DE60215635T2

DE60215635T2 - Inhibitoren zur Inhibierung unspezifischer Hybridisierung, klinische Diagnosereagenzien und ein Verfahren zur klinischen Analyse

Info

Publication number: DE60215635T2
Application number: DE60215635T
Authority: DE
Inventors: Shujiro Tsukuba-shi SAKAKI; Kenshiro Shuto; Mamoru Noda-shi TSUCHIDA; Yoshihiro Hannou-shi ASHIHARA; Mitsuo Kawagoe-shi ISOMURA
Original assignee: NOF Corp
Current assignee: NOF Corp
Priority date: 2001-04-26
Filing date: 2002-04-25
Publication date: 2009-07-09
Anticipated expiration: 2022-04-26
Also published as: DE60215635D1; WO2002088389A1; US8252531B2; EP1391519B1; CN1547615A; US20040219546A1; EP1391519A1; CN1281762C; EP1391519A4

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Inhibitoren zur Inhibierung unspezifischer Hybridisierung beim Detektieren einer Ziel-Nucleinsäuresubstanz in einer Probe auf dem Gebiet der klinischen Analyse und dergleichen, klinische Diagnosereagenzien, die den Inhibitor enthalten, und ein Verfahren zur klinischen Analyse, bei dem der Inhibitor verwendet wird.
Auf dem Fachgebiet der klinischen Analyse wird die Detektion von Nucleinsäuresubstanzen wie DNAs und RNAs durch Hybridisierung bewerkstelligt. Dieses Verfahren umfasst das Inkontaktbringen einer markierten Probe mit einer Feststoffphase, auf der eine DNA oder dergleichen einer Sequenz, die zu der Ziel-Nucleinsäuresubstanz komplementär ist, fixiert ist, Wegwaschen anderen Materials als der Ziel-Nucleinsäuresubstanz und Messen der Aktivität des an die Feststoffphase gebundenen markierten Materials.
Auf dem Gebiet der klinischen Analyse ist es erforderlich, dass die Sequenz der Nucleinsäuresubstanz ("nucleic substance") durch Detektieren einer Ziel-Nucleinsäuresubstanz mittels Hybridisierung genau erkannt wird.
Bei der Bewertung einer Probe durch Hybridisierung ist es üblicherweise und weithin bekannt, oberflächenaktive Agenzien, z. B. Natriumdodecylsulfat (als SDS abgekürzt) oder N-Lauroylsarcocin (als N-LS abgekürzt); oder Proteine, z. B. Rinderserumalbumin (als BSA abgekürzt) oder Casein, zur Inhibierung unspezifischer Hybridisierung zuzusetzen. Jedoch haben derartige oberflächenaktive Agenzien und Proteine wenig unspezifische Hybridisierung-hemmende Wirkung, so dass die Sequenz der Nucleinsäuresubstanz nicht genau erkannt werden kann.
Patrick et al. (Nature Biotechnology, 17, 365–370 (1999)) schlagen vor, die Bindung von SNPs einer DNA zu hemmen bzw. zu inhibieren, indem ein elektrischer Strom an die Oberfläche eines DNA-Chips angelegt wird. Dieses Verfahren erfordert jedoch bestimmte DNA-Chips und kann nicht auf jeden bestehenden DNA-Chip angewandt werden.
Andererseits werden Polymere mit einer Phosphorylcholinartigen Gruppe auf ihre mögliche Verwendung auf dem Gebiet der klinischen Analyse untersucht. Es ist bekannt, dass Polymere mit einer Phosphorylcholin-artigen Gruppe exzellente Biokompatibilitäten, z. B. Blutkompatibilität, Fähigkeit, Komplemente zu inaktiveren, und Nicht-Adsorbierbarkeit von Biomaterialien, sowie eine exzellente Anti-Fouling-Eigenschaft und Feuchtigkeitsbindungseigenschaft ("moisture holding property") haben, was an ihren Strukturen liegt, die ähnlich zu Phospholipiden sind, die von Biomembranen abstammen. Untersuchungen bzw. Forschungen und Entwicklungen bei der Synthese und Verwendung der Polymere sind aktiv durchgeführt worden, um bio-verwandte Materialien ("biorelated materials") zu entwickeln, die die meisten dieser Eigenschaften bereitstellen. JP-7-5177-A , JP-7-83923-A und JP-10-114800-A offenbaren hochgradig genaue klinische Analysetechniken, bei denen Polymere mit einer Phosphorylcholin-Gruppe Adsorption von Proteinen durch einen Behälter hemmen.
Zusätzlich zu dem Obenstehenden, offenbart EP 1 245 636 ein Polymer, das durch Umsetzen eines Acrylats, das einer Phosphorylcholin-artigen Gruppe entspricht, mit Methacrylsäure und Butylmethacrylat erhalten wird. Das aus der vorgenannten Reaktion erhaltene Polymer kann für verschiedene Kosmetika, Arzneimittel und dergleichen verwendet werden und ist in Wasser bei einer gewöhnlichen Temperatur größtenteils löslich.
Die EP 1 206 946 offenbart ein medizinisches Material, das durch Bildung eines Polymers, das eine Phosphorylcholin-Gruppierung mit einer daran gebundenen Carboxylgruppe umfasst, erhalten wird.
Polymer Journal, Band 22, Nr. 5, 1990, Seiten 335–360 offenbart die Synthese von Poly(2-methacryloxyloxyethylphosphorylcholin-co-n-butylmethacrylat), das eine Kompatibilität mit Blut aufweist. Das Polymer wird durch Umsetzung von 2-Methacryloyloxyethyl-phosphorylcholin, das sowohl eine Phosphocholin-Gruppierung als auch eine Carboxylgruppe enthält, mit n-Butylmethacrylat, einem hydrophoben Monomer, erhalten.
Journal of Virological Methods, Band 23, 1989, Seiten 105–109 offenbart ein von 2-Methacryloyloxyethylphosphorylchlorin abgeleitetes Polymer, das durch Umsetzung von 2-Methacryloyloxyethyl-phosphorylcholin mit Styrol hergestellt wird.
EP 0 580 435 und WO 98/22162 offenbaren Polymere und ihre Blutkompatibilität. EP 0 580 435 betrifft Polymere, die für ein Material für ein künstliches Organ oder ein Oberflä chenmodifiziermittel ("surface modifier") für ein hochmolekulares Material eingesetzt werden können. WO 98/22162 betrifft Verbindungen (üblicherweise Polymere), die eine zwitterionische Gruppierung und eine kationische Gruppierung umfassen, und ihre Verwendung, um Substrate zu beschichten.
EP 1 095 665 offenbart ein Polymer, das ähnlich ist zu dem, das in Polymer Journal, Band 22, Nr. 5, 1990, Seiten 335–360 offenbart ist, und als eine Wundabdeckungszubereitung ("wound covering preparations") verwendet wird.
Es ist jedoch nicht bekannt, dass die Sequenz einer Nucleinsäuresubstanz genau erkannt werden kann, d. h. unspezifische Hybridisierung kann gehemmt werden, indem bestimmte Polymere mit Phosphorylcholingruppen verwendet werden.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Inhibitor unspezifischer Hybridisierung bereitzustellen, der die Genauigkeit der Reaktion bei der Hybridisierung erhöht und unspezifische Hybridisierung hemmt.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur klinischen Analyse bereitzustellen, das ein Reagens umfasst, das unspezifische Hybridisierung während einer Hybridisierung hemmt und Detektion einer Ziel-Nucleinsäuresubstanz mit hoher Effizienz und Genauigkeit ermöglicht.
Es ist noch ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur klinischen Analyse bereitzustellen, wobei unspezifische Hybridisierung in der klinischen Analy se gehemmt wird und eine Ziel-Nucleinsäuresubstanz leicht mit hoher Genauigkeit detektiert wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Verwendung eines Polymers (H) mit einer unspezifische Hybridisierung hemmenden Wirkung als ein Inhibitor bereitgestellt, wobei das Polymer in seinem Molekül wenigstens eine der Carboxyl- und Sulfongruppen und Phosphorylcholin-artige Gruppen hat und ein gewichtsmittleres Molekulargewicht von 1.000 bis 5.000.000 hat.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird weiterhin ein Verfahren zur klinischen Analyse bereitgestellt, umfassend die Stufen:

(1) Inkontaktbringen einer Probe mit einem Testagens, das zur Hybridisierung mit einer spezifischen Nukleinsäuresubstanz in der Anwesenheit eines Inhibitors unspezifischer Hybridisierung, der ein Polymer (H) mit einer unspezifische Hybridisierung hemmenden Wirkung umfasst, fähig ist, unter besonderen Bedingungen zur Hybridisierung der spezifischen Nukleinsäuresubstanz mit dem Testagens, wobei das Polymer in seinem Molekül wenigstens eine der Carboxyl- und Sulfongruppen und Phosphorylcholin-artige Gruppen hat und ein gewichtsmittleres Molekulargewicht von 1.000 bis 5.000.000 hat, und
(2) Detektion eines durch Hybridisierung mit dem Testagens in Stufe (1) gebildeten Reaktanden.

Der erfindungsgemäße Inhibitor enthält ein Polymer (H) mit einer unspezifische Hybridisierung hemmenden Wirkung, wobei das Polymer in seinem Molekül wenigstens eine der Carboxyl- und Sulfongruppen und Phosphorylcholin-artige Gruppen (als PC-Gruppe abgekürzt) hat und ein bestimmtes gewichtsmittleres Molekulargewicht hat.
Im Polymer (H) ist das Verhältnis der wenigstens einen Carboxyl- und Sulfongruppen zu den PC-Gruppen nicht besonders beschränkt, solange das Polymer (H) die unspezifische Hybridisierung hemmende Wirkung hat und kann auf geeignete Weise, abhängig von den Arten und dem Verhältnis der Monomere, die bei der Herstellung des Polymers, das später diskutiert werden soll, verwendet werden oder dem Molekulargewicht des Polymers (H) bestimmt werden.
Das Polymer (H) kann wahlweise andere Gruppen haben, solange das Polymer (H) die essentiellen Gruppen, wie sie oben erwähnt sind, hat, das bestimmte Molekulargewicht hat und die unspezifische Hybridisierung hemmende Wirkung hat. Beispiele derartiger anderer Gruppen können verschiedene Gruppen, z. B. Phosphorsäure-, Betain-, primäre Amino-, sekundäre Amino-, tertiäre Aminogruppen, quaternäres Ammonium, Acrylamid, Methacrylamid, 4-Butanlactam(2-Pyrrolidon), 4-Butanlactim-(2-Hydroxy-1-pyrrolin), 6-Hexanlactam(ε-Caprolactam), Polyethylenoxid, Polypropylenoxid und Block- oder Random-Polymere von Polyethylenoxid und Polypropylenoxid umfassen. Die Beispiele der anderen Gruppen können auch Gruppen umfassen, die von verschiedenen hydrophoben Monomeren, die später diskutiert werden sollen, abgeleitet sind.
Der Gehalt solcher Gruppen im Polymer (H) kann in geeigneter Weise aus dem Bereich des Gehalts ausgewählt werden, der die Gegenstände der vorliegenden Erfindung nicht stören wird oder verstärken wird.
Das Molekulargewicht des Polymers (H) ist üblicherweise 1.000 bis 5.000.000, bevorzugt 10.000 bis 2.000.000, ausgedrückt durch das gewichtsmittlere Molekulargewicht. Nicht bevorzugt ist, dass das Molekulargewicht weniger als 1.000 ist, da hinreichende Inhibierung bzw. Hemmung der unspezifischen Hybridisierung schwer zu erreichen ist, und dass das Molekulargewicht über 5.000.000 ist, da die Viskosität des Polymers (H) zu hoch ist, was Hybridisierung hemmen kann.
Das Polymer (H) kann beispielsweise durch Polymerisieren eines Monomers mit einer PC-Gruppe (bezeichnet als PC-Monomer) und eines Monomers mit einer Sulfongruppe (bezeichnet als SA-Monomer) und/oder eines Monomers mit einer Carboxylgruppe (bezeichnet als CA-Monomer) und wahlweise anderen Monomeren, z. B. einem hydrophoben Monomer, nach Bedarf, durch konventionelle radikalische Polymerisation hergestellt werden. Jedes in der Polymerisation verwendete Polymer muss nicht von einer einzelnen Art sein, sondern kann auch von zwei oder mehr Arten sein.
Beispiele des PC-Monomers können Monomere umfassen, wie sie durch die Formel (1) wiedergegeben werden:
In der Formel (1) bedeutet X einen zweiwertigen organischen Rest, Y bedeutet eine Alkylenoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und Z bedeutet ein Wasserstoffatom oder R⁵O(C=O)-, wobei R⁵ eine Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet. R¹ in der Formel (1) bedeutet ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe und R², R³ und R⁴ sind dieselben oder unterschiedliche Gruppen und jede bedeutet ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. m ist 0 oder 1 und n bezeichnet eine ganze Zahl von 1 bis 4.
X in der Formel (1) kann beispielsweise -C₆H₄-, -C₆H₁₀-, -(C=O)O-, -O-, -CH₂O-, -(C=O)NH-, -O(C=O)-, -O(C=O)O-, -C₆H₄O-, -C₆H₄CH₂O- oder -C₆H₄(C=O)O- sein. Y in der Formel (1) kann beispielsweise eine Methoxy-, Ethyloxy-, Propyloxy-, Butyloxy-, Pentyloxy- oder Hexyloxygruppe sein. R⁵ in der Formel für Z kann beispielsweise eine Alkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, z. B. eine Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl-, Hexyl-, Heptyl-, Octyl-, Nonyl- oder Decylgruppe; oder eine Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen, z. B. eine Hydroxymethyl-, 2-Hydroxy-ethyl-, 3-Hydroxypropyl-, 2-Hydroxypropyl, 4-Hydroxybutyl-, 2-Hydroxybutyl-, 5-Hydroxypentyl-, 2-Hydroxypentyl-, 6-Hydroxyhexyl-, 2-Hydroxyhexyl-, 7-Hydroxyheptyl-, 2-Hydroxyheptyl, 8-Hydroxyoctyl-, 2-hydroxyoctyl-, 9-Hydroxynonyl, 2-Hydroxynonyl-, 10-Hydroxydecyl- oder 2-Hydroxydecyl-Gruppe sein.
Beispiele des PC-Monomers können umfassen:
2-((Meth)acryloyloxy)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 3-((meth)acryloyloxy)propyl-2'-(trimethyl ammonio)ethylphosphat, 4-((Meth)acryloyloxy)butyl-2'-(trimethylammonio)ethyl-phosphat, 5-((Meth)acryloyloxy)pentyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 6-((Meth)acryloyloxy)hexyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-((Meth)acryloyloxy)ethyl-2'-(triethylammonio)ethylphosphat, 2-((Meth)acryloyloxy)ethyl-2'-(tripropylammonio)ethylphosphat, 2-((Meth)acryloyloxy)ethyl-2'-(tributylammonio)ethyl-phosphat, 2-((Meth)acryloyloxy)ethyl-2'-(tricyclohexylammonio)ethylphosphat, 2-((Meth)acryloyloxy)ethyl-2'-(triphenylammonio)ethylphosphat, 2-((Meth)acryloyloxy)ethyl-2'-(trimethanolammonio)ethylphosphat, 2-((Meth)acryloyloxy)propyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-((Meth)acryloyloxy)butyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-((Meth)acryloyloxy)pentyl-2'-(trimethylammonio)ethyl-phosphat, 2-((Meth)acryloyloxy)hexyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-(Vinyloxy)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-(Allyloxy)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-(p-Vinylbenzyloxy)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-(p-Vinylbenzoyloxy)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-(styryloxy)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-(p-Vinylbenzyl)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-(Vinyloxycarbonyl)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-(Allyloxycarbonyl)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-(Acryloylamino)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, 2-(Vinylcarbonylamino)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat, Ethyl-(2'-trimethylammonioethylphosphorylethyl)fumarat, Butyl-(2'-trimethylammonioethylphosphorylethyl)fumarat, Hydroxyethyl-(2'-trimethylammonioethylphosphorylethyl)fumarat, Ethyl-(2'-trimethylammonioethylphosphorylethyl)maleat, Butyl-(2'-trimethylammonioethyl phosphorylethyl)maleat und Hydroxyethyl-(2'-trimethylammonioethylphosphorylethyl)-maleat.
Unter diesen Beispielen wird 2-((Meth)acryloyloxy)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat bevorzugt und insbesondere wird 2-(Methacryloyloxy)ethyl-2'-(trimethylammonio)ethylphosphat (d. h., 2-(Methacryloyloxy)ethylphosphorylcholin) (als MPC abgekürzt) wegen seiner Erhältlichkeit bzw. Verfügbarkeit bevorzugt. Wie der Begriff hierin verwendet wird, bedeutet (Meth)acryloyl Methacryloyl und/oder Acryloyl.
Das PC-Monomer kann durch ein konventionelles Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch Umsetzung von 2-Hydroxyethylmethacrylat und 2-Bromethylphosphoryldichlorid in Gegenwart einer tertiären Base, deren Reaktionsprodukt weiterhin mit einem tertiären Amin umgesetzt wird, wie es in JP-54-63025-A offenbart ist, oder durch Umsetzung eines polymerisierbaren Monomers, das eine Hydroxylgruppe hat, und einer cyclischen Phosphorverbindung, gefolgt von Ringöffnung mit einem tertiären Amin, wie es in JP-58-154591-A offenbart ist.
Beispiele des SA-Monomers können 2-Methylpropansulfonat, 2-Dimethylpropansulfonat, Styrolsulfonat und 2-Sulfoethylmethacrylat umfassen. Unter diesen Beispielen werden 2-Methylpropansulfonat, 2-Dimethylpropansulfonat und Styrolsulfonat bevorzugt.
Beispiele des CA-Monomers können (Meth)acrylsäure, 3-Pentensäure, 4-Pentensäure, 3-Acryloxypropionsäure, 2-(Meth)acryloyloxyethylphthalsäure umfassen. Unter diesen Beispielen werden Methacrylsäure und Acrylsäure bevorzugt.
Das hydrophobe Monomer kann ein Monomer sein, wie es durch die Formel (2) wiedergegeben ist:
In der Formel (2) bedeutet R⁶ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe, L¹ bedeutet -C₆H₄-, -C₆H₁₀-, -(CO)O-, -O-, -(C=O)NH-, -O(C=O)- oder -O(C=O)O- und L² bedeutet ein Wasserstoffatom, -(CH₂)_g-L³ oder ((CH₂)_p-O)_h-L³, worin g und h jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 24 bezeichnen, p eine ganze Zahl von 3 bis 5 bezeichnet und L³ ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe, -C₆H₅ oder -OC₆H₅ bedeutet.
Beispiele des hydrophoben Monomers können umfassen: geradkettige oder verzweigte Alkyl(meth)acrylate, z. B. Methyl(meth)acrylat, Ethyl(meth)acrylat, Butyl(meth)acrylat, 2-Ethylhexyl(meth)acrylat, Lauryl(meth)acrylat oder Stearyl-(meth)acrylat; cyclische Alkyl(meth)acrylate, z. B. Cyclohexyl(meth)acrylat; (Meth)acrylate mit aromatischem Ring, z. B. Benzyl(meth)acrylat oder Phenoxyethyl(meth)acrylat; Polyalkylenglykol(meth)acrylate, z. B. Polypropylenglykol(meth)acrylat; Styrolmonomere, z. B. Styrol, Methylstyrol oder Chlormethylstyrol; Vinylether-Monomer, z. B. Methylvinylether oder Butylvinylether; und Vinylester-Monomere, z. B. Vinylacetat oder Vinylpropionat. Unter diesen Beispielen werden Butylmethacrylat und Laurylmethacrylat bevorzugt.
Das Polymer (H) kann ein Polymer sein, das das bestimmte oben genannte Molekulargewicht hat, und durch Polymerisation einer Monomerzusammensetzung, enthaltend 5 bis 95 mol%, bevorzugt 10 bis 90 mol% des PC-Monomers und 5 bis 95 mol%, bevorzugt 10 bis 90 mol% von wenigstens einem der SA- und CA-Monomere, oder einer Monomerzusammensetzung, enthaltend 5 bis 90 mol%, bevorzugt 10 bis 85 mol% des PC-Monomers, 5 bis 90 mol%, bevorzugt 10 bis 85 mol% von wenigstens einem der CA- und CA-Monomere, und 5 bis 60 mol%, bevorzugt 5 bis 50 mol% des hydrophoben Monomers, erhalten wird.
Der Ausdruck "wenigstens eines der SA- und CA-Monomere", wie er hierin verwendet wird, umfasst all die Ausführungsformen, worin entweder das SA- oder das CA-Monomer alleine enthalten ist, und worin sowohl die SA- und die CA-Monomere zusammen enthalten sind. Weiterhin kann jede der oben genannten Monomerzusammensetzungen wahlweise andere Monomere, zusätzlich zu dem PC-Monomer, dem SA-Monomer, dem CA-Monomer und dem hydrophoben Monomer enthalten. In jeder der Monomerzusammensetzungen ist der Gehalt an derartigen anderen Monomeren üblicherweise nicht höher als 10 mol%, bevorzugt 5 mol%. In einigen Ausführungsformen ist es vielmehr bevorzugt, dass keine derartigen anderen Monomere enthalten sind.
Falls die Gehalte an PC-Monomer und wenigstens einem der SA- und CA-Monomere in jeder Monomerzusammensetzung alle weniger als 5 mol% sind, kann die unspezifische Hybridisierung nicht hinreichend gehemmt werden, was daher nicht bevorzugt ist. Das Polymer (H) kann durch konventionelle radikalische Copolymerisation hergestellt werden.
Dem vorliegenden Inhibitor sind keine besonderen Beschränkungen auferlegt, solange der Inhibitor das Polymer (H) enthält. Der vorliegende Inhibitor kann verwendet werden, indem der Inhibitor zu dem Hybridisierungssystem unter Mischen zugesetzt wird, so dass der Gehalt an Polymer (H) im Hybridisierungssystem üblicherweise 0,0001 bis 20 Gew.-%, bevorzugt 0,001 bis 10 Gew.-%, ist. Falls der Gehalt an Polymer (H) weniger als 0,0001 Gew.-% ist, kann die unspezifische Hybridisierung hemmende Wirkung nicht in hinreichender Weise erreicht werden, wohingegen bei über 20 Gew.-% die Viskosität des Hybridisierungssystems zu hoch ist, was die Hybridisierungsreaktion hemmen kann, weshalb dies nicht bevorzugt ist.
Der Inhibitor der vorliegenden Erfindung kann wahlweise andere Bestandteile enthalten, z. B. oberflächenaktive Stoffe, Lösungsmittel und Konservierungsstoffe, solange die Wirkungen der vorliegenden Erfindung nicht beeinträchtigt werden. Der Inhibitor kann in der Form von Pulvern oder einer Lösung vorliegen, aber die Lösungsform wird in der Verwendung bevorzugt.
Das Testagens kann eine beliebige Nucleinsäuresubstanz sein, solange es mit der zu detektierenden bestimmten Nucleinsäuresubstanz hybridisiert, und kann z. B. ein Testagens sein, das, abhängig vom Ziel, in konventionellen klinischen Diagnosereagenzien verwendet wird.
Wie der Begriff hierin verwendet wird, bedeutet Nucleinsäuresubstanz ("nucleic substance") eine beliebige oder mehrere Gruppe(n) von Verbindungen, die Kohlenhydratmoleküle, z. B. Pentose oder Hexose, mit einem oder mehreren daran ge bundenen Phosphormolekülen enthalten, wobei jedes der Kohlenhydratmoleküle an eine Base, z. B. Adenin, abgeleitet von Purin, oder Thymin, abgeleitet von Pyrimidin, bindet. Speziell umfassen natürlich auftretende Nucleinsäuremoleküle genomische DNAs, genomische RNAs und verschiedene Typen von RNAs, z. B. mRNAs, tRNAs und rRNAs, und auch cDNAs. Weiterhin umfasst die Nucleinsäuresubstanz auch synthetisierte DNAs oder Hybriden aus natürlich auftretenden DNAs und synthetisierten DNAs.
Die Nucleinsäuresubstanz kann entweder einzel- oder doppelsträngig, linear oder zirkulär oder Plasmide oder Oligonucleotide oder Polynucleotide sein. Die Nucleinsäuresubstanz kann Basen oder Basenpaare mit von etwa 10 bis etwa 20.000 Basen (20 kb) umfassen. Zusätzlich zu derartig natürlich auftretenden Substanzen können beispielsweise jene, die von Quellen wie ATCC- oder Gene Bank (GenBank)-Bibliotheken erhalten werden, und synthetische Zusammensetzungen, d. h. Nucleinsäure-artige Materialien, auch eingeschlossen sein. Synthetische Nucleinsäuren können durch eine Vielfalt von Lösungs- oder Festphasen-Verfahren hergestellt werden. Im Allgemeinen wird Festphasen-Synthese bevorzugt. Synthese von Nucleinsäuren durch Phosphittriester-, Phosphotriester- und H-Phosphonat-Chemien sind weitgehend verfügbar. (Caruthers et al., US-Patent 4,458,066 und US-Patent 4,500,707 ; Caruthers et al., Genetic Engineering, 4: 1–17 (1982); Jones, Kapitel 2, Atkinson, et al., Kapitel 3 und Sproat et al., Kapitel 4, in Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Gait (Hrsg.), IRL Press, Washington, D. C. (1984)).
In erfindungsgemäßen Verfahren zur klinischen Analyse kann der Gehalt an vorhandenem Inhibitor in geeigneter Weise, abhängig vom Verfahren zur klinischen Analyse und dem zu detektierenden Ziel, gewählt werden, und kann derart sein, dass der Gehalt an Polymer (H) des Inhibitors im Hybridisierungssystem üblicherweise 0,0001 bis 20 Gew.-%, bevorzugt 0,001 bis 10 Gew.-%, ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren zur klinischen Analyse kann wahlweise andere Verbindungen enthalten, die für das Testagens erforderlich sind, z. B. verschiedene Zusatzstoffe und Lösungsmittel.
Das Verfahren zur klinischen Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst Stufe (1) des ersten Inkontaktbringens einer Probe mit einem Testagens, das zur Hybridisierung mit einer spezifischen Nucleinsäuresubstanz in der Anwesenheit eines Inhibitors unspezifischer Hybridisierung, der ein Polymer (H) mit einer unspezifische Hybridisierung hemmenden Wirkung umfasst, fähig ist, unter besonderen Bedingungen zur Hybridisierung der spezifischen Nucleinsäuresubstanz mit dem Testagens, wobei das Polymer in seinem Molekül wenigstens eine der Carboxyl- und Sulfongruppen und Phosphorylcholin-artige Gruppen hat und ein gewichtsmittleres Molekulargewicht von 1.000 bis 5.000.000 hat.
Stufe (1) kann unter Verwendung des erfindungsgemäßen Inhibitors oder des erfindungsgemäßen klinischen Diagnosereagens durchgeführt werden. Stufe (1) kann beispielsweise durch Zusetzen des vorliegenden Inhibitors zu einem System, das eine Probe und ein Testagens enthält, und Halten des Systems unter den besonderen Bedingungen; durch Halten ei nes Systems, das eine Probe und ein Testagens enthält, unter den besonderen Bedingungen und Zusetzen des vorliegenden Inhibitors zu dem System; oder durch Zusetzen des vorliegenden Inhibitors zu einer Probe und/oder einem Testagens vorab und dann Inkontaktbringen der Probe und des Testagens unter den besonderen Bedingungen durchgeführt werden.
Stufe (1) kann beispielsweise durch Zusetzen des vorliegenden Inhibitors bei oder nach Fixierung des Testagens auf einen Träger und Hybridisierung des Testagens mit einer Probe ausgeführt werden. In diesem Fall kann der erfindungsgemäße Inhibitor in der Form entweder einer Lösung oder eines Pulvers sein und kann wegen seiner Bereitschaft zur Homogenisierung mit dem Reaktionssystem bevorzugt in Lösungsform sein.
Der Träger kann beispielsweise eine Membran, z. B. eine Nitrocellulose-, Nylon- oder PVDF-Membran, oder eine Platte oder eine flache Platte, z. B. jene, die aus Polystyrol, Polypropylen, Glas oder Metall hergestellt sind, sein, ist aber nicht auf diese Beispiele beschränkt. Das Testagens kann an dem Träger beispielsweise durch elektrostatische Bindung, durch Anwendung von Ionizität ("ionicity"), durch kovalente Bindung durch UV-Strahlen oder dergleichen oder durch kovalente Bindung unter Verwendung eines Vernetzungsmittels fixiert werden.
Alternativ kann Stufe (1) auch in einer Lösung ohne den Träger durchgeführt werden. Beispiele derartiger Verfahren können Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Sequenzierreaktion, RNA-abhängige DNA-Synthese unter Verwendung einer reversen Transkriptase oder verschiedene Transkriptionsreaktionen unter Verwendung einer DNA-Polymerase, die bei der genetischen Modifikation eingesetzt werden, umfassen.
In Stufe (1) können die besonderen Bedingungen zur Hybridisierung der spezifischen Nucleinsäuresubstanz mit dem Testagens in geeigneter Weise, z. B. aus geeigneten Bedingungen für Southern-Hybridisierung, wenn die zu detektierende spezifische Nucleinsäuresubstanz eine DNA ist, oder aus geeigneten Bedingungen zur Northern-Hybridisierung, wenn die zu detektierende spezifische Nucleinsäuresubstanz eine RNA ist, ausgewählt werden.
Das Verfahren zur klinischen Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst Schritt (2) der Detektion eines Reaktanden, der durch Hybridisierung mit dem Testagens in Stufe (1) gebildet wurde.
In Stufe (2) kann der Recktand detektiert werden, z. B. durch Markierung in Übereinstimmung mit einer konventionellen Markierungstechnik zur Detektion eines Reaktanden und Messung der Aktivität oder dergleichen der Markierung. Die Markierung kann mit Radioisotopen, z. B. ³²P, ¹⁴C oder ³H, Fluoreszenzfarbstoffen, Enzymproteinen oder Antikörpern gegen verschiedene antigene Substanzen durchgeführt werden. Die markierten Verbindungen können unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit dem Markierungsreagens als dem Substrat oder durch chemische Reaktion hergestellt werden. Das Verfahren zur Detektion des Reaktanden kann in Abhängigkeit von Markierungsverfahren passend ausgewählt werden. Wenn die Markierung z. B. mit einem Radioisotop durchgeführt wird, kann der markierte Recktand mittels eines Szintilla tionszählers oder mittels Autoradiographie detektiert werden; wenn mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert wird mittels eines Detektors, der Laser verwendet; und wenn mit einem Enzymprotein oder verschiedenen Antigenen markiert wird, mittels Detektion von Chemilumineszenz, Fluoreszenz oder Färbung des Enzymsubstrats.
Das Verfahren zur klinischen Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung ist nicht besonders beschränkt, solange das Verfahren die Stufe (1) und (2), die oben stehend diskutiert wurden, umfasst und es kann leicht unter Anwendung verschiedener konventioneller Verfahren praktiziert bzw. angewendet werden. Eine Ausführungsform, bei der Southern-Blot-Hybridisierung angewendet wird, wird nachstehend diskutiert. Die anschließende Diskussion umfasst nicht die Beschreibung des erfindungsgemäßen Inhibitors, aber das Verfahren zur klinischen Analyse gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Zugeben des vorliegenden Inhibitors in geeigneter Weise zu verschiedenen Zeitpunkten und in der bevorzugten Menge, wie sie oben erwähnt ist, ausgeführt werden.
Zuerst werden genomische DNAs mit ISOGEN (hergestellt durch NIPPON GENE CO., LTD.) aus biologischen Geweben, z. B. Blut, präpariert. Die resultierenden DNAs werden durch Elektrophorese an 0,7% Agarosegel ("0.7% agarose gel electrophoresis") aufgetrennt. Nach dem Abschluss der Elektrophorese wird das Gel in eine 0,25 N Salzsäurelösung bei Raumtemperatur für 15 Minuten eingetaucht und dann in eine 0,4 N Natriumhydroxidlösung bei Raumtemperatur für 30 Minuten unter sanftem Schütteln. Auf einer vorher vorbereiteten Blot Table werden das resultierende Gel, eine Gene Screen Plus-Membran (hergestellt von DuPont), 3MM-Filterpapiere (hergestellt von Whatman plc), Papierhandtücher ("Kimtowels") und ein Gewicht übereinander in dieser Reihenfolge angeordnet und über Nacht stehengelassen, um die DNAs im Gel auf die Gene Screen Plus-Membran zu transkribieren bzw. übertragen. Wenn die Transkription abgeschlossen ist, wird die Gene Screen Plus-Membran bei Raumtemperatur für 15 Minuten in einen 0,5 M Tris-Puffer eingetaucht, bei Raumtemperatur getrocknet und bei 80°C für 2 Stunden gebacken. Die resultierende Membran wird in 2×SSC (0,3 M Natriumchlorid, 0,03 M Natriumcitrat) geschüttelt und dann in einen Schnell-Hybridisierungspuffer ("rapid hybridization buffer") (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) bei 65°C für 15 Minuten unter Schütteln zur Prä-Hybridisierung eingetaucht. Eine Lösung von Ziel-DNA-Sonden (³²P-markiert), die zuvor durch Nick-Translation mit [γ³²P]-dCTP markiert wurden, wird zu dem Hybridisierungspuffer zugegeben und die Hybridisierung wird bei 65°C 2 Stunden lang durchgeführt. Die Membran wird bei 65°C für 15 Minuten in 0,1×SSC (0,015 M Natriumchlorid, 0,0015 M Natriumcitrat) geschüttelt. Dieser Arbeitsgang wird zweimal wiederholt, um überschüssige Sonden wegzuwaschen. Überschüssige Feuchtigkeit wird auf Filterpapieren entfernt und Röntgenfilm wird den radioaktiven Strahlen aus den Sonden bei –70°C 24 Stunden lang ausgesetzt und entwickelt. Die Zielbanden ("objective bands") werden mittels eines Densitometers quantifiziert. (Molecular Cloning: A LABORATORY MANUAL, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)).
Die vorliegende Erfindung wird nun detaillierter unter Bezug auf Beispiele und Vergleichsbeispiele erklärt werden, aber die vorliegende Erfindung ist nicht darauf beschränkt.
Synthesebeispiel 1
19,4 g MPC und 0,6 g Methacrylsäure (als MA abgekürzt) wurden in 40 g Wasser gelöst und in einen Vierhalskolben gegossen. Die Lösung wurde 30 Minuten lang mit Stickstoff durchperlt, 1,6 g Bernsteinsäureperoxid wurde bei 60°C zugegeben, und das Gemisch wurde 8 Stunden lang polymerisiert. Die Polymerisationslösung wurde unter Rühren tropfenweise zu 3 l Aceton zugegeben. Das resultierende Präzipitat wurde durch Filtration herausgenommen und 48 Stunden lang bei Raumtemperatur vakuumgetrocknet, um 14,6 g Polymerpulver zu erhalten (abgekürzt als Polymer (P1)). Das Molekulargewicht von Polymer (21) wurde durch Gelpermeationschromatographie (GPC) analysiert, wobei das Elutionslösungsmittel ein 20 mM Phosphatpuffer (pH 7,4) war, das Referenzmaterial war Polyethylenglykol und die Detektion erfolgte in Übereinstimmung mit dem Brechungsindex. Weiterhin wurde das Zusammensetzungsverhältnis von Polymer (21) und die in Polymer (21) enthaltenen Gruppen durch ¹H-NMR bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Synthesebeispiele 2 bis 5
Polymerpulver wurden auf die gleiche Weise wie im Synthesebeispiel 1 hergestellt, außer dass die Arten und das Zusammensetzungsverhältnis der Monomere, die in Synthesebeispiel 1 verwendet wurden, abgeändert wurden, wie es in Tabelle 1 gezeigt ist. Die erhaltenen Polymerpulver wurden als Polymere (P2) bis (P5) bezeichnet. Die gleichen Analysen wie in Synthesebeispiel 1 wurden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Synthesebeispiele 6 und 7
Polymerpulver wurden auf die gleiche Weise wie in Synthesebeispiel 1 hergestellt, außer dass die Arten und das Zusammensetzungsverhältnis der Monomere, die in Synthesebeispiel 1 verwendet wurden, abgeändert wurden, wie es in Tabelle 1 gezeigt ist, 40 g Wasser wurden durch 120 g Isopropanol ersetzt, und 1,6 g Bernsteinsäureperoxid wurde durch 0,7 g Azobisisobutyronitril (als AIBN abgekürzt) ersetzt. Die erhaltenen Polymerpulver wurden als Polymere (P6) und (P7) bezeichnet. Die gleichen Analysen wie in Synthesebeispiel 1 wurden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt, worin BMA eine Abkürzung für Butylmethacrylat ist.
Synthesebeispiele 8 bis 10
Polymerpulver wurden auf die gleiche Weise wie in Synthesebeispiel 1 hergestellt, außer dass die Arten und das Zusammensetzungsverhältnis der Monomere, die in Synthesebeispiel 1 verwendet wurden, abgeändert wurden, wie es in Tabelle 2 gezeigt ist, und die Menge an Bernsteinsäureperoxid war 0,65 g. Die erhaltenen Polymerpulver wurden als Polymere (P8) bis (P10) bezeichnet. Die gleichen Analysen wie in Synthesebeispiel 1 wurden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt, wobei MPs eine Abkürzung für 2-Methylpropansulfonsäure ist.
Synthesebeispiele 11 bis 12
Polymerpulver wurden auf die gleiche Weise wie in Synthesebeispiel 1 hergestellt, außer dass die Arten und das Zusammensetzungsverhältnis der Monomere, die in Synthesebeispiel 1 verwendet wurden, abgeändert wurden, wie es in Tabelle 2 gezeigt ist, die Menge an Wasser war 120 g und die Menge an Bernsteinsäureperoxid war 0,23 g. Die erhaltenen Polymerpulver wurden als Polymere (P11) bis (P12) bezeichnet. Die gleichen Analysen wie in Synthesebeispiel 1 wurden durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt, worin Am eine Abkürzung für Acrylamid, Vp für N-Vinyl-2-pyrrolidon und MANa für Natriummethacrylat ist.
Beispiel 1-1
Eine Oligo-DNA, deren 5'-Ende zur Immobilisierung mit einer Aminogruppe modifiziert ist (als PUC-NH₂), eine vollständig übereinstimmende Oligo-DNA, deren 5'-Ende mit Biotin modifiziert ist und die eine zu PUC-NH₂ komplementäre Sequenz hat (als PUC abgekürzt), und Mismatch-Oligo-DNAs, deren 5'-Ende mit Biotin modifiziert ist, die SNPs von PUC sind (als PUC' und PUC'' abgekürzt), die jeweils die unten dargestellte DNA-Sequenz haben, wurden verwendet. PUC-NH₂, PUC, PUC' und PUC'' wrden durch ESPEC OLIGO SERVICE CORP. hergestellt.
100 μl/Kavität einer 25 pmol/ml PUC-NH₂-Lösung in 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,5), gemischt mit 1 mM EDTA, (abgekürzt als E-NaPB), wurden in eine DNA-BIND-Platte mit 96 Kavitäten ("DNA-BIND 96-well plate") (hergestellt von Corning Incorporated) dispensiert und über Nacht bei 4°C inkubiert (Immobilisierung von PUC-NH₂). Dann wurde die PUC-NH₂-Lösung aus jeder Kavität entfernt und jede Kavität wurde dreimal mit Dulbecco's PBS (als D-PBS abgekürzt) gewaschen. 200 μl/Kavität der E-NaPB-Lösung, gemischt mit 3 BSA, (als B-E-NaPB abgekürzt), wurden zugegeben, und es wurde 1 Stunde lang bei 37°C inkubiert (Blockierungsschