CN102369295A

CN102369295A - 用于进行样品和探针单独变性的杂交的组合物和方法

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Publication number: CN102369295A
Application number: CN2010800095393A
Authority: CN
Inventors: S·H·马希森
Original assignee: Dako Denmark ApS
Current assignee: Denmark Dako Co ltd; Agilent Technologies Inc
Priority date: 2009-02-26
Filing date: 2010-02-26
Publication date: 2012-03-07
Anticipated expiration: 2030-02-26
Also published as: EP2401395A1; US20190249235A1; US9309562B2; US9303287B2; CN107574230A; US9388456B2; CN102369295B; EP2401396A1; US10202638B2; US20110318745A1; JP6091753B2; US20220154263A1; EP2401399A1; CA2753271C; EP3243909B1; US20110311974A1; US20160304945A1; WO2010097656A1; EP2401399B1; EP2401396B1

Abstract

本发明提供用于在杂交应用中单独变性探针和靶标的方法和组合物。本发明可以例如在杂交应用中不使用甲酰胺或减少对甲酰胺的依赖性。用于本发明的组合物包括含水组合物，该含水组合物含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂。

Description

用于进行样品和探针单独变性的杂交的组合物和方法

技术领域

本发明涉及用于杂交应用的组合物和方法，其涉及靶标和探针的单独变性。在一个实施方案中，本发明可以用于DNA和RNA的体内、体外和原位的分子检测。特别是，本发明可以在细胞学、组织学和分子生物学领域中用于DNA和RNA分子检测。在其它实施方案中，本发明可以用于原位杂交(ISH)应用。

背景技术

双链核酸分子(即DNA(脱氧核糖核酸)、DNA/RNA(核糖核酸)和RNA/RNA)以双螺旋构型结合。该双螺旋结构由碱基以特定方式(A+T/U或G+C)配对时的相对链上碱基是的氢键结合和堆叠碱基是的疏水键合稳定化。互补碱基配对(杂交)是涉及核酸的所有处理的核心。

在杂交的基础实例中，核酸探针或引物经设计与靶标核酸例如样品中的DNA或RNA结合或“杂交”。一种类型的杂交应用，原位杂交(ISH)，包括与标本中的靶标杂交，其中该标本可以在体内、原位或体外，例如固定或粘附到载玻片上。可以标记探针以使得可能使用荧光或明视野显微镜/扫描仪识别探针-靶杂合体。

核酸杂交测定的效率和准确度主要取决于以下3个因素中的至少一个：a)变性条件，b)复性条件，和c)杂交后的洗涤条件。

为了使探针或引物与样品中的靶标核酸结合，必须分离核酸的互补链。该链分离步骤称为“变性”，通常需要积极条件以破坏双螺旋中的氢键和疏水键。探针和靶标分子可以单独地变性或一起变形(共变性)。已有人提出，单独变性可更好地保持形态学，而共变性可减少实际操作步骤的数目。出于这些理由，单独变性步骤最常用在分子细胞遗传学应用中，且共变性最常用在分析组织切片时。

传统的杂交实验，例如ISH测定，使用含甲酰胺的溶液以使双链核酸变性。甲酰胺通过置换松散而均匀结合的水合分子并通过造成Watson-Crick结合位点的“甲酰胺化”来破坏碱基配对。因此，甲酰胺对双链核酸和类似物具有去稳定效应。

一旦核酸的互补链已分离，“复性”或“重新退火”步骤就允许引物或探针与样品中的靶标核酸结合。该步骤有时也称为“杂交”步骤。虽然甲酰胺促进双链核酸和类似物的变性，但与不含甲酰胺的含水变性溶液相比，甲酰胺还会显著延长复性时间。事实上，重新退火步骤在传统的杂交应用中是最耗时间的。传统杂交时间的实例见图1和图2。

另外，甲酰胺在长时间处理中具有缺点。甲酰胺是有毒有害物质，其使用和废料都受到严格的法规管制。此外，使用高浓度甲酰胺会导致细胞结构、核结构和/或染色体结构的形态学上的破坏，在检测期间产生高背景信号。

因此，存在克服现有技术杂交应用相关缺点的需要。针对该需要，本发明提供相比现有技术杂交应用的若干潜在优势。

发明内容

本发明的一个目的是提供方法和组合物，其得出相比现有技术杂交应用具有至少一个下述优势的杂交应用：更低的背景、更均匀的背景、样品形态学的保持、更容易的自动化、更快的过程和更安全(较低毒性)的试剂。本发明实现这些目的的一种方式是提供用于探针和靶标的单独变性的方法和组合物。

本发明的组合物和方法适用于任何杂交技术。本发明的组合物和方法还适用于使用碱基配对进行杂交或结合的任何分子系统，例如DNA、RNA、PNA、LNA和其合成或天然类似物。

本发明的核酸杂交方法和组合物可以用于基因组DNA、染色体、染色体片段、基因和染色体畸变的体内、体外或原位分析，例如与正常条件或疾病相关的易位、缺失、扩增、插入、突变或倒位。此外，该方法和组合物有助于检测感染原以及RNA的表达水平变化，例如，mRNA及其互补DNA(cDNA)。

其它用途包括对下述进行的体内、体外或原位分析：信使RNA(mRNA)、病毒RNA、病毒DNA、小干扰RNA(siRNA)、小核RNA(snRNA)、非编码RNA(ncRNA，例如tRNA和rRNA)、转运信使RNA(tmRNA)、微小RNA(miRNA)、PIWI相互作用RNA(piRNA)、长链非编码RNA、小核RNA(snoRNA)、反义RNA、双链RNA(dsRNA)，甲基化和其它碱基修饰、单核苷酸多态性(SNPs)、拷贝数变异(CNVs)，和单独或与未标记核酸组合的用例如放射性同位素、荧光分子、生物素、地高辛(DIG)或抗原标记的核酸。

本发明的核酸杂交方法和组合物可用于核酸的体内、体外或原位分析，使用例如RNA印迹(northern blot)、DNA印迹(Southern blot)、流式细胞术、放射自显影、荧光显微镜术、化学发光、免疫组织化学、虚拟核型(virtual karyotype)、基因测定、DNA微阵列(例如阵列比较基因组杂交(阵列CGH))、基因表达谱、基因ID、叠瓦阵列(Tiling array)、凝胶电泳、毛细管电泳和原位杂交例如FISH、SISH、CISH的技术。本发明的方法和组合物可用于体外和体内样品例如骨髓涂片、血涂片、石蜡包埋的组织制备物、酶解的组织样品、骨髓、羊水细胞、细胞离心(cytospin)制备物、印迹(imprint)等。

在一个实施方案中，本发明提供方法和组合物，其用于对分子和靶标使用单独变性步骤，将至少一种分子(例如，探针)与靶标(例如，生物样品)杂交。在其它实施方案中，本发明可以不使用甲酰胺，或减少在这种变性步骤中对甲酰胺的依赖性，例如将传统变性缓冲液中70％的甲酰胺降低到本发明的组合物和方法中的50％、25％、15％、10％、5％、2％、1％或0％v/v的甲酰胺，。因此，在某些方面，本发明克服了与传统杂交测定相关的若干缺点，包括与在这种传统杂交测定中使用甲酰胺相关的主要毒性问题和耗时的复性步骤。

本发明的一方面提供用于在杂交应用中单独变性探针和靶标的组合物或溶液。用于变性靶标的组合物可以包括与用于变性探针的组合物相同的成分，或两种组合物可以包括不同成分。本发明中使用的组合物可以包括含水组合物，其含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂。足以变性双链核苷酸序列的有效量是允许杂交的量。例如，用于测定极性非质子溶剂的量是否对杂交有效的一种方式是，确定极性非质子溶剂当用在本文所述的杂交方法和组合物中例如实施例1中时是否产生可检测信号和/或扩增的核酸产物。

极性非质子溶剂有效量的非限制性实例包括例如约1％至约95％(v/v)。在某些实施方案中，极性非质子溶剂的浓度为5％至60％(v/v)。在其它实施方案中，极性非质子溶剂的浓度为10％至60％(v/v)。在再一些实施方案中，极性非质子溶剂的浓度为30％至50％(v/v)。1％至5％、5％至10％、10％、10％至20％、20％至30％、30％至40％、40％至50％、或50％至60％、或60％至70％(v/v)的浓度也是合适的。在某些实施方案中，极性非质子溶剂的浓度可以是0.1％、0.25％、0.5％、1％、2％、3％、4％或5％(v/v)。在其它实施方案中，极性非质子溶剂的浓度可以是7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、10％、10.5％、11％、11.5％、12％、12.5％、13％、13.5％、14％、14.5％、15％、15.5％、16％、16.5％、17％、17.5％、18％、18.5％、19％、19.5％或20％(v/v)。

依据本发明的另一方面，含水组合物包括具有降低的毒性的极性非质子溶剂。例如，在杂交应用中使用的比传统溶液毒性低的组合物可以包括一种组合物，前提条件是该组合物不含甲酰胺，或前提条件是该组合物含有少于25％、或少于10％、或少于5％、或少于2％、或少于1％、或少于0.5％、或少于0.1％、或少于0.05％、或少于0.01％的甲酰胺。毒性较低的组合物在一个实施方案中还可以包括一种组合物，前提条件是该组合物不含二甲亚砜(DMSO)，或前提条件是该组合物含有少于25％、10％、5％、2％、或少于1％、或少于0.5％、或少于0.1％、或少于0.05％、或少于0.01％的DMSO。

在本发明的一方面，可根据极性非质子溶剂的Hansen溶度参数，来选择用于本发明的合适极性非质子溶剂。例如，合适的极性非质子溶剂可具有的分散溶度参数介于17.7-22.0MPa^1/2之间，极性溶度参数介于13-23MPa^1/2之间，氢键溶度参数介于3-13MPa^1/2之间。

依据本发明的一方面，用于本发明的合适极性非质子溶剂是环状化合物。环状化合物具有环状基本结构。实例包括本文所公开的环状化合物。在其它实施方案中，所述极性非质子溶剂可选自下式1-4：

式1 式2 式3 式4

其中X为O，R1为烷二基。

依据本发明的另一方面，用于本发明的合适极性非质子溶剂可选自下式5：

式5

其中X是任选的，如果存在则选自O或S；

其中Z是任选的，如果存在则选自O或S；

其中A和B独立地为O或N或S或烷二基的部分或伯胺；

其中R为烷二基；和

其中Y为O或S或C。

式5的合适极性非质子溶剂的实例在下式6-9中提供：

式6 式7 式8 式9

其中：其中：其中：其中：

X不存在； Z和X为O； X不存在； X不存在；

A、B和Z为O； A和B为烷二基的 A为烷二基的部 A为烷二基的部

Y为C；和部分；分；分；

R为乙-1，2二基； Y为S；和 Y为C； Y为C；

R为丁-1，4二基； B和Z为O；和 B为甲胺；

R为丙-1，3二基； Z为O；和

R为丙-1，3二基。

依据本发明的又一实施方案，所述极性非质子溶剂具有内酯、砜、腈、亚硫酸或碳酸官能团。这类化合物的特征是具有相当高的介电常数、高偶极距和水溶性。

依据本发明的另一方面，具有内酯官能团的极性非质子溶剂是γ-丁内酯(GBL)，具有砜官能团的极性非质子溶剂是环丁砜(SL)，具有腈官能团的极性非质子溶剂是乙腈(AN)，具有亚硫酸官能团的极性非质子溶剂是亚硫酸乙二醇酯(GS)，具有碳酸官能团的极性非质子溶剂是碳酸亚乙酯(EC)、碳酸异丙二醇酯(PC)或硫代碳酸亚乙酯(ETC)。在本发明的又一方面，本发明的组合物和方法包括极性非质子溶剂，前提条件是该极性非质子溶剂不是乙腈(AN)或环丁砜(SL)。

依据又一方面，本发明公开了一种杂交核酸序列的方法，包括：

-混合第一核酸序列与第一含水组合物，该第一含水组合物含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂；

-混合第二核酸序列与第二含水组合物，该第二含水组合物含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种变性剂；和

-混合该第一和第二核酸序列，其时间至少足以使第一和第二核酸序列杂交。

-混合第一核酸序列与第一含水组合物，该第一含水组合物含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂；和

-将含有第二核酸序列和足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种变性剂的第二含水组合物用于所述第一核酸序列，其时间至少足以使第一和第二核酸序列杂交。

在一个实施方案中，第二含水组合物中的变性剂是极性非质子溶剂。在一个实施方案中，第一和第二含水组合物具有相同成分。在另一实施方案中，第一和第二含水组合物具有不同成分。

在一个实施方案中，第一核酸序列是生物样品。在另一实施方案中，该生物样品是细胞学或组织学样品。

在一个实施方案中，第一核酸序列是单链序列且第二核酸序列是双链序列。在另一实施方案中，第一核酸序列是双链序列且第二核酸序列是单链序列。在又一实施方案中，第一和第二核酸序列两者都是双链的。在又一实施方案中，第一和第二核酸序列两者都是单链的。

在一个实施方案中，提供足够量的时间以变性第一核酸序列。在一个实施方案中，提供足够量的能量以变性第一核酸序列。在另一实施方案中，提供足够量的时间以变性第二核酸序列。在另一实施方案中，提供足够量的能量以变性第二核酸序列。在另一实施方案中，提供足够量的时间以使第一和第二核酸杂交。在另一实施方案中，提供足够量的能量以使第一和第二核酸杂交。

依据本发明的又一方面，通过加热含水组合物和核酸序列来提供能量。因此，本发明的方法可以包括加热和冷却含水组合物和核酸序列的步骤。

本发明的又一方面包括一种方法，其中提供足够量的能量的步骤涉及通过使用微波、热浴、加热板、加热线、珀耳帖元件、感应加热或加热灯来进行加热步骤。

依据又一方面，本发明涉及含有1至95％(v/v)之间的至少一种极性非质子溶剂的组合物在杂交应用中单独变性靶标和样品的用途。

依据又一方面，本发明涉及一种试剂盒，其包括用于杂交测定的本发明的组合物，其中探针和靶标单独地变性。

附图说明

图1描绘了用第一标记的FISH探针与甲醛固定的石蜡包埋的组织切片(组织学标本)共变性进行的单基因座检测的典型时间进程。条带代表用传统杂交溶液进行的杂交测定。左边的第一条带代表脱蜡步骤；第二条带代表加热-预处理步骤；第三条带代表消化步骤；第四条带代表变性和杂交步骤；第五条带代表严格性洗涤步骤；和第六条带代表封固步骤。

图2描绘了用第一标记的FISH探针与细胞学标本共变性进行的单基因座检测的典型时间进程。条带代表用传统杂交溶液进行的杂交。左边的第一条带代表固定步骤；第二条带代表变性和杂交步骤；第三条带代表严格性洗涤步骤；和第四条带代表封固步骤。

具体实施方式

A.定义

在本发明范围内，下列术语可理解如下：

“生物样品”可理解为一种或多种细胞或细胞碎片的任何体内、体外或原位样品。它可以是例如单细胞生物或多细胞生物、组织切片、细胞学样品、染色体铺片、纯化的核酸序列、通过例如基于生物的系统或通过化学合成而制备的人工制备核酸序列、微阵列或其它形式的核酸芯片。在一个实施方案中，样品是哺乳动物样品，例如人、小鼠、猫、大鼠或犬的样品。

“核酸”、“核酸链”和“核酸序列”是指利用碱基配对而结合或杂交的任何核酸，包括具有由天然存在核苷酸和/或包含非标准核碱基(nucleobase)的核酸类似物而形成的主链和/或非标准主链(例如肽核酸(PNA)或锁核酸(LNA))或核酸的任何衍生形式的寡聚物或聚合物。

本文所用的术语“肽核酸”或“PNA”是指具有携带悬垂核碱基(天然的和经修饰的)的聚酰胺主链的合成聚合物，包括但不限于例如在以下文献中涉及或声称是肽核酸的任何寡聚物或聚合物区段：美国专利号5,539,082、5,527,675、5,623,049、5,714,331、5,718,262、5,736,336、5,773,571、5,766,855、5,786,461、5,837,459、5,891,625、5,972,610、5,986,053、6,107,470、6,201,103、6,228,982和6,357,163、WO96/04000，所有文献或其中所引用的任何参考文献都通过引用结合到本文中。PNA上的悬垂核碱基例如嘌呤碱基或嘧啶碱基，可通过接头与主链连接，所述接头例如在PCT/US02/30573或其中所引用的任何参考文献中提及的接头之一。在一个实施方案中，PNA具有N-(2-氨基乙基)-甘氨酸)主链。可按照PCT/US02/30573或其中所引用的任何参考文献所述，来合成(并任选标记)PNA。PNA与DNA和RNA杂交紧密，并具有高度序列特异性，因为PNA主链不带电荷。因此，短PNA探针可表现出与较长DNA或RNA探针相当的特异性。PNA探针在与互补DNA或RNA结合中也可表现出更高特异性。

本文所用的术语“锁核酸”或“LNA”是指包含至少一个或多个LNA亚基的寡聚物或聚合物。本文所用的术语“LNA亚基”是指含有连接核糖的2′-氧与4′-碳的亚甲基桥的核糖核苷酸。通常可参见Kurreck，Eur.J.Biochem.，270：1628-44(2003)。

核酸和核酸类似物的实例也包括核苷酸单体聚合物，所述单体包括双链和单链脱氧核糖核苷酸(DNA)、核糖核苷酸(RNA)、其α-异头物形式、其合成和天然类似物等。核酸链可完全由脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)、其合成或天然类似物、或其混合物组成。DNA、RNA或本文所定义的其它核酸都可用于本发明的方法和组合物。

“极性非质子溶剂”是指有机溶剂，其偶极距为约2德拜单位或更高，在或邻近环境温度即约20℃时水溶性为至少约5％(体积)，并且在大约中性pH(即5-9的范围，或在6-8的范围)不经历明显的氢交换。极性非质子溶剂包括以下所讨论的按照Hansen溶度参数定义的那些。

“烷二基”是指通过从母体烷、烯或炔的两个不同碳原子中的各自除去一个氢原子而得到的、具有两个一价基团中心的饱和或不饱和、支链、直链或环状烃基。

“含水溶液”可理解为含有水、甚至少量水的溶液。例如，含1％水的溶液就可理解为含水溶液。

“杂交应用”、“杂交测定”、“杂交实验”、“杂交过程”、“杂交技术”、“杂交方法”等可理解为是指涉及核酸杂交的任何过程。除非另有说明，术语“杂交”和“杂交步骤”可理解为是指杂交过程的重新退火步骤以及变性步骤(如果存在)。

“杂交组合物”是指用于进行杂交过程(例如使探针与核酸序列结合)的本发明含水溶液。杂交组合物可包含例如至少一种极性非质子溶剂、至少一种核酸序列和杂交溶液。杂交组合物不包含酶或其它成分，例如用于扩增生物样品中的核酸的三磷酸脱氧核苷(dNTP)。

“杂交溶液”是指用于本发明杂交组合物的含水溶液。杂交溶液的详细讨论如下，并且可包含例如缓冲剂、促进剂、螯合剂、盐、去垢剂和封闭剂。

“Hansen溶度参数”和“HSP”是指以下内聚能(溶解度)参数：(1)分散溶度参数(δ_D，“D参数”)，其度量得自原子力的非极性相互作用；(2)极性溶度参数(δ_P，“P参数”)，其度量永久偶极-永久偶极之间的相互作用；和(3)氢键溶度参数(δ_H，“H参数”)，其度量电子交换。Hansen溶度参数进一步定义如下。

“重复序列”可理解为是指快速重新退火(大约25％)和/或中速重新退火(大约30％)的哺乳动物基因组组分。快速重新退火组分含有小的(长度为几个核苷酸)高度重复序列，通常以串联形式存在(例如卫星DNA)，而中速重新退火组分含有散在分布的重复DNA。散在分布的重复序列可分为SINE(短散在分布的重复序列)或LINE(长散在分布的重复序列)，这两者都属于灵长类的反转录转座子。SINE和LINE包括但不限于Alu重复序列、Kpn重复序列、二核苷酸重复序列、三核苷酸重复序列、四核苷酸重复序列、五核苷酸重复序列和六核苷酸重复序列。Alu重复序列构成大部分人类SINE，其特征是大约280-300bp的共有序列，由两个类似序列排列成头尾相连的二聚体而组成。除了SINE和LINE之外，重复序列也存在于染色体末端的染色体端粒和染色体着丝粒，其含有仅存在于染色体中心区的独特重复序列。然而，不同于随机分散在整个基因组、端粒和着丝粒中的SINE和LINE，重复序列位于染色体的某区域内。

对于甲酰胺的毒性标识，“无毒”和“降低的毒性”是按照“1999年5月31日欧洲议会和委员会的各成员国涉及危险制剂的分类、包装和标识的法律、法规和管理规定的指令1999/45/EC”(ecb.jrc.it/legislation/1999L0045EC.pdf)(“指令(Directive)”)来定义的。按照该指令，用以下分类级别来定义毒性：T+“剧毒”；T“有毒”；C“腐蚀”；Xn“有害”；Xi“刺激”。风险术语(“R术语”)描述了所分类毒性的风险。甲酰胺被列为T(有毒)和R61(对未出生胎儿可导致伤害)。下列所有化学品的毒性均低于甲酰胺：乙腈(Xn、R11、R20、R21、R22、R36)；环丁砜(Xn、R22)；γ-丁内酯(Xn、R22、R32)；和碳酸亚乙酯(Xi、R36、R37、R38)。在本申请的提交时，三硫代碳酸亚乙酯和亚硫酸乙二醇酯尚未被标记。

本文所用的“变性”是指通过应用一种或多种化合物例如强酸或强碱、浓无机盐、有机溶剂，和/或通过外部应力例如热量，使核酸或蛋白质降低或丧失其三级结构和/或二级结构的过程。这意味着，当变性涉及核酸时，以及当所述核酸为双链时，链可以部分或完全分离。这还意味着，双链核酸的结合相互作用由变性充分弱化，从而与没有变性的情况相比，可以更加有效地发生与例如替代的互补链进行的杂交。

“变性剂”是指与水相比能够降低核酸的互补链的相互结合亲和力的任何物质。典型变性剂的非限制性实例包括有机溶剂，例如甲酰胺、尿素、DMSO和四烷基铵卤化物或其组合。变性条件依赖于序列且在不同的环境参数下不同。解链温度(T_m)可用于调节变性条件以减少存在变性剂时的互补碱基配对。T_m是这样的温度(在定义的离子强度和pH下)，在该温度下50％的靶标序列与完全匹配的探针杂交。对于DNA-DNA杂合体，T_m可以由下述公式近似：

T_m＝81.5℃。+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是鸟嘌呤和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比；％form是甲酰胺在杂交溶液中的百分比；L是杂合体的碱基对长度。T_m对于每1％的错配减少约1℃。

本文所用的“单独变性”是指在没有探针时使靶标核酸变性和/或在没有靶标核酸时使探针变性的杂交方法。例如，在第一溶液中使靶标变性，在第二溶液中使探针变性，然后变性的探针可以和变性的靶标混合，其时间足以使靶标和探针杂交。在另一个实例中，在第一溶液中使靶标变性，然后将其与探针混合，其时间足以使靶标和探针杂交。在又一个实例中，可以在第一溶液中使探针变性，然后将其与靶标混合，其时间足以使靶标和探针杂交。

B.溶剂选择

可根据极性非质子溶剂的Hansen溶度参数，选择用于本发明的合适的极性非质子溶剂。实验测定和/或计算溶剂HSP的方法是本领域已知的，已经报道了超过1200种化学品的HSP。

例如，可根据折射率，以合理的准确度计算D参数，或可在建立了临界温度和摩尔体积之后，通过与类似大小、形状和组成的已知溶液进行比较，从图表中得到D参数。可从已知偶极距估计P参数(参见例如McClellan A.L.，Tables of Experimental Dipole Moments(W.H.Freeman1963))，使用公式1：

公式1：δ_P＝37.4(偶极距)/V^1/2

其中V是摩尔体积。对于计算H参数，没有公式。相反，通常根据基团贡献来确定H参数。

HSP表征可方便地用球形示意图来直观表示，实验所测合适参考溶剂的HSP在球心。球的半径(R)表示仍然能允许“良”相互作用发生的参考溶剂HSP的最大可容许变异。良溶剂在球内，而不良溶剂在外。用公式2可测定基于它们相应HSP值的两种溶剂是的距离R_a：

公式2：(R_a)²＝4(δ_D1-δ_D2)²+(δ_P1-δ_P2)²(δ_H1-δ_H2)²

其中下标1表示参考样品，下标2表示试验化学品，所有值的单位都是MPa^1/2。良溶度需要R_a小于溶度球的实验所测半径R_o。两种溶剂是相对能量差，即RED数，可通过获取R_a与R_o之比而求得，如公式3中所示。

公式3：RED＝R_a/R_o

RED数小于1.0，表示高亲和性；RED数等于或接近1.0，表示边界条件；RED数逐渐升高，表示亲和性逐渐降低。

在某些实施方案中，本发明极性非质子溶剂的D参数介于17.7-22.0MPa^1/2之间。这种相对高的D参数通常与具有环状结构和/或具有硫或卤素结构的溶剂有关。线状化合物可能不属于用于本发明的最合适溶剂，但如果它们的P和H参数在下述范围内，也可以考虑。因为在公式2中D参数乘以4，所以限制是一半R_o。另外，应当注意，在21上下或更高的D值通常代表固体。

在某些实施方案中，本发明极性非质子溶剂的P参数介于13-23MPa^1/2之间。这种特别高的P参数通常与具有高偶极距并可能也具有相对低分子体积的溶剂有关。例如，对于接近60cc/mole的V，偶极距应介于4.5-3.1之间。对于接近90cc/mole的V，偶极距应介于5.6-3.9之间。

在某些实施方案中，本发明极性非质子溶剂的H参数介于3-13MPa^1/2之间。通常，具有醇基的极性非质子溶剂不用于本发明的组合物和方法，因为这类溶剂的H参数太高。

极性非质子溶剂的摩尔体积也可能有关，因为它进入到三个Hansen溶度参数的评价中。随着摩尔体积变小，液体倾向于快速蒸发。随着摩尔体积变大，液体倾向于进入上述D和P参数范围的固体区。因此，本发明的极性非质子溶剂相当接近HSP空间的液体/固体分界线。

在某些实施方案中，本发明的极性非质子溶剂具有内酯、砜、腈、亚硫酸和/或碳酸官能团。这类化合物的特征是具有相当高的介电常数、高偶极距和水溶性。具有内酯官能团的示例性极性非质子溶剂是γ-丁内酯(GBL)，具有砜官能团的示例性极性非质子溶剂是环丁砜(SL；四氢噻吩-二氧化物)，具有腈官能团的示例性极性非质子溶剂是乙腈(AN)，具有亚硫酸官能团的示例性极性非质子溶剂是亚硫酸乙二醇酯(GS)，而具有碳酸官能团的示例性极性非质子溶剂是碳酸亚乙酯(EC)、碳酸异丙二醇酯(PC)或三硫代碳酸亚乙酯(ETC)。这些示例性溶剂的结构提供如下，它们的Hansen溶度参数、RED数和摩尔体积见表1。

表1

n/a＝不适用。

可用于本发明的其它合适极性非质子溶剂是环状化合物，例如ε-己内酯。另外，取代的吡咯烷酮(pyrolidinone)和氮在5-元或6-元环内的相关结构，以及具有两个腈基、或一个溴和一个腈基的环状结构，也可适用于本发明。例如，N-甲基吡咯烷酮(下文示出)可以是可用于本发明的方法和组合物的合适极性非质子溶剂。

其它合适的极性非质子溶剂可含有环尿烷基(NHCOO-)。然而，并非所有这种化合物都是合适的。本领域技术人员可按本文所述筛选可用于本发明组合物和方法的化合物。适用于本发明的示例性化学品见下表2和表3。

表2

表2根据它们的Hansen溶度参数，给出用于本发明组合物和方法的潜在化学品的示例性列表。其它化合物当然也满足这些要求，例如表3给出的那些化学品。

表3

表2和表3中列出的部分化学品已用在现有技术的杂交和/或PCR应用中(例如，二甲亚砜(DMSO)已用在杂交和PCR应用中；环丁砜(SL)、乙腈(AN)、2-吡咯烷酮、ε-已内酰胺和乙二醇已用在PCR应用中)。因此，在某些实施方案中，极性非质子溶剂不是DMSO、环丁砜、乙腈、2-吡咯烷酮、ε-已内酰胺或乙二醇。然而，大部分极性非质子溶剂尚未用在现有技术杂交应用中。此外，即便用到了这种化合物，现有技术也未能认识到其可以在这种杂交应用中有利地用于单独地变性探针和靶标，如本申请公开。

另外，并非表2和表3中列出的所有化学品都合适用于本发明的组合物和方法。例如，虽然由于其Hansen溶度参数(HSPs)落在上述范围内而在表2中列出了DMSO，但DMSO并不能用于在本发明的组合物和方法中允许探针和靶标的单独变性。然而，本领域技术人员能够使用本文提供的指导筛选合适的化合物，包括测试实施例之一所提供的化合物。例如，在某些实施方案中，合适的极性非质子溶剂所具有的HSP应在上述范围之内，其结构示于上式1-9。

C.组合物、缓冲剂和溶液

(1)变性溶液

在杂交应用中单独地变性或共变性探针和靶标的传统组合物在本领域是已知的。这种组合物可以包括例如缓冲剂、促进剂、螯合剂、盐、去垢剂和封闭剂。

例如，缓冲剂可以包括SSC、HEPES、SSPE、PIPES、TMAC、TRIS、SET、柠檬酸、磷酸盐缓冲液，例如磷酸钾或焦磷酸钠等。缓冲剂的浓度可以是从0.01x到50x，例如0.01x、0.1x、0.5x、1x、2x、5x、10x、15x、20x、25x、30x、35x、40x、45x或50x。通常，缓冲剂的浓度是从0.1x到10x。

促进剂可以包括聚合物(例如FICOLL)、PVP、肝素、硫酸葡聚糖、蛋白质(例如BSA)、二醇(例如乙二醇、甘油、1，3丙二醇、丙二醇或二甘醇)、其组合(例如Dernhardt氏溶液和BLOTTO)、以及有机溶剂(例如甲酰胺、二甲基甲酰胺、DMSO等)。促进剂存在的浓度可以是1％至80％或0.1x至10x，例如0.1％(或0.1x)、0.2％(或0.2x)、0.5％(或0.5x)、1％(或1x)、2％(或2x)、5％(或5x)、10％(或10x)、15％(或15x)、20％(或20x)、25％(或25x)、30％(或30x)、40％(或40x)、50％(或50x)、60％(或60x)、70％(或70x)或80％(或80x)。通常，甲酰胺浓度可以是从25％至75％，例如25％、30％、40％、50％、60％、70％或75％，而DMSO、硫酸葡聚糖和二醇存在的浓度可以从5％至10％，例如5％、6％、7％、8％、9％或10％。

螯合剂可以包括EDTA、EGTA等。螯合剂存在的浓度可以从0.1mM至10mM、例如0.1mM、0.2mM、0.5mM、1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、或10mM。通常，螯合剂的浓度可以是0.5mM至5mM，例如0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM或5mM。

盐可以包括氯化钠、磷酸钠、磷酸镁等。该盐存在的浓度可以是从1mM至750mM，例如1mM、5mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM或750mM。通常，该盐的浓度可以是10mM至500mM、例如10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、100mM、200mM、300mM、400mM、或500mM。

去垢剂可以包括吐温、SDS、Triton、CHAPS、去氧胆酸等。该去垢剂存在的浓度可以是从0.001％至10％，例如0.001、0.01、0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％。通常，该去垢剂的浓度可以是0.01％至1％、例如0.01％、0.02％、0.03％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％。

核酸封闭剂可以包括例如酵母tRNA、均聚DNA、变性鲑鱼精子DNA、鲱鱼精子DNA、人类总DNA、COT1DNA等。封闭核酸存在的浓度可以是0.05mg/mL至100mg/mL。然而，本发明的组合物和方法令人惊奇地表现出明显降低的背景水平而不需要封闭剂。

在文献中，用于杂交应用的传统变性缓冲液有很大差异。例如，传统溶液可以包含5x或6xSSC、0.01M EDTA、5xDemhardt氏溶液、0.5％SDS和100mg/mL剪切的变性鲑鱼精子DNA。另一种传统溶液可包含50mM HEPES、0.5M NaCl和0.2mM EDTA。用于生物标本RNA检测的FISH的典型溶液可包括例如2x SSC、10％硫酸葡聚糖、2mM氧钒基-核糖核苷复合物、50％甲酰胺、0.02％无RNA酶的BSA和1mg/mL大肠杆菌tRNA。用于生物标本DNA检测的FISH的典型溶液可包括例如2x SSC、10％硫酸葡聚糖、50％甲酰胺和例如0.3mg/mL鲑鱼精子DNA或0.1mg/mL COT1DNA。其它典型溶液可包含40％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、30mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、Alu-PNA(封闭PNA)或COT-1DNA，和在某些情况下0.1μg/μL人类总DNA(THD)。其它变性缓冲液在题为“杂交条件”的部分在下文中讨论。

本发明的组合物可以包括与至少一种极性非质子溶剂组合的任何上述传统组分。传统组分的浓度可以是与传统变性溶液中所用的相同浓度，或者可以是更高或更低浓度，或者可完全省略不用。

例如，如果本发明的组合物包括盐，例如NaCl和/或磷酸盐缓冲液时，盐浓度可以是0-1200mM NaCl和/或0-200mM磷酸盐缓冲液。在某些实施方案中，盐浓度可以是例如0mM、15mM、30mM、45mM、60mM、75mM、90mM、105mM、120mM、135mM、150mM、165mM、180mM、195mM、210mM、225mM、240mM、255mM、270mM、285mM或300mMNaCl和5mM磷酸盐缓冲液，或600mM NaCl和10mM磷酸盐缓冲液。在其它实施方案中，盐浓度可以是例如，其浓度为0.1X、0.2X、0.3X、0.4X、0.5X、0.6X、0.7X、0.8X、0.9X、1X、2X、3X、4X、5X、6X、7X，或8X SSC。

如果本发明的组合物包含促进剂例如硫酸葡聚糖、二醇或DMSO，硫酸葡聚糖浓度可以是5％至40％，二醇浓度可以是0.1％至10％，DMSO可以是0.1％至10％。在某些实施方案中，硫酸葡聚糖的浓度可以是10％或20％，乙二醇、1，3-丙二醇或甘油的浓度可以是1％至10％。在某些实施方案中，DMSO的浓度可以是1％。在某些实施方案中，含水组合物不包含DMSO作为促进剂。在某些实施方案中，含水组合物不包含甲酰胺作为促进剂，或者包含甲酰胺，条件是所述组合物含有小于10％、或小于5％、或小于2％、或小于1％、或小于0.5％、或小于0.1％、或小于0.05％、或小于0.01％。

如果本发明的组合物包含柠檬酸，其浓度范围可以是1mM至50mM，pH范围可以是5.0至8.0。在某些实施方案中，柠檬酸浓度可以是10mM，pH可以是6.2。

本发明的组合物可包含能减少与例如细胞膜的非特异性结合的试剂，例如鲑鱼精子或少量人类总DNA，或者例如，它们可包含能封闭例如重复序列与靶标结合的封闭剂，例如大量人类总DNA或重复序列富集DNA或特定封闭剂例如PNA或LNA的片段和序列。这些试剂的浓度可以是0.01-100μg/μl或0.01-100μM。例如，在某些实施方案中，这些试剂可以是0.1μg/μl人类总DNA或0.1μg/μl非人类DNA，例如鲱鱼精子、鲑鱼精子或小牛胸腺DNA或5μM封闭PNA。然而，本发明的组合物和方法表现出明显降低的背景水平而不需要封闭剂。

本发明的一方面提供一种组合物或溶液，其用于在杂交应用中单独变性探针和靶标。用于变性靶标的组合物可以包括与用于变性探针的组合物相同的成分，或两种组合物可以包括不同成分。用于本发明的组合物可以包括含水组合物，该含水组合物包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂。足以变性双链核苷酸序列的有效量是允许杂交的量。例如，用于测定极性非质子溶剂的量是否对杂交有效的一种方式是，确定极性非质子溶剂当用在本文所述的杂交方法和组合物中例如实施例1中时是否产生可检测信号和/或扩增的核酸产物。

如果本发明的组合物用在杂交测定中，该组合物还可以包括一种或多种核酸探针。该探针可以可用可检测化合物(例如酶、生色团、荧光染料和半抗原)直接或间接标记。DNA探针浓度可以是0.1至100ng/μL。例如，在某些实施方案中，探针浓度可以是1至10ng/μL。PNA探针浓度可以是0.5至5000nM。例如，在某些实施方案中，探针浓度可以是5至1000nM。

在一个实施方案中，本发明的组合物包含40％极性非质子溶剂(v/v)(例如碳酸亚乙酯，“EC”)、10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液和1-10ng/μL探针的混合物。本发明的另一种示例性组合物包含15％EC、20％硫酸葡聚糖、600mM NaCl、10mM磷酸盐缓冲液和0.1μg/μl人类总DNA的混合物。又一种示例性组合物包含15％EC、20％硫酸葡聚糖、600mM NaCl、10mM柠檬酸pH 6.2和0.1μg/μl非人类DNA(例如鲱鱼精子、鲑鱼精子或小牛胸腺)或0.5％甲酰胺或1％二醇(例如乙二醇、1，3丙二醇或甘油)。又一种示例性组合物包括15％EC、20％硫酸葡聚糖、600mM NaCl、10mM柠檬酸，pH 6.2。又一种示例性组合物包括15％EC和10mM柠檬酸，pH 6.2。

(2)极性非质子溶剂

不同的极性非质子溶剂可赋予本发明组合物不同特性。例如，对极性非质子溶剂的选择可促进组合物的稳定性，因为某些极性非质子溶剂会随时间降解。例如，极性非质子溶剂碳酸亚乙酯分解成乙二醇(其是相当稳定的分子)和二氧化碳(其可与水反应形成碳酸，改变本发明组合物的酸度)。不受理论的束缚，据信在碳酸亚乙酯分解时pH的改变使本发明组合物的杂交效果降低。然而，可通过降低组合物的pH，通过添加柠檬酸作为缓冲液(pH 6.2)，替代传统的磷酸盐缓冲液(其通常在约pH 7.使用4)，和/或通过添加乙二醇(浓度例如介于0.1％至10％，或介于0.5％至5％，例如1％、2％、3％等)，改善稳定性。例如，使用10mM柠檬酸缓冲液，本发明组合物在2-8℃可保持稳定大约8个月。如果组合物贮存在低温(例如-20℃)时也可改善稳定性。

另外，在某些条件下，某些极性非质子溶剂可使本发明组合物分离成多相体系。对于不同的极性非质子溶剂而言，得到多相体系的条件可以不同。然而，通常，随着极性非质子溶剂浓度增加，相数增加。例如，包含低浓度碳酸亚乙酯(即小于20％)的组合物可以单相形式存在，而包含更高浓度碳酸亚乙酯的组合物可分离成两相、或甚至三相。举例来说，在20％硫酸葡聚糖、600mM NaCl、10mM柠檬酸盐缓冲液中包含15％碳酸亚乙酯的组合物在室温下以单相存在，而在10％硫酸葡聚糖、300mMNaCl和5mM磷酸盐缓冲液中包含40％碳酸亚乙酯的组合物在室温下由粘稠的下相(总体积的大约25％)和不太粘稠的上相(总体积的大约75％)组成。然而，包含例如40％极性非质子溶剂(例如，在10mM柠檬酸缓冲液中的40％EC)或50％极性非质子溶剂(例如，在2xSSC中50％EC)的组合物是单相体系。

另一方面，某些极性非质子溶剂在室温下可以两相形式存在，甚至在低浓度时。例如，环丁砜、γ-丁内酯、三硫代碳酸亚乙酯、亚硫酸乙二醇酯和碳酸异丙二醇酯在浓度为10、15、20或25％(20％硫酸葡聚糖、600mM NaCl、10mM柠檬酸缓冲液)时，在室温下以两相形式存在。相比之下，含有较低百分比的硫酸葡聚糖或不含硫酸葡聚糖的极性非质子溶剂组合物在室温下保持为单相(例如2xSSC中的20％GBL和2xSSC中的20％SL)。

也可通过调节本发明组合物的温度来改变相数。通常，随着温度上升，相数减少。例如，在2-8℃，在10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl和5mM磷酸盐缓冲液中包含40％碳酸亚乙酯的组合物可分离成三相体系。

也可通过调节组合物中硫酸葡聚糖和/或盐的浓度，来改变相数。一般而言，降低硫酸葡聚糖浓度(传统浓度为10％)和/或盐浓度，可减少相数。然而，根据组合物中特定极性非质子溶剂及其浓度，可甚至用更高浓度的盐和硫酸葡聚糖产生单相。例如，通过增加硫酸葡聚糖和盐的浓度，包含少量EC(例如15％、10％、或5％)的组合物可工作良好，同时仍然保持单相体系。在一个具体的实施方案中，包含HER2基因DNA探针、CEN7PNA探针、15％EC、20％硫酸葡聚糖、600mM NaCl和10mM磷酸盐缓冲液的组合物甚至在-20℃冻结。在其它实施方案中，组合物在-20℃是液体。

某些极性非质子溶剂允许探针在一相或另一相中可产生更强信号。例如，40％亚硫酸乙二醇酯在下相产生强烈信号，而在上相无信号。同样，某些种类的探针在一相或另一相中可产生更强烈的信号。例如，PNA探针倾向于在下相、而不是上相中显示出更强烈信号。

因此，本发明的多相体系可用于方便地检查样品的不同方面。

可用本发明的单相组合物、本发明多相组合物的单一相、或本发明多相组合物的任何一相或多相的混合物，来进行杂交应用。例如，在单相体系中，可提取一定体积的样品用于杂交。在多相体系中，可从目标相(例如上相、下相或中相)中提取一定体积的样品用于杂交。或者，在提取一定体积的混合样品用于杂交之前，可将多相体系中的各相混合。然而，根据组合物的不同，多相体系可产生强烈而不均匀的局部背景染色。尽管，加入少量甲酰胺将会减低单相体系中的背景，但它对具有高浓度(例如40％)极性非质子溶剂的多相体系却没什么效果。

由于杂交步骤中使用的组合物可能不同于在单独变性步骤中使用的组合物，本发明组合物的硫酸葡聚糖和盐浓度不是关键的。事实上，与探针和靶标共变性的杂交应用相比，缺少硫酸葡聚糖，盐和缓冲剂的本发明组合物在其中探针和靶标单独地变性的杂交应用中产生较低背景(例如，评分低1¹/₂至2)和更均匀的背景。然而，包含缓冲剂的组合物(例如，40％EC加上10mM柠檬酸盐缓冲液)比无缓冲的组合物产生稍稍较高的背景(例如，评分高出1/2)。在一个实施方案中，含有EC和缓冲剂的组合物(例如，15％EC加上10mM柠檬酸盐缓冲液)可起作用而无需任何硫酸葡聚糖。

与使用传统缓冲液的其中靶标和探针共变性的杂交应用相比，使用本发明组合物的其中靶标和探针单独地变性的杂交应用可产生更均匀的信号强度和更低更均匀的背景染色。

(3)对于具体应用的优化

可以改变本发明的组合物，以优化具体应用的结果。例如，可以改变极性非质子溶剂、盐、促进剂、封闭剂和/或氢离子(即pH)的浓度，以改善具体应用的结果。

例如，可改变极性非质子溶剂浓度，以改善信号强度和背景染色。通常，随着极性非质子溶剂浓度增加，信号强度增加且背景染色降低。例如，与包含5％EC的组合物相比，包含15％EC的用于变性探针的组合物倾向于表现出较强信号和较低背景。然而，对于具有低浓度极性非质子溶剂(例如0％至20％)的组合物，如果增加盐和/或硫酸葡聚糖的浓度，则可改善信号强度。例如，用5％至10％EC，当盐浓度比传统盐浓度升高大约3-4倍(即大约1200mM NaCl、20mM磷酸盐缓冲液；传统盐浓度约300mM NaCl)时，可观察到强烈信号。类似地，在使用较低浓度的极性非质子溶剂时，通常需要较高浓度的硫酸葡聚糖以保持良好信号和背景强度。

因此，也可改变盐和硫酸葡聚糖的浓度，以改善信号强度和背景染色。通常，随着用于变性探针的组合物中盐和硫酸葡聚糖的浓度增加，信号强度增加，背景染色降低。例如，传统浓度的大约2-4倍的盐浓度(即，300mM NaCl 5mM磷酸盐缓冲液)产生强烈信号和低背景。然而，令人惊奇的是，甚至完全不含盐时也可以使用本发明组合物。在无盐条件下，通过增加促进剂和/或极性非质子溶剂的浓度，可改善信号强度。

同样，随着硫酸葡聚糖浓度从0％增至20％，用于变性探针的组合物表现出增加的信号强度。然而，甚至在硫酸葡聚糖浓度为0％时可观察到良好信号。在低硫酸葡聚糖条件下，通过增加极性非质子溶剂和/或盐的浓度，可改善信号强度。

另外，可改变用于本发明组合物的探针类型，以改善结果。例如，在本发明某些方面，与DNA/PNA探针组合相比，在本发明组合物中DNA/DNA探针组合可表现出低背景，或反之亦然。另一方面，在低盐和/或低极性非质子溶剂浓度下，与DNA探针相比，PNA探针倾向于显示更强烈信号。事实上，在没有极性非质子溶剂时，PNA探针也显示信号，而在没有极性非质子溶剂时，DNA探针则显示微弱信号或无信号。

本发明的进一步优化是使探针和靶标的变性彼此分离，例如使用不含标记探针的特定变性缓冲液以变性靶标。已发现，将本发明的组合物用于这样的单独变性可以降低背景染色，并使得染色相对于背景和信号强度更均匀。另外，本发明的组合物允许单独变性在低温下进行，这有利于例如保持样品形态学和核酸序列的结构。如上所述，本发明的组合物还比例如传统的甲酰胺变性缓冲液毒性低。本领域技术人员显见，这种用于靶标的变性组合物可以由更加传统的变性剂例如尿素、DMSO或甲酰胺取代极性非质子溶剂组成，而用于探针的变性组合物可以包含极性非质子溶剂以取代更传统的变性剂。然后可以例如用PCT/IB09/005893中描述的快速杂交缓冲剂在杂交步骤中混合探针和靶标。

D.应用、方法和用途

(1)分析样品

本发明的方法和组合物可全部或部分用于细胞学、组织学或分子生物学领域中所有类型的包括靶标和探针单独变性的杂交应用。依据一个实施方案，本发明方法中的第一或第二核酸序列存在于生物样品中。这些样品的实例包括例如组织样品、细胞制备物、细胞碎片制备物、以及分离或富集的细胞组分制备物。样品可源自不同组织(例如乳房、肺、结直肠、前列腺、肺、头颈部、胃、胰脏、食道、肝脏和膀胱或其它相关组织及其赘生物)、任何细胞悬液、血液样品、细针吸出物、腹水、痰、腹膜洗液、肺部洗液、尿、粪、细胞刮取物、细胞涂片、细胞离心涂片或细胞涂片离心(cytoprep)细胞。

可用标准方案分离和处理样品。细胞碎片制备物可通过例如细胞匀浆、冻融处理或细胞破碎而获取。可根据获取样品的目的并根据其场所的常规方法的不同，采用多种不同方式处理分离的样品。通常用不同试剂处理样品，以保藏组织，用于随后的样品分析，或者可直接分析样品。广泛用于保藏样品的方法实例是经福尔马林固定，然后石蜡包埋和冷冻保藏。

对于中期铺片，细胞培养物通常经秋水仙碱或其它合适的纺锤体极破坏剂处理，以将细胞周期终止在中期。然后将细胞固定并印迹到(spottedonto)显微镜载玻片上，用甲醛处理，洗涤并在乙醇中脱水。然后加入探针，通过下述任何技术分析样品。

细胞学包括检查来自生物样品的单个细胞和/或染色体铺片。样品的细胞学检查首先是获取细胞标本，这通常是通过以下方式而达到：通过刮取、擦拭或刷取某区域(例如就宫颈标本而言)、或通过采集体液(例如得自胸腔、膀胱或脊柱的那些)、或通过细针吸出或穿刺活检(例如就内部肿瘤而言)。在常规手工细胞学制备中，将样品移至液体悬浮材料中，再将液体中的细胞直接转移或通过基于离心的处理步骤，转移到显微镜载玻片上，进行观察。在典型的自动化细胞学制备中，将过滤装置放入液体悬液中，过滤装置同时可分散细胞并将细胞捕获到滤膜上。再取出滤膜并贴放在显微镜载玻片上。将细胞固定在显微镜载玻片上，然后通过下述任何技术进行分析。

