慢性肾脏疾病形成。在一个实施方案中，其中预测包括长期肾替代疗法(即，例如，透析)。

定义

如本文所用，“肾功能损伤”是肾功能计量的骤然(即，例如，在14日内、优选地在7日内、更优选地在72小时内并且仍更优选地在48小时内)可测量降低。可以例如通过肾小球滤过率(GFR)或估计的GFR(eGFR)下降、尿排出量减少、血清肌酸酐增加、血清半胱氨酸蛋白酶抑制物C增、需要肾替代疗法(即，例如，透析)等鉴定这种肾功能损伤。

如本文所用，“肾功能改善”是肾功能计量的骤然(即，例如，在14日内、优选地在7日内、更优选地在72小时内并且仍更优选地在48小时内)可测量增加。用于测量和/或估计GFR的优选方法在下文描述。

如本文所用，“降低的肾功能”是肾功能的骤然(即，例如，在14日内、优选地在7日内、更优选地在72小时内并且仍更优选地在48小时内)降低，所述突然降低由血清肌酸酐绝对增大于或等于0.1mg/dL(≥8.8μmol/L)、血清肌酸酐增加百分比大于或等于20%(距基线1.2倍)或尿排出量减少(记录的小于每小时0.5mL/kg的少尿症)确定。

如本文所用，“急性肾衰竭”或“ARF”是肾功能的骤然(即，例如，在14日内、优选地在7日内、更优选地在72小时内并且仍更优选地在48小时内)降低，所述突然降低由血清肌酸酐绝对增加大于或等于0.3mg/dl(≥26.4μmol/l)、血清肌酸酐增加百分比大于或等于50%(距基线1.5倍)或尿排出量减少(记录的小于每小时0.5mL/kg的少尿症，持续至少6小时)确定。此术语与“急性肾损伤”或“AKI”同义。

如本文所用，术语“使信号与分析物的存在或量相关”指使用以已知浓度的目的分析物所计算的标准曲线进行的分析测量。技术人员将理解，从某种测定法获得的信号经常是例如在一种或多种抗体和靶生物分子(即，例如，分析物)和/或含有与例如抗体结合的表位的多肽之间所形成的复合物的直接结果。尽管此类测定法可以检测全长生物标记物并且分析结果可以表述为目的生物标记物的浓度，但是来自测定法的信号实际上是样品中存在的全部这类“免疫反应性”多肽的结果。

当本术语在本文使用时，如果某种测定法可以产生表示有生理意义浓度的分析物存在或其量的可检测信号，将这种测定法“设置成检测”这种分析物。例如，抗体表位通常为8个氨基酸级别，从而免疫测定法可以设置成检测目的标记物，所述免疫测定法也将检测与这种标记物序列结合的多肽，只要这些多肽含有与这种测定法中所用的抗体或多种抗结合必需的表位。

如本文所用，术语“相关的标记物”是相对于生物标记物如本文所述的肾生物标记物(即，例如，肾损伤标记物)之一而言的。相关的标记物也可以指具体标记物或其生物合成亲本的一个或多个片段、变体等，它们可以作为标记物本身的替代物或作为独立生物标记物被检测到。该术语也指生物学样品中存在的一种或多种多肽，所述多肽源自与额外种类(如结合蛋白、受体、肝素、脂类、糖等)复合的生物标记物前体。

如本文所用，术语“受试者”或“患者”指人或非人生物。因此，本文所述的方法和组合物同等地适用于人类和兽类疾病。另外，尽管受试者或患者优选地是活生物，但是本文所述的发明也可以用于死后分析。优选的受试者或患者是人，如本文所用，所述人指因疾病或病状而接受医疗护理的活人。

如本文所用，术语“分析物”指任何测量的化合物或分子。优选地，测量样品(即，例如，体液样品)中的分析物。这种样品可以从受试者或患者获得或可以从意在向受试者或患者提供的生物材料获得。例如，样品可以从就可能移植入受试者而受到评价的肾获得，从而分析物量值可以用来评价肾的事先存在的损伤。

如本文所用，术语“体液样品”指出于目的受试者(如患者或移植供体)的诊断、预后、分级或评价目的所获得的体液的任何样品。在某些实施方案中，可以出于以下目的获得这种样品：确定持续存在的医学状况的转归或治疗方案对医学状况的影响。优选的体液样品包括但不限于血清、血浆、脑脊液、尿、唾液、痰或胸腔积液。此外，某些体液样品可以在分级或纯化过程(例如将全血分离成血清或血浆组分)后更容易地进行分析。

如本文所用，术语“诊断”指一种方法，其中训练有素的医疗人员可以借以所述方法估计和/或确定患者是不是患有给定疾病或病状的概率(即，例如，可能性)。在本发明的情况下，“诊断”包括使针对本发明肾生物标记物的测定法(即，例如，免疫测定法)的结果，任选地连同他临床指标相关联，以确定样品从中获得并且验定的受试者或患者出现或不出现急性肾损伤或急性肾衰竭。这种诊断是“确定”不暗示这种诊断是100%精确的。因此，例如，低于预定诊断阈值的所测量的生物标记物水平可以指示疾病在受试者中发生的较大可能性，而高于预定诊断阈值的所测量的生物标记物水平可以指示相同疾病发生的较小可能性。

如本文所用，术语“预后”指特定临床转归将发生的概率(即，例如，可能性)。例如，预后指示物的水平或其水平的变化(其转而与增加的病态概率(例如，肾功能恶化、未来的ARF或死亡)相关)称作“表示患者中增加的不利转归可能性”。

如本文所用，术语“RIFLE”标准指对肾状态的任何定量性临床评价，其用来基于急性肾损伤(AKI)的统一定义，建立风险、损伤、衰竭、丧失和终末期肾病的肾分级。Kellum，Crit.Care Med.36:S141-45(2008)；和Ricci等人,Kidney Int.73，538-546(2008)，每篇文献因而通过引用方式完整地并入。

如本文所用，术语“修正的RIFLE标准”提供替代性分类用于将AKI患者分层，并且可以包括I期、II期和/或III期。Mehta等人,Crit.Care11:R31(2007)，因而通过引用方式完整地并入。

如本文所用，术语“I期”指包括RIFLE风险类别的风险分级，以血清肌酸酐增加多于或等于0.3mg/dL(≥26.4μmol/L)和/或距基线增加多于或等于150%(1.5倍)为特征。可选地，该类别可以由每小时尿排出量小于0.5mL/kg持续超过6小时来定义。

如本文所用，术语“II期”指包括RIFLE损伤类别的风险分级，以血清肌酸酐距基线增加超过200%(>2倍)为特征。可选地，该类别可以由每小时尿排出量小于0.5mL/kg持续超过12小时来定义。

如本文所用，术语“III期”指包括RIFLE衰竭类别的风险分级，以血清肌酸酐距基线增加超过300%(>3倍)和/或血清肌酸酐≥354μmol/L伴随急性增加至少44μmol/L为特征。可选地，该类别可以由每小时尿排出量小于0.3mL/kg持续24小时或无尿12小时来定义。

如本文所用，术语“风险类别”指RIFLE分级，其中就血清肌酸酐而言，意指距基线至少1.5倍的任何增加，或尿产生量<0.5mL/kg体重/hr持续大约6小时。

如本文所用，术语“损伤类别”指RIFLE分级，其中就血清肌酸酐而言，意指距基线至少2.0倍的任何增加，或尿产生量<0.5ml/kg/hr持续12小时。

如本文所用，术语“衰竭类别”指RIFLE分级，其中就血清肌酸酐而言，意指距基线至少3.0倍的任何增加，或尿肌酸酐>355μmol/l(同时增量>44)或尿排出量低于0.3ml/kg/hr持续24小时或无尿至少12小时。

如本文所用，术语“丧失类别”指临床转归风险和/或RIFLE分级，其中临床转归风险以持续需要肾替代疗法多于4周为特征。

如本文所用，术语“终末期肾病类别”或“ESRD类别”指以需要透析多于3个月为特征的临床转归风险和/或RIFLE分级。

如本文所用，术语“临床转归风险”指涉及肾恢复或肾不恢复的医学预后。

如本文所用，术语“肾生物标记物”指与慢性肾脏疾病进展性形成相关的任何生物学化合物。具体而言，肾生物标记物可以是肾损伤标记物。例如，肾生物标记物可以包括透明质酸、死亡受体5、转化生长因子β1或它们的代谢物和/或衍生物的任一种。

如本文中使用时，术语“正向生物标记物”指经确定在患有疾病或病状的受试者中与未患有这种疾病或病状的受试者相比升高的任何生物标记物。

如本文中使用时，术语“负向生物标记物”指经确定在患有疾病或病状的受试者中与未患有这种疾病或病状的受试者相比降低的任何生物标记物。

如本文所用，术语“正向肾生物标记物值”指相对于测量的生物标记物浓度低于指定阈值时所分配的可能性，当测量的生物标记物浓度高于指定阈值时，分配受试者的任何增加的遭受未来肾功能损伤的可能性(即，例如，增加的概率)。可选地，相对于测量的生物标记物浓度高于指定阈值时所分配的可能性，当测量的生物标记物浓度低于指定阈值时，可以将增加的不发生肾功能损伤的可能性赋予受试者。可选地，当测量的生物标记物浓度低于该阈值时，可以将肾功能改善赋予受试者。正向肾损伤标记物可以包括但是不限于以下一种或多种增加的可能性：急性肾损伤、AKI恶化期进展、死亡、需要肾替代疗法、需要排出肾毒素、终末期肾病、心力衰竭、中风、心肌梗死、慢性肾脏疾病进展等。

如本文所用，术语“负向肾生物标记物值”指相对于测量的生物标记物浓度高于阈值时所赋予的可能性，当测量的生物标记物浓度低于指定阈值时，赋予受试者的任何增加的遭受未来肾功能损伤的可能性(即，例如，增加的概率)。可选地，相对于测量的生物标记物浓度低于阈值时所赋予的可能性，当测量的生物标记物浓度高于指定阈值时，可以将增加的不发生肾功能损伤的可能性赋予受试者。可选地，当测量的生物标记物浓度高于该阈值时，可以将肾功能改善赋予受试者。负向肾损伤标记物可以包括但是不限于以下一种或多种增加的可能性：急性肾损伤、AKI恶化期进展、死亡、需要肾替代疗法、需要排出肾毒素、终末期肾病、心力衰竭、中风、心肌梗死、慢性肾脏疾病进展等。

如本文所用的术语“先前存在的”和“预先存在”意指从受试者获得体液样品时存在的任何风险因子(即，例如，肾生物标记物)。

如本文所用，术语“预测”指形成预后和/或分级风险指派的方法，其中受过医学训练的人分析生物标记物信息并且任选地采用相关的临床指标和/或人口统计的信息分析。

如本文所用，术语“急性肾病/衰竭/损伤”指肾功能在数小时至数日内的任何进展性恶化，导致含氮废物(如尿素氮)和肌酸酐在血液中滞留。这些物质的滞留也可以称作氮质血症。引自：Current Medical Diagnosis&Treatment2008,第47版,McGraw Hill,NewYork,第785-815页，所述文献通过引用的方式完整并入本文。

如本文所用，术语“慢性肾病/衰竭/损伤”指一种医学状况，其中示例性症状可以包括但不限于高磷血症(即，例如，>4.6mg/dl)或低肾小球滤过率(即，例如，每1.73m²体表面<90ml/分钟)。然而，许多CKD患者可以具有正常的血清磷酸盐水平合并肾小球滤过率持久降低3个或更多个月，或正常的GFR合并结构性肾畸形的持久证据。在一些情况下，将诊断患有慢性肾脏疾病的患者进行血液透析以维持正常的血液稳态(即，例如，脲或磷酸盐水平)。可选地，“慢性肾脏疾病”指一种医学状况，其中患者存在i)每1.73m²体表面<60mi/分钟的GFR持久降低持续3个或更多个月；或ii)在没有GFR降低的情况下结构性或功能性肾功能异常。肾的结构或解剖异常可以定义为，但不限于持续性微量蛋白尿或蛋白尿或血尿或存在肾囊肿。慢性肾衰竭(慢性肾脏疾病)也可以因肾功能异常丧失数月至数年而引起。引自：Current Medical Diagnosis&Treatment2008,第47版,McGraw Hill,New York,第785-815页，所述文献通过引用的方式完整并入本文。

如本文所用，术语“约”在任何分析量值的情境下指给定量值的+/-5%。

如本文所用，术语“无症状的”指不患有肾病和/或损伤的患者和/或受试者，其中肾病和/或损伤症状可以包括，但不限于，具有降低的肾小球滤过率(即，例如，在每1.73m²体表面大约70-89ml/分钟之间)持续少于3个月。

如本文所用，术语“肾小球滤过率”指能够确定肾功能的任何量值。通常，正常的肾小球滤过率在每1.73m²体表面大约120-90ml/分钟之间。当时肾小球滤过率小于每1.73m²体表面90ml/分钟时，假定肾功能受损。当时肾小球滤过率下降低于每1.73m²体表面大约30ml/分钟时，很可能是肾衰竭。当时肾小球滤过率下降低于每1.73m²体表面大约15ml/分时，经常开始透析。

如本文所用，术语“肾衰竭”指肾移除废物并浓缩尿而不丢失电解质的能力的任何急性、突然和/或慢性丧失。

如本文所用，术语“生物学样品”指源自活生物的任何物质。例如，样品可以源自血液作为尿样、血清样品、血浆样品和或全血样品。可选地，样品可以源自(例如通过活组织检查)收集的组织。这种组织样品可以例如包括肾组织、血管组织和/或心脏组织。生物学样品也可以包含体液，其包括但不限于尿、唾液或汗。

如本文所用，术语“试剂”指用来产生化学反应从而检测、测量、产生等其他物质的任何物质。

如本文所用的术语“抗体”指能够特异性结合抗原或表位的任何肽或多肽或其片段，所述肽或多肽源自一个免疫球蛋白基因或多个免疫球蛋白基因、以其为模型或基本上由其编码。见，例如，引自：Fundamental Immunology，第3版，W.E.Paul编著，Raven Press，N.Y.(1993)；Wilson等人,J.Immunol.Methods175:267-273(1994)；和Yarmush等人,J.Biochem.Biophys.Methods25:85-97(1992)。术语抗体包括但不限于抗原结合部分，即由保留结合抗原能力的片段、子序列和/或互补性决定区(CDR)例举的“抗原结合位点”，其包括但不限于：(i)Fab片段，一种包含V_L、V_H、C_L或CH₁结构域的单价片段；(ii)F(ab')₂片段，一种包含由二硫键在铰链区连接的两个Fab片段的双价片段；(iii)包含V_H和C_H1结构域的F_d片段；(iv)包含抗体单臂的V_L和V_H结构域的F_v片段；(v)包含V_H结构域的dAb片段(Ward等人,Nature341:544-546(1989))；或(vi)分离的互补性决定区(CDR)。通过提到术语“抗体”，也包括单链抗体。

如本文所用，术语“表位”指能够与抗特异性结合的任何抗原决定簇。表位通常显示化学活跃的表面分子如氨基酸或糖侧链并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。可以区分构象型和非构象型表位，在于变性溶剂存在的情况下，与前者的结合可能丧失，而与后者的结合作用可以不丧失。

如本文所用，在提到生物标记物的用途，术语“相关联”指将患者中任何生物标记物的存在和/或量与所述生物标记物在已知患有给定病状或已知存在这种病状风险的人中或在已知不存在给定病状的人中的存在和/或量比较。经常，这种采取将生物标记物浓度形式的分析结果与预定阈值比较的形式，其中选择所述预定阈值以指示疾病的发生或不发生或未来某种转归的可能性。

附图简述

图1提出示例性数据，其显示针对表现急性肾损伤的患者中的尿肌酸酐尿归一化的透明质酸排泄量。样品在因严重急性肾损伤而启动替代疗法后1-14日之间(即，D1、D7和D14)取得。所示数据代表在肾损伤后28日正在恢复或不恢复的患者中的数据(分别是R28和NR28)。

图2提出示例性数据，其显示在D1、D7和/或D14从肾损伤后28日正在恢复或不恢复的患者中取得的尿样之间的绝对差值(分别是R28和NR28)。

图3提出示例性数据，其显示在D1、D7和/或D14从肾损伤后60日正在恢复或不恢复的患者中取得的尿样之间的绝对差值(分别是R60和NR60)。

图4提出示例性数据，其显示在D1、D7和/或D14从肾损伤后28日正在恢复或不恢复的患者中取得的尿样之间的相对差值(分别是R28和NR28)。

图5提出示例性数据，其显示在D1、D7和/或D14从肾损伤后60日正在恢复或不恢复的患者中取得的尿样之间的相对差值(分别是R60和NR60)。

图6提出示例性数据，其显示当HA排泄在D1和D14之间持续性升高时，预测性透析在肾损伤后60日的患者中的高灵敏度。

图7提出示例性数据，其显示在AKI发作后前21日期间尿TGF-β1/肌酸酐比数据。在第7日和第14日上，在不恢复的患者中比率显著较高。

本发明的具体实施方案

本发明涉及肾脏疾病的预防和治疗领域。可以根据长期透析的需要或期望调整肾脏疾病的治疗。例如，可以通过监测与慢性肾脏疾病的发展相关的尿生物标记物确定长期透析治疗的预后。例如，测量透明质酸、死亡受体5和/或转化生长因子β1的大约14日标准时间过程可以用来建立患者已经患有急性肾损伤时恢复与不恢复的风险。

本领域迫切需要的是，如果可以根据长期预后调整治疗AKI并预防CKD的研究努力，则可能实施更有效的临床策略。使用这种方法，可以向被预测无法恢复肾功能的患者选择性地提供激进疗法。相反，具有有利预后的患者将免于激进介入治疗及其潜在副作用。

本文中提出的多种实施方案已经解决本领域中的多种问题，所述问题此前阻碍临床医生精确预测哪些患者将从肾病和/或损伤中恢复以及哪些患者将无法恢复的能力。

I.肾损伤和/或疾病

肾负责水和溶质从身体中排泄。它的功能包括维持酸碱平衡、调节电解质浓度、控制血液容积和调节血压。就这一点而论，肾功能因损伤和/或疾病的丧失导致严重的发病和死亡。肾损伤的详细讨论在Harrison's Principles of Internal Medicine，第17版，McGraw Hill，New York，第741-1830页中提供，所述文献因而通过引用的方式完整并入。肾位于腹侧(脊柱任一侧处的上腹部后背)。它们存在腹内深处并受脊柱、下肋骨护架和背部强壮肌肉保护。这个位置保护肾免遭许多外力影响。它们受到良好衬垫，原因在于肾是具有大量血管的器官，这意味它们具有巨大的血液供应量。如果损伤发生，严重出血可以出现。

肾可以因供应或流出肾的血管的损伤受损。这种损伤可以是以下形式：动脉瘤、动静脉瘘、动脉阻塞或肾静脉血栓形成。出血的程度取决于损伤的位置和程度。如果肾在中心受损(在内侧)，它们也可以大量出血-这是致命性损伤。幸运地是，由钝伤引起的大部分肾损伤在外周发生，仅造成肾淤紫(通常是一个自限性过程)。

存在未诊断的肾病状如错构瘤(良性肿瘤)、输尿管肾盂连接处梗阻(先天性或获得性UPJ梗阻)和其他病症--的人易感发生肾损伤并且如这些损伤发生，则更可能具有严重的并发症。肾损伤和出血的其他原因是医疗过程。肾活组织检查样品、肾造瘘管放置或其他手术可能造成动脉和静脉之间的异常连接(动静脉瘘)。这通常是个自限性问题，但是通常需要密切结果。肾损伤也可以破坏尿路，造成尿从肾中泄漏。

每只肾每天过滤约1700升血液并且每天将流体和废物浓缩成约1升尿。因为这一点，肾比几乎任何其他器官接受身体内更多的有毒质暴露。因此，它们因有毒质而高度易发生损伤。无痛性肾病是最常见类型的肾中毒性损伤之一。暴露于铅、清洁产品、溶剂、燃料或其他肾毒性化学品(可能对肾有毒的那些化学品)可能损伤肾。身体废物(如尿酸(其可以伴随痛风或伴随治疗骨髓、淋巴结，或其他病症出现))的过多积累也可以损伤肾。

由药物的免疫反应引起的炎症(刺激，伴随肿胀和存在外部免疫细胞)、感染或其他病症也可以损伤肾的结构，通常造成多种类型的肾小球肾炎或急性肾小管坏死(组织死亡)。自身免疫紊乱也可以损伤肾。肾的损伤可以导致伴有最小症状或无症状的短期损伤。或者，它可以因出血和相关的休克而是致命的，或它可以导致急性肾衰竭或慢性肾衰竭。

输尿管损伤(从肾至膀胱携带尿的管道的损伤)也可以由创伤(钝伤或穿透伤)、来自医疗过程的并发症和腹膜后腔中的其他疾病如腹膜后纤维化(RPF)、腹膜后肉瘤或转移性淋巴结阳性癌引起。医学疗法(如OB/GYN手术、先前放疗或化疗和既往腹盆腔手术)增加输尿管损伤的风险。

A.急性肾衰竭

急性(突发)肾衰竭是肾移除废物并浓缩尿而不丢失电解质的能力的突然丧失。存在肾损伤的许多可能原因，它们包括但不限于血流量下降(这可以随创伤引起的极低血压发生)、手术、严重疾病、脓毒性休克、出血、烧伤或脱水、急性肾小管坏死(ATN)、直接损伤肾的感染如急性肾盂肾炎或败血症、尿路梗阻(梗阻性尿路病)、自身免疫肾脏如间质性肾炎或急性肾病综合征、造成肾小血管内凝血的病症、特发性血栓性血小板减少性紫癜(ITTP)、输血反应、恶性高血压、硬皮病、溶血尿毒综合征、分娩病症如出血性胎盘剥离或前置胎盘。

急性肾衰竭的症状可以包括但不限于：尿量下降(少尿症)、排尿停止(无尿)、夜尿频多、踝、足和腿肿胀、全身浮肿、流体滞留、感觉减退、尤其在手掌和脚掌、食欲下降、口中味觉障碍、持续呃逆、精神状态或情绪变化、激动、嗜睡、倦怠、谵妄或意识模糊、昏迷、情绪变化、注意力不集中、幻觉、运动迟缓、呆滞、发作、手颤栗(震颤)、恶心或呕吐(可以持续数日)、易于淤紫、出血时间延长、鼻出血、血便、胁腹痛(在肋和髋之间)、乏力、呼气异味或高血压。

急性肾衰竭(ARF)也可以称作急性肾损伤(AKI)并且可以以肾小球滤过率(GFR)骤降(即，例如，一般在约48小时至1周内地检测到)为特征。这种过滤能力丧失导致正常情况下由肾排泄的含氮废物(脲和肌酸酐)和非含氮废物滞留、排尿量下降或这两种情况。据报道ARF卷入约5%的入院、4-15%的心肺转流术和至多到30%的重症监护。ARF可以按因果关系归类为肾前性疾病、内在性肾病或肾后性疾病。内在性肾病可以进一步划分成肾小球异常、肾小管异常、间质异常和血管异常。下文总结与其相应风险因子相关描述的ARF主要病因。见，表1；引自：Merck Manual，第17版，第222章，并且所述文献因而通过引用的方式完整并入。

表1．代表性急性肾衰竭风险因子

在缺血性ARF的情况下，疾病过程可以划分为4个期。在持续数小时至数日的起始期期间，减少的肾灌注演化成损伤。肾小球超滤减少，滤液流量因肾小管内部的残片而降低，并且滤液经受损的上皮返回渗漏。可以在这个阶段期间通过肾的再灌注介导肾损伤。起始之后是延长期，其以持续的局部缺血性损伤和炎症为特征并且可以包括内皮损伤和血管充血。在持续1至2周的维持期期间，出现肾细胞损伤，并且肾小球滤过和尿输出量达到最小。恢复期可以随之而来，其中肾上皮修复并且GFR逐渐恢复。尽管这种情况，患有ARF的受试者的存活率可以低至约60%。

由放射造影剂(也称作造影介质)和其他肾毒素(如环孢菌素)、抗生素(包括氨基糖苷类)和抗癌药物(如顺铂)引起的急性肾损伤表现数日至约一周时间。认为造影剂引起的肾病(CIN，它是由放射造影剂引起的AKI)由肾内血管收缩(导致局部缺血性损伤)引起并且因生成直接毒害肾小管上皮细胞的活性氧种类引起。CIN经典地表现为血尿氮和血清肌酸酐的急性(24-48小时内发作)但可逆(第3-5日达到峰值，在1周内消退)增高。

常报道的用于定义和检测AKI的标准是血清肌酸酐骤升(一般在约2-7日内或在住院时间内)。虽然利用血清肌酸酐升高来定义和检测AKI是充分建立的，血清肌酸酐升高的幅度和测量这种幅度以定义AKI的时间在各出版物之间大幅度变动。传统上，使用血清肌酸酐相对大的增加如100%、200%、增加至少100%至超过2mg/dL的值和其他定义来定义AKI。然而，最新趋势已经是趋向于使用较小的血清肌酸酐上升来定义AKI。

例如，已经报道升高的血清肌酸酐和AKI之间的关系与健康风险相关。Praught等人,Curr Opin Nephrol Hypertens14:265-270(2005)；和Chertow等人,J Am SocNephrol16:3365-3370(2005)(两份参考文献均通过引用的方式完整并入本文)。如这些出版物中所述，现在已知的急性肾功能恶化(AKI)和增加的死亡风险和其他有害转归与血清肌酸酐的很小增加相关。可以将这些肌酸酐增加测定为相对(百分比)值或标称值。已经报道血清肌酸酐距损伤前值小至20%的相对增加指示急性肾功能恶化(AKI)和增加的健康风险，但是更常报道的定义AKI和增加的健康风险的值是相对增加至少25%。已经报道小至0.3mg/dL、0.2mg/dL或甚至0.1mg/dL的名义增加指示肾功能恶化和死亡风险增加。已经使用血清肌酸酐升高至这些阈值的多个时间段来定义AKI，例如，2日、3日、7日或被定义为患者在住院或在重症监护室中的时间的可变量时间段。这些研究指出，不存在针对肾功能恶化或AKI的特定阈值血清肌酸酐上升(或这种上升的时间段)，而存在风险随血清肌酸酐上升幅度的增加而持续增加。

另一项研究将血清肌酸酐水平与术后死亡率相关联。在心脏手术后，血清肌酸酐轻度下降(即，例如，在大约-0.1至-0.3mg/dL之间)的患者具有最低死亡率，其中患者具有与血清肌酸酐大幅降低(即，例如，多于或等于-0.4mg/dL)或血清肌酸酐增加相关的较大死亡率。Lassnigg等人,J Am Soc Nephrol15:1597-1605(2004)，通过引用的方式完整并入本文。这些研究结果提出，肾功能的甚至十分微小变化，如由手术48小时内微小肌酸酐变化所检测，可以预示患者的转归。

提出一项在临床试验中和临床实践中使用血清肌酸酐来定义AKI的统一分级系统对AKI患者分层。Bellomo等人,Crit Care8(4):R204-212(2004)，所述文献通过引用的方式完整并入本文。例如，血清肌酸酐上升25%可以定义为造影剂引起的肾病。McCollough等人,Rev Cardiovasc Med.7(4):177-197(2006)，所述文献通过引用的方式完整并入本文。虽然多个小组提出略微差异的使用血清肌酸酐检测AKI的标准，但是共同之处在于，血清肌酸酐的微小变化如0.3mg/dL(即，例如，大约25%)足以检测到表征肾功能恶化的AKI，以及血清肌酸酐变化的幅度可以是AKI严重性和死亡风险的指示物。

虽然在多日时间范围内连续测量血清肌酸酐是一项检测和诊断AKI患者的已接受方法，通常认为血清肌酸酐在诊断、评估和监测AKI患者方面具有几种局限性。认为血清肌酸酐上升至大约0.3mg/dL(25%)的时间段用于AKI诊断，并且取决于所用的定义，这个时间段可以是48小时或更长。

由于AKI中的细胞损伤可以在数小时时间范围内发生，在48小时或更长时间检测到的血清肌酸酐升高可以是损伤的晚期指示物，并且取决于血清肌酸酐，因此可能延误AKI的诊断。另外，血清肌酸酐不是确切肾状态的良好指示物并且当肾功能快速变化时，大部分的AKI急性期期间需要治疗。直至由本发明的一些实施方案定义，不存在确定一些AKI患者是否将充分恢复或一些患者是否将需要透析(短期或长期)或一些患者是将具有其他有害转归(包括但不限于死亡、主要不良心脏事件或慢性肾脏疾病)的方法。因为血清肌酸酐是过滤速率的标记物，它不区分AKI的病因(肾前性疾病、内在性肾病、肾后性梗阻病、粥样栓塞病等)或内在性肾病中损伤的种类或位置(例如，肾小管、肾小球或间质来源)。尿输出量类似地受限。

这些局限性强调需要检测和评估AKI的更好方法，尤其在早期和亚临床期，当肾恢复和修复可能发生时还在稍晚期检测和评估AKI的更好方法。另外，存在更好地鉴定具有罹患AKI的风险的患者的需要。

B.慢性肾衰竭

不同于急性肾衰竭，慢性肾衰竭缓慢地恶化。它最经常地因造成肾功能渐进性丧失的任何疾病产生。它可以是从轻度功能障碍至严重肾衰竭。慢性肾衰竭可以导致终末期肾病(ESRD)。

慢性肾衰竭通常经过许多年才出现，因为肾的内部结构缓慢地受损。在早期阶段，可以不存在症状。实际上，进展可以如此缓慢，从而症状不出现直至肾功能小于正常的十分之一。

慢性肾衰竭和ESRD在美国侵袭每1000个人中2个人。糖尿病和高血压是两种最常见的病因并且引起大部分病例。其他主要病因包括但不限于Alport综合征、无痛性肾病、任何类型的肾小球肾炎(最常见病因之一)、肾结石和感染、梗阻性尿路病、多囊性肾病或返流性肾病。慢性肾衰竭导致流体和废物在身体内积累，导致含氮废物在血液中堆积(氮质血症)和总体病态健康。大部分身体系统受慢性肾衰竭影响。

初始症状可以包括但不限于乏力、频繁呃逆、总体不适感、泛发性瘙痒(瘙痒症)、头痛、恶心、呕吐或非故意的体重减轻。另外，稍后症状可以包括但不限于呕吐物中或在粪便中带血、警觉度下降，包括嗜睡、意识模糊、谵妄、orcoma、手、足或其他区域内感觉下降、易于淤紫或出血、尿输出量增加或下降、肌肉颤搐或痉挛、发作或皮肤内或上白色晶体(尿毒霜)。

