CN114561449B - 一种免预杂交的Northern blot杂交液及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种免预杂交的Northernblot杂交液及其应用，该免预杂交的Northernblot杂交液的pH值为7.4，包括如下终浓度的组分：5×SSC、20mMNa2HPO4、质量百分比为7％的SDS、质量百分比为0.02％的聚乙烯吡咯烷酮、质量百分比为0.02％的聚蔗糖400、质量百分比为0.02％的BSA、质量百分比为0.5％的吐温‑20；所述5×SSC含有0.75M的NaCl和0.075M的柠檬酸钠。采用本发明的Northernblot杂交液，无需进行杂交液与膜的预杂交步骤，即可直接将探针加入到杂交液中，使探针与尼龙膜上RNA进行杂交，减少实验步骤和时间。

Description

一种免预杂交的Northern blot杂交液及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种免预杂交的Northern blot杂交液及其应用。
背景技术
Northern blot是主要用于检测基因mRNA表达水平变化的重要手段之一。相较于其他检测基因表达方法(如QPCR、基因芯片、RNA酶保护实验等)，Northern blot具有灵敏度高、特异性强及假阳性低等特点，使得Northern blot实验被认为检测基因相对表达的最真实可靠的实验方法。Northern blot实验过程中，将探针与带有RNA的膜进行杂交是必不可少的实验步骤，但是目前无论是购买的杂交液还是公开的杂交液配方，在进行探针与膜杂交前均需要杂交液与膜进行预杂交，预杂交步骤需要0.5-4小时不等，严重增加了实验的时长，耗费实验人员的精力。因此，研发一种免预杂交的Northern blot杂交液具有重要意义。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种免预杂交的Northernblot杂交液及其使用方法。
本发明第一方面提供一种免预杂交的Northern blot杂交液，所述Northern blot杂交液的pH值为7.4，包括如下终浓度的组分：5×SSC、20mMNa2HPO4、质量百分比为7％的SDS、质量百分比为0.02％的聚乙烯吡咯烷酮、质量百分比为0.02％的聚蔗糖400、质量百分比为0.02％的BSA和质量百分比为0.5％的吐温-20；
所述5×SSC含有0.75M的NaCl和0.075M的柠檬酸钠。
本发明第二方面提供所述免预杂交的Northern blot杂交液的配置方法，所述配置方法包括：先用无菌水溶解Na2HPO4，调节pH值为7.4后，再分别加入其他组分充分溶解，即得。
进一步地，所述配置方法包括：先用200mL无菌水溶解2.84gNa2HPO4，经磷酸盐调pH值为7.4后，再分别加入250mL20×SSC、70gSDS、0.2g聚乙烯吡咯烷酮、0.2g聚蔗糖400、0.2gBSA和5mL吐温-20，充分溶解后，定容至1L，即得；
所述20×SSC的pH值为7.4，含有3M的NaCl和0.3M的柠檬酸钠。
本发明第三方面提供一种用于制备免预杂交的Northern blot杂交液的试剂盒，所述试剂盒包括：20×SSC、Na2HPO4、SDS、聚乙烯吡咯烷酮、聚蔗糖400、BSA和质量百分比为100％的吐温-20；
所述20×SSC的pH值为7.4，含有3M的NaCl和0.3M的柠檬酸钠。
本发明第四方面提供所述免预杂交的Northern blot杂交液或所述试剂盒在Northern blot中的应用。
本发明第五方面提供Northern blot中探针与RNA杂交的方法，包括：将探针和所述免预杂交的Northern blot杂交液加入到交联RNA的尼龙膜中，使探针与尼龙膜上RNA进行杂交。
进一步地，所述杂交的温度为50℃，杂交的时间为3-16h。
进一步地，所述杂交的时间为10-16h。
进一步地，所述探针与免预杂交的Northern blot杂交液的体积比为1ul：1mL。
本发明的有益效果为：
1.采用本发明的Northern blot杂交液，无需进行杂交液与尼龙膜的预杂交步骤，即可直接将探针加入到杂交液中，使探针与尼龙膜上RNA进行杂交，减少实验步骤，节省实验时间。
2.采用本发明的Northern blot杂交液，无论是否进行预杂交，进行3个小时的杂交即可很好地促使探针与RNA结合。
附图说明
图1为以U6为探针的不同处理方式杂交15h放射自显影结果。1#和2#为实施例1杂交液，3#为SGIMA杂交液；1#为未预杂交，2#和3#为预杂交30min。
图2为以U6为探针的不同处理方式杂交3h放射自显影结果。4#和5#为实施例1杂交液；4#为未预杂交，5#为预杂交30min。
具体实施方式
为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例1
按照表1 Northern blot杂交液的最优配方配制杂交液。
表1 Northern blot杂交液最优配方(pH7.4，1L)
Figure BDA0003524136420000031
试剂配制说明：
1.20×SSC：将175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠·2H2O溶解于800mL的去离子水中，调节pH值至7.4后，加去离子水定容至1L，高温高压灭菌后，室温保存。
2.Northern blot杂交液：先用200mL无菌水溶解Na2HPO4，经磷酸盐调pH值为7.4后，再分别加入其他对应量取的试剂充分溶解后，定容至1L。
3.Northern blot杂交液配好后，用前可于65℃温浴溶解沉淀，可长期保存室温或65℃。
实施例2
利用U6作为探针，采用实施例1杂交液进行实验验证。采用Trizol法从拟南芥中提取总RNA、将样品RNA变性后，加入变性胶进行电泳，再进行转膜和交联、进行不同杂交处理(见表2实验设计)、洗膜、生物素标记、洗膜、最后放射性自显影检测。
不同杂交处理设计：本实验共设计5组为1#、2#、3#、4#、5#，每组均上样为10ug、5ug、1ug总变性RNA。
不同杂交处理时杂交温度为50℃。
不同杂交处理时，U6探针(0.25μM)与杂交液的体积比为1ul：1mL。
表2实施例2实验方案设计
Figure BDA0003524136420000032
结果表明，采用本发明杂交液可以达到与SIGMA杂交液同样的效果，且不进行预杂交步骤亦可得到同样的效果(见附图1)。采用本发明杂交液，无论是否进行预杂交，进行3个小时的杂交即可很好地促使探针与RNA结合(见附图2)，随着杂交的时间增加，效果会更好。以上结果表明，本发明杂交液可以省略预杂交步骤，实现探针与RNA的结合。
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

Claims (9)

1.一种免预杂交的Northern blot杂交液，其特征在于，所述Northern blot杂交液的pH值为7.4，由如下终浓度的组分组成：5×SSC、20 mM Na2HPO4、质量百分比为7%的SDS、质量百分比为0.02%的聚乙烯吡咯烷酮、质量百分比为0.02%的聚蔗糖400、质量百分比为0.02%的BSA、和质量百分比为0.5%的吐温-20；
所述5×SSC含有0.75 M的NaCl和0.075 M的柠檬酸钠。
2.权利要求1所述免预杂交的Northern blot杂交液的配置方法，其特征在于，所述配置方法包括：先用无菌水溶解Na2HPO4，调节pH值为7.4后，再分别加入其他组分充分溶解，即得。
3.根据权利要求2所述的配置方法，其特征在于，所述配置方法包括：先用200 mL无菌水溶解2.84 g Na2HPO4，经磷酸盐调pH值为7.4后，再分别加入250 mL 20×SSC、70 g SDS、0.2 g聚乙烯吡咯烷酮、0.2 g聚蔗糖400、0.2 g BSA、和5 mL吐温-20，充分溶解后，定容至1L，即得；
所述20×SSC的pH值为7.4，含有3 M的NaCl和0.3 M的柠檬酸钠。
4.一种用于制备免预杂交的Northern blot杂交液的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的免预杂交的Northern blot杂交液。
5.权利要求1所述免预杂交的Northern blot杂交液或权利要求4所述试剂盒在Northern blot中的应用，其特征在于，在进行Northern blot时，无需进行预杂交步骤。
6.Northern blot中探针与RNA杂交的方法，其特征在于，包括：将探针和权利要求1所述免预杂交的Northern blot杂交液加入到交联RNA的尼龙膜中，使探针与尼龙膜上RNA进行杂交。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述杂交的温度为50 ℃，杂交的时间为3-16 h。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述杂交的时间为10-16 h。
9.根据权利要求6-8任一项所述的方法，其特征在于，所述探针与免预杂交的Northernblot杂交液的体积比为1 ul：1 mL。
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