在使用细胞学样品的传统DNA杂交实验中，将含有标本的玻片浸泡在甲醛缓冲液中，洗涤，然后在乙醇中脱水。再加入探针，给标本盖上盖玻片。然后在足以分离标本中的任何双链核酸的温度下使探针和标本共变性(例如5分钟，在82℃)，然后在足以允许杂交的温度下孵育(例如在45℃过夜)。杂交之后，除去盖玻片，对标本进行高严格性洗涤(例如在65℃10分钟)，接着是一系列低严格性洗涤(例如在室温下2x3分钟)。然后样品经脱水和封固，用于分析。

在使用细胞学样品的传统RNA杂交实验中，细胞在40％甲酰胺、1xSSC和10mM磷酸钠中平衡5分钟，在含有20ng的寡核苷酸探针(例如标记的50bp寡核苷酸的混合)、1xSSC、40％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、0.4％BSA、20mM氧钒核糖核苷复合物、鲑鱼精DNA(10mg/ml)，大肠杆菌tRNA(10mg/ml)和10mM磷酸钠的杂交反应中在37℃孵育过夜。然后用4xSSC/40％甲酰胺洗涤两次，再用2x SSC/40％甲酰胺洗涤两次，两者都在37℃进行，然后在室温下用2x SSC洗涤三次。可以例如使用与Cy3缀合的地高辛单克隆抗体来检测地高辛标记的探针。可以例如使用链霉抗生物素-Cy5来检测生物素标记的探针。检测可以通过荧光或CISH进行。

组织学包括检查组织薄片中的细胞。为了制备组织样品用于组织学检查，将组织片固定在合适固定剂(通常是醛，例如甲醛或戊二醛)中，然后包埋在融化石蜡中。再在切片机上对含有组织样品的蜡块进行切片，得到含有组织的石蜡薄片，通常厚度为2-10微米。再将标本放在显微镜载玻片上，风干并加热，使标本粘附在载玻片上。再将残余石蜡溶于合适溶剂(通常是二甲苯、甲苯或其它)中。这些所谓的脱蜡溶剂再用洗涤-脱水类试剂除去，然后通过下述任何技术来分析样品。或者，可从冷冻标本制备切片，快速固定在10％福尔马林或其它合适的固定剂中，再用脱水剂浸泡，然后分析样品。

在使用组织学样品的传统DNA杂交实验中，将经福尔马林固定、石蜡包埋的组织标本切成2-6μm的切片并收集在载玻片上。石蜡被融化(例如30-60分钟，在60℃)并通过用二甲苯(或二甲苯替代品)洗涤例如2x5分钟而除去(脱蜡)。使样品复水，洗涤和预处理(例如在95-100℃10分钟)。载玻片经洗涤并用胃蛋白酶或其它合适的渗透剂处理，例如在37℃处理3-15分钟。载玻片经洗涤(例如2x3分钟)，脱水并使用探针。给标本盖上盖玻片，通过在足以分离任何双链核酸的温度下孵育载玻片(例如82℃5分钟)使探针和标本共变性，然后在足以允许杂交的温度下孵育(例如在45℃过夜)。杂交之后，除去盖玻片，对标本进行高严格性洗涤(例如10分钟，在65℃)，接着是一系列低严格性洗涤(例如2x3分钟，在室温下)。然后样品经脱水和封固，用于分析。

在使用组织学样品的传统RNA杂交实验中，带有FFPE组织切片的载玻片在二甲苯中脱蜡2x5分钟，浸渍在99％乙醇中2x3分钟，在96％乙醇中2x3分钟，然后在纯水中3分钟。将载玻片放置在恒湿箱中，添加蛋白酶K，并在室温孵育载玻片5分钟-15分钟。载玻片浸泡在纯水中2x3分钟，浸泡在96％乙醇中10秒钟，并风干5分钟。将探针添加到组织切片并和用盖玻片覆盖。在55℃在恒湿箱中孵育载玻片90分钟。在孵育之后，载玻片在55℃浸泡在严格性洗涤溶液中25分钟，然后浸泡在TBS中10秒钟。用抗体在恒湿箱中孵育载玻片30分钟。将载玻片浸泡在TBS中2x3分钟，然后在纯水中2x1分钟，然后放置在恒湿箱中。然后用底物孵育载玻片60分钟，并将载玻片浸泡在自来水中5分钟。

在传统RNA印迹过程中，RNA靶标样品在RNA上样缓冲液中65℃变性10分钟，并立即放置于冰上。对凝胶上样，用1xMOPS缓冲液(10XMOPS含有200mM的3-吗啉丙磺酸(morpholinopropansulfonic acid)、50mM乙酸钠、10mM EDTA，pH 7.0)在25V电泳过夜。然后在20xSSC中预平衡凝胶10分钟，且使用无菌20xSSC作为转移缓冲液将RNA转移到尼龙膜上。然后使用例如在120mJ的紫外交联或在120℃加热30分钟，将核酸固定在该膜上。然后在水中洗涤该膜并风干。该膜放置在可密封塑料袋中并在68℃不使用探针预杂交30分钟。探针在100℃变性5分钟并放置于冰上。添加杂交缓冲液(预热到68℃)，并在68℃使探针杂交过夜。然后从袋子上移除该膜并在室温下在低严格性洗涤缓冲液(例如，2xSSC，0.1％SDS)中振荡洗涤两次，每次5分钟。然后在68℃在预热的高严格性洗涤缓冲液(例如，0.1xSSC、0.1％SDS)中洗涤该膜两次，每次15分钟。然后可以存储该膜或将其立即展开用于检测。

传统杂交技术的附加实例可参见例如Sambrook等人的Molecular克隆A Laboratory Manual，2^nd Ed，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)中的1.90-1.104，2.108-2.117，4.40-4.41，7.37-7.57，8.46-10.38，11.7-11.8，11.12-11.19，11.38，和11.45-11.57等章节；和Ausubel等人的Current方案in分子生物学，John Wiley&Sons，Inc.(1998)的2.9.1-2.9.6，2.10.4-2.10.5，2.10.11-2.10.16，4.6.5-4.6.9，4.7.2-4.7.3，4.9.7-4.9.15，5.9.18，6.2-6.5，6.3，6.4，6.3.3-6.4.9，5.9.12-5.9.13，7.0.9，8.1.3，14.3.1-14.3.4，14.9，15.0.3-15.0.4，15.1.1-15.1.8和20.1.24-20.1.25等章节。

(2)杂交技术

本发明的组合物和方法可全部或部分用于包括靶标和探针单独变性的用于细胞学和组织学样品的所有类型的核酸杂交技术。这种技术包括例如原位杂交(ISH)、荧光原位杂交(FISH；包括多色FISH、纤维-FISH等)、显色原位杂交(CISH)、银染原位杂交(SISH)、比较基因组杂交(CGH)、染色体涂染和原位阵列。

适用于本发明的杂交的分子探针例如在美国专利公布号2005/0266459中描述，其通过引用结合到本文中。一般而言，探针可制备如下：即通过化学合成、PCR或通过克隆扩增特定DNA序列，将所述DNA插入载体，并在合适宿主细胞中扩增载体和插入片段。常用载体包括细菌质粒、粘粒、细菌人工染色体(BAC)、PI衍生的人工染色体(PAC)或酵母人工染色体(YAC)。然后提取所扩增的DNA并纯化，用作探针。用于制备和/或合成探针的方法是本领域已知的，例如公开于PCT/US02/30573。

一般而言，探针的类型决定了杂交测定中可检测的特征类型。例如，整个核DNA或基因组DNA探针可用作物种特异性探针。染色体涂染是源自单一染色体类型的DNA序列集合，并可识别分裂中期和是期核中的特定染色体类型，对特定染色体的数目进行计数，显示易位或识别染色体外染色质片段。不同的染色体类型还具有可被靶向用于探针杂交的独特重复序列，以检测和计数特定染色体。大的插入探针可用于靶向独特单拷贝序列。对于这些大探针，杂交效率与探针大小成反比。较小的探针还可以用于检测畸变，例如缺失、扩增、倒位、重复和非整倍性。例如，不同颜色的基因座特异性探针可用于通过信号分离原位杂交来检测易位。

一般而言，区分密切相关序列的能力与杂交探针的长度成反比，因为随着探针长度增加，野生型复合物和突变型复合物之间的热稳定性差异下降。通常需要长度大于10bp的探针以获取正确识别独特生物或目标临床疾病所需的序列多样性。另一方面，与非靶序列相比，非常短的寡聚物(＜10个碱基对)中精细至单个碱基(点突变)的序列差异都足以区别与互补核酸靶序列的杂交。

在一个实施方案中，至少一组原位杂交探针可以包括一种或多种PNA探针，如上文定义并如美国专利7,105,294号，其通过引用结合到本文中。用于合成PNA探针的方法在PCT/US02/30573中描述。或者，或另外，上述任何技术中的至少一组杂交探针可包含一种或多种锁核酸(LNA)探针，正如WO 99/14226所述，其通过引用结合到本文中。由于2′和4′碳之间的额外桥连键，LNA主链得以预组织以用于杂交。LNA/DNA和LNA/RNA的相互作用比相应的DNA/DNA和DNA/RNA的相互作用更强烈，正如更高解链温度所示。因此，降低杂交所需能量的本发明的方法和组合物特别适用于用LNA探针的杂交。

在一个实施方案中，探针可包含可检测标记(提供分析可识别信号并允许检测探针-靶杂合体的分子)，如美国专利公开2005/0266459所述，其通过引用结合到本文中。可以标记探针以使得可能通过使用例如荧光或明视野显微镜/扫描仪来识别探针-靶杂合体。在某些实施方案中，可以使用放射性标记例如³¹P、³³P或³²S，非放射性标记例如地高辛配基和生物素，或荧光标记来标记探针。可检测标记可以直接连接到探针，或例如通过使用接头间接连接到探针。本领域技术人员已知的任何标记方法，包括酶促方法和化学方法，都可用于标记本发明方法和组合物所用的探针。在其它实施方案中，不标记探针。

一般而言，原位杂交技术例如CGH、FISH、CISH和SISH使用大的、主要是非特异性核酸探针，所述探针以不同的严格性与细胞染色体中的基因或基因片段杂交。使用大探针使原位杂交技术非常灵敏。然而，在传统杂交测定中成功使用大基因组探针取决于封闭来自例如广泛存在于基因组中的重复序列的不想要的背景染色。用于减少非特异性探针结合的传统方法包括通过用含有ficoll、牛血清清蛋白(BSA)、聚乙烯吡咯烷酮和核酸的预杂交溶液来孵育组织，以使蛋白质和组织上的结合位点饱和。这种封闭步骤是耗时而昂贵的。有利地，本发明的方法和组合物减少和/或消除对这种封闭步骤的需要，并显示出明显降低的背景水平而不需要封闭剂，且不需要在含甲酰胺的缓冲液中的过夜杂交。然而，在一个实施方案中，可以根据本领域已知的例如PCT/US02/30573公开的方法来抑制重复序列。

可直接或间接使用荧光染料(例如FISH)、有机显色剂(例如CISH)、银颗粒(例如SISH)或其它金属颗粒(例如金促进的荧光原位杂交，GOLDFISH)，来检测细胞学和组织学样品中的结合探针。因此，根据检测方法，得自待检样品的细胞群可通过荧光显微镜术或常规明视野光学显微镜来观察。

对细胞学和组织学样品的杂交测定是测定特定DNA序列的数目、大小和/或位置的重要工具。例如，在CGH中，将全基因组染色并与正常参考基因组比较，用于检测具有异常拷贝数的区域。通常，来自受试者组织和正常对照组织的DNA用不同颜色的探针来标记。将DNA混合物合并并加入到正常染色体的中期铺片(或加入到微阵列芯片，对于阵列CGH或基质-CGH)。然后比较颜色比例，识别具有异常拷贝数的区域。

当需要多色图像和/或当方案要求定量信号时，通常使用FISH。该技术通常要求制备细胞学样品，标记探针，变性靶染色体和探针，将探针与靶序列杂交并检测信号。通常，杂交反应对靶序列进行荧光染色，使它们的位置、大小或数目可用荧光显微镜术、流式细胞术或其它合适仪器来测定。范围从全基因组到几千碱基对的DNA序列都可用FISH来研究。通过荧光显微镜技术，例如反褶积(deconvolution)，甚至单个mRNA分子都可被检测到。FISH也可用于中期铺片和是期核。

FISH已经成功用于对中期染色体、间期核、染色质纤维和裸DNA分子的重复DNA序列和单拷贝DNA序列作图，并通过大重复家族(largerepeated family)、尤其是核糖体DNA和主要串联排列家族(major tandemarray family)的定位而用于染色体识别和核型分析。FISH的一个最重要应用就是检测单拷贝DNA序列，尤其是在人和其它真核模型物种的疾病相关基因中，和检测感染因子。FISH可用于检测例如在出生前诊断、造血系统癌症和实体瘤中的染色体非整倍性；检测基因异常例如癌基因扩增、基因缺失或基因融合；染色体结构异常例如易位、重复、插入或倒位；邻近基因综合征(contiguous gene syndrome)例如微缺失综合征(microdeletion syndrome)；各种治疗的遗传效应；体细胞中的病毒核酸和染色体中的病毒整合位点等。在多色FISH中，用单独颜色对每个染色体染色，允许确定衍生异常染色体的正常染色体。这种技术包括多色FISH(m-FISH)、光谱核型分析(SKY)、组合二元关系标记(combined binaryration labeling)(COBRA)，变色核型分析(color-changing karyotyping)、多色显带分析、高分辨率多色显带分析、端粒多色FISH(TM-FISH)，信号分离FISH(ssFISH)和信号融和FISH。

CISH和SISH可用于与FISH相同的许多应用，并具有允许分析基础组织形态学的额外优势，例如用于组织病理学应用。如果进行FISH，则杂交混合物可以包含多组不同的和平衡配对的探针，如美国专利6,730,474号所述，其通过引用结合到本文中。对于CISH，交混合物可含有设计为用一种或多种常规有机显色剂来检测的至少一组探针，对于SISH，杂交混合物可含有设计为用银颗粒检测的至少一组探针，正如以下文献所述：Powell RD等，“Metallographic in situ hybridization(金相原位杂交)，”Hum.Patho1.，38：1145-59(2007)。

本发明的组合物也可全部或部分用于涉及杂交的所有类型的分子生物学技术，包括印迹和探针(例如DNA印迹、RNA印迹等)和阵列。

(3)杂交条件

本发明的方法涉及极性非质子溶剂在包括靶标和探针单独变性的杂交应用中的用途。本发明的组合物特别适用于在所述方法中单独变性探针和样品。

使用本发明组合物的杂交方法可以涉及应用该组合物到包含靶标核酸序列、很可能为双链形式的样品。通常，为了确保探针与靶标序列杂交，一起加热探针和样品，以变性任何双链核酸。已提出，单独变性可更好地保留形态学，而共变性可减少实际操作步骤的数目。出于这些理由，单独变性步骤最常用在分子细胞遗传学应用中，且共变性最常用在分析组织切片时。

通常通过在热量(例如，在从约70℃到约95℃的温度)和有机溶剂例如甲酰胺和四烷基铵卤化物或其组合存在下(一起或单独地)孵育靶标和探针进行变性。例如，可以通过高于70℃的温度(例如，约73℃)和含有70％甲酰胺和2xSSC(0.3M氯化钠和0.03M柠檬酸钠)的变性缓冲液的组合，使染色体DNA变性。通常确定变性条件，以便保持细胞形态学(例如，相对低的温度和高甲酰胺浓度)。

在涉及靶标和探针单独变性的传统杂交应用中，靶标可以例如在包含50％至70％甲酰胺和2X SSC的缓冲液中在70℃至85℃变性5-30分钟，而探针可以例如在50％至100％甲酰胺中在75℃至95℃变性5-10分钟。探针和靶标单独变性的另一种传统方案可以涉及在70％(v/v)甲酰胺、10％(v/v)20X SSC和10％(v/v)磷酸盐缓冲液中，或在70％(v/v)甲酰胺、2X SSC(pH7.0)和0.1mM EDTA，pH7.0中在75℃孵育靶标2分钟，并在2％(w/v)硫酸葡聚糖、50％甲酰胺、2X SSC和50mM磷酸盐缓冲液中在75℃孵育探针5-10分钟。用于探针和靶标单独变性的另一传统方案可以涉及在0.05M NaOH和2X SSC中在室温下孵育靶标约5分钟，并在2X SSC、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、0.15％SDS在70-75℃孵育探针10分钟。

在涉及靶标和探针共变性的传统杂交应用中，典型的方案可以涉及在2X SSC、50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、0.15％SDS中在80℃一起孵育靶标和探针30秒至5分钟。用于共变性靶标和探针的另一种传统方案可以包括在70％甲酰胺和2X SSC(调节到pH 7.2)中在75℃一起孵育靶标和探针2-4分钟。用于共变性靶标和探针的又一种传统方案可以包括在50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖和0.1％SDS中在65℃至70℃一起孵育靶标和探针5分钟。

然而，在本发明的方法中，探针和样品在单独的缓冲液变性，然后样品和探针混合以用于杂交步骤。样品变性缓冲液和探针变性缓冲液可以包括相同成分，或可以包括不同成分。例如，两种缓冲液都可以包括至少一种极性非质子溶剂，或两种缓冲液中的仅一种可以包括极性非质子溶剂。极性非质子溶剂与核酸相互作用并有助于变性和重新退火步骤。极性非质子溶剂还允许使用较低变性温度并避免对有毒化学品例如甲酰胺的需要。结果，本发明所述的极性非质子溶剂产生较低背景和更均匀的背景，保持样品形态学，允许更容易的自动化，并提供更安全(较低毒性)的试剂。

使用本发明变性组合物的杂交可以使用与用传统组合物进行的杂交相同的测定方法进行。例如，加热预处理、消化、变性、杂交、洗涤和封固步骤可以使用在体积、温度、试剂和孵育时间方面与传统组合物相同的条件。然而，本发明的组合物为包括探针和样品的单独变性的杂交应用提供改进的结果。大量的变化存在于本领域已知的传统杂交方案中。本发明的组合物可用于本领域已知的任何传统杂交方案。例如，该组合物用于包括传统甲酰胺杂交缓冲液的杂交应用，或可用于包括PCT/IB09/005893中公开的极性非质子溶剂杂交缓冲液的杂交应用。

或者，可以通过传统方法，例如通过增加或减少用于单独地变性靶标和探针的温度和/或时间来改变和最优化使用本发明组合物的测定。本领域技术人员应理解，在某些情况下例如RNA检测时，变性步骤不是必需的。

例如，在某些实施方案中，用于单独地变性靶标和探针的变性温度可以从55℃到100℃变化，杂交温度可以从20℃到55℃变化。在其它实施方案中，变性温度可以从55℃到70℃、70℃到80℃、80℃到90℃或90℃到100℃变化，杂交温度可以从20℃到30℃、30℃到40℃、40℃到50℃或50℃到55℃变化。在其它实施方案中，变性温度可以是67℃、72℃、82℃或92℃，杂交温度可以是37℃、40℃、45℃或50℃。

在其它实施方案中，样品和探针的单独变性时间是从0到15分钟，杂交时间可以从0分钟到72小时变化。在其它实施方案中，变性时间可以从0到5分钟变化，杂交时间可以从0分钟到8小时变化。在其它实施方案中，变性时间可以是0、1、2、3、4、5、10、15或30分钟，杂交时间可以是0分钟、5分钟、15分钟、30分钟、60分钟、180分钟或240分钟。

因此，使用本发明组合物的杂交可以在不到8小时内完成。在其它实施方案中，杂交步骤可以在不到6小时内完成。在再一些实施方案中，杂交步骤可以在4小时内完成。在其它实施方案中，杂交步骤可以在3小时内完成。在又一些实施方案中，杂交步骤可以在2小时内完成。在其它实施方案中，杂交步骤可以在1小时内完成。在再一些实施方案中，杂交步骤可以在30分钟内完成。在其它实施方案中，它们的杂交步骤可发生在15分钟内。杂交步骤甚至可发生在10分钟内或不到5分钟内。

随着杂交时间的改变，探针浓度也可不同，以产生强烈信号和/或降低背景。例如，随着杂交时间减少，探针量可增加，以改善信号强度。另一方面，随着杂交时间减少，探针量可以减少，以改善背景染色。

本发明的组合物还消除了杂交应用期间对封闭步骤的需求，即通过封闭例如重复序列与靶DNA的结合而改善信号和背景强度。因此，不需要使用人类总DNA、封闭PNA、COT-1DNA、来自任何其它来源的RNA或DNA，作为封闭剂。另外，本发明的组合物和方法令人惊奇地表现出明显降低的背景水平而不需要在含甲酰胺的缓冲液中进行过夜杂交。

本发明的含水组合物还提供了明显降低组合物所含的核酸序列浓度的可能性。通常，与传统的探针浓度相比，探针浓度可降低2-8倍。例如，如果HER2DNA探针和CEN17PNA探针用于本发明的组合物，它们的浓度可分别降低至其在传统杂交组合物中浓度的1/4和1/2。该特征，以及不需要封闭用DNA(例如封闭PNA或COT1)，允许在自动化仪器系统中增加探针体积，与传统组合物系统所用的传统的10μL体积相比，这减少了因蒸发而带来的损失，详细讨论如下。

降低探针浓度也降低了背景。然而，降低探针浓度与杂交时间成负相关，即浓度越低，所需杂交时间越长。然而，甚至当极低浓度的探针与本发明含水组合物一起使用时，杂交时间仍然比用传统组合物更短。

本发明的组合物通常允许比传统杂交组合物更好的信噪比。例如，与在传统组合物中杂交过夜相比，使用某些探针，使用本发明组合物的一小时杂交将会产生类似或较低的背景和更强烈信号。当不加探针时没有观察到背景。

本领域技术人员应理解，不同类型的杂交测定、不同类型的样品、不同类型的探针靶标、不同长度的探针、不同类型的探针，例如DNA/RNA/PNA/LNA寡核苷酸、短DNA/RNA探针(0.5-3kb)、染色体涂染探针、CGH、重复序列探针(例如α-卫星重复)、单基因座等，将影响例如获得最有效杂交所需的盐和极性非质子溶剂的浓度。温度和孵育时间也是杂交应用的重要变量。根据本文提供的教导，本领域技术人员能够理解如何改变这些因素以最优化本发明的方法。

当使用本发明组合物时，也可改变和优化传统的测定方法，这取决于系统是否是手动、半自动或自动化的。例如，与传统上需要升温的共变性方案相比，通过单独变性探针和靶标，可以按更加简单的自动化方式使用较小体积的杂交缓冲液。此外，半自动或全自动系统将得益于用本发明组合物获得的短杂交时间。短杂交时间可减少在这类系统中使用传统组合物所遇到的困难。例如，使用半自动和自动化系统的一个问题就是，杂交期间样品会发生明显蒸发，因为这类系统需要小的样品体积(例如10-150μL)、升高的温度和延长的杂交时间(例如14小时)。因此，在传统杂交溶液中的组分比例相当恒定。然而，由于本发明的组合物允许单独变性靶标和探针，可减少蒸发，允许用于半自动和全自动系统的杂交组合物的组分比例的灵活性增加。

例如，两种自动化仪器用于在包含传统共变性步骤中(即样品和探针一起变性)的杂交应用中使用本发明组合物进行杂交。以体积计包含40％碳酸亚乙酯的组合物已用在PCT申请DK2008/000430中公开的装置中，且以体积计包含15％碳酸亚乙酯的组合物已用在HYBRIMASTERHS-300中(Aloka CO.LTD，Japan)。当本发明的组合物用在HYBRIMASTER HS-300中时，该仪器可以进行快速FISH杂交，用水取代传统的有毒甲酰胺混合物，因而改善了安全性并减少了蒸发。如果将水湿润的条带连接到Aloka仪器的反应单元(杂交室)的内部盖子上，例如美国专利申请11/031,514号所述，其通过引用结合到本文中，甚至会进一步减少蒸发。有利地，在上述仪器的两个实例中，靶标和探针的单独变性将减少蒸发和样品应力。

自动化图像分析的其它问题就是所需的图像数，所需的大量存储空间和采集图像所需的时间。本发明的组合物通过产生与传统组合物相比非常强烈信号，而解决了该问题。因为本发明组合物产生非常强烈信号，所以可以用比传统组合物所需的更低的放大倍数来作图并且仍然可以对其进行检测和分析，例如通过算法。因为放大倍数更低，焦平面更宽，所以本发明组合物减少或消除了对采集样品连续切片的需要。由本发明的单独变性方法提供的更均匀背景染色和信号强度也将有利于成像分析。结果是总体成像快得多，因为本发明组合物需要更少连续切片或不需要连续切片，并且各图像覆盖大得多的面积。另外，总体分析时间更快，因为总图像文件小得多。

因此，本发明的组合物和方法解决了传统的杂交组合物和方法相关的许多问题。

通过以下非限制性实施例，可以更清楚地理解本说明书，所述实施例构成了本说明书的组合物的优选实施方案。除非在实施例中或其它地方另有说明，否则在本说明书和权利要求书中所用的表达成分数量、反应条件等的所有数字都可理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此，除非另有相反说明，否则以下说明书和所附权利要求书中给出的数字参数都是近似值，其可根据意图在本文中获取的所需性质的不同而异。至少而并非试图将等同方案原则的应用限制在权利要求书的范围之内，每个数字参数应当视为按照有效数字的数值和通常的四舍五入方式。

尽管宽范围给出的数字范围和参数是近似值，但是在具体实施例中给出的数值是尽可能精确地报告的。然而，任何数值必定具有来自其各自测试的标准差的某些误差。以下实施例说明了本发明，并且不应视为以任何方式限制本发明。

实施例

对于本发明具体的实施方案，将会详细给出参考。尽管参考这些实施方案描述了本发明，但可以理解，它们不得视为将本发明限制至这些实施方案。相反，本发明覆盖了替代、修改和等同方案，其可按照所附权利要求书的定义而包括在本发明之内。

以下实施例中所用的试剂来自Dako的组织学FISH辅助试剂盒(K5599)和细胞学FISH辅助试剂盒(K5499)(Dako Denmark A/S，GlostrupDenmark)。试剂盒含有完成经福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片标本的FISH程序所需的所有关键试剂，除了探针之外。按照制造商描述制备所有样品。Dako杂交仪(S2450，Dako)用于消化、变性和杂交步骤。

在杂交后一周内，使用装有DAPI、FITC、德克萨斯红单滤色镜和FITC/德克萨斯红双滤色镜的Leica DM6000B荧光显微镜，在10x、20x、40x物镜和100x油镜下，对FISH载玻片进行评价。

使用Olympus BX51光学显微镜，在4x、10x、20x、40x和60x物镜下，对CISH载玻片进行评价。

在以下实施例中，“硫酸葡聚糖”是指分子量M_w＞500,000的硫酸葡聚糖的钠盐(D8906，Sigma)。所有浓度的极性非质子溶剂都以体积(v/v)百分比计。磷酸盐缓冲液是指含有NaH₂PO₄，·2H₂O(磷酸二氢钠-二水合物)和Na₂HPO₄·H₂O(磷酸氢二钠-一水合物)的磷酸缓冲溶液。柠檬酸缓冲液是指含有柠檬酸钠(Na₃C₆H₅O₇，2H₂O；1.06448，Merck)和柠檬酸-一水合物(C₆H₈O₇，H₂O；1.00244，Merck)的柠檬酸缓冲溶液。

通用组织学FISH/CISH程序(实施例1-20)

将带有经福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的来自人(扁桃体、乳癌、肾和结肠)的多组织阵列切片的载玻片在60℃加热30-60分钟，在二甲苯浴中脱蜡，在乙醇浴中复水，然后移入洗涤缓冲液。再将样品在预处理溶液中在至少95℃预处理10分钟，洗涤2x3分钟。然后将样品用胃蛋白酶RTU在37℃消化3分钟，洗涤2x3分钟，在一系列乙醇中脱水，蒸发并风干。按照所述，在单独实验下，将样品与10μL FISH探针一起孵育。将样品再通过严格性洗涤，在65℃洗涤10分钟，再洗涤2x3分钟，然后在一系列乙醇中脱水，蒸发并风干。最终，将载玻片用15μL抗褪色封固剂封固。完成染色之后，观察人员连续评价染色载玻片的信号强度、形态学和背景，进行评分。

通用细胞学FISH程序(实施例21-22)

将带有中期制备物的载玻片在3.7％甲醛中固定2分钟，洗涤2x5分钟，在一系列乙醇中脱水，蒸发并风干。按照所述，在单独实验下，将样品与10μL FISH探针一起孵育。将样品再通过严格性洗涤，在65℃洗涤10分钟，再洗涤2x3分钟，然后在一系列乙醇中脱水，蒸发并风干。最终，将载玻片用15μL抗褪色封固剂封固。最终，将载玻片用15μL抗褪色封固剂封固。完成染色之后，观察人员连续评价染色载玻片的信号强度、形态学和背景，按照组织切片评分指南所述，进行评分。

通用组织学FISH/CISH过程(实施例23-30)

将带有经福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)的来自人(扁桃体、乳癌、肾和结肠)的多组织阵列切片的载玻片在60℃加热30-60分钟，在二甲苯浴中脱蜡，在乙醇浴中复水，然后移入洗涤缓冲液。再将样品在预处理溶液中在至少95℃预处理10分钟，洗涤2x3分钟。然后将样品用胃蛋白酶RTU在37℃消化3分钟，洗涤2x3分钟，在一系列乙醇中脱水，蒸发并风干。将样品与10μL FISH探针共变性，或将FISH探针和样品首先单独地变性，然后按照所述在单独实验下一起孵育。将样品再通过严格性洗涤缓冲液中，在65℃洗涤10分钟，然后在洗涤缓冲液中再洗涤2x3分钟，然后在一系列乙醇中脱水，蒸发并风干。最终，将载玻片用15μL抗褪色封固剂封固。完成染色之后，观察人员连续评价染色载玻片的信号强度、形态学和背景，进行评分。

组织切片评分指南

在0-3级量表上评价信号强度，其中0表示无信号，3表示强烈信号。在0-3级量表上评价细胞/组织结构，其中0表示无结构和无核边界，3表示完整结构和清晰核边界。介于0和3之间，有额外的0.5级，除非观察人员可评价信号强度、组织结构和背景。

根据0-3级量表上的分级系统，对信号强度进行评分。

0 无信号可见。

1 信号强度微弱。

2 信号强度中等。

3 信号强度强烈。

该评分系统允许使用1/2级。

根据0-3级量表上的分级系统，对组织和核结构进行评分。

0 组织结构和核边界完全被破坏。

1 组织结构和/或核边界差。该级别包括某些区域具有空核的情况。

2 组织结构和/或核边界可见，但核边界不清晰。该级别包括少量核是空的情况。

3 组织结构和核边界完整而清晰。

该评分系统允许使用1/2级。

根据0-3级量表上的分级系统，对背景进行评分。

0 无或几乎无背景可见。

1 有些背景。

2 中等背景。

3 高背景。

该评分系统允许使用1/2级。

实施例1

本实施例比较了经本发明组合物或传统杂交溶液处理的样品的信号强度和细胞形态学，作为变性温度的函数。

FISH探针组合物I：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％甲酰胺(15515-026，Invitrogen)、5μM封闭PNA(参见KirstenVang Nielsen等，PNA Suppression Method Combined with Fluorescence InSitu Hybridisation(FISH)Technique inPRINS and PNA Technologies inChromosomal Investigation，第10章(Franck Pellestor编著)(Nova SciencePublishers，Inc.2006))、10ng/μL德克萨斯红标记的CCND 1基因DNA探针(RP11-1143E20，大小192kb)。

FISH探针组合物II：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％碳酸亚乙酯(03519，Fluka)、5μM封闭PNA、10ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针(RP11-1143E20，大小192kb)。

如果存在，不同粘度的各相在使用前混合。按照指示，将FISH探针变性5分钟并在45℃杂交60分钟。

结果：

信号评分为“3”分，是在20x物镜下清晰可见。

实施例2

本实施例比较了经本发明组合物或传统杂交溶液处理的样品的信号强度和背景染色，作为杂交时间的函数。

FISH探针组合物I：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％甲酰胺、5μM封闭PNA、10ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针。

FISH探针组合物II：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％碳酸亚乙酯、5μM封闭PNA、10ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针。

如果存在，不同粘度的各相在使用前混合。将FISH探针在82℃孵育5分钟，然后在45℃孵育14小时、4小时、2小时、60分钟、30分钟、15分钟、0分钟。

结果：

信号评分为“3”分，是在20x物镜下清晰可见。

实施例3

本实施例比较了经具有不同极性非质子溶剂的本发明组合物或传统杂交溶液处理的样品的信号强度。

FISH探针组合物II：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％碳酸亚乙酯(EC)、5μM封闭PNA、10ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针。

FISH探针组合物III：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％碳酸异丙二醇酯(PC)(540013，Aldrich)、5μM封闭PNA、10ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针。

FISH探针组合物IV：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％环丁砜(SL)(T22209，Aldrich)、5μM封闭PNA、10ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针。

FISH探针组合物V：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％乙腈(AN)(C02CIIX，Lab-Scan)、5μM封闭PNA、10ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针。

FISH探针组合物VI：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％γ-丁内酯(GBL)(B103608，Aldrich)、5μM封闭PNA、7，5ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针。

如果存在，不同粘度的各相在使用前混合。将FISH探针在82℃孵育5分钟，然后在45℃孵育60分钟。

结果：

信号评分为“3”分，是在20x物镜下清晰可见。

实施例4

本实施例比较了经具有不同浓度极性非质子溶剂的本发明组合物处理的样品的信号强度。

FISH探针组合物：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、10-60％碳酸亚乙酯(按照指示)、5μM封闭PNA、7.5ng/μL德克萨斯红标记的IGK-恒定区DNA基因探针((CTD-3050E15、RP11-1083E8；大小227kb)和7.5ng/μL FITC标记的IGK-可变区基因DNA探针(CTD-2575M21、RP11-122B6、RP11-316G9；大小350和429kb)。

结果：

信号评分为“3”分，是在20x物镜下清晰可见。

实施例5

本实施例比较了经有或没有PNA封闭的组合物处理的样品的信号强度和背景强度。

FISH探针组合物：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％碳酸亚乙酯、7.5ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针。

结果：

信号评分为“3”分，是在20x物镜下清晰可见。

实施例6

本实施例比较了经本发明组合物处理的样品的信号强度，作为探针浓度和杂交时间的函数。

FISH探针组合物：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％碳酸亚乙酯、和10、7.5、5或2.5ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针(按照指示)。

如果存在，不同粘度的各相在使用前混合。将FISH探针在82℃孵育5分钟，然后在45℃孵育3小时、2小时和1小时。

结果：

信号评分为“3”分，是在20x物镜下清晰可见。

实施例7

本实施例比较了经本发明组合物处理的样品的信号强度，作为盐、磷酸盐和缓冲液的浓度的函数。

FISH探针组合物：10％硫酸葡聚糖、([NaCl]、[磷酸盐缓冲液]、[TRIS缓冲液]如结果所示)、40％碳酸亚乙酯、7.5ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针。

结果：

信号评分为“3”分，是在20x物镜下清晰可见。

实施例8

本实施例比较了经本发明组合物处理的样品的信号强度，作为硫酸葡聚糖浓度的函数。

FISH探针组合物：0、1、2、5或10％硫酸葡聚糖(按照指示)、300mMNaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％碳酸亚乙酯、5ng/μL德克萨斯红标记的SIL-TAL1基因DNA探针(RP1-278O13；大小67kb)和6ng/μL FITCSIL-TAL1(ICRFc112-112C1794、RP11-184J23、RP11-8J9、CTD-2007B18、133B9；大小560kb)。

如果存在，不同粘度的各相在使用前混合。将FISH探针在82℃孵育5分钟，然后在45℃孵育60分钟。不封闭。

结果：

注意：本实验没有得到评分为“3”的结果，因为SIL-TAL1德克萨斯红标记的探针仅为67kb并且来自未优化制备物。

实施例9

本实施例比较了经本发明组合物处理的样品的信号强度，作为硫酸葡聚糖、盐、磷酸盐和极性非质子溶剂的浓度的函数。

FISH探针组合物Ia：34％硫酸葡聚糖、0mM NaCl、0mM磷酸盐缓冲液、0％碳酸亚乙酯、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针(大小218kb)和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。

FISH探针组合物Ib：34％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、0％碳酸亚乙酯、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针(大小218kb)和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。

FISH探针组合物Ic：34％硫酸葡聚糖、600mM NaCl、10mM磷酸盐缓冲液、0％碳酸亚乙酯、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针(大小218kb)和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。

FISH探针组合物IIa：32％硫酸葡聚糖、0mM NaCl、0mM磷酸盐缓冲液、5％碳酸亚乙酯、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针(大小218kb)和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。

FISH探针组合物IIb：32％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、5％碳酸亚乙酯、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针(大小218kb)和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。

FISH探针组合物IIc：32％硫酸葡聚糖、600mM NaCl、10mM磷酸盐缓冲液、5％碳酸亚乙酯、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针(大小218kb)和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。

FISH探针组合物IIIa：30％硫酸葡聚糖、0mM NaCl、0mM磷酸盐缓冲液、10％碳酸亚乙酯、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针(大小218kb)和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。

FISH探针组合物IIIb：30％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、10％碳酸亚乙酯、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针(大小218kb)和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。

FISH探针组合物IIIc：30％硫酸葡聚糖、600mM NaCl、10mM磷酸盐缓冲液、10％碳酸亚乙酯、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针(大小218kb)和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。

FISH探针组合物IVa：28％硫酸葡聚糖、0mM NaCl、0mM磷酸盐缓冲液、15％碳酸亚乙酯、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针(大小218kb)和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。

FISH探针组合物IVb：28％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、15％碳酸亚乙酯、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针(大小218kb)和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。

FISH探针组合物IVc：28％硫酸葡聚糖、600mM NaCl、10mM磷酸盐缓冲液、15％碳酸亚乙酯、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针(大小218kb)和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。

FISH探针参考V：标准售卖的含有封闭PNA的HER2PharmDx探针混合物(K5331，Dako)的小管。杂交过夜20小时。

所有组合物以单相存在。将FISH探针在82℃孵育5分钟，然后在45℃孵育60分钟，不封闭，除了FISH探针参考V之外，后者具有PNA封闭并杂交20小时。

结果：

注意：组合物IVa给出强烈DNA信号，其中无盐。这用标准FISH组合物(其中DNA结合是盐依赖型的)是不可能的。

实施例10

本实施例比较了经本发明组合物处理的样品的信号强度，作为高盐(4x正常)条件下的极性非质子溶剂和硫酸葡聚糖的浓度的函数。

FISH探针组合物I：0％碳酸亚乙酯、29％硫酸葡聚糖、1200mM NaCl、20mM磷酸盐缓冲液、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。组合物是单相。

FISH探针组合物II：5％碳酸亚乙酯、27％硫酸葡聚糖、1200mMNaCl、20mM磷酸盐缓冲液、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。组合物是单相。

FISH探针组合物III：10％碳酸亚乙酯、25％硫酸葡聚糖、1200mMNaCl、20mM磷酸盐缓冲液、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。组合物是单相。

FISH探针组合物IV(未测试)：20％碳酸亚乙酯、21％硫酸葡聚糖、1200mM NaCl、20mM磷酸盐缓冲液、10ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针和50nM FITC标记的CEN-7PNA探针。组合物具有两相。

结果：

注意：组合物II仅用5％EC就得到良好DNA信号，用10％EC就得到强烈DNA信号。

实施例11

本实施例比较了经本发明组合物的不同相处理的样品的信号强度和背景。

FISH探针组合物：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％碳酸亚乙酯、8ng/μL德克萨斯红标记的HER2基因DNA探针和600nM FITC标记的CEN-17PNA探针。将FISH探针在82℃孵育5分钟，然后在45℃孵育60分钟。不封闭。

结果：

注意：在这些实验中，上相比下相具有更多背景。

实施例12

本实施例类似于上一个实施例，但使用不同DNA探针并用GBL替代EC。

FISH探针组合物：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％GBL、10ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针和600nM FITC标记的CEN-17PNA探针。

将FISH探针在82℃孵育5分钟，然后在45℃孵育60分钟。不封闭。

结果：

实施例13

本实施例检查了本发明组合物中的相数，作为极性非质子溶剂和硫酸葡聚糖的浓度的函数。

FISH探针组合物：10％或20％硫酸葡聚糖；300mM NaCl；5mM磷酸盐缓冲液；0、5、10、15、20、25、30％EC；10ng/μL探针。

结果：

注意：15％EC、20％硫酸葡聚糖得到以上单相溶液中的最好的高信号强度。两相20％EC比15％.甚至具有更高信号强度(数据未显示)。

实施例14

本实施例比较了经本发明不同组合物处理的样品的信号强度和背景，作为探针浓度和杂交时间的函数。

FISH探针组合物I：10ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(标准浓度)和标准浓度的CEN7FITC标记的PNA探针(50nM)；15％EC；20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM磷酸盐缓冲液。

FISH探针组合物II：5ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/2的标准浓度)和标准浓度(50nM)FITC标记的CEN7PNA探针；15％EC；20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM磷酸盐缓冲液。

FISH探针组合物III：2.5ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/4的标准浓度)和1/2标准浓度(25nM)的CEN7PNA探针；15％EC；20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM磷酸盐缓冲液。

组合物I-III以单相形式存在。将FISH探针在82℃孵育5分钟，然后在45℃孵育3小时、2小时和1小时。

结果：

信号评分为“3”分，是在20x物镜下清晰可见。B.G.：背景

实施例15

本实施例比较了经本发明组合物处理的样品的信号强度和背景，作为封闭剂的函数。

FISH探针组合物：15％EC；20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM磷酸盐缓冲液；2.5ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/4的标准浓度)和1/2的标准浓度(300nM)FITC标记的CEN17PNA探针。样品用以下试剂封闭：(a)无；(b)0.1μg/μl COT1(15279-011，Invitrogen)；(c)0.3μg/μlCOT1；或(d)0.1μg/μl人类总DNA，然后用本发明组合物杂交。

所有样品都以单相形式存在。将FISH探针在82℃孵育5分钟，然后在45℃孵育60分钟。

结果：

注意：无封闭的背景水平明显低于无封闭的标准FISH通常观察到的水平。相比之下，如果标准FISH组合物不含封闭剂，信号通常不能读出。

实施例16

本实验比较了用本发明的组合物去除背景染色的不同方式。

所有组合物都含有15％EC、20％硫酸葡聚糖、600mM NaCl、10mM磷酸盐缓冲液、2.5ng/μL HER2DNA探针(1/4的标准浓度)、300nMCEN17PNA探针(1/2的标准浓度)和一种以下背景降低剂：

A)5μM封闭PNA(参见Kirsten Vang Nielsen等，PNA SuppressionMethod Combined with Fluorescence In Situ Hybridisation(FISH)TechniqueinPRINS and PNA Technologies in Chromosomal Investigation，第10章(Franck Pellestor编著)(Nova Science Publishers，Inc.2006))

B)0.1μg/μl COT-1DNA

C)0.1μg/μl人类总DNA(THD)(超声处理的未标记的THD)

D)0.1μg/μl剪切鲑鱼精子DNA(AM9680，Ambion)

E)0.1μg/μl小牛胸腺DNA(D8661，Sigma)

F)0.1μg/μl鲱鱼精子DNA(D7290，Sigma)

G)0.5％甲酰胺

H)2％甲酰胺

I)1％乙二醇(1.09621，Merck)

J)1％甘油(1.04095，Merck)

K)1％1，3-丙二醇(533734，Aldrich)

L)1％H₂O(对照)

所有样品都以单相形式存在。将FISH探针在82℃孵育5分钟，然后在45℃在FFPE组织切片上孵育60和120分钟。

结果：

注意：所有背景降低剂，除了封闭PNA以外，都表现出降低背景的效果。因此，针对重复DNA序列的特异性封闭是不需要的。

实施例17

本实验比较了使用两种不同极性非质子溶剂的上相和下相的信号强度。

FISH探针组合物I：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％三硫代碳酸亚乙酯(ET)(E27750，Aldrich)、5μM封闭PNA、10ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针。

FISH探针组合物II：10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、40％亚硫酸乙二醇酯(GS)(G7208，Aldrich)、5μM封闭PNA、10ng/μL德克萨斯红标记的CCND1基因DNA探针。

将FISH探针在82℃孵育5分钟，然后在45℃孵育60分钟。

结果：

实施例18.

本实验检查了不同极性非质子溶剂形成单相体系的能力。

所有组合物都含有：20％硫酸葡聚糖、600mM NaCl、10mM磷酸盐缓冲液、以及10、15、20或25％的以下极性非质子溶剂之一：

环丁砜

γ-丁内酯

三硫代碳酸亚乙酯

亚硫酸乙二醇酯

碳酸异丙二醇酯

结果：所检查的所有浓度的所有极性非质子溶剂在所用的组合物中都得到至少两相体系。然而，这并不排除这些化合物可在其它组合物条件下得到单相体系。

实施例19

本实验检查了本发明组合物在多FFPE组织切片的显色原位杂交(CISH)分析中的使用。

FISH探针组合物I：4.5ng/μL TCRAD FITC标记的基因DNA探针(1/4的标准浓度)(RP11-654A2、RP11-246A2、CTP-2355L21、RP11-158G6、RP11-780M2、RP11-481C14；大小1018kb)；15％EC；20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.0。

FISH探针组合物II：4.5ng/μL TCRAD FITC标记的基因DNA探针(1/4的标准浓度)(大小1018kb)；15％EC；20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.0；0.1ug/uL剪切鲑鱼精子DNA。

FISH探针组合物III：300nM各种单独的FITC标记的PNA CEN17探针(1/2的标准浓度)；15％EC；20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.0。

使用Dako DuoCISH方案(SK108)和用于分离探针的组合物分析所有样品，除了严格性洗涤进行20分钟、而不是10分钟，而且不用DuoCISH红色显色剂步骤之外。

结果：

注意：信号强度非常强烈。因为高水平的背景，所以无法判断将鲑鱼精子DNA加入到组合物II中是否减低了背景。使用10x物镜观察例如扁桃体，其通常具有较少背景，信号清晰可见。如果组织具有高背景，使用20x物镜，信号清晰可见。

实施例20

本实施例比较了经具有两种DNA探针的本发明组合物处理的FFPE组织切片的信号强度和背景。

FISH探针组合物I：9ng/μL IGH FITC标记的基因DNA探针(RP11-151B17、RP11-112H5、RP11-101G24、RP11-12F16、RP11-47P23、CTP-3087C18；大小612kb)；6.4ng/μL MYC Tx Red标记的DNA探针(CTD-2106F24、CTD-2151C21、CTD-2267H22；大小418kb)；15％EC；20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.0。

FISH探针组合物II：9ng/μL IGH FITC标记的基因DNA探针；6.4ng MYC TxRed标记的DNA探针；15％EC、20％硫酸葡聚糖；600mMNaCl；10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.0；0.1ug/uL剪切鲑鱼精子DNA。

注意：高背景可能是因为使用标准探针浓度这一事实。

实施例21

本实验检查了本发明组合物在细胞学样品中的使用。

FISH探针组合物：15％EC；20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM磷酸盐缓冲液；5ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/2的标准浓度)和1/2标准浓度的CEN7(25nM)。

将FISH探针在中期染色体铺片上在82℃孵育5分钟，然后在45℃孵育30分钟，都不封闭。

结果：

用本发明组合物没有观察到染色体显带(R显带模式)，与传统ISH溶液相反，后者通常显示R显带。观察到是期核和中期染色体的低的均匀红色背景染色。

实施例22

本实施例比较了有或无封闭时DNA探针对细胞学样品、中期铺片的信号强度和背景。

FISH探针组合物I：6ng/μL TCRAD德克萨斯红标记的基因DNA探针(标准浓度)(CTP-31666K20、CTP-2373N7；大小301kb)和4.5ng/μLFITC标记的基因DNA探针(1/4的标准浓度)；15％EC、20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.0。

FISH探针组合物II：6ng/μL TCRAD德克萨斯红标记的基因DNA探针(标准浓度)(大小301kb)和4.5ng/μL FITC标记的基因DNA探针(1/4的标准浓度)；15％EC、20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.0；0.1ug/uL剪切鲑鱼精子DNA。

将FISH探针在中期铺片上在82℃孵育5分钟，然后在45℃孵育60分钟。

结果：

用本发明组合物又没有观察到染色体显带(R显带模式)。另外，没有观察到是期核或中期染色体的背景染色。

实施例23

本实施例比较涉及在杂交之前探针和标本共变性的实验以及涉及在杂交之前探针和标本单独变性的实验的信号强度和背景。

FISH探针组合物：2.5ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/4的标准浓度)和1/2的标准浓度(300nM)的CEN17PNA探针；15％EC，20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.0。

标本变性组合物：15％EC、20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.0。

如下标所示进行变性5分钟。在45℃进行杂交60分钟。在参考样品中，FISH探针和组织一起变性。

结果：

这些结果表明，在单独地对标本和探针进行变性时背景染色较低。对于单独变性样品，背景染色也均匀得多(数据未显示)。

实施例24

本实施例比较涉及在杂交之前共变性探针和标本的实验以及涉及在杂交之前单独变性探针和标本的实验的信号强度和背景。

标本变性组合物I：15％EC，10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0

标本变性组合物II：20％EC，10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0

标本变性组合物III：25％EC，10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0

标本变性组合物IV：30％EC，10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0

标本变性组合物V：40％EC，10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0

标本变性组合物VI：40％EC

标本变性组合物VII：15％EC，20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0。

上述所有六种缓冲剂组合物在室温下保持为单相。

FISH探针组合物：2.5ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/4的标准浓度)和1/2的标准浓度(300nM)的CEN17PNA探针；15％EC，20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0。

该探针缓冲液在82℃变性5分钟。组织样品与不同的标本变性组合物在82℃变性5分钟。

如上文所述预处理载玻片，直到第一脱水步骤。在已用胃蛋白酶消化样品之后，洗涤载玻片2x3分钟，并添加200μL的标本变性组合物之一。然后用盖玻片覆盖载玻片并在杂交仪(Dako)上在82℃孵育5分钟。然后移除盖玻片，并在洗涤缓冲剂中洗涤载玻片2x3分钟，除了带有标本变性组合物I*的载玻片，后者在2xSSC中洗涤。然后载玻片在96％乙醇中脱水2分钟并风干。

FISH探针在恒温仪上在1.5mL离心管中在82℃变性5分钟，然后置于冰上。10μL变性的FISH探针添加到变性的脱水标本中，对载玻片加上盖玻片并密封，然后在45℃杂交60分钟。在杂交之后，如上文所述处理标本。

在参考样品中，FISH探针和组织一起变性。

结果：

^*在探针应用之前的变性和脱水之后用2xSSC而不是洗涤缓冲剂洗涤该载玻片2x3分钟，并与用洗涤缓冲剂洗涤的相应的载玻片相比，显示出稍微增加的背景染色。

这些结果表明，与探针和标本共变性相比，样品和探针单独变性明显降低背景。背景染色也比在探针和标本共变性时更均匀(数据未显示)。

实施例25

标本变性组合物：15％EC，20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.0。

如上文所述预处理载玻片，直到第一脱水步骤。在已用胃蛋白酶消化样品之后，洗涤载玻片2x3分钟，并添加200μL标本变性组合物。载玻片由盖玻片覆盖并在杂交仪(Dako)上在72℃孵育10分钟。然后移除盖玻片，将载玻片洗涤2x3分钟，在96％乙醇中脱水2分钟并风干。

(11μL的等份)FISH探针如表所示在恒温仪上在1.5mL离心管中变性，然后置于冰块上。10μL的变性的FISH探针添加到变性的脱水标本中。对载玻片加上盖玻片并密封，并在45℃杂交60分钟。在杂交之后，如上文所述处理标本。

结果：

这些结果表明，可以降低FISH探针的变性温度至例如62℃达1分钟而不负面影响信号强度或背景。

实施例26

FISH探针组合物I：2.5ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/4的标准浓度)和1/2的标准浓度(300nM)的CEN17PNA探针；15％EC，20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物II：15％EC，10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物III：15％EC，20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

如上文所述预处理载玻片，直到变性步骤。在样品脱水之后，添加200μL的标本变性组合物。载玻片由盖玻片覆盖并在杂交仪(Dako)上在67℃孵育10分钟。然后移除盖玻片，并将载玻片洗涤2x3分钟，在96％乙醇中脱水2分钟并风干。

FISH探针在恒温仪上在1.5mL离心管中在67℃变性3分钟并在之后立即使用。10μL变性的FISH探针添加到变性的脱水标本中。为载玻片加上盖玻片并密封，并在45℃杂交60分钟。在杂交之后，如上文所述处理标本。

在参考样品中，FISH探针和组织在67℃一起变性10分钟并在45℃杂交60分钟。

结果：

这些结果表明，与共变性探针和标本相比，单独变性样品和探针明显降低背景。背景染色也比在探针和标本共变性时更均匀。在变性缓冲液不含硫酸葡聚糖和NaCl时，背景染色稍微更低。

实施例27

本实施例比较涉及在杂交之前共变性探针和标本的实验以及涉及在杂交之前分别用不同变性剂单独变性探针和标本的实验的信号强度和背景。

FISH探针组合物I：40％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖，300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、5μM封闭PNAs、10ng/μL HER2TxRed标记的DNA基因探针标准浓度(600mM)的CEN17PNA探针。

标本变性组合物II：40％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、5μM封闭PNAs。

标本变性组合物III：15％EC、10mM柠檬酸缓冲液、pH 6.2。

如上文所述预处理载玻片，直到变性步骤。在样品脱水之后，添加100μL的标本变性组合物。载玻片由盖玻片覆盖并如所述在杂交仪(Dako)上孵育。然后移除盖玻片，并将载玻片洗涤2x3分钟，在96％乙醇中脱水2分钟并风干。

FISH探针在恒温仪上在1.5mL离心管中在82℃变性5分钟并在之后立即使用。10μL变性的FISH探针添加到变性的脱水标本中。对载玻片加上盖玻片并密封，并在45℃杂交过夜(约20h)。在杂交之后，如上文所述处理标本。

在参考样品中，FISH探针和组织如所述一起变性并在45℃杂交过夜(约20h)。

结果：

这些结果表明，与用甲酰胺共变性探针和标本相比，用EC单独变性样品提供等价的染色背景和信号强度。在较低变性温度下用EC(III)比用甲酰胺(II)时的DNA信号稍强。用标本组合物III(EC)比用标本组合物II(甲酰胺)时背景染色更低。对于单独变性和共变性，在67℃/10分钟下的最佳结果变性是使用组合物III(EC)的单独变性获得的，这产生与参考等价的结果。

实施例28

本实施例比较涉及在杂交之前单独变性探针和标本的实验的信号强度和背景。

FISH探针组合物I：3.3ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/3的标准浓度)和1/2的标准浓度(300nM)的CEN17PNA探针；15％EC(E26258，Aldrich-Sigma)，20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

FISH探针组合物II：3.3ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/3的标准浓度)和1/2的标准浓度(300nM)的CEN17PNA探针；15％SL，20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

FISH探针组合物III：3.3ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/3的标准浓度)和1/2的标准浓度(300nM)的CEN17PNA探针；15％PC，20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

FISH探针组合物IV：3.3ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/3的标准浓度)和1/2的标准浓度(300nM)的CEN17PNA探针；15％GBL，20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

FISH探针组合物V：3.3ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/3的标准浓度)和1/2的标准浓度(300nM)的CEN17PNA探针；15％甲酰胺，20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物VI：15％EC，10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物VII：15％SL，10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物VIII：15％PC，10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物IX：15％GBL，10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物X：15％甲酰胺，10mM柠檬酸盐缓冲液，pH 6.2。

FISH探针在恒温仪上在管中在67℃变性5分钟并在之后立即使用。10μL变性的FISH探针添加到变性的脱水标本中。对载玻片加上盖玻片并密封，并在45℃杂交60分钟。在杂交之后，如上文所述处理标本。

这些结果表明，在使用较短杂交孵育时间(60分钟)时，与使用甲酰胺的单独变性相比，使用EC、SL、PC和GBL的单独变性为DNA探针提供更强的信号强度。

实施例29

FISH探针组合物I：3.3ng/μL HER2TxRed标记的DNA探针(1/3的标准浓度)和1/2的标准浓度(300nM)的CEN17PNA探针；15％EC(E26258，Aldrich-Sigma)，20％硫酸葡聚糖；600mM NaCl；10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物II：15％EC，10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物III：15％SL，10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物IV：15％PC，10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物V：15％GBL，10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物VI：15％甲酰胺，10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.2。

这些结果表明，当使用极性非质子基探针缓冲液(I)且杂交孵育时间较短(60分钟)时，使用EC(II)、SL(III)、PC(IV)、GBL(V)和甲酰胺(VI)对组织单独变性可提供等价的染色背景和信号强度。

实施例30

FISH探针组合物I(K5331，Dako)：40％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、300mM NaCl、5mM磷酸盐缓冲液、5μM封闭PNA、10ng/μL HER2TxRed标记的DNA基因探针标准浓度(600mM)的CEN17PNA探针。

标本变性组合物II：15％EC，10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物III：15％SL，10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物IV：15％PC，10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物V：15％GBL，10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.2。

标本变性组合物VI：15％甲酰胺，10mM柠檬酸缓冲液，pH 6.2。

FISH探针在恒温仪上在管中在82℃变性5分钟并在之后立即使用。10μL变性的FISH探针添加到变性的脱水标本中。对载玻片加上盖玻片并密封，并在45℃杂交过夜。在杂交之后，如上文所述处理标本。

这些结果表明，与使用甲酰胺(VI)的单独组织变性相比，使用EC(II)、SL(III)、PC(IV)和GBL(V)的单独组织变性提供等价或更佳的信号强度。当使用基于预变性传统甲酰胺的探针(I)且杂交孵育时间(约20h)时如此。背景染色是等价的。

更多的实施方案

实施方案1.一种杂交核酸序列的方法，包括：

-混合第一核酸序列与第一含水组合物，所述第一含水组合物含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂；

-混合第二核酸序列与第二含水组合物，所述第二含水组合物含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少变性剂；和

-混合所述第一核酸序列和所述第二核酸序列，其时间至少足以使所述第一核酸序列和所述第二核酸序列杂交；

其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)。

实施方案2.一种杂交核酸序列的方法，包括：

-混合第一核酸序列与第一含水组合物，所述第一含水组合物含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂，和

-混合所述第一核酸序列与第二含水组合物，所述第二含水组合物包括第二核酸序列和足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种变性剂，其时间至少足以使所述第一核酸序列和所述第二核酸序列杂交，

其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)。

实施方案3.一种杂交核酸序列的方法，包括：

-混合第一核酸序列与第一含水组合物，所述第一含水组合物含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂；和

-混合所述第一核酸序列与第二核酸序列，其时间至少足以使所述第一核酸序列和所述第二核酸序列杂交，

其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)。

实施方案4.实施方案1或2的方法，其中所述第二含水组合物中的变性剂是极性非质子溶剂。

实施方案5.实施方案1至4中任一项的方法，其中所述第一核酸序列在生物样品中。

实施方案6.实施方案5的方法，其中所述生物样品是细胞学或组织学样品。

实施方案7.实施方案1-6中任一项的方法，其中所述第一核酸序列是单链序列，所述第二核酸序列是双链序列。

实施方案8.实施方案1-6中任一项的方法，其中所述第一核酸序列是双链序列，所述第二核酸序列是单链序列。

实施方案9.实施方案1-6中任一项的方法，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列都是双链序列。

实施方案10.实施方案1-6中任一项的方法，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列都是单链序列。

实施方案11.实施方案1-10中任一项的方法，其中提供足够量的能量以使所述第一核酸和第二核酸杂交。

实施方案12.实施方案1-11中任一项的方法，其中提供足够量的能量以使所述第一核酸变性。

实施方案13.实施方案1-12中任一项的方法，其中提供足够量的能量以使所述第二核酸变性。

实施方案14.实施方案11-13的方法，其中通过加热所述组合物来提供能量。

实施方案15.实施方案14的方法，其中通过使用微波、热浴、加热板、加热线、珀耳帖元件、感应加热或加热灯来执行所述加热步骤。

实施方案16.实施方案12-15中任一项的方法，其中用于使所述第一核酸变性的温度为70℃至85℃。

实施方案17.实施方案12-16中任一项的方法，其中用于使所述第二核酸变性的温度为70℃至85℃。

实施方案18.实施方案12-15中任一项的方法，其中用于使所述第一核酸变性的温度是60℃至75℃。

实施方案19.实施方案12-15或18中任一项的方法，其中用于使所述第二核酸变性的温度是60℃至75℃。

实施方案20.实施方案12-15中任一项的方法，其中用于使所述第一核酸变性的温度是62℃、67℃、72℃或82℃。

实施方案21.实施方案12-15或20中任一项的方法，其中用于使所述第二核酸变性的温度是62℃、67℃、72℃或82℃。

实施方案22.实施方案1-21中任一项的方法，其中提供足够量的时间以使所述第一核酸变性。

实施方案23.实施方案1-22中任一项的方法，其中提供足够量的时间以使所述第二核酸变性。

实施方案24.实施方案22或23的方法，其中所述时间是1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟或30分钟。

实施方案25.实施方案1-24中任一项的方法，其中所述杂交步骤包括加热和冷却所述组合物的步骤。

实施方案26.实施方案1-25中任一项的方法，其中所述杂交步骤需要不到8小时。

实施方案27.实施方案的方法26，其中所述杂交步骤需要不到1小时。

实施方案28.实施方案27的方法，其中所述杂交步骤需要不到30分钟。

实施方案29.实施方案28的方法，其中所述杂交步骤需要不到15分钟。

实施方案30.实施方案29的方法，其中所述杂交步骤需要不到5分钟。

实施方案31.实施方案1-30中任一项的方法，还包括封闭步骤。

实施方案32.实施方案1-31中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂浓度以体积计为1％至95％。

实施方案33.实施方案32的方法，其中所述极性非质子溶剂的浓度以体积计为5％至10％。

实施方案34.实施方案32的方法，其中所述极性非质子溶剂的浓度以体积计为10％至20％。

实施方案35.实施方案32的方法，其中所述极性非质子溶剂的浓度以体积计为20％至30％。

实施方案36.实施方案1-35中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂是无毒的。

实施方案37.实施方案1-36中任一项的方法，前提条件是所述含水组合物不包含甲酰胺。

实施方案38.实施方案1-36中任一项的方法，前提条件是所述含水组合物含有少于10％甲酰胺。

实施方案39.实施方案38的方法，前提条件是所述含水组合物含有少于2％甲酰胺。

实施方案40.实施方案39的方法，前提条件是所述含水组合物含有少于1％甲酰胺。

实施方案41.实施方案1-40中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂具有内酯、砜、腈、亚硫酸和/或碳酸官能团。

实施方案42.实施方案1-41中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂的分散溶度参数范围为17.7至22.0MPa^1/2，极性溶度参数范围为13至23MPa^1/2，氢键溶度参数范围为3至13MPa^1/2。

实施方案43.实施方案1-42中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂具有环状基本结构。

实施方案44.实施方案1-43中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂选自：

其中X是O，R1是烷基二基，和

其中X是任选的，如果存在则选自O或S；

其中Z是任选的，如果存在则选自O或S；

其中A和B独立地为O或N或S或烷二基的一部分或伯胺，

其中R为烷二基，和

其中Y为O或S或C。

实施方案45.实施方案1-44中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂选自：乙酰苯胺、乙腈、N-乙酰基吡咯烷酮、4-氨基吡啶、苯甲酰胺、苯并咪唑、1，2，3-苯并三唑、二氧化丁二烯、碳酸2，3-丁二醇酯、γ-丁内酯、己内酯(ε)、氯马来酸酐、2-氯环己酮、碳酸氯代乙二醇酯、氯硝甲烷、柠康酸酐、巴豆酸内酯、5-氰基-2-硫尿嘧啶、环丙腈、硫酸二甲酯、二甲砜、1，3-二甲基-5-四唑、1，5-二甲基四唑、1，2-二硝基苯、2，4-二硝基甲苯、二苯砜、1，2-二硝基苯、2，4-二硝基甲苯、二苯砜、ε-己内酰胺、乙磺酰氯、亚膦酸二乙酯、N-乙基四唑、碳酸亚乙酯、三硫代碳酸亚乙酯、硫酸乙二醇酯、亚硫酸乙二醇酯、糠醛、2-呋喃甲腈、2-咪唑、靛红、异噁唑、丙二腈、4-甲氧基苄腈、1-甲氧基-2-硝基苯、α-溴代特窗酸甲酯、1-甲基咪唑、N-甲基咪唑、3-甲基异噁唑、N-甲基吗啉-N-氧化物、苯甲砜、N-甲基吡咯烷酮、甲基环丁砜、4-甲苯磺酸甲酯、3-硝基苯胺、硝基苯并咪唑、2-硝基呋喃、1-亚硝基-2-吡咯烷酮、2-硝基噻吩、2-噁唑烷酮、9，10-菲醌、N-苯基悉尼酮、邻苯二甲酸酐、皮考啉腈(2-氰基吡啶)、1，3-丙磺酸内酯、-丙醇酸内酯、碳酸异丙二醇酯、4H-吡喃-4-硫酮、4H-吡喃-4-酮(γ-吡喃酮)、哒嗪、2-吡咯烷酮、糖精、琥珀腈、对氨基苯磺酰胺、环丁砜、2，2，6，6-四氯环己酮、四氢噻喃氧化物、四亚甲基砜(环丁砜)、噻唑、2-硫尿嘧啶、3，3，3-三氯丙烯、1，1，2-三氯丙烯、1，2，3-三氯丙烯、硫杂环丁烷-二氧化物和硫杂环丁烷。

实施方案46.实施方案1-44中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂选自：

实施方案47.实施方案1-44中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂是：

实施方案48.实施方案1-47中任一项的方法，其中所述含水组合物还包括至少一种选自以下的额外组分：缓冲剂、盐、促进剂、螯合剂、去垢剂和封闭剂。

实施方案49.实施方案48的方法，其中所述促进剂是硫酸葡聚糖，所述盐是氯化钠和/或磷酸盐缓冲液。

实施方案50.实施方案49的方法，其中所述硫酸葡聚糖存在的浓度是5％至40％，所述氯化钠存在的浓度是0mM至1200mM，和/或所述磷酸盐缓冲液存在的浓度是0mM至50mM。

实施方案51.实施方案50的方法，其中所述硫酸葡聚糖存在的浓度是10％至30％，所述氯化钠存在的浓度是300mM至600mM，和/或所述磷酸盐缓冲液存在的浓度是5mM至20mM。

实施方案52.实施方案48的方法，其中所述促进剂选自：甲酰胺、DMSO、甘油、丙二醇、1，2-丙二醇、二甘醇、乙二醇、二醇和1，3丙二醇，所述缓冲剂是柠檬酸缓冲剂。

实施方案53.实施方案52的方法，其中所述甲酰胺存在的浓度是0.1-5％，所述DMSO存在的浓度是0.01％至10％，所述甘油、丙二醇、1，2-丙二醇、二甘醇、乙二醇、二醇和1，3丙二醇存在的浓度是0.1％至10％，所述柠檬酸缓冲剂存在的浓度是1mM至50mM。

实施方案54.实施方案48的方法，其中所述封闭剂选自：人类总DNA、鲱鱼精子DNA、鲑鱼精子DNA和小牛胸腺DNA。

实施方案55.实施方案54的方法，其中所述人类总DNA、鲱鱼精子DNA、鲑鱼精子DNA和小牛胸腺DNA存在的浓度是0.01至10μg/μL。

实施方案56.实施方案48的方法，其中所述含水组合物包括40％的至少一种极性非质子溶剂、10％的硫酸葡聚糖、300mM的氯化钠和/或5mM的磷酸盐缓冲液。

实施方案57.实施方案48的方法，其中所述含水组合物包括15％的至少一种极性非质子溶剂、20％的硫酸葡聚糖、600mM的氯化钠和/或10mM的磷酸盐缓冲液。

实施方案58.实施方案48的方法，其中所述含水组合物包括15％的至少一种极性非质子溶剂、20％的硫酸葡聚糖、600mM的氯化钠、和10mM的柠檬酸缓冲剂，pH 6.2。

实施方案59.实施方案1-58中任一项的方法，其中所述含水组合物在室温下包含一相。

实施方案60.实施方案1-58中任一项的方法，其中所述含水组合物在室温下包含多相。

实施方案61.实施方案60的方法，其中所述含水组合物在室温下包含两相。

实施方案62.实施方案60或61的方法，其中所述含水组合物的各相混合在一起。

实施方案63.一种含水组合物，其用于在杂交应用中执行靶标的单独变性，所述组合物包括足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂，其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)。

实施方案64.实施方案63的含水组合物，其中所述极性非质子溶剂的浓度由实施方案32至35中任一项定义。

实施方案65.实施方案63或64的含水组合物，其中所述极性非质子溶剂由实施方案36或41至47中任一项定义。

实施方案66.实施方案61至65中任一项的含水组合物，其中所述含水组合物由实施方案37至40或48至62中任一项定义。

实施方案67.组合物的用途，所述组合物包括以体积计在1至95％之间的至少一种极性非质子溶剂，用于在杂交应用中执行靶标的单独变性。

实施方案68.实施方案67的组合物的用途，其中所述极性非质子溶剂的浓度由实施方案32至35中的任一项定义。

实施方案69.实施方案67或68的组合物的用途，其中所述极性非质子溶剂由实施方案36或41至47中的任一项定义。

实施方案70.实施方案67至69中的任一项的组合物的用途，其中所述含水组合物由实施方案37至40或48至62中的任一项定义。

实施方案71.一种用于执行杂交测定的试剂盒，包括：

-实施方案63-66中任一项的第一含水组合物；和

-包含至少一种核酸序列的第二含水组合物。

实施方案72.实施方案71的试剂盒，其中所述第二含水组合物还包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种变性剂。

实施方案73.实施方案72的试剂盒，其中所述第二含水组合物中的变性剂是极性非质子溶剂。

实施方案74.实施方案73的试剂盒，其中所述第二含水组合物中的极性非质子溶剂的浓度由实施方案32至35中任一项定义。

实施方案75.实施方案73或74的试剂盒，其中所述第二含水组合物中的极性非质子溶剂由实施方案36或41至47中任一项定义。

实施方案76.实施方案71到75中任一项的试剂盒，其中所述第二含水组合物由实施方案37至40或48至62中任一项定义。

Claims

1.一种杂交核酸序列的方法，包括：

其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)。

2.一种杂交核酸序列的方法，包括：

其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)。

3.一种杂交核酸序列的方法，包括：

其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)。

4.实施方案1或2的方法，其中所述第二含水组合物中的变性剂是极性非质子溶剂。

5.实施方案1至4中任一项的方法，其中所述第一核酸序列在生物样品中。

6.实施方案5的方法，其中所述生物样品是细胞学或组织学样品。

7.实施方案1-6中任一项的方法，其中所述第一核酸序列是单链序列，所述第二核酸序列是双链序列。

8.实施方案1-6中任一项的方法，其中所述第一核酸序列是双链序列，所述第二核酸序列是单链序列。

9.实施方案1-6中任一项的方法，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列都是双链序列。

10.实施方案1-6中任一项的方法，其中所述第一核酸序列和第二核酸序列都是单链序列。

11.实施方案1-10中任一项的方法，其中提供足够量的能量以使所述第一核酸和第二核酸杂交。

12.实施方案1-11中任一项的方法，其中提供足够量的能量以使所述第一核酸变性。

13.实施方案1-12中任一项的方法，其中提供足够量的能量以使所述第二核酸变性。

14.实施方案11-13的方法，其中通过加热所述组合物来提供能量。

15.实施方案14的方法，其中通过使用微波、热浴、加热板、加热线、珀耳帖元件、感应加热或加热灯来执行所述加热步骤。

16.实施方案12-15中任一项的方法，其中用于使所述第一核酸变性的温度为70℃至85℃。

17.实施方案12-16中任一项的方法，其中用于使所述第二核酸变性的温度为70℃至85℃。

18.实施方案12-15中任一项的方法，其中用于使所述第一核酸变性的温度是60℃至75℃。

19.实施方案12-15或18中任一项的方法，其中用于使所述第二核酸变性的温度是60℃至75℃。

20.实施方案12-15中任一项的方法，其中用于使所述第一核酸变性的温度是62℃、67℃、72℃或82℃。

21.实施方案12-15或20中任一项的方法，其中用于使所述第二核酸变性的温度是62℃、67℃、72℃或82℃。

22.实施方案1-21中任一项的方法，其中提供足够量的时间以使所述第一核酸变性。

23.实施方案1-22中任一项的方法，其中提供足够量的时间以使所述第二核酸变性。

24.实施方案22或23的方法，其中所述时间是1分钟、2分钟、3分钟、4分钟、5分钟、10分钟、15分钟或30分钟。

25.实施方案1-24中任一项的方法，其中所述杂交步骤包括加热和冷却所述组合物的步骤。

26.实施方案1-25中任一项的方法，其中所述杂交步骤需要不到8小时。

27.实施方案的方法26，其中所述杂交步骤需要不到1小时。

28.实施方案27的方法，其中所述杂交步骤需要不到30分钟。

29.实施方案28的方法，其中所述杂交步骤需要不到15分钟。

30.实施方案29的方法，其中所述杂交步骤需要不到5分钟。

31.实施方案1-30中任一项的方法，还包括封闭步骤。

32.实施方案1-31中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂浓度以体积计为1％至95％。

33.实施方案32的方法，其中所述极性非质子溶剂的浓度以体积计为5％至10％。

34.实施方案32的方法，其中所述极性非质子溶剂的浓度以体积计为10％至20％。

35.实施方案32的方法，其中所述极性非质子溶剂的浓度以体积计为20％至30％。

36.实施方案1-35中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂是无毒的。

37.实施方案1-36中任一项的方法，前提条件是所述含水组合物不包含甲酰胺。

38.实施方案1-36中任一项的方法，前提条件是所述含水组合物含有少于10％甲酰胺。

39.实施方案38的方法，前提条件是所述含水组合物含有少于2％甲酰胺。

40.实施方案39的方法，前提条件是所述含水组合物含有少于1％甲酰胺。

41.实施方案1-40中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂具有内酯、砜、腈、亚硫酸和/或碳酸官能团。

42.实施方案1-41中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂的分散溶度参数范围为17.7至22.0MPa^1/2，极性溶度参数范围为13至23MPa^1/2，氢键溶度参数范围为3至13MPa^1/2。

43.实施方案1-42中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂具有环状基本结构。

44.实施方案1-43中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂选自：

其中X是O，R1是烷二基，和

其中X是任选的，如果存在则选自O或S；

其中Z是任选的，如果存在则选自O或S；

其中A和B独立地为O或N或S或烷二基的部分或伯胺，

其中R为烷二基，和

其中Y为O或S或C。

45.实施方案1-44中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂选自：乙酰苯胺、乙腈、N-乙酰基吡咯烷酮、4-氨基吡啶、苯甲酰胺、苯并咪唑、1，2，3-苯并三唑、二氧化丁二烯、碳酸2，3-丁二醇酯、γ-丁内酯、己内酯(ε)、氯马来酸酐、2-氯环己酮、碳酸氯代乙二醇酯、氯硝甲烷、柠康酸酐、巴豆酸内酯、5-氰基-2-硫尿嘧啶、环丙腈、硫酸二甲酯、二甲砜、1，3-二甲基-5-四唑、1，5-二甲基四唑、1，2-二硝基苯、2，4-二硝基甲苯、二苯砜、1，2-二硝基苯、2，4-二硝基甲苯、二苯砜、ε-己内酰胺、乙磺酰氯、亚膦酸二乙酯、N-乙基四唑、碳酸亚乙酯、三硫代碳酸亚乙酯、硫酸乙二醇酯、亚硫酸乙二醇酯、糠醛、2-呋喃甲腈、2-咪唑、靛红、异噁唑、丙二腈、4-甲氧基苄腈、1-甲氧基-2-硝基苯、α-溴代特窗酸甲酯、1-甲基咪唑、N-甲基咪唑、3-甲基异噁唑、N-甲基吗啉-N-氧化物、苯甲砜、N-甲基吡咯烷酮、甲基环丁砜、4-甲苯磺酸甲酯、3-硝基苯胺、硝基苯并咪唑、2-硝基呋喃、1-亚硝基-2-吡咯烷酮、2-硝基噻吩、2-噁唑烷酮、9，10-菲醌、N-苯基悉尼酮、邻苯二甲酸酐、皮考啉腈(2-氰基吡啶)、1，3-丙磺酸内酯、-丙醇酸内酯、碳酸异丙二醇酯、4H-吡喃-4-硫酮、4H-吡喃-4-酮(γ-吡喃酮)、哒嗪、2-吡咯烷酮、糖精、琥珀腈、对氨基苯磺酰胺、环丁砜、2，2，6，6-四氯环己酮、四氢噻喃氧化物、四亚甲基砜(环丁砜)、噻唑、2-硫尿嘧啶、3，3，3-三氯丙烯、1，1，2-三氯丙烯、1，2，3-三氯丙烯、硫杂环丁烷-二氧化物和硫杂环丁烷。

46.实施方案1-44中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂选自：

47.实施方案1-44中任一项的方法，其中所述含水组合物中的极性非质子溶剂是：

48.实施方案1-47中任一项的方法，其中所述含水组合物还包括至少一种选自以下的额外组分：缓冲剂、盐、促进剂、螯合剂、去垢剂和封闭剂。

49.实施方案48的方法，其中所述促进剂是硫酸葡聚糖，所述盐是氯化钠和/或磷酸盐缓冲液。

50.实施方案49的方法，其中所述硫酸葡聚糖存在的浓度是5％至40％，所述氯化钠存在的浓度是0mM至1200mM，和/或所述磷酸盐缓冲液存在的浓度是0mM至50mM。

51.实施方案50的方法，其中所述硫酸葡聚糖存在的浓度是10％至30％，所述氯化钠存在的浓度是300mM至600mM，和/或所述磷酸盐缓冲液存在的浓度是5mM至20mM。

52.实施方案48的方法，其中所述促进剂选自：甲酰胺、DMSO、甘油、丙二醇、1，2-丙二醇、二甘醇、乙二醇、二醇和1，3丙二醇，所述缓冲剂是柠檬酸缓冲剂。

53.实施方案52的方法，其中所述甲酰胺存在的浓度是0.1-5％，所述DMSO存在的浓度是0.01％至10％，所述甘油、丙二醇、1，2-丙二醇、二甘醇、乙二醇、二醇和1，3丙二醇存在的浓度是0.1％至10％，所述柠檬酸缓冲剂存在的浓度是1mM至50mM。

54.实施方案48的方法，其中所述封闭剂选自：人类总DNA、鲱鱼精子DNA、鲑鱼精子DNA和小牛胸腺DNA。

55.实施方案54的方法，其中所述人类总DNA、鲱鱼精子DNA、鲑鱼精子DNA和小牛胸腺DNA存在的浓度是0.01至10μg/μL。

56.实施方案48的方法，其中所述含水组合物包括40％的至少一种极性非质子溶剂、10％的硫酸葡聚糖、300mM的氯化钠和/或5mM的磷酸盐缓冲液。

57.实施方案48的方法，其中所述含水组合物包括15％的至少一种极性非质子溶剂、20％的硫酸葡聚糖、600mM的氯化钠和/或10mM的磷酸盐缓冲液。

58.实施方案48的方法，其中所述含水组合物包括15％的至少一种极性非质子溶剂、20％的硫酸葡聚糖、600mM的氯化钠、和10mM的柠檬酸缓冲剂，pH 6.2。

59.实施方案1-58中任一项的方法，其中所述含水组合物在室温下包含一相。

60.实施方案1-58中任一项的方法，其中所述含水组合物在室温下包含多相。

61.实施方案60的方法，其中所述含水组合物在室温下包含两相。

62.实施方案60或61的方法，其中所述含水组合物的各相混合在一起。

63.一种含水组合物，其用于在杂交应用中执行靶标的单独变性，所述组合物包括足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂，其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜(DMSO)。

64.实施方案63的含水组合物，其中所述极性非质子溶剂的浓度由实施方案32至35中任一项定义。

65.实施方案63或64的含水组合物，其中所述极性非质子溶剂由实施方案36或41至47中任一项定义。

66.实施方案61至65中任一项的含水组合物，其中所述含水组合物由实施方案37至40或48至62中任一项定义。

67.一种组合物的用途，所述组合物包括以体积计在1至95％之间的至少一种极性非质子溶剂，用于在杂交应用中执行靶标的单独变性。

68.实施方案67的组合物的用途，其中所述极性非质子溶剂的浓度由实施方案32至35中的任一项定义。

69.实施方案67或68的组合物的用途，其中所述极性非质子溶剂由实施方案36或41至47中的任一项定义。

70.实施方案67至69中的任一项的组合物的用途，其中所述含水组合物由实施方案37至40或48至62中的任一项定义。

71.一种用于执行杂交测定的试剂盒，包括：

-实施方案63-66中任一项的第一含水组合物；和

-包含至少一种核酸序列的第二含水组合物。

72.实施方案71的试剂盒，其中所述第二含水组合物还包含足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种变性剂。

73.实施方案72的试剂盒，其中所述第二含水组合物中的变性剂是极性非质子溶剂。

74.实施方案73的试剂盒，其中所述第二含水组合物中的极性非质子溶剂的浓度由实施方案32至35中任一项定义。

75.实施方案73或74的试剂盒，其中所述第二含水组合物中的极性非质子溶剂由实施方案36或41至47中任一项定义。

76.实施方案71到75中任一项的试剂盒，其中所述第二含水组合物由实施方案37至40或48至62中任一项定义。