细胞因子和其他炎症标记物的循环水平在慢性肾衰竭患者中明显地升高。这可能由增加的产生、减少的移除或这两种情况引起。然而，没有充分确立肾功能本身多大程度地有助于尿毒症促炎环境。在就要开始肾替代疗法的176位患者(年龄，52+/-1岁；GFR，6.5+/-0.1mL/分钟)中报道了炎症和肾小球滤过率(GFR)之间的关系。Pecoits-Filho等人,“CRF患者中循环性炎性标记物和残余肾功能之间的联系”Am J Kidney Dis.41(6):1212-1218(2003)。例如，在过夜禁食后测量高敏感性C-反应蛋白(hsCRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、透明质酸和新蝶呤的循环水平。患者随后根据中位数GFR(6.5mL/分钟)划分成两个组。尽管GFR范围狭窄(1.8至16.5mL/分钟)，但是在具有较低GFR的亚组中hsCRP、透明质酸和新蝶呤水平显著更高，并且显著负相关在GFR和IL-6(ρ=-0.18；P<0.05)、透明质酸(ρ=-0.25；P<0.001)和新蝶呤(ρ=-0.32；P<0.0005)之间是明显的。在多变量分析中，年龄和GFR与炎症相关，但是心血管疾病和糖尿病与之不相关。这些结果显示低GFR本身与炎性状态相关，显示肾消除促炎细胞因子受损、尿毒症中增加的细胞因子生成或炎症对肾功能的不利影响。

C.透析

透析(即，例如，肾替代疗法)是当肾不能从血液移走有毒物质(杂质或废物)时从血液移走有毒物质的方法并且可以使用几种不同的方法进行。例如，腹膜透析可以通过利用腹内侧腹膜过滤废物。腹部用帮助移除毒素的特定溶液填充。这种溶液留在腹中一段时间并且随后被排出。这种形式的透析可以在家实施，但是必须每天进行。可选地，可以通过使血液经身体外部的特殊滤器循环，进行血液透析。血液连同帮助移除毒素的溶液流过滤器。

透析使用接近血管中血液的特殊途径。这种路径可以是暂时或永久的。暂时路径采取透析导管(置于可以支持可接受血流量的大静脉中的中空管)形式。大部分导管在紧急情况下短时间使用。然而，可以使用称作隧道式导管的导管延长的时间段，经常数周至数月。通过将动脉手术方式连接至静脉产生永久路径。这允许静脉接受高压的血液，这导致静脉壁增厚。这种静脉可以接受反复穿刺操作并且也提供优异的血流速率。动脉和静脉之间的连接可以使用血管(动静脉瘘或AVF)或合成桥接物(动静脉移植体或AVG)产生。血液从身体中的进入点偏转至透析机。这里，血液以反流方式流至称作透析液的特殊溶液。血液的化学不平衡和不纯性得到纠正并且使血液随后返回至身体。通常，大部分患者每周就接受血液透析3次。每次持续3-4小时。

透析目的是辅助肾功能，包括过滤血液、移除废物、调节身体水、维持电解质平衡或维持血液pH在7.35和7.45之间。另外，透析可以替代没有正常工作的肾的一些功能，所述肾否则将导致患者死亡。

透析最经常用于患有肾衰竭的患者，但是它也可以在紧急情况下快速移除药物或毒物。这项技术可以在急性或慢性肾衰竭的人群中挽救生命。

II.尿肾生物标记物

目前，在AKI后，不存在改善肾恢复或改善短期和长期肾转归的有效疗法。另外，也缺少预测恢复的方法。生物标记物用于早期检测肾病和/或肾损伤的新生作用可以帮助鉴定预测肾临床转归的新预后工具。肾恢复的生物标记物的潜在候选物包括但不限于在导致再生和增殖的途径中表达的分子以及纤维化和凋亡的标记物。此外，肾损伤生物标记物也可以起到区分早期消退，并且因此增加恢复的可能性。

急性肾损伤(AKI)具有估计的每百万群体大约2000例的发生率并且这种比率正在增加。Ali等人,Incidence and outcomes in acute kidney injury:a comprehensivepopulation-based study”J Am Soc Nephrol18:1292-1298(2007)。全世界进入重症监护室的全部人群的大约5%形成需要透析的严重AKI。Uchino等人,“Acute renal failure incritically ill patients:a multinational,multicenter study”JAMA294:813-818(2005)。一项美国多中心研究发现，少于仅约60%从严重AKI幸存的患者截止两个月恢复肾功能。Palevsky等人,“Intensity of renal support in critically ill patients withacute kidney injury”N Engl J Med359:7-20(2008)。因此，大量AKI患者进展成终末期肾病(ESRD)。

然而，由于仅一部分AKI患者不能恢复肾功能，则在不存在确定哪些患者将恢复并且哪些将不恢复的一些手段情况下，不能适宜地选择性靶向旨在改善恢复或提供肾支持的介入治疗(例如早期透析)(即，例如，非侵入性生物标记物的可获得性)。目前，用于AKI后恢复的临床风险预测是极其有限的。因此，肾病控制领域中长期感受到需要开发允许早期预测肾功能恢复的非侵入性生物标记物。

鉴定这类非侵入性生物标记物(即，例如，尿生物标记物)将大大改善长期预后，从而调整研究投入以治疗AKI和预防ESRD。换而言之，具有预测哪些患者将不恢复肾功能的能力允许临床医生将有限资源集中于开发激进治疗介入法并且将它们应用于这些预测存在风险的患者上。相反，具有有利预后的患者将免于激进介入治疗及其潜在副作用，从而释放医疗资源至存在需要的那些患者并降低总体医疗成本。

在一个实施方案中，本发明构思了用于评价受试者中肾功能的方法和组合物。如本文所述，测量本文所述的多种肾损伤标记物可以用于在患有肾功能损伤、肾功能降低和/或急性肾衰竭(也称作急性肾损伤)或存在这种风险的受试者中诊断、预后、风险分级、分期、监测、分类和确定其他诊断及治疗方案。

可以将如本文所述的肾生物标记物单独或以包含多种肾生物标记物的组用于风险分级。在一个实施方案中，风险分级鉴定受试者未来存在以下风险：i)肾功能损伤；ii)进展成肾功能降低；iii)进展成ARF；或iv)肾功能改善等。在一个实施方案中，风险分级诊断现存的疾病，包括鉴定已经：i)患有肾功能损伤；ii)进展成肾功能降低；或iii)进展成ARF等的受试者。在一个实施方案中，风险分级监测肾功能的劣化和/或改善。在一个实施方案中，风险分级预测了未来医学转归，包括但不限于，肾功能改进或恶化、死亡风险下降或增加、受试者将需要开始或继续肾替代疗法(即，血液透析、腹膜透析、血液滤过和/或肾移植)的风险下降或增加、受试者将从肾功能损伤中恢复的风险下降或增加、受试者将从ARF中恢复的风险下降或增加、受试者将进展至终末期肾病的风险下降或增加、受试者将进展至慢性肾衰竭的风险下降或增加、受试者将遭受移植肾排异的风险下降或增加等。

在一个实施方案中，本发明构思了用于评价受试者中肾状态的方法。在一个实施方案中，该方法提供源自受试者的体液样品。在一个实施方案中，这种方法包括使用体液样品进行检测一种或多种肾生物标记物的测定法，所述肾生物标记物选自包括但不限于透明质酸(HA)、死亡受体5(DR5)或转化生长因子β1(TGFβ1)的组。随后使分析量值(例如，HA、DR5和TGFβ1的测量浓度)与确立受试者的肾状态的阈值相关联。

确立患者的肾状态的相关性可以包括，但不限于使分析量值与如本文所述的受试者的风险分级、诊断、预后、分期、分类和监测中的一项或多项相关。因此，本发明利用本发明的一种或多种肾生物标记物以评价肾病和/或损伤。

多种方法可以用来实现这些方法中使用的所需阈值。例如，可以从正常受试者群体通过选择如这类正常受试者中所测量的代表第75、第85、第90、第95或第99百分位数生物标记物的肾生物标记物浓度，确定阈值。可选地，可以从受试者“患病”群体，例如，那些遭受损伤或具有损伤易感性(例如，进展成ARF或一些其他临床转归如死亡、透析、肾移植等)，通过选择如这类患病受试者中所测量的代表第75、第85、第90、第95或第99百分位数生物标记物的肾生物标记物浓度，确定阈值。在另一备选项中，可以从相同受试者中肾生物标记物的先前量值确定阈值；即，受试者中生物标记物水平的时间变化可以用来向受试者赋予风险。

然而，前述讨论不意在暗示本文中构思的肾生物标记物限于与相应的各个阈值比较。用于组合分析结果的其他方法可以包括使用多变量统计回归、对数线性建模、神经网络分析、n-of-m分析、决策树分析、计算标记物比率等。这个列表不意在是限制的。在这些方法中，可以处理通过组合各个生物标记物所确定的复合结果，如同这种复合结果本身是生物标记物一样；即，可以如本文所述对各个生物标记物所述那样确定复合结果的阈值，并且将个体患者的复合结果与这个阈值比较。

在一个实施方案中，本发明构思了预测肾损伤和/或疾病后肾功能恢复的尿透明质酸(HA)生物标记物。在一个实施方案中，鉴定生物标记物提供患者分级以调整治疗强度从而防止不必要的长期并发症。

在一个实施方案中，本发明构思一种方法，所述方法包括在肾损伤和/或疾病发作后早期预测肾损伤和/或疾病的长期预后。在一个实施方案中，当尿HA在因严重急性肾损伤而开始替代疗法后第1日-第14日之间持续升高时，该方法预测长期透析。在一个实施方案中，当尿HA在因严重急性肾损伤而开始替代疗法后第1日-第14日之间持续升高时，该方法预测长期透析。在一个实施方案中，长期透析包括在肾损伤后至少六十(60)日。在一个实施方案中，长期透析包括在肾脏疾病诊断后至少六十(60)日。

本文中提供的一些数据从报名参与一项大型多中心随机对照试验的四十三(43)位患者收集，所述多中心随机对照试验研究不同RRT剂量对AKI存活的影响。在一个实施方案中，AKI存活与尿透明质酸(HA)生物标记物相关。虽然不必理解发明机理，但认为HA(即，例如，透明质酸(hyaluronan)或透明质酸盐)包括非硫酸化的糖胺聚糖，并且据信广泛地分布遍及结缔组织、上皮组织和神经组织。也认为HA是胞外基质内部的几种组分之一并且可以通过介导细胞增殖和移行、胞外基质合成和降解，参与组织修复与重建。例如，已经观察到片段化的HA在组织损伤期间积累并且可以刺激多种免疫细胞在损伤部位表达炎性基因。另外，已经见到受损的HA清除导致持续性炎症。

在一个实施方案中，这种生物标记物预测肾功能不恢复，其中透析超过六十(60)日。在一个实施方案中，肾功能的不恢复包括生物标记物升高超过其初始值持续至少十四(14)日。在一个实施方案中，这种生物标记物预测得到接受者操作特征(ROC)分析支持。在一个实施方案中，ROC分析提供计算结果，其包括但不限于拟合曲线下面积和/或梯形(Wilcoxon)面积。在一个实施方案中，拟合曲线下面积=0.9686，具有估计的标准误=0.0518。在一个实施方案中，梯形(Wilcoxon)面积=0.9692，具有估计的标准误=0.0568。见，图5。

A.透明质酸

认为透明质酸(HA)是在体内作为大部分胞外基质的高分子质量组分存在的遍在结缔组织糖胺聚糖。未将HA鉴定为正常肾皮质间质组织的主要组分。Hansell等人,“Hyaluronan content in the kidney in different states of body hydration”Kidney Int58:2061-2068(2000)。然而，在由众多疾病引起的急性及慢性肾损伤后，HA在肾近端小管上皮细胞(PTC)周围表达。Sibalic等人,“Upregulated renal tubular CD44,hyaluronan,and osteopontin in kdkd mice with interstitial nephritis”NephrolDial Transplant12:1344-1353(1997)；和Lewington等人,“Expression of CD44inkidney after acute ischemic injury in rats”Am J Physiol Regul Integr CompPhysiol278:R247-254(2000)。另外，增加的间质HA沉积与进行性肾病中的蛋白尿和肾功能相关。Sano等人,“Localization and roles of CD44,hyaluronic acid and osteopontinin IgA nephropathy”Nephron89:416-421(2001)。

HA与其主要受体CD44的结合通过HA和炎症细胞上表达的CD44之间的相互作用促进炎症。Melin等人,“Ischemia-induced renal expression of hyaluronan and CD44indiabetic rats”Nephron Exp Nephrol103:e86-94(2006)。HA/CD44结合促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径并且增强PTC移行，一个参与上皮细胞-成纤维细胞转分化和进行性肾纤维化的过程。Yang等人,“Dissection of key events in tubular epithelial tomyofibroblast transition and its implications in renal interstitial fibrosis”Am J Pathol159:1465-1475(2001)。在来自糖尿病受试者的缺血性肾中，肾HA含量已经开始在24小时后增加并且局部缺血/再灌注(I/R)后1-8周显著地增加。Okajima K:“Regulation of inflammatory responses by natural anticoagulants”ImmunolRev184:258-274(2001)。

透明质酸(hyaluronic acid，本领域中也称作透明质酸(hyaluronate)和透明质酸(hyaluronan)，缩写为HA)是糖胺聚糖，包含直链不分枝的多糖链，具有交替的N-乙酰-D-氨基葡萄糖和D-葡糖醛酸单元。Laurent等人,“Hyaluronan”FASEB J6:2397-2404(1992)；和Delpech等人,“Hyaluronan:fundamental principles and applications in cancer”JIntern Med242:41-48(1997)。HA在多种类型的生物材料(包括细菌和动物)中普遍存在。在人类中，HA以高浓度存在于脐带、眼的玻璃体液、软骨和滑液中。少量HA存在于CSF、淋巴液、血清和尿中。HA的水平已经与疾病如类风湿性关节炎、肝硬化和Wilm肿瘤相关。HA通常与非特异性肿瘤相关，但是没有发现其用途此前适用于发现、疗法和管理特定的临床肿瘤。HA已知在几种病理生理状况(包括癌症)中发挥作用。

例如，HA水平已经显示在某些动物肿瘤模型(例如，兔V2癌瘤)和人癌症(例如，肺、Wilms瘤、乳腺等)中升高。Knudson等人,“The role and regulation of tumorassociated hyaluronan”引自：The Biology of Hyaluronan(J.Whelan编著),第150-169页,New York,Wiley Chichister(Ciba Foundation Symposium143),1989)。在肿瘤组织中，HA支持肿瘤细胞黏附和移行并且还提供对抗免疫监视的一些保护作用。

