CN104711369A

CN104711369A - 高致病性猪蓝耳病病毒的检测引物、探针及检测方法

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Publication number: CN104711369A
Application number: CN201310684967.1A
Authority: CN
Inventors: 苟德明; 张利; 康康
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2013-12-13
Filing date: 2013-12-13
Publication date: 2015-06-17
Anticipated expiration: 2033-12-13
Also published as: CN104711369B

Abstract

本发明公开了一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测引物、探针及检测方法，是将血清样本直接加至包括检测引物和探针的荧光定量RT-PCR反应体系中，进行RT-PCR，结束后检测是否含有高致病性猪蓝耳病病毒。本发明方法实现了在一个PCR管中连续、自动进行病毒RNA的释放、反转录和荧光定量PCR检测；从得到病毒血清样本到获得检测结果只需要1.5个小时；灵敏性、准确性可与传统RT-PCR相媲美；克服了传统RT-PCR需要提取RNA这一繁琐步骤的不足，减少操作步骤，提高检测速度，节省成本，有效避免交叉污染，能进行高致病性猪蓝耳病病毒的高通量检测，对快速发现高致病性猪蓝耳病疫情，及时制定防控措施具有重要的意义。

Description

高致病性猪蓝耳病病毒的检测引物、探针及检测方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)的检测引物、探针及检测方法。

背景技术

猪蓝耳病病毒(PRRSV)是单链RNA病毒，基因组全长15kb，属于动脉炎病毒科动脉炎病毒属。猪蓝耳病又称“猪繁殖与呼吸综合症”，该病毒可引起成年猪繁殖障碍、流产和死胎，以及仔猪呼吸异常，是一种高度传染性疾病。1987年猪蓝耳病首次在北美发现，现已席卷全球，成为危害性最大的猪传染性疾病之一。猪蓝耳病病毒可以分为两种基因型，即以VR-2332株为代表的美洲型毒株和以Lelystad virus(LV)代表的欧洲型毒株。高致病性猪蓝耳病是由高致病性猪蓝耳病病毒(Highly Pathogenic Porcine Reproductive and Respiratory SyndromeVirus,HP-PRRSV)引起的一种急性高致死性传染病，于2006年在中国首次发现；发现的当年在中国感染了200万头猪，死亡率达到20%。序列分析表明，HP-PRRSV在非结构蛋白2（NSP2）编码区内存在一段不连续的30个氨基酸的缺失。

目前，检测猪蓝耳病病毒的方法包括病毒的分离和培养，酶联免疫吸附(ELISA)等，但这些方法在灵敏性和特异性方面仍存在一定不足。反转录PCR(RT-PCR)技术由于灵敏性和特异性较高，已经成为猪蓝耳病检测的常用方法。但常规RT-PCR需要进行后续电泳鉴定，易发生交叉污染而产生假阳性，且操作耗时较长。相比之下，荧光定量PCR技术（real-time RT-PCR）具有更高的灵敏性，且无需PCR后续处理，能有效避免交叉污染并提高检测效率。

然而，目前基于RT-PCR检测蓝耳病的方法都要进行病毒RNA提取，然后以RNA为模板进行检测；这一RNA提取步骤无疑大大增加了检测工作量、时间和成本，难以实现高通量检测；此外，提取RNA的过程仍容易发生RNA降解或交叉污染等事件；且对于痕量样本，提取RNA仍存在较大困难。

因此，现有的基于RT-PCR检测蓝耳病的方法还有待于改进和发展。

发明内容

基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种新的高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法，以及该检测方法所使用的引物和探针。

为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：

一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测引物，所述检测引物如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示。

一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测探针，所述检测探针如SEQ ID No:3所示。

一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法，使用上述检测引物和检测探针进行检测，包括以下步骤：

将血清样本直接加至荧光定量RT-PCR反应体系中，进行荧光定量RT-PCR，反应结束后检测PCR产物中是否含有高致病性猪蓝耳病病毒；其中，

所述荧光定量RT-PCR反应体系为：

所述荧光定量RT-PCR的反应程序为：55±1℃反应30min，95℃反应5min;94℃变性30s，60±1℃退火/延伸40s，反应35～45个循环。

在其中一个实施例中，所述RT-PCR反应体系为：

在其中一个实施例中，所述荧光定量RT-PCR的反应程序为：55℃反应30min，95℃反应5min;94℃变性30s，60℃退火/延伸40s，反应40个循环。

本发明提供了一种无需提取病毒RNA就能直接用检测血清中高致病性猪蓝耳病病毒的直扩RT-PCR方法。该直扩RT-PCR技术由于具有以下几点特别之处而实现了无需从血清中提取病毒RNA的目的，从而有效克服了传统RT-PCR技术需要提取RNA而带来的操作繁琐、提取困难、交叉感染、容易降解等诸多难题：

1、本发明使用了一种高耐受性DNA聚合酶

在原始生物样本中，往往含有大量抑制PCR的物质，比如全血（或血清、血浆）中含有大量免疫球蛋白、血红蛋白、亚铁血红素等；土壤中含有较多腐殖酸，牛奶中含有较多乳铁蛋白等。这些物质会强烈抑制DNA聚合酶的活性，使PCR失效，这是传统RT-PCR技术必须提取病毒RNA的重要原因。本发明直扩RT-PCR方法使用高耐受DNA聚合酶，该酶通过基因工程手段对DNA聚合酶的编码序列进行改造，将第708位的谷氨酸突变为赖氨酸（E708K）或谷氨酰胺（E708Q），使得突变酶能够耐受高达20%的全血、0.2～0.4μg/ml腐殖酸，或2.6～5.2mM乳铁蛋白。

2、本发明使用了一种PCR增强剂

该PCR增强剂由肉碱（L-carnitine）、海藻糖（D-(+)-trehalose）、非离子去污剂NP-40组成，既能提高高GC含量基因的扩增效率，又能增加反应体系对PCR抑制物质的耐受性。此外，某些抑制物质（如血红蛋白）会造成荧光定量PCR的荧光淬灭，这是传统RT-PCR技术必须提取病毒RNA进行检测的另一重要原因。而PCR增强剂，能够有效降低抑制物质的荧光淬灭效应。因此，本发明的直扩RT-PCR方法能使用染料法或探针法，进行病毒RNA的实时荧光定量PCR检测。

此外，要成功实现直扩RT-PCR，病毒RNA的有效释放及反转录成cDNA是又一重要影响因素。本发明发明人经过大量摸索，发现在55℃反应30min，可实现一步病毒RNA释放及反转录，既避免通过高温变性病毒外壳蛋白这一剧烈操作，又大大缩短操作时间和简化步骤，进一步提高了检测速度。PCR增强剂中含有非离子去污剂NP-40，这有助于裂解病毒外壳来释放RNA。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明的高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法直接将血清加入反应体系，在一个PCR管中连续、自动实现病毒RNA的释放、反转录（RT）和荧光定量PCR检测；实现了无需提取病毒RNA、直接从血清中检测高致病性猪蓝耳病病毒的目的，从得到病毒血清样本到获得检测结果只需要1.5个小时；有效克服了传统RT-PCR需要提取RNA的不足，能大大减少操作步骤，大幅度提高检测速度，节省成本，有效避免交叉污染；

2、本发明的高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法的灵敏性不低于传统RT-PCR，甚至在低浓度血清的情况下灵敏性高于传统RT-PCR；

3、本发明的高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法能进行病毒的高通量检测，对于快速发现高致病性猪蓝耳病疫情，及时制定防控措施具有重要而深远的意义。

附图说明

图1为本发明实施例1中检测高致病性猪蓝耳病病毒的直扩RT-PCR方法扩增HP-PRRSV产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；其中泳道1为核酸分子Marker；泳道2为从HP-PRRSV血清中纯化的RNA；泳道3为HP-PRRSV阳性血清；泳道4为HP-PRRSV阴性血清；

图2为本发明实施例2中对检测高致病性猪蓝耳病病毒的直扩RT-PCR方法与提取RNA的传统RT-PCR的灵敏性比较图；

图3为本发明实施例3中检测高致病性猪蓝耳病病毒的直扩RT-PCR方法对不同浓度血清（5～25%）的耐受能力图；其中A为直扩RT-PCR方法检测HP-PRRSV的Ct值；B为直扩RT-PCR方法扩增HP-PRRSV产物的琼脂糖凝胶电泳图谱；

图4为本发明实施例4中采用直扩RT-PCR方法检测高致病性猪蓝耳病病毒(HP-PRRSV)的动态范围及线性度。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

以下实施例中涉及的实验材料如下：

1.病毒血清：来自湖北省农业科学院畜牧兽医研究所144份血清样本。

2.试剂：Direct One-step S/P qRT-PCR TaqProbe Kits(VitaNavi Technology),QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN).

3.仪器：荧光定量PCR仪（StepOne Plus,ABI），冷冻离心机（5804R,Eppendorf），核酸电泳仪（EPS-100,上海天能），凝胶成像系统（Dolphin-Doc,WEALTEC）。

如无特殊说明，以下实施例中所采用的操作均为本领域技术人员所熟知的常规操作。

实施例1高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法(直扩RT-PCR方法)

1、特异引物和探针的设计

高致病性蓝耳病病毒HP-PRRSV在非结构蛋白2(NSP2)编码区存在一段不连续的30个氨基酸的缺失，据此设计特异引物和探针：在该缺失区域的两端分别设计上下游引物；并设计一条Taqman探针，使其跨越氨基酸缺失区域的两端侧翼序列。

上游引物(dHP-PRRSV-F)的序列为：

5’-GGTCGGCACCAGTTCCTG-3’(SEQ ID No:1)，

下游引物(dHP-PRRSV-R)的序列为：

5’-AAATCCAGAGGCTCATCCTGG-3’(SEQ ID No:2)，

Taqman探针(dHP-PRRSV-pro)的序列为：

5’-FAM-CGCGTAGAACTGTGACAACAACGCTGACG-BHQ1-3’(SEQ ID No:3)。

2、直扩RT-PCR反应体系的摸索

在25μl反应体系中包含2×S/P qRT-PCR buffer mix(VitaNavi Technology),SP RT/PCR enzyme mix(VitaNavi Technology)，上游引物(dHP-PRRSV-F)，下游引物(dHP-PRRSV-R)，Taqman探针，适量的血清样本。其中，2×S/P qRT-PCRbuffer mix包含PCR增强剂、dNTP、Mg²⁺等，SP RT/PCR enzyme mix中包含反转录酶和高耐受性Taq DNA聚合酶。对一系列参数进行摸索，包括引物浓度（0.2～0.4μM）、探针浓度（0.2～0.4μM），enzyme mix的用量（0.75～1.50μl/25μl）。设置阳性对照和阴性对照；其中阳性对照使用1μl HP-PRRSV RNA为模板（100μl HP-PRRSV血清用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)来提取，用100μlRNase-free水来洗脱RNA）；阴性对照用1μl HP-PRRSV阴性血清为模板。每种样本（包括阴性、阳性对照）各3个重复。

经过摸索，确定了直扩RT-PCR的反应体系。在25μl反应体系中包含12.5±0.25μl2×S/P qRT-PCR buffer mix(VitaNavi Technology),1.25μl SP RT/PCRenzyme mix(VitaNavi Technology)，0.3±0.1μM上游引物(dHP-PRRSV-F，SEQID No:1)，0.3±0.1μM下游引物(dHP-PRRSV-R，SEQ ID No:2)，0.2±0.1μMTaqman探针(SEQ ID No:3)，1.25～5μl血清，其余为去离子水。

最优的直扩RT-PCR反应体系为：在25μl反应体系中包含12.5μl2×S/PqRT-PCR buffer mix(VitaNavi Technology),1.25μl SP RT/PCR enzyme mix(VitaNavi Technology)，0.3μM上游引物(dHP-PRRSV-F)，0.3μM下游引物(dHP-PRRSV-R)，0.2μM Taqman探针，1.25～5μl血清，其余为去离子水。

3、荧光定量直扩RT-PCR反应条件的摸索

将步骤2中筛选出最优反应体系的反应管放入荧光定量PCR仪中，对系列反应条件进行摸索，包括：

（1）病毒RNA释放及反转录的温度（55～60℃）

（2）退火/延伸温度（60～65℃）、退火/延伸时间（30～120s）、PCR循环数（35～45）。

在PCR过程中，在每个循环的退火/延伸阶段收集荧光信号。

经过摸索，确定了荧光定量直扩RT-PCR的反应程序：55±1℃反应30min，95℃反应5min;94℃变性30s，60±1℃退火/延伸40s，反应35～45个循环。最优的荧光定量直扩RT-PCR反应条件为：55℃反应30min，95℃反应5min;94℃变性30s，60℃退火/延伸40s，反应40个循环；在每个循环的退火/延伸阶段收集荧光信号。

4、结果判定

采用步骤2的最优反应体系，步骤3的最优反应条件对血清样本进行直扩RT-PCR，从荧光定量PCR上获取各反应管的扩增曲线和Ct值，计算每种样本的Ct平均值。正常的检测结果应为：阴性对照无检测信号，阳性对照有检测信号，且Ct平均值<37。若待检测样本的Ct值平均值>37，重做实验。

将直扩RT-PCR的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到分子量约73bp的特异条带(如图1)，其分子量与用纯化RNA进行RT-PCR得到的结果一致，而阴性对照没有该条带。上述结果说明，直扩RT-PCR检测HP-PRRSV是准确的。

采用本实施例的直扩RT-PCR方法实现了不提取病毒RNA，直接用血清即可检测高致病性猪蓝耳病病毒。利用本发明的直扩RT-PCR方法检测高致病性猪蓝耳病病毒，从得到病毒血清样本到获得检测结果只需要1.5个小时。

实施例2实施例1的检测方法的灵敏度测试

采用步骤2的最优反应体系，步骤3的最优反应条件对血清样本进行直扩RT-PCR，从荧光定量PCR上获取各反应管的扩增曲线和Ct值，计算每种样本的Ct平均值。从图2可以看出，使用1μl纯化的HP-PRRSV RNA为模板，荧光定量PCR的Ct值是27.13，而采用实施例1的直扩RT-PCR从1μl HP-PRRSV血清中检测到的Ct值是26.02，该结果说明本发明的直扩RT-PCR方法检测HP-PRRSV的灵敏性能够跟传统的以纯化RNA为模板的RT-PCR法相媲美，甚至是传统RT-PCR灵敏性的2倍。

实施例3实施例1的检测方法的血清耐受能力测试

按照实施例1步骤2的最优反应体系来配制除血清外的反应液；将1μlHP-PRRSV阳性血清，用不含HP-PRRSV的阴性血清分别稀释至1.25,2.5,3.75,5,6.25μl，然后分别加入反应管中，使各管中的HP-PRRSV病毒拷贝数保持一致，而血清占总体积的百分比分别为5%,10%,15%,20%,25%。将各反应管放入荧光定量PCR仪，按实施例1步骤3的最优反应条件进行反应。

结果显示，直扩RT-PCR在高达20%的血清中仍有活性，即RT-PCR的Ct值<37，图3A），且琼脂糖凝胶电泳图上有特异条带（图3B）。

实施例4实施例1的检测方法的检测动态范围及线性度

按照实施例1步骤2的最优反应体系来配制除血清外的反应液；取一份HP-PRRSV阳性血清，用不含HP-PRRSV的阴性血清进行4倍梯度稀释，得到4⁰,4^-1,4^-2,4^-3μl阳性血清样本，所有反应管维持5%的血清终浓度。分别取各种稀释度的血清1μl加入反应管，置于荧光定量PCR仪，按实施例1步骤3的最优反应条件进行反应。

结果表明，64倍稀释的血清仍得到阳性检测信号（图4）；稀释倍数和Ct值之间的相关系数为0.959，表明线性关系较好。

实施例5实施例1的检测方法的高通量检测

将收集的144份样本，用实施例1的检测方法(直扩RT-PCR法)在96孔荧光定量PCR仪上进行检测，3个小时左右完成了全部样本的检测。在这些样本中，有94份是HP-PRRSV阳性，占65.3%；其余50份为阴性样本，占34.7%。上述结果与采用传统RT-PCR方法检测得到的数据完全一致（参见Yang K,Gene,2013），证明了本发明的检测方法(直扩RT-PCR)检测高致病性蓝耳病病毒的准确性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims

1.一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测引物，其特征在于，所述检测引物如SEQ ID No:1和SEQ ID No:2所示。

2.一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测探针，其特征在于，所述检测探针如SEQ ID No:3所示。

3.一种高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法，其特征在于，使用权利要求1所述的检测引物和权利要求2所述的检测探针，包括以下步骤：

所述荧光定量RT-PCR反应体系为：

4.根据权利要求3所述的高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法，其特征在于，所述荧光定量RT-PCR反应体系为：

5.根据权利要求3所述的高致病性猪蓝耳病病毒的检测方法，其特征在于，所述荧光定量RT-PCR的反应程序为：55℃反应30min，95℃反应5min;94℃变性30s，60℃退火/延伸40s，反应40个循环。