也已经观察到小片段的HA刺激血管生成，并且这类片段存在于在膀胱癌患者的尿和肿瘤组织中。Sattar等人,“Does hyaluronan have a role in endothelial cellproliferation of the synovium?”Semin Arthritis Rheum22:37-43(1992)；LokeshwarVB,Selzer MG Differences in hyaluronic acid mediated functions and signalingin arterial,microvessel,and vein-derived human endothelial cells.J BiolChem2000;275:27641-27649。当HA酶(内切糖苷酶)降解HA聚合物时产生透明质酸片段。Csoka TB,Frost GI,Stern R.Hyaluronidases in tissue invasion.InvasionMetastasis1997;17:297-311；和55.Roden L,Campbell P,Fraser JR,Laurent TC,Petroff H,Thompson JN.Enzymatic pathways of hyaluronan catabolism.引自：WhelanJ编著,The Biology of Hyaluronan.New York:Wiley Chichister1989:60-86。已经一种HA试验来检测膀胱癌，无论肿瘤等级是什么。Lokeshwar VB,Obek C,Pham HT,Wei D,YoungMJ,Duncan RC.Urinary hyaluronic acid and hyaluronidase:markers for bladdercancer detection and evaluation of grade.J Urol2000；163:348-356。

最近报道了与标准BTA-Stat相比，HA-HA酶检验监测膀胱肿瘤复发的功效。Lokeshwar等人,Bladder Tumor Markers for Monitoring Recurrence and ScreeningComparison of Hyaluronic Acid-Hyaluronidase and BTA-Stat Tests.Cancer95:61-72(2002)。这项研究提出一项生物化学试验如HA-HA酶检验可以比膀胱镜检查更早地检测膀胱癌复发。如果这类早期检测可以就转归而言提供临床优点，膀胱镜检查可能不再是监测复发时决定试验灵敏度、特异性和准确度的最终金标准。这一点的一个有趣推论将是治疗前列腺癌瘤患者并在根治性前列腺切除术或放射疗法后增加前列腺特异性抗原。HA-HA酶检验可以是用于监测膀胱癌复发的膀胱镜检查的有效辅助。伴随超过90%灵敏度和86%准确度，HA-HA酶检验可以是监测膀胱癌复发的膀胱镜检查的有效辅助。假阳性HA-HA酶检验带来5个月内显著的复发风险。因此，可能的是，生物化学检验的组合可以有效地监测膀胱癌复发，这可以允许监测膀胱镜检查流程的数目减少最小50%。

透明质酸酶(HA酶)是通过水解HA中N-乙酰葡糖胺键降解HA的内切糖苷酶。由透明质酸酶所致的HA有限降解导致产生生血管的具有特定长度(约3-25个二糖单位)的HA片段(West等人,Angiogenesis induced by degradation products of hyaluronicacid.Science,228:1324-1326,1985)。在脊椎动物中，透明质酸酶可以分成两类：在中性pH(最适pH为5.0)有活性的那些和在酸性pH(pH3.5-4.0)有活性的那些(Roden等人,Enzymatic pathways of hyaluronan catabolism.引自：The Biology of hyaluronan,(J.Whelan编著),第60-86页,New York,Wiley Chichister(Ciba FoundationSymposium143)；West等人,ibid.；Gold,Purification and properties ofhyaluronidase from human liver.Biochem。J.,205:69-74,1982；Fraser和Laurent,Turnover and metabolism of Hyaluronan.引自：Biology of Hyaluronan,(J.Whelan编著),第41-59页,New York,Wiley Chichister(Ciba Foundation Symposium143)；Zhu等人,Molecular cloning of a mammalian hyaluronidase reveals identity withhemopexin,a serum heme-binding protein.J.Biol.Chem.,269:32092-32097,1994；Lin等人,A hyaluronidase activity of the sperm plasma membrane protein PH-20enables sperm to penetrate the cumulus layer surrounding the egg.J.CellBiol.,125:1157-1163,1995)。例如，睾丸透明质酸酶属于中性类型，而肝透明质酸酶具有酸性最适pH。HA和透明质酸酶的协调作用已知在胚胎发育、血管新生、血管重建、免疫监视和肿瘤进展期间发挥重要作用(McCormick和Zetter，Adhesive interactions inangiogenesis and metastasis.Pharmacol.Ther.,53:239-260,1992；Hobarth等人,Topical chemo-prophylaxis of superficial bladder cancer by mitomycin C andadjuvant hyaluronidase,Eur.Urol.,21:206-210,1992；Knudson等人,The role andregulation of tumor-associated hyaluronan.引自：The Biology of Hyaluronan(J.Whelan编著)第150-169页,New York,Wiley,Chichester(Ciba FoundationSymposium143),1989；Lin等人,Urinary hyaluronic acid is a Wilms'tumormarker.J.Ped.Surg.,30:304-308,1995；Stern等人,Hyaluronidase levels in urinefrom Wilms'tumor patients.J.Natl.Canc.Inst.,83:1569-1574,1991)。

B.死亡受体5

死亡受体5(DR5)认为是受肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL)激活的促凋亡性受体。认为TRAIL是可溶性形式的内源性凋亡诱导配体，所述内源性凋亡诱导配体在广泛类型的细胞中诱导凋亡并且促进后续炎症和纤维化。已经报道TRAIL或DR5缺陷小鼠相对地抵抗炎症和后续纤维化的发生。Wang等人,“Over-expression of C/EBP-alpha inducesapoptosis in cultured rat hepatic stellate cells depending on p53andperoxisome proliferator-activated receptor-gamma”Biochem Biophys ResCommun380:286-291(2009)；和Takeda等人,“Death receptor5mediated-apoptosiscontributes to cholestatic liver disease”Proc Natl Acad Sci U S A105:10895-10900(2008)。

本文中提出的数据示例了一种用于一系列尿蛋白的筛选方法，所述尿蛋白与炎症、败血症、急性肾损伤和急性肾衰竭相关。从这个表中，确定尿死亡受体5(DR5)作为严重AKI后恢复的潜在生物标记物。死亡受体5(也称作TRAIL2)是肿瘤坏死因子(TNF)超家族的部分并且是肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TRAIL2)。当TRAIL与其受体(DR4和DR5)结合时，启动事件级联，导致NFkB活化和凋亡。Shetty等人,“Tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand(TRAIL)up-regulates death receptor5(DR5)mediated by NFkB activation in epithelial cell lines”Apoptosis7:413-420(2002)。

在一个实施方案中，本发明构思一种尿生物标记物，其包括能够预测AKI后肾功能恢复的DR5。在一个实施方案中，本发明构思一种尿生物标记物，其包括能够为AKI后治疗强度提供患者分级和预防长期并发症的DR5。

C.转化生长因子β1

认为转化生长因子-β1(TGFβ1)是执行许多细胞功能(包括但不限于增殖、分化和凋亡)的分泌型蛋白。TGFβ1可以通过刺激胞外基质组分合成和减少胶原蛋白酶产生直接发挥作用，或通过其他促纤维生成因子(如结缔组织生长因子(CTGF))间接发挥作用，其中所述促纤维生成因子可以在伴随终末期肾衰竭出现(无论原发病因学是什么)的肾小球硬化、间质纤维化和肾小管萎缩出现中发挥作用。Wolf G.,“Renal injury due to renin-angiotensin-aldosterone system activation of the transforming growth factor-beta pathway”Kidney Int70:1914-1919(2006)。TGFβ1也在局部缺血/再灌注(I/R)后高度表达并且通过诱导内皮细胞的表型转变以转分化为成纤维细胞/肌成纤维细胞表型而促进血管丧失。

本文中提出的数据筛查与肾生理学相关的一系列尿蛋白。从这个表中，确定尿转化生长因子β1(TGF-β1)作为严重AKI后肾恢复的潜在生物标记物。TGF-β1是参与胚胎发育和组织愈合与修复的生长因子。已知TGF-β1参与肾小管上皮细胞信号传导。Sakurai等人,“An in vitro tubulogenesis system using cell lines derived from the embryonickidney shows dependence on multiple soluble growth factors”Proc Natl Acad SciUSA94:6279-6284(1997)。

在一个实施方案中，本发明构思一种尿生物标记物，其包括能够预测AKI后肾功能恢复的TGF-β1。在一个实施方案中，本发明构思一种尿生物标记物，其包括能够为AKI后治疗强度提供患者分级和预防长期并发症的TGF-β1。

D.临床试验结果

1.试验设计

一项最近肾恢复研究(BioMARK)是作为退伍军人事务部/国家健康研究所(VA/NIH)急性肾衰竭试验网络研究(下文称作ATN研究)的一部分所实施的观察性队列研究。ATN研究包括一项用于患有急性肾损伤的危重患者中肾替代疗法的两项策略的多中心、前瞻性试验。ATN研究在2003年11月和2007年7月之间在27所退伍军人管理局和大学附属医学中心实施。全部成年患者(18岁或更大)存在临床上与急性肾小管坏死相符并且需要肾替代疗法(RRT)的AKI(定义为缺血性或肾毒性损伤和少尿症或血清肌酸酐增加的临床环境)，以及一个或多个非肾器官系统衰竭或败血症。

排除标准包括：i)男性中多于2mg/dl或女性中多于1.5mg/dl的基线血清肌酸酐；ii)临床上认为AKI归因于急性肾小管坏死之外的病因学；iii)肾移植之前；iv)妊娠；v)箝闭；vi)体重超过120kg；vii)RRT非候选资格；(viii)濒死状态；或ix)预期因不可逆性医学状况而第28日不存活的患者。在随机分组之前，合格患者不能已经接受多于一次断续血液透析或持续低效率透析或超过24小时的连续肾替代疗法。

作为ATN试验的子研究，要求一些在匹兹堡大学医学中心、匹兹堡退伍军人医学中心、克利夫兰临床基金会、休斯顿的德克萨斯大学健康科学中心和华盛顿大学医学中心报名的患者接受所选择的前瞻性生物标记物(即，例如，透明质酸、转化生长因子β1或死亡受体5)的一系列测量。这项具体研究要求生物标记物测定的额外知情同意书，并且来自这5个中心的总计76个病例可用于分析并且纳入这项研究中。从匹兹堡大学机构审查委员会和全部参与地点获得批准。

2.数据收集和分析

研究参与者的医学记录经前瞻性评审以抽取住院数据，包括基线人口统计学特征、连续肾功能和/或存在少尿症(如由尿输出量<400ml/日定义)。通过使用全身性炎症反应综合征标准定义败血症的存在。肾恢复的定义从第二届急性透析质量倡议(ADQI)组国际共识会议中修改。肾功能的恢复由长期存活或透析非依赖性定义。不恢复由未存活或透析非依赖性定义。

在以下时间获得新鲜尿样品：在报名后第1日、第7日和第14日。将尿在4°C以1000xg离心5分钟后，将尿样等分并且在-80°C贮存。在研究之前不将样品融化和再冷冻。使用市售的酶测定法(DZ072B，Diazyme labs，加利福尼亚州，美国)测量尿肌酸酐浓度；使用市售的测定法(Echelon Biosciences，盐湖城，美国)测量尿HA；并且使用市售的测定法(R&D，Minneapolis，USA)测量TGFβ1。全部指标均根据相应的制造商说明书测量。通过化学发光免疫测定法使用自动化分析仪(Diagnostic Products Corp，洛杉矶，加利福尼亚州)测量DR5。

作为透析非依赖性的恢复转归定义为在第60日出现。在报名后第60日从AKI恢复的患者和未能恢复的那些患者之间比较基线特征。将连续数据表述为均数±SD并且使用student't检验或Wilcoxon秩和检验进行比较。将分类数据表述为比例并且使用卡方检验或Fisher精确检验进行比较。将肾生物标记物水平通过尿肌酸酐浓度归一化并且在每个时间点分析。随后与每位患者的第1日和最后可获得量值相比，使用前14日内的最大相对变化进行分析。随后将对数回归与数据集合拟合以评价每种潜在生物标记物和AKI恢复之间的关系。因此，产生接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)(AUC ROC)以评估每种肾生物标记物的预测准确度。通过灵敏度和特异性的最大总和确定最佳截值点。为评估每种肾生物标记物相对于传统临床预测物的额外预测能力，基于AUC ROC分析确定一种临床预测模型并且随后将每种肾生物标记物单独添加至这个临床模型。来自组合模型的AUC ROC与这个临床模型的AUC ROC比较。均使用SAS9.0(SAS Institute，Cary，NC)以显著性水平0.05进行分析。

3.结果

表2中汇总76位患者的临床特征。

表2：人口统计和临床指标

a.第1日总结

恢复组和不恢复组中存在相等的患者数目。就性别、人种、基线肾功能或第1日临床评价得分(即，例如，APACHE II评分和/或克利夫兰门诊部ICU ARF肾衰竭评分)而言，在恢复组和不恢复组之间未发现显著差异。与恢复组相比，在不恢复组中平均年龄、随机分组之前ICU停留时间长度，查尔森合并症指数，第1日总SOFA评分均显著更高。与恢复组中的76.3%相比，观察在不恢复组中局部缺血具有引起AKI的最高百分比(97.4%)。也在不恢复组中与恢复组相比，更经常地观察到败血症引起AKI(分别地是71.05%对60.53%)。

b.第60日恢复预测

对独立生物标记物组合的五(5)种不同模型筛选预测截止第60日恢复的最佳ROC曲线下面积(AUC ROC)。见，表3。

表3：预测截止第60日恢复的尿生物标记物模型相关性

数据表明，第14日HA、第14日TGFβ1和DR5的最后可用值是AKI恢复的最佳预测物，AUC ROC范围是0.70至0.89。优化的临床模型是年龄和查尔森合并症指数的组合，其指示针对AKI恢复的0.74的显著AUC ROC。当添加尿肾生物标记物至这个临床模型时，观察到AUCROC的巨大改善。与HA、DR5和TGFβ1的相对变化组合的临床模型指标的AUC ROC分别是0.83、0.86、0.84和0.91，其中当第14日HA与年龄组合时AUC ROC达到0.97(在全部以上模型中P<0.001；表4)。

表4：使用临床模型组合时改进的预测

通过选择最大AUC ROC值决定每种尿标记物的显著时间点。通过确定以上5个模型的灵敏度和特异性的最大总和，确定临床阈值。见，表3。观察到第14日HA在12mcg/mg.Cr具有最高灵敏度值0.93和最高特异性值0.83。即使灵敏度较低时，也确定DR5的最后可用值和第14日-TGFβ1是有预测作用的。见，表5。

表5：尿生物标记物阈值

恢复组和不恢复组之间在基线肾功能、败血症组合、APACHE II评分或RRT强度方面没有发现显著差异。然而，发现不恢复组中的患者更年长，更可能患有肾局部缺血，在RRT之前遭遇更长的ICU停留、更多的共病和更高的SOFA评分。数据显示，年龄、第1日总SOFA评分和查尔森合并症指数的组合构成优选的临床预测模型。

这些数据也表明，尿生物标记物HA、DR5和TGFβ1的相对变化与AKI不利转归显著相关。这三种(3)肾生物标记物分别代表持续性肾胞外基质沉积、细胞凋亡、固有细胞表型转分化和肾小管上皮细胞损伤的生物学过程。虽然不需要理解发明机理，但是认为由于第1日值代表损害强度和内部细胞反应，这些肾生物标记物的相对变化可能代表与个体基线特征无关的恢复程度。另外，第14日HA与转归之间的强相关性表明胞外基质沉积可以在肾恢复的过程中发挥作用。

III.肾状态分析量值

使用ROC分析，可以建立特定肾生物标记物分析量值区分两个群体的能力。例如，从“第一”亚群(即，例如，预先易发生一种或多种肾状态未来变化的群体)和“第二”亚群(即，例如，预先不易发生一种或多种肾状态未来变化的群体)建立ROC曲线。这些ROC曲线的计算和建立这些ROC曲线下的面积将特定分析量值的预测力定量。在一些实施方案中，由本文所述的分析量值建立的预测力包括大于0.5、优选地至少0.6、更优选地0.7、仍更优选地至少0.8、甚至更优选地至少0.9和最优选地至少0.95的AUC ROC。

A.免疫测定法

通常，免疫测定法包括使含有或疑似含有目的生物标记物的样品与特异性结合于生物标记物的至少一种抗体接触。随后产生可检测信号，其指示因样品中的多肽与抗体结合所形成的复合物的存在或量。可检测信号随后与样品中生物标记物的存在或量相关。已经就检测和分析生物学生物标记物方面报道了众多方法和装置。见，例如，美国专利6,143,576；6,113,855；6,019,944；5,985,579；5,947,124；5,939,272；5,922,615；5,885,527；5,851,776；5,824,799；5,679,526；5,525,524；和5,480,792和The Immunoassay Handbook,David Wild,ed.Stockton Press,New York,1994，所述文献的每一篇通过引用的方式完整并入本文，包括全部表、图和权利要求。

众多免疫分析装置和方法可以使用标记物的分子在多种夹心、竞争性或非竞争性分析模式下来产生与目的生物标记物的存在或量相关的信号。合适的分析模式也包括色谱法、质谱法和蛋白质“印迹”法。此外，某些方法和装置如生物传感器和光学免疫测定法可以用来确定分析物的存在或量，无需标记物的分子。见，例如，美国专利5,631,171；和5,955,377，所述专利的每一篇通过引用的方式完整并入本文，包括全部表、图和权利要求。执行这些免疫测定法的自动仪器是可商业获得的包括但不限于Beckman AbbottRoche Dade Behring 系统。可以使用任何合适的免疫测定法，例如，酶联免疫测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、竞争性结合测定法等。

可以将抗体或其他多肽固定到免疫测定法中使用的多种固相支持物上。可以用来固定特异性结合成员的固相包括但不限于被开发和/或用作固相结合分析中固相的那些。合适固相的实例包括但不限于膜滤器、纤维素基纸、珠(包括聚合物粒子、乳胶粒子和顺磁粒子)、玻璃、硅晶圆、微粒子、纳米粒子、TentaGels、AgroGels、PEGA凝胶、SPOCC凝胶和多孔平板。例如，可以通过将抗体或多种抗体以阵列方式涂布于固体支持物上制备分析条。这种条可以随后浸入测标本品并随后通过洗涤和检测步骤迅速处理以产生可测量的信号，如显色的点。抗体或其他多肽可以通过直接缀合于分析装置表面或通过间接结合与分析装置的特定区带结合。在后一种情况的实例中，抗体或其他多肽可以固定在粒子或其他固相支持物上并且将这种固相支持物固定至装置表面。

在某些实施方案中，尿肾生物标记物分析方法包括免疫测定法。例如，此类测定法中所用的抗体可以特异性结合目的肾生物标记物的表位并且也可以结合与其相关的一种或多种多肽，如这个术语在下文定义那样。在一个实施方案中，目的肾生物标记物是全长标记物(即，例如，蛋白质)。在一个实施方案中，目的肾生物标记物是蛋白质片段标记物(即，例如，肽)。众多免疫测定法形式是可用地与体液样品相容，所述体液样品包括但不限于尿、血清、唾液、泪和血浆。

从免疫测定法获得的可检测信号可以是是在一种或多种抗体和靶生物分子(即，例如，分析物)和含有与抗体结合的必需表位的多肽之间所形成的复合物的直接结果。尽管此类测定法可以检测全长生物标记物并且分析结果可以表述为目的生物标记物的浓度，但是来自测定法的信号实际上可以是样品中存在的全部这类“免疫反应性”多肽的结果。也可以通过除免疫测定法之外的手段确定生物标记物的表达，所述手段包括蛋白质测量(即，例如，点印迹、蛋白质印迹法、色谱方法、质谱法等)和核酸测量(mRNA定量)。这个列表不意在是限制的。

前述方法步骤不应当解释为意指肾生物标记物分析量值在本文所述的方法中孤立使用。相当，可以在本文所述的方法中包含额外的变量或其他临床指标。例如，如本文所述的风险分级、诊断、分级、监测等方法可以与相关于患者群体的一种或多种临床指标组合、所述临床指标包括但不限于人口统计信息(例如，体重、性别、年龄、人种)、医疗史(例如，家族史、手术类型、预存疾病如动脉瘤(aneurism)、充血性心力衰竭、先兆子痫、子痫、糖尿病、高血压、冠状动脉病、蛋白尿、肾功能不全或败血症、毒素暴露类型如NSAID、环孢菌素、他克莫司、氨基糖苷类、膦甲酸、乙二醇、血红蛋白、肌红蛋白、异环磷酰胺、重金属、甲氨蝶呤、不透射线性造影剂或链佐星)、临床变量(例如，血压、温度、呼吸速率)、风险评分(APACHE评分、预测评分、TUA/NSTEMI的IMI风险评分、Framingham风险评分)、肾小球滤过率、估计的肾小球滤过率、尿产生速率、血清或血浆肌酸酐浓度、尿肌酸酐浓度、钠排泄分数、尿钠浓度、尿肌酸酐对血清或血浆肌酸酐比率、尿比重、尿重量摩尔渗透压浓度、尿脲氮对血浆脲氮比率、血浆BUN对肌酸酐比、计算为尿钠/(尿肌酸酐/血浆肌酸酐)的肾衰竭指数、血清或血浆嗜中性粒细胞明胶酶(NGAL)浓度、尿NGAL浓度、血清或血浆半胱氨酸蛋白酶抑制物C浓度、血清或血浆心肌钙蛋白浓度、血清或血浆BNP浓度、血清或血浆NT前BNP浓度和血清或血浆前BNP浓度。下文描述可以与一种或多种肾生物标记物分析量值组合的其他肾功能量度。引自：Harrison’s Principles of Internal Medicine,17th Ed.,McGrawHill,New York,第1741-1830页；和引自：Current Medical Diagnosis&Treatment2008,第47版,McGraw Hill,New York,第785-815页，所述文献各自通过引用的方式完整并入本文。

当测量多于一种生物标记物时，各个生物标记物可以在同时获得的样品中测量，或者可以从不同(例如，较早或较晚)时间获得的样品测定。也可以对相同或不同的体液样品测量各个生物标记物。例如，可以在血清或血浆样品中测量一种肾生物标记物，可以在尿样中测量另一种肾生物标记物。此外，可能性的分配可以将与肾生物标记物分析量值与一个或多个额外变量的时间变化组合。

B.可检测标签

可以使用多种光学、声学和电化学方法从可检测标签产生可检测信号。检测模式的实例包括但不限于荧光、放射化学检测、反射比、吸光度、电流分析、电导、阻抗、干涉测量、椭圆偏振测量术等。在这些方法的某些中，固相抗体可以偶联至用于信号生成的换能器(例如，衍射光栅，电化学传感器等)，而在其他方法中，信号由空间上与固相抗体分离的换能器产生(例如，采用激发光源和光学检测器的荧光计)。这个列表不意在是限制的。基于抗体的生物传感器也可以用来确定分析物的存在或量，这任选地消除对标记分子的需要。

生物学测定法需要检测方法，并且用于分析量值定量的最常见方法之一是将可检测标签缀合至蛋白质或核酸，所述蛋白质或核酸对正在研究的生物系统中的组分之一具有亲和力。在上文描述的免疫测定法中使用的可检测标签可以包括但不限于本身是可检测的分子(例如，荧光部分、电化学标签、ecl(电化学发光)标签、金属螯合物、胶体金属粒子等)以及可以通过产生可检测反应产物(例如，酶如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等)或通过使用特异性结合分子(例如，与第二抗体结合的标记物抗体、生物素、洋地黄甙、麦芽糖、寡组氨酸、2,4-二硝基苯、苯基砷酸盐、ssDNA、dsDNA等)而间接检测到的分子，其中所述特异性结合分子本身可以是可检测的。

固相和可检测标签缀合物的制备经常包括使用化学交联剂。交联试剂可以包含至少两个反应基团，并且总体上分成同功能交联剂(含有相同的反应基团)和异功能交联剂(含有不相同的反应基团)。通过胺、硫氢基偶联或非特异性反应的同双功能交联剂是从许多商业来源可获得。马来酰亚胺、烷基和芳基卤化物、α-酰卤和吡啶基二硫化物是巯基反应基团并且认为与硫氢基反应以形成巯基醚键，而吡啶基二硫化物与硫氢基反应以产生混合的硫化物。吡啶基二硫化物产物是可切割的。亚氨酯也对蛋白质交联十分有用于。多种异双功能交联剂(每种组合用于成功缀合的不同属性)是可商业获得的。

C.透明质酸测定法

可以通过首先采集清洁(clean-catch)尿标本测定尿透明质酸，其中所述尿标本贮存在-20°C直至测定。HA测定法可以基于针对透明质酸的基于ELISA平板的测定法，所述测定法使用生物素酰化的蛋白聚糖G1结构域(HA结合)区。Fosang等人,Matrix,10:306-313(1990)。在一个实施方案中，可以通过以下方式修改测定法：使用人脐带HA(25(μg/ml)包被的96孔微量滴定平板和生物素酰化牛鼻软骨HA-结合蛋白(1.μg/ml)，其中所述滴定平板与尿标本在磷酸盐缓冲盐水(PBS)+0.05%Tween20(PBS+Tween)中的连续稀释物孵育。在室温孵育16小时后，PBS+Tween中洗涤各孔。使用抗生物素蛋白-生物素检测系统和ABTS(2,2'-联氮基-双(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸))底物(Vector Laboratories,Burlingame,Calif.)，定量与这些孔结合的HA结合蛋白。可以通过将吸光度(405nm)对人脐带HA浓度(ng/mL)作图制备标准曲线。使用这种曲线，可以计算尿标本的每个稀释物中的HA浓度。从几种这类测定中，测定每份样品中的平均HA浓度并且随后相对于尿样中的肌酸酐浓度(mg/ml)归一化。

本发明的上述HA测定法已经显示使用大约500ng/mL临界值以约88%的灵敏度检出膀胱癌。Lokeshwar等人,用于检测和评价膀胱癌的方法，美国专利6,350,571(所述专利通过引用方式并入本文)。虽然不需要理解发明机理，但是认为HA浓度的临界值可以变动，并且必须考虑群体跨度(spread)。设定HA浓度的临界值达到长期透析的适宜预测物可以涉及考虑多个因素，包括但不限于年龄、膳食、样品中蛋白质的浓度、环境影响、遗传背景、水化状态、医疗史、身体状况、性别、体重等。

在一个实施方案中，HA测定法包括使HA吸附到固相的表面上。虽然不需要理解发明机理，但是认为HA可以源自任何便利来源，如人脐带。固相可以是任何常规的固相，包括硝酸纤维素等并优选地是微量滴定孔。在使HA吸附到固相后，固相的表面优选地使用常规缓冲液洗涤。因为这种固相仍具有在其表面上留下的能够与HA或其他分子偶联的位点，所以优选在添加样品之前，添加封闭物质，从而覆盖固相上仍没有吸附HA的任何部分。合适封闭物质的实例包括源自牛或其他动物的γ-球蛋白和白蛋白。优选牛血清白蛋白。在封闭固相的游离位点后，固相的表面优选地使用常规缓冲液洗涤。

接下来，将HA结合蛋白(HABP)在从疑似患有肾损伤的人采集的生物流体样品存在下添加至包被的固相支持物，并且在这样的条件下孵育，从而允许HABP与固相支持物上包被的HA和尿HA(如果存在的话)结合。孵育时间和条件可以在宽大界限值范围内变动，但是约4至约16小时的孵育时间和约4°C至约37°C的孵育温度是令人满意的。然而，更长或更短的孵育时间和更高或更低的孵育温度也是可能的。

适合随本发明测定法一起使用的HABP可以容易地从众多来源如牛鼻软骨(Tengblad,Biochim.Biophys.Acta,578:281-289,1979)、猪咽软骨(Fosang等人,Matrix,10:306-313,1990)纯化。在HABP与包被的HA和/或样品HA结合后，固相的表面优选地使用常规缓冲液洗涤。接下来，测定与固相支持物上包被的HA结合的HABP的量。优选地，HABP是生物素酰化的，并且与抗生物素蛋白-酶缀合物和任产生有色产物的酶的任何底物孵育后，使结合的HABP可视化。这种检测系统不使用放射性活度作为标签，多个标记物(即，酶分子)经固定用于与固相支持物结合的每个HABP，并且信号(即，有色产物)因酶的周转扩增。然而，任何常规的标记物系统可以与HABP一起使用。

合适标记物系统的实例包括酶、荧光、化学发光、酶-底物、同位素标记物、放射标签等。优选地，通过抗生物素蛋白-生物素检测系统确定与固相支持物上包被的HA结合的HABP的量。另一种有用的标记物系统使用硫酸角蛋白和硫酸角蛋白反应性抗体。尿HA水平可以使用微量滴定平板读数仪有用地测定，并且可以从标准曲线外推出来。与包被的HA偶联的HABP的量随后可以与患者中存在膀胱癌相关，其中从所述患者中收集生物流体的样品。

对于HA测定法，优选地使用纯化的透明质酸作为标准物。

上述测定法中使用的HA结合片段可以从人脐带HA(约500mg)通过用20,000单位睾丸透明质酸酶(Sigma Chemical Co.,St.Louis,Mo.)在37°C消化持续不同时间间隔来分离。产生的HA片段在Sephadex G-50柱(1.5x120cm)上分离。收集10ml级分并且对其测定糖醛酸含量(Bitter和Muir,A modified uronic acid carbazolereaction.Anal.Biochem.,4:330-334,1962)。将级分合并以产生3种制备物F1、F2和F3。通过Dygert测定法确定每个级分中还原性末端的数目(Dygert等人,Determination ofreducing sugars with improved precision.Anal.Biochem.,13:367-374,1965)。由于HA或其片段的每条直链多糖含有单个还原性末端，所以从每摩尔糖醛酸的还原性末端数目计算每个片段的链长度。还通过HA消化期间掺入³H标记物的HA(如Lokeshwar等人,Ankyrinbinding domain of CD44(GP85)is required for the expression of hyaluronicacid-mediated adhesion function.J.Cell Biol.,1261099-1109,1994中所述制备)并用凝胶电泳和荧光显影分析片段确定每个片段中寡糖的大小范围。

因此，在本发明的一个实施方案中，可以通过定量测量从疑似患有肾损伤和/或肾病的患者收集的生物流体样品(如，例如，尿标本)中的HA预测长期透析。任何常规的测定方法学可以用来确定HA的存在和量值，包括放射测定法、夹心测定法、抑制测定法等。然而，HA优选地用竞争性结合分析测量。更优选地，本发明的测定法按照与ELISA试验相同的方式工作，但是不利用抗体竞争机制。

在一个实施方案中，可以使用以下种方法预测长期透析，所述方法包括：

(a)用HA包被固相支持物(优选地，微量滴定孔)；

(b)在从疑似患有肾损伤和/或肾疾病的人采集的生物流体样品(如尿样)存在下使HA结合蛋白(HABP)与包被的固相支持物接触并且在这样的条件下孵育，从而允许HABP与固相支持物上包被的HA和样品中的HA(如果存在的话)结合；

(c)测定与固相支持物上包被的HA结合的HABP的量，并且从中确定样品中存在的HA的量。

虽然不需要理解发明机理，但是认为当样品中存在HA时，更少的HABP将与包被的HA结合，如通过例如与标准物比较所确定。换而言之，与包被的HA结合的HABP的量减少(即，与对照相比)将意味着样品中存在的升高的HA。在一个实施方案中，升高的尿HA预示长期透析。

在一个实施方案中，该方法还可以包括检测与结合的HABP相关或由其产生的信号。虽然不需要理解发明机理，但是认为与固相支持物上包被的HA结合的HABP的量可以用来从中确定样品中存在的HA的量。例如，微量滴定平板读数仪可以用来测量有色产物的吸光度作为与固相支持物结合的生物素酰化HABP的间接度量(例如，抗生物素蛋白-酶缀合物和标记物底物用来产生有色产物)。可以通过在不存在任何HA或含有HA的样品的情况下将HA-包被的孔与缓冲液单独孵育，获得最大吸光度。随后可以通过将吸光度对ng/孔或0.2mlHA作图准备标准曲线。使用这种标准曲线，可以计算样品的每个稀释物中的HA浓度(ng/mL)。从几种这类测定中，可以测定每份样品中的平均HA浓度。可以测定肌酸酐浓度，从而可以将HA浓度归一化。

在一个实施方案中，预测患者是否将需要长期透析可以通过源自归一化尿HA水平的以下计算来确定：从时间过程曲线外推的HA(ng/mL)x稀释倍数/mg/ml尿蛋白。例如，低吸光度读数将指示尿样中明显量的HA，这本身将指示患者中需要长期透析。

1.从患者尿中分离HA和HA片段

来自正常受试者和患者的尿标本可以浓缩10倍并且针对PBS充分透析。将大约2ml每一份透析的标本(约20mg蛋白质)施加至用PBS平衡的琼脂糖凝胶6CL-B柱(1.5x120cm)(Pharmacia,Piscataway,N.J.)。该柱在PBS中以7ml/小时运行并且收集3.5ml级分。通过如上文所述的ELISA样测定法测定级分的HA。由于标准球状蛋白质标记物和直链多糖如HA和HA片段具有不同的形状，所以使用人脐静脉HA(分子量约2x10⁶D)和HA片段、F1、F2和F3将该柱校准。

ELISA样测定法可以包括使用生物素酰化的HA结合蛋白来测定尿标本中的HA浓度。因为尿HA水平(即，正常情况下按ng量计)发现受水化状态和尿输出量影响，所以将这些水平针对尿肌酸酐含量归一化。

D.测定法相关性

在一些实施方案中，肾生物标记物分析量值与肾功能的一种或多种未来变化相关。在一个实施方案中，风险分级包括确定受试者未来肾功能改善的可能性(即，例如，概率)。

在一个实施方案中，肾生物标记物分析量值与肾功能的这种未来改善的可能性相关联。在一个实施方案中，该方法使这种未来损伤与肾功能相关联。在一个实施方案中，风险分级包括确定受试者进展成急性肾衰竭(ARF)的风险。

在一个实施方案中，肾生物标记物分析量值与进展成急性肾衰竭(ARF)的可能性相关联。在一个实施方案中，风险分级方法包括确定受试者的转归风险。

在一个实施方案中，分析量值与临床转归出现的可能性相关联，所述临床转归与受试者患有的肾损伤相关联。

因此，测量的浓度值可以各自与阈值比较，其中鉴定到“正向肾损伤标记物”，或“负向肾损伤标记物”。在一个实施方案中，风险分级包括确定受试者肾功能未来降低的风险。在一些实施方案中，该方法赋予可能性、风险或概率，从而目的事件更有或更不可能在体液样品从受试者获得的时间的180日内发生。在一些实施方案中，所赋予的可能性、风险或概率与目的事件在包括但不限于18个月、120日、90日、60日、45日、30日、21日、14日、7日、5日、96小时、72小时、48小时、36小时、24小时、12小时或更短的时间段内发生有关。可选地，在体液样品从受试者获得的0小时时间赋予风险等同于当前状况的诊断。

连同其他，选择诊断阈值包括考虑疾病的概率、在不同检验阈值时真实和错误诊断的分布和基于这种诊断估计治疗的结果(或治疗失败)。例如，当考虑施用高度有效并具有低水平风险的特异性疗法时，几乎不需要检验，因为临床医生可以接受明显的诊断不确定性。在另一方面，在治疗选项较不有效并且风险更大的情况下，临床医生经常需要更高程度的诊断确定性。因此，成本/效益分析涉及选择诊断阈值。

1.阈值

可以以多种方式确定合适的阈值。例如，诊断急性心肌梗死的一个推荐诊断阈值使用心肌钙蛋白，其中诊断阈值设定在正常群体中测量的心肌钙蛋白浓度的97.5百分位数。确定诊断阈值的另一种方法包括测量来自相同患者的连续样品，其中先前“基线”结果用来监测生物标记物水平的时间变化。

群体研究也可以用来选择阈值。例如，接受者操作特征(“ROC”)源自信号检测理论领域，所述信号检测理论在第二次世界大战期间形成用于分析雷达图像，并且ROC分析经常用来选择区分“患病”亚群与“未患病”亚群的阈值。预测力平衡假阳性(即，例如，当人们检验呈阳性时，但是实际上未患有疾病时)和假阴性(即，例如，当人们检验呈阴性，提示他们健康时，此时他们实际上患有疾病)的出现。为绘制ROC曲线，在决策阈值连续变动时，测定真阳性率(TPR)和假阳性率(FPR)。由于TPR等价于灵敏度并且FPR等同于(1-特异性)，所以ROC曲线有时称作灵敏度与(1-特异性)曲线。一项完美检验将具有ROC曲线下面积1.0；一项随机检验将具有ROC曲线下面积0.5。选择阈值以提供可接受水平的特异性和灵敏度，这通常借助加和特异性值与灵敏度值来确定。因此，计算的阈值越大，处于分析下的特定分析量值的预测力越大。

在这个情境下，“患病”意指群体具有一种特征(即，例如，存在某种疾病或病状或某种转归出现)而“未患病”群体缺少相同特征。尽管单一决策阈值是这种方法的最简单应用，但是可以使用多个决策阈值。例如，低于第一阈值时，可以向疾病的不存在赋予相对高的可信度，并且高于第二阈值时，也可以向疾病的存在赋予相对高的可信度。在这两个阈值之间可以视为中间状态。这意指在实际中仅是示例性的。

除阈值比较之外，用于使分析量值与患者分级(即，例如，发生或不发生疾病、转归的可能性等)相关联的其他方法包括但不限于决策树、规则集、Bayesian方法和神经网络方法。这些方法可以产生表示受试者或患者属于多个分级中一个分级的程度的概率值。

多个阈值也可以用来评估受试者和/或患者中的肾状态。例如，多阈值方法可以将预先易发生一种或多种肾状态未来变化、发生损伤、分级等的“第一”亚群与预先不易出现这类情况的“第二”亚群合并成单一组。这种合并组随后再分成3个或更多个相等部分(即，例如，三分位、四分位、五分位等，取决于再分次数)。基于受试者所属的细分部分，向受试者赋予比值比。如果考虑三分位实施方案，则可以使用最低或最高三分位作为比较其他细分部分的参考。赋予这个参考细分部分比值比1。向第二三分位赋予相对于第一三分位的比值比。即，第二三分位中的某个人遭受一种或多种肾状态未来变化的可能性可能比第一三分位中的某个人高3倍。还向第三三分位赋予相对于第一三分位的比值比。

2.特异性和灵敏度

在一些实施方案中，一种或多种肾生物标记物或者这类生物标记物的复合物的测量浓度可以作为连续变量处理。例如，任何特定的生物标记物浓度可以转变成受试者的肾功能未来降低、发生损伤、分级等的相应概率。可选地，阈值可以在受试者群体分成“组距(bins)”如“第一”亚群(例如，其预先易发生一种或多种肾状态未来变化、发生损伤、分级等)和预先不易出现这类情况的“第二”亚群时提供可接受水平的特异性和灵敏度。

在一个实施方案中，选择阈值以便通过检验准确度(test accuracy)的一个或多个以下量度而分离第一和第二群体：

i)大于1、优选地至少约2或更大或约0.5或更小、更优选地至少约3或更大或约0.33或更小、仍更优选地至少约4或更大或约0.25或更小、甚至更优选地至少约5或更大或约0.2或更小和最优选地至少约31或更大或约0.1或更小的比值比；

ii)大于0.5、优选地至少约0.6、更优选地至少约0.7、仍更优选地至少约0.8、甚至更优选地至少约0.9和最优选地至少约0.95的特异性，伴随大于0.2、优选地大于约0.3、更优选地大于约0.4、仍更优选地至少约0.5、甚至更优选地约0.6、还更优选地大于约0.7、仍更优选地大于约0.8、更优选地大于约0.9和最优选地大于约0.95的相应灵敏度；

iii)大于0.5、优选地至少约0.6、更优选地至少约0.7、仍更优选地至少约0.8、甚至更优选地至少约0.9和最优选地至少约0.95的灵敏度，伴随大于0.2、优选地大于约0.3、更优选地大于约0.4、仍更优选地至少约0.5、甚至更优选地约0.6、还更优选地大于约0.7、仍更优选地大于约0.8、更优选地大于约0.9和最优选地大于约0.95的相应特异性；

iv)至少约75%灵敏度，其与至少约75%特异性组合；大于1、至少约2、更优选地至少约3、仍更优选地至少约5和最优选地至少约10的正似然比(计算为灵敏度/(1-特异性))；或

v)小于1、小于或等于约0.5、更优选地小于或等于约0.3和最优选地小于或等于约0.1的负似然比(计算为(1-灵敏度))/特异性)。

已经报道检验准确度的多种量度并且将它们用来确定给定生物标记物的有效性。Fischer等人,Intensive Care Med.29:1043-1051(2003)。这些准确度量度包括但不限于灵敏度和特异性、预示值、似然比、诊断比值比和AUC ROC值。例如，AUC ROC值等于分级者将使随机选择的正案例高于随机选择的负案例的概率。因此，可以认为AUC ROC值等同于Mann-Whitney U检验，所述的Mann-Whitney U检验对所考虑的两个组中获得的评分之间的中位数差异检验，如果这些组具有连续数据的话，或等同于Wilcoxon秩检验。

如上文讨论，合适的检验可以显示关于这些多样量度的一个或多个以下结果：大于0.5、优选地至少0.6、更优选地至少0.7、仍更优选地至少0.8、甚至更优选地至少0.9并且最优选地至少0.95的特异性、伴随大于0.2、优选地大于0.3、更优选地大于0.4、仍更优选地至少0.5、甚至更优选地0.6、还更优选地大于0.7、仍更优选地大于0.8、更优选地大于0.9并且最优选地大于0.95的相应灵敏度；大于0.5、优选地至少0.6、更优选地至少0.7、仍更优选地至少0.8、甚至更优选地至少0.9并且最优选地至少0.95灵敏度、伴随大于0.2、优选地大于0.3、更优选地大于0.4、仍更优选地至少0.5、甚至更优选地0.6、还更优选地大于0.7、仍更优选地大于0.8、更优选地大于0.9并且最优选地大于0.95的相应特异性；至少75%灵敏度，其与至少75%特异性组合；大于0.5、优选地至少0.6、更优选地0.7、仍更优选地至少0.7、甚至更优选地至少0.8并且最优选地至少0.95的ROC曲线面积；不同于1、优选地至少约2或更大或约0.5或更小、更优选地至少约3或更大或约0.33或更小、仍更优选地至少约4或更大或约0.25或更小、甚至更优选地至少约5或更大或约0.2或更小并且最优选地至少约10或更大或约0.1或更小的比值比；大于1、至少2、更优选地至少3、仍更优选地至少5并且最优选地至少10的正似然比(计算为灵敏度/(1-特异性))；和或小于1、小于或等于0.5、更优选地小于或等于0.3并且最优选地小于或等于0.1的负然比(计算为(1-灵敏度))/灵敏度)。

E.临床指标测定法

额外的临床指标可以与本发明的肾生物标记物分析量值组合，以改善与肾损伤和/或疾病的风险分级、分级、诊断和/或预后的相关性的灵敏度和特异性。这些包括但不限于与肾状态相关的其他生物标记物。

提到常见生物标记物名称，后接这种生物标记物或其亲本的Swiss-Prot条目编号的实例包括但不限于：肌动蛋白(P68133)；腺苷脱氨酶结合蛋白(DPP4、P27487)；α-1-酸性糖蛋白1(P02763)；α-1-微球蛋白(P02760)；白蛋白(P02768)；血管紧张素原酶(肾素、P00797)；膜联蛋白A2(P07355)；β-葡糖醛酸糖苷酶(P08236)；B-2-微球蛋白(P61679)；β-半乳糖苷酶(P16278)；BMP-7(P18075)；脑钠肽(proBNP、BNP-32、NTproBNP；P16860)；钙结合蛋白β(S100-β、P04271)；碳酸酐酶(Q16790)；酪蛋白激酶2(P68400)；钙黏着蛋白-3(P07858)；蓝胞浆素(P00450)；簇集蛋白(P10909)；补体C3(P01024)；半胱氨酸丰富蛋白(CYR61、O00622)；细胞色素C(P99999)；表皮生长因子(EGF、P01133)；内皮素(P05305)；胞外体Fetuin-A(P02765)；心脂肪酸结合蛋白(FABP3、P05413)；肝脂肪酸结合蛋白(P07148)；铁蛋白(轻链、P02793；重链P02794)；果糖-1,6-二磷酸酶(P09467)；GRO-α(CXCL1、(P09341)；生长激素(P01241)；肝细胞生长因子(P14210)；胰岛素样生长因子I(P01343)；免疫球蛋白G；免疫球蛋白轻链(κ和Lambda)；干扰素γ(P01308)；溶菌酶(P61626)；白介素-1α(P01583)；白介素-2(P60568)；白介素-4(P60568)；白介素-9(P15248)；白介素-12p40(P29460)；白介素-13(P35225)；白介素-16(Q14005)；L1细胞黏附分子(P32004)；乳酸脱氢酶(P00338)；亮氨酸氨基肽酶(P28838)；安眠蛋白(Meprin)A-α亚基(Q16819)；安眠蛋白A-β亚基(Q16820)；中期因子(P21741)；MIP2-α(CXCL2、P19875)；MMP-2(P08253)；MMP-9(P14780)；神经轴突导向因子-1(Netrin-1)(O95631)；中性内肽酶(P08473)；骨桥蛋白(P10451)；肾乳头抗原1(RPA1)；肾乳头抗原2(RPA2)；视黄醇结合蛋白(P09455)；核糖核酸酶；S100钙结合蛋白A6(P06703)；血清淀粉样蛋白P组分(P02743)；钠/氢交换蛋白同工型(NHE3、P48764)；亚精胺/精胺N1-乙酰转移酶(P21673)；TGF-β1(P01137)；转铁蛋白(P02787)；三叶因子3(TFF3、Q07654)；toll样蛋白4(O00206)；总蛋白；肾小管间质性肾炎抗原(Q9UJW2)；尿调节蛋白(Tamm-Horsfall蛋白、P07911)。

1.风险分级改善

处于风险分级目的，改善确定肾状态的临床指标生物标记物包括但不限于：脂连蛋白(Q15848)；碱性磷酸酶(P05186)；氨基肽酶N(P15144)；钙结合蛋白D28k(P05937)；半胱氨酸蛋白酶抑制物C(P01034)；F1FO ATP酶的8亚基(P03928)；γ-谷氨酰转移酶(P19440)；GSTa(α-谷胱甘肽-S-转移酶，P08263)；GSTpi(谷胱甘肽-S-转移酶P；GST class-pi；P09211)；IGFBP-1(P08833)；IGFBP-2(P18065)；IGFBP-6(P24592)；整合型膜蛋白1(Itm1，P46977)；白介素-6(P05231)；白介素-8(P10145)；白介素-18(Q14116)；IP-10(干扰素-γ诱导的10kDa蛋白，P02778)；IRPR(IFRD1，O00458)；异戊酰基-CoA脱氢酶(IVD，P26440)；I-TAC/CXCL11(O14625)；角蛋白19(P08727)；Kim-1(甲型肝炎病毒细胞受体1，O43656)；L-精氨酸:甘氨酸转脒基酶(P50440)；瘦蛋白(P41159)；脂笼蛋白(NGAL，P80188)；MCP-1(P13500)；MIG(γ-干扰素单核细胞因子Q07325)；MIP-1a(P10147)；MIP-3a(P78556)；MIP-1β(P13236)；MIP-1d(Q16663)；NAG(N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶，P54802)；有机离子转运蛋白(OCT2，O15244)；骨保护素(O14788)；P8蛋白(O60356)；纤维蛋白溶酶原激活物抑制剂1(PAI-1，P05121)；ProANP(1-98)(P01160)；蛋白质磷酸酶1-β(PPI-β，P62140)；Rab GDI-β(P50395)；肾激肽释放酶(Q86U61)；整合型膜蛋白的RT1.B-1(α)链(Q5Y7A8)；可溶性肿瘤坏死因子受体超家族成员1A(sTNFR-I，P19438)；可溶性肿瘤坏死因子受体超家族成员1B(sTNFR-II，P20333)；金属蛋白酶的组织抑制物3(TIMP-3，P35625)；uPAR(Q03405)，它们可以与本发明的肾损伤标记物分析量值组合。

F.人口统计信息指标

可以与本发明的肾损伤标记物分析量值组合的其他临床指标包括人口统计信息，所述人口统计信息包括但不限于体重、性别、年龄、人种、医疗史、家族史、手术类型、预存疾病如动脉瘤(aneurism)、充血性心力衰竭、先兆子痫、子痫、糖尿病、高血压、冠状动脉病、蛋白尿、肾功能不全或败血症、毒素暴露类型如NSAID、环孢菌素、他克莫司、氨基糖苷类、膦甲酸、乙二醇、血红蛋白、肌红蛋白、异环磷酰胺、重金属、甲氨蝶呤、不透射线性造影剂或链佐星)、临床变量(例如，血压、温度、呼吸速率)、风险评分(APACHE评分、PREDICT评分、TUA/NSTEMI的IMI风险评分、Framingham风险评分)、尿总蛋白量值、肾小球滤过率、估计的肾小球滤过率、尿产生速率、血清或血浆肌酸酐浓度、肾乳头抗原1(RPA1)量值；肾乳头抗原2(RPA2)量值；尿肌酸酐浓度、钠排泄分数、尿钠浓度、尿肌酸酐对血清或血浆肌酸酐比率、尿比重、尿重量摩尔渗透压浓度、尿脲氮对血浆脲氮比率、血浆BUN对肌酸酐比和/或计算为尿钠/(尿肌酸酐/血浆肌酸酐)的肾衰竭指数。下文描述可以与肾损伤标记物分析量值组合的其他肾功能量度。引自：Harrison’s Principles of Internal Medicine,17th Ed.,McGraw Hill,New York,第1741-1830页；和引自：Current Medical Diagnosis&Treatment2008,第47版,McGraw Hill,New York,第785-815页，所述文献因而各自通过引用的方式完整并入。

以这种方式组合肾生物标记物量值与临床指标测量量值可以包括使用多变量统计回归、对数线性建模、神经网络分析、n-of-m分析、决策树分析等。这个列表不意在是限制的。

G.常规肾诊断法

如上文指出，如本文所用的术语“急性肾(或肾)损伤”和“急性肾(或肾)衰竭一般就血清肌酸酐距基线值的变化进行部分定义。ARF的最常规定义具有常见要素，包括但不限于利用血清肌酸酐并且经常利用尿输出量。患者可以出现肾功能障碍，而没有这种比较中使用的可获得的基线肾功能量度。在这种情况下，可以通过假定患者起初具有正常GFR来估计基线血清肌酸酐值。

1.肾小球滤过率和肌酸酐

肾小球滤过率(GFR)通常定义为每单位时间从肾(肾)小球毛细血管滤过至Bowman囊中的流体的体积。肾小球滤过率(GFR)可以过测量在血液中具有稳定水平并且被自由过滤但是既不由肾重吸收也不由其分泌的任何化学物来计算。GFR一般以单位ml/分钟表述：

通过将GFR相对于身体表面积归一化，可以假定每1.73m²大约75-100ml/分钟的GFR。如此测量的比率是尿中源自可计算血液体积的物质的量。

存在用来计算或估计肾小球滤过率(GFR或eGFR)的几项不同技术。然而，在临床实践中，肌酸酐清除率用来测量GFR。肌酸酐由身体天然产生(肌酸酐是肌肉中存在的肌酸的代谢物)。它由肾小球自由地过滤，并且由肾小管以非常小的量主动分泌，从而肌酸酐清除率对实际GFR估计过高10-20%。考虑到易于测量肌酸酐清除率，这种误差幅度是可接受的。

如果肌酸酐尿浓度(UCr)、尿流速(V)和肌酸酐血浆浓度(PCr)的值是已知的，可以计算肌酸酐清除率(CCr)。由于尿浓度和尿流速的乘积产生肌酸酐排泄速率，所以也称肌酸酐清除率为其排泄速率(UCr×V)除以其血浆浓度。这通常以数学方式表述为：

常见地，进行24小时尿收集，从一个早晨的空膀胱至下一个早晨的膀胱内容物，随后进行对比性血液检查：

为了允许比较体格不同的人之间的结果，CCr经常针对身体表面积(BSA)校正并且与平均体格的人相比，表述为ml/min/1.73m²。尽管大部分成人具有接近1.7(1.6-1.9)的BSA，但是极端肥胖或消瘦的患者应当将他们的CCr对其实际BSA进行校正：

肌酸酐清除率量值的准确度是有限的(甚至当时收集是完整时也是如此)，因为随着肾小球滤过率(GFR)下降，肌酸酐分泌增加，并且因此血清肌酸酐的上升较少。因此，肌酸酐排泄远大于过滤的负载，导致可能过大过高估计GFR(多大两倍差距)。然而，对于临床目的而言，重要的是确定肾功能是否稳定或变得恶化或更好。这经常通过单独监测血清肌酸酐来确定。如同肌酸酐清除率，血清肌酸酐将不是ARF非稳定状态条件下GFR的精确反映。然而，血清肌酸酐距基线变化的程度将反映GFR的变化。血清肌酸酐是轻易和容易测量的并且它对肾功能是特异的。

为了基于mL/kg/hr确定尿输出量的目的，小时尿收集和测量是足够用的。在例如仅累积性24小时输出量是可获得的并且没有提供患者重量的情况下，已经描述了RIFLE尿输出标准的少量修改。例如，一些已经假定平均患者重量为70kg，其中将患者基于以下项：<35mL/h(风险)，<21mL/h(损伤)或<4mL/h(衰竭)分配RIFLE分级。Bagshaw等人,Nephrol.Dial.Transplant.23:1203-1210(2008)。

2.选择治疗方案

一旦获得肾诊断，临床医生可以轻易地选择与诊断相容的治疗方案，如开始肾替代疗法、停止递送已知损伤肾的化合物、肾移植、推迟或避免已知损伤肾的手术、调整利尿药施用、开始目的指导的疗法等。已经相对于本文所述的诊断方法讨论了众多疾病的多种适宜疗法。见，例如，Merck Manual of Diagnosis and Therapy,第17版,Merck ResearchLaboratories,Whitehouse Station,NJ,1999。此外，由于本文所述的方法和组合物提供预后信息，本发明的肾生物标记物可以用来监测治疗过程。例如，改善的预后状态或恶化的预后状态可以表示一种具体疗法是不是有效。

IV.抗体

在本文所述的免疫测定法中使用的抗体优选地与本发明的肾损伤标记物特异性结合。术语“特异性结合”不意在表示抗体排他地结合于其预期靶，因为如上文指出，抗体结合于显示与该抗体结合的表位的任何多肽。相反，如果与抗体对不显示适宜表位的非靶分子的亲和力相比时，它对预期靶的亲和力约5倍更大，则抗体“特异性结合”。优选地、抗体的亲和力将比其对靶分子非亲和力大至少约5倍、优选地10倍、更优选地25倍、甚至更优选地50倍和最优选地100倍或更大。在一些实施方案中，抗体以至少约10⁷M^-1和优选地在约10⁸M^-1至约10⁹M^-1、约10⁹M^-1至约10¹⁰M^-1、或约10¹⁰M^-1至约10¹²M^-1之间的亲和力结合。

亲和力可以计算为K_d=k_off/k_on(k_off是解离速率常数，K_on是缔合速率常数，Kd是平衡常数)。以在平衡过测量标记物配体在多种浓度(c)时的结合分数(r)，确定亲和力。使用斯卡查德方程：r/c=K(n-r)将数据作图，其中r=在平衡时结合配体的摩尔数/受体的摩尔数；c=在平衡时游离配体浓度；K=平衡缔合常数；并且n=每个受体分子的配体结合位点数。通过作图分析，将r/c在Y-轴上对X-轴上的r作图，因此产生斯卡查德曲线。通过斯卡查德分析测量抗体亲和力是本领域熟知的。见，例如，van Erp等人,J.Immunoassay12:425-443(1991)；和Nelson等人,Comput.Methods Programs Biomed.27:65-68(1988)。

众多出版物讨论了噬菌体展示技术针对与选定分析物的结合产生和筛选多肽文库的用途。见，例如，Cwirla等人,Proc Natl Acad Sci USA97:6640-6645(1990)；Devlin等人,Science249:404-406(1990)；Scott等人,Science249:386-388(1990)；和Ladner等人,美国专利号5,571,698(全部参考文献通过引用方式并入本文)。噬菌体展示法的基本概念是在编码待筛选多肽的DNA和这种多肽之间建立物理联系。这种物理联系由噬菌体粒子提供，其中所述噬菌体粒子将多肽展示为包围噬菌体基因组的衣壳的部分，所述噬菌体基因组编码这种多肽。在多肽与其遗传物质之间建立物理允许同时大规模筛选极大数目的携带不同多肽的噬菌体。展示对靶具有亲和力的多肽的噬菌体与这种靶结合，并且通过针对这种靶的亲和力筛选富集这些噬菌体。从这些噬菌体展示的多肽的身份可以从它们相应的基因组中确定。使用这些方法，被鉴定为对所需靶具有结合亲和力的多肽随后可以通过常规手段大量合成。见，例如，美国专利号6,057,098，所述专利因而通过引用的方式完整并入，包括全部表、图和权利要求。

随后可以通过以下方式选择由这些方法产生的抗体：首先用纯化的目的多肽筛选亲和力和特异性并且(如果需要)，将抗体的亲和力和特异性的结果与需要从结合作用中排除的多肽的结果比较。筛选方法可以包括在微量滴定平板的独立孔中固定纯化的多肽。随后将含有潜在抗体或抗体群组的溶液置于相应的微量滴定孔中并且孵育约30分钟至2小时。随后洗涤微量滴定孔并且将标记物的第二抗体(例如，如果生成的抗体是小鼠抗体，与碱性磷酸酶缀合的抗小鼠抗体)添加至各孔并且孵育约30分钟并且随后洗涤。将底物添加至各孔并且其中针对固定多肽的抗体存在的情况下，颜色反应将出现。

随后可以就所选的测定法设计中的亲和力和特异性进一步分析如此鉴定的抗体。在开发针对靶蛋白的免疫测定法时，纯化的靶蛋白充当标准，其中针对所述标准，判断使用已经选择的抗体的免疫测定法的灵敏度和特异性。因为多种抗体的结合亲和力可以不同；某些抗体对(例如，在夹心测定法中)可以在空间上彼此干扰等，抗体的分析性能可以是比绝对的抗体亲和力和特异性更重要的量度。

V.试剂盒

在一些实施方案中，本发明也构思用于执行本文所述方法的装置和试剂盒。合适的试剂盒包含足够对至少一种所述的肾损伤标记物执行分析的试剂，连同用于进行所述阈值比较的说明书。

在某些实施方案中，在分析装置中提供用于执行此类测定法的试剂并且此类分析装置可以包含于这种试剂盒中。优选的试剂可以包含一种或多种固相抗体，所述固相抗体包括检测与固相支持物结合的预期生物标记物靶的抗体。在夹心免疫测定法情况下，这类试剂也可以包括一种或多种可检测标记物的抗体，所述可检测标记物的抗体包括检测与可检测标签结合的预期生物标记物靶的抗体。下文描述额外的任选部件，其中所述部件可以作为分析装置的部分提供。

在一些实施方案中，本发明提供用于分析所述肾损伤标记物的试剂盒。试剂盒包含用于分析至少一份测试样品的试剂，所述测试样品包含针对肾损伤标记物的至少一种抗体。试剂盒也可以包括用于进行本文所述的一种或多种诊断性和/或预后关联的装置和说明书。优选的试剂盒将包含针对分析物，用于进行夹心测定法的抗体对或用于进行竞争性测定法的标记物种类。优选地，抗体对包含与固相缀合的第一抗体和与可检测标签缀合的第二抗体，其中第一和第二抗体的每一种结合肾损伤标记物。最优选地，每种抗体是单克隆抗体。使用试剂盒并且进行关联的说明书可以为标签形式，所述标签指在试剂盒制造、运输、销售或使用期间的任何时间与其结合或相伴的任何书面或记录的材料。例如，术语标签包括广告传单和小册子、包装材料、说明书、录音带或录像带、计算机磁盘以及在试剂盒上直接印刷的文字。

在一个实施方案中，本发明构思了用于预测长期透析的诊断试剂盒。在一个实施方案中，试剂盒包含HA和/或HA酶、HABP和标记物或与标记物缀合的HABP和适用于检测生物学样品(即，例如，尿样)中HA和/或HA酶存在的辅助试剂。由本发明构思的诊断试剂盒的实例是常规的试纸条检验装置。

在一个实施方案中，试纸条检验装置可以支持HA测定法预测长期透析。例如，如上文所述，使用常规方法时，试纸条形式的固相可以用来分析HA。在一个实施方案中，试纸条可以用HA涂布或浸渍，其中所述试纸条可以用来检验任何生物流体，包括但不限于尿。

实验

在一些实施方案中，本发明充分地适应于实施这些目的并且获得所提及的结果和优势，以及其中内在的那些结果和优势。本文中提供的实例是优选实施方案的代表，是示例性的，并且不意在作为本发明范围的限制。

实施例1

人尿样中归一化的透明质酸

如上文所述测定人尿中的透明质酸。通过采集和分析尿中的HA两周(即，十四日；D1-D14)生成时间过程。提出的数据显示遭受肾损伤后在二十八(28)日正在恢复的患者和不恢复的患者(即，例如，R28=恢复的患者；和NR28=不恢复的患者)。在十四(14)日采集时间期间，在第1日(D1)、第7日(D7)和第14日(D14)分析样品。见，图1。

数据显示，对于恢复的患者，透明质酸在D1最高并且在D7和D14进行性下降。相反，对于不恢复的患者，透明质酸在相同的时间段范围内稳定增加。显然，数据表明，透明质酸与从肾损伤中恢复相关。

实施例2

人尿样中归一化的绝对透明质酸水平

这个实施例中的数据检验高于肾损伤后D1、D7和D14采集的样品的归一化绝对透明质酸水平之间的差异，其中根据实施例1针对肾损伤后28日(R28)和60日(R60)显示恢复的患者和不恢复性患者(NR28和NR60)取得所述样品。

数据显示，在第1日和第7日之间以及在第1日第14日之间，恢复的患者展示归一化透明质酸的排泄量清晰减少(即，例如，绝对透明质酸排泄量在这个时间段内下降)。然而，在第7日和第14日之间的差异是可忽略，这意指排泄速率未改变。相反，在不恢复的患者中，在第1日和第7日之间以及在第1日第14日之间的差异展示归一化透明质酸的排泄量清晰增加(即，例如，绝对透明质酸排泄量在这个时间段内增加)。另外，排泄速率在第7日和第14日之间不变化。见图2和图3。

实施例3

人尿样中归一化的相对透明质酸水平

这个实施例将根据实施例2的数据再作图以进一步显示恢复患者和不恢复患者之间的差异幅度。具体而言，数据表述为百分比(即，D7÷D1，D14÷D1，D7÷D14，或D14÷D7)。

这份数据显示，在恢复性患者中，相对透明质酸排泄量在第1日和第14日之间进行性下降，其中第14日和第7日之间的相对差异是几乎可忽略的。这与上述数据的解释一致，其中上述数据表明透明质酸在恢复性肾损伤患者中随时间推移下降。相反，这份数据显示，在不恢复性患者中，相对透明质酸排泄量在这段时间自始至终保持升高。这与上述数据的解释一致，其中上述数据表明透明质酸在不恢复性肾损伤患者中随时间推移升高。见，图4和图5。

实施例4

在肾损伤后D14预测长期透析

分析根据实施例2提出的数据并进行再作图以评价真阳性和假阳性之间的关系。具体而言，在其中存在尿HA/肌酸酐持续升高(即，D1和D14量值之间存在差异)的情况下，高度灵敏地预测出患者将在肾损伤后D60依赖长期透析。见，图6。总之，数据表明，肾损伤后D1-D14之间显示持续升高的尿HA的患者将在D60(并且最可能在此后)依赖透析。

实施例V

TGF-β1预测AKI后肾恢复

这项研究从属于包括24位患者的一项较大的多中心随机对照试验，所述试验研究不同肾替代疗法剂量对从AKI幸存的影响。

在AKI发作后第14日，与的确恢复肾功能的那些患者相比，尿TGF-β1在截止第60日未能恢复肾功能的患者中显著更高(p<0.01)。见，图7。

使用在AKI发作后第14日收集并且具有接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)0.81(估计的标准误=0.09)的样品，尿TGF-β1值预测截止第60日肾恢复。另外，如果考虑从第1日至第14日的尿TGF-β1变化，AUC ROC曲线下面积增至0.84(p<0.01)。使用市售ELISA试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)测量TGF-b1。

实施例VI

死亡受体5(DR5)预测AKI后肾恢复

这项研究从属于包括25位患者的一项较大的多中心随机对照试验，所述试验研究不同肾替代疗法剂量对从AKI幸存的影响。

在AKI发作后第14日，与的确恢复肾功能的那些受试者相比，尿DR5在截止第60日未能恢复肾功能的受试者中显著更高。见，表6。

表6.恢复者和未恢复者截止第60日的肾功能的DR5值(A)显示未恢复者和恢复者第1日和第14日的平均DR5值。(B)显示未恢复者和恢复者第1日和第14日的平均DR5对数值。

使用在AKI发作后第14日收集并且具有接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)0.90(p<0.02)的样品，尿DR5值预测截止第60日肾恢复。使用市售检测试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA)测量DR5。这种测定系统基于胞外珠平台，所述平台随炎性细胞因子5-plex、+IL-10、TNF-R₁和TNF-R₂多路复用。

尽管已经对本领域技术人员充分详细地描述和例举本发明，多种替代形式、修改和改进应当显而易见而不脱离本发明的精神和范围。本文中提供的实例是优选实施方案的代表，是示例性的，并且不意在作为本发明范围的限制。本领域技术人员将想到其中修改和其他用途。这些修改包含于本发明的精神范围内并且由权利要求书的范围限定。

对本领域技术人员将显而易见的是，可以对本文公开的发明作出各种替换和修改而不脱离本发明的范围和精神。

本说明书中提到的全部专利及出版物说明本发明所属领域的普通技术人员的水平。将全部全部专利及出版物通过引用方式以相同的程度并入本文，如同专门且个别地指出通过引用的方式并入每份单独的出版物。

本文中示意性描述的本发明可以在本文未具体公开的任意要素或诸要素、限制或诸限制不存在的情况下恰当地实施。因此，例如，在本文中的每种情况下，术语“包含”，“基本上由……组成”和“由……组成”的任一者可以替换为其他两个术语的任一者。已经使用的术语和表述已经作为描述而非限制的术语使用，并且在使用此类术语和表述时，不意图排除所示或所述特征的任何等同物或其部分，但是应当意识到在所要求保护的本发明范围内可能存在各种修改。因而，应当理解尽管本发明已经通过优选的实施方案和任选的特征具体地公开，然而本领域技术数人员可以求助于本文所公开构思的修改和变例，并且将此类修改和变例视为处于如后附权利要求书所定义的本发明范围内。

其他实施方案在以下权利要求的范围内阐述。

Claims (68)

1.用于测量包括尿透明质酸肾生物标记物值、尿转化生长因子β1肾生物标记物值和尿死亡受体5肾生物标记物值和至少一种临床指标值的患者值的试剂在制备以预测显示急性肾损伤的至少一种症状的患者的肾恢复概率的试剂盒中的用途，所述临床指标值选自下组：总SOFA评分、APACHE II评分、年龄和查尔森合并症指数，其中所述测量在从所述患者获得的生物流体样品上进行。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述预测的肾恢复概率在距所述急性肾损伤发作的至少60日内发生。

3.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品在距所述肾损伤发作的至少14日内获得。

4.根据权利要求1所述的用途，其中所述样品在距所述肾损伤发作的1日内获得。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述预测包括所述患者值与阈值相之间的关联。

6.根据权利要求1所述的用途，其中所述阈值包括尿透明质酸阈值。

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述尿透明质酸阈值是大约12μg/mg肌酸酐。

8.根据权利要求6所述的用途，其中所述尿透明质酸阈值包括至少0.70的接受者操作特征曲线下面积值。

9.根据权利要求1所述的用途，其中所述阈值包括透明质酸阈值和至少一种临床指标阈值。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述尿透明质酸阈值和所述至少一种临床指标阈值包括至少0.75的接受者操作特征曲线下面积值。

11.根据权利要求1所述的用途，其中所述阈值包括尿转化生长因子β1阈值。

12.根据权利要求11所述的用途，其中所述尿转化生长因子β1值的所述阈值是大约274pg/mg肌酸酐。

13.根据权利要求11所述的用途，其中所述尿转化生长因子β1阈值包括至少0.70的接受者操作特征曲线下面积(AUC ROC)值。

14.根据权利要求1所述的用途，其中所述阈值包括所述尿转化生长因子β1阈值和至少一种临床指标阈值。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述尿转化生长因子β1阈值和所述至少一种临床指标阈值包括至少0.74的接受者操作特征曲线下面积值。

16.根据权利要求1所述的用途，其中所述阈值包括尿死亡受体5阈值。

17.根据权利要求16所述的用途，其中所述尿死亡受体5阈值是大约2.7ng/mg肌酸酐。

18.根据权利要求16所述的用途，其中所述尿死亡受体5阈值包括至少0.70的接受者操作特征曲线下面积值。

19.根据权利要求1所述的用途，其中所述阈值包括所述尿死亡受体5阈值和临床指标阈值。

20.根据权利要求19所述的用途，其中所述尿死亡受体5阈值和所述至少一种临床指标阈值包括至少0.76的接受者操作特征曲线下面积值。

21.根据权利要求1所述的用途，其中所述至少一种临床指标阈值包括至少0.71的接受者操作特征曲线下面积值。

22.根据权利要求1所述的用途，其中所述患者值包括至少两种临床指标值。

23.根据权利要求1所述的用途，其中所述阈值包括至少两种临床指标阈值，所述临床指标阈值包括至少0.74的接受者操作特征曲线下面积值。

24.根据权利要求22所述的用途，其中所述至少两种临床指标值包括年龄值和查尔森合并症指数值。

25.用于测量包括尿透明质酸肾生物标记物值、尿转化生长因子β1肾生物标记物值和尿死亡受体5肾生物标记物值和至少一种临床指标值的患者值的试剂在制备用于对显示急性肾损伤的至少一种症状的患者进行风险分级的试剂盒中的用途，所述临床指标值选自下组：总SOFA评分、APACHE II评分、年龄和查尔森合并症指数，其中所述测量在从所述患者获得的生物流体样品上进行，所述患者值与生物标记阈值相比较，以确定所述风险分级。

26.根据权利要求25所述的用途，其中所述比较还确定正向肾生物标记值。

27.根据权利要求25所述的用途，其中所述比较还确定负向肾生物标记值。

28.根据权利要求25所述的用途，其中所述样品在距所述急性肾损伤发作的至少14日内获得。

29.根据权利要求25所述的用途，其中所述风险分级包括风险类别。

30.根据权利要求25所述的用途，其中所述风险分级包括损伤类别。

31.根据权利要求25所述的用途，其中所述风险分级包括衰竭类别。

32.根据权利要求25所述的用途，其中所述风险分级包括分配肾恢复可能性。

33.根据权利要求32所述的用途，其中所述的肾恢复可能性包括具有高于大约0.70阈值的接受者操作特征曲线下面积的所述生物标记值。

34.根据权利要求25所述的用途，其中所述风险分级包括分配所述肾不恢复可能性。

35.根据权利要求34所述的用途，其中所述肾不恢复可能性包括具有低于大约0.70的阈值的接受者操作特征曲线下面积的所述生物标记值。

36.根据权利要求25所述的用途，其中所述风险分级包括确定患者临床转归风险。

37.根据权利要求36所述的用途，其中所述临床转归风险包括肾功能改善。

38.根据权利要求36所述的用途，其中所述临床转归风险包括降低的肾功能。

39.根据权利要求38所述的用途，其中所述降低的肾功能包括肾损伤。

40.根据权利要求39所述的用途，其中所述肾损伤是进行性的。

41.根据权利要求36所述的用途，其中所述临床转归风险包括丧失类别。

42.根据权利要求36所述的用途，其中所述临床转归风险包括终末期肾衰竭类别。

43.根据权利要求36所述的用途，其中将所述临床转归风险发生的可能性与患者的接受者操作特征曲线下面积值相关联。

44.根据权利要求43所述的用途，其中所述丧失类别的所述可能性在大约0.5-0.3之间的患者的接受者操作特征曲线下面积值之内增加。

45.根据权利要求43所述的用途，其中所述丧失类别的所述可能性在0.5的患者的接受者操作特征曲线下面积值以上减少。

46.根据权利要求43所述的用途，其中所述终末期肾衰竭类别的所述可能性在0.3的患者的接受者操作特征曲线下面积值以下增加。

47.根据权利要求43所述的用途，其中所述终末期肾衰竭类别的所述可能性在大约0.3的患者的接受者操作特征曲线下面积值以上减少。

48.根据权利要求25所述的用途，其中所述风险分级包括确定肾功能未来降低的受试者风险。

49.根据权利要求48所述的用途，其中所述受试者未来肾功能降低的风险在患者的接受者操作特征曲线下面积值0.5以下增加。

50.根据权利要求48所述的用途，其中所述受试者未来肾功能降低的风险在患者的接受者操作特征曲线下面积值0.5以上减少。

51.根据权利要求48所述的用途，其中所述未来肾功能降低的可能在体液样品从受试者获得的时间的180日内发生。

52.根据权利要求48所述的用途，其中所述未来肾功能降低的可能在选自18个月、120日、90日、60日、45日、30日、21日、14日、7日、5日、96小时、72小时、48小时、36小时、24小时、12小时和更短的时间段内发生。

53.根据权利要求48所述的用途，其中所述肾功能降低在所述体液样品从所述受试者获得的时间0小时处发生，从而提供当前状况的诊断。

54.用于测量受试者中至少一种先前存在的肾病风险因子和至少一种临床指标的试剂在制备用于选择受试者进行风险分级的试剂盒中的用途，其中所述先前存在的肾病风险因子包括选自下组的肾生物标记物：尿透明质酸、尿转化生长因子1β和尿死亡受体5，所述至少一种临床指标选自下组：年龄、SOFA评分、查尔森合并症指数和APACHE II评分。

55.根据权利要求54所述的用途，其中所述风险分级包括风险类别。

56.根据权利要求54所述的用途，其中所述风险分级包括损伤类别。

57.根据权利要求54所述的用途，其中所述风险分级包括衰竭类别。

58.根据权利要求54所述的用途，其中所述风险分级包括丧失类别。

59.根据权利要求54所述的用途，其中所述风险分级包括终末期肾病类别。

60.根据权利要求55所述的用途，其中所述风险类别包括大约0.6-0.7之间的患者的接受者操作特征曲线下面积值。

61.根据权利要求56所述的用途，其中所述损伤类别包括大约0.5-0.6之间的患者的接受者操作特征曲线下面积值。

62.根据权利要求57所述的用途，其中所述衰竭类别包括大约0.4-0.5之间的患者的接受者操作特征曲线下面积值。

63.根据权利要求59所述的用途，其中所述丧失类别包括大约0.3-0.4之间的患者的接受者操作特征曲线下面积值。

64.根据权利要求59所述的用途，其中所述终末期肾病类别包括低于0.3的患者的接受者操作特征曲线下面积值。

65.根据权利要求54所述的用途，其中所述肾病选自肾前性疾病、内在性肾病和肾后性急性肾衰竭疾病。

66.根据权利要求54所述的用途，其中所述受试者进一步包含至少一种医学状况，所述医学状况选自正在接受或已经接受过大血管手术、冠状动脉搭桥或其他心脏手术；受试者患有先前存在的充血性心力衰竭、先兆子痫、子痫、糖尿病、高血压、冠状动脉病、蛋白尿、肾功能不全、低于正常范围的肾小球滤过、肝硬化、高于正常范围的血清肌酸酐和败血症。

67.根据权利要求54所述的用途，其中所述受试者进一步包含暴露于至少一种化合物，所述化合物选自非甾体抗炎药、环孢菌素、他克莫司、氨基糖苷类、膦甲酸、乙二醇、血红蛋白、肌红蛋白、异环磷酰胺、重金属、甲氨蝶呤、不透射线性造影剂或链佐星。

68.根据权利要求54所述的用途，其中基于对选自肾功能、肾功能降低和急性肾衰竭的损伤的现有诊断，进一步选择所述受试者用于风险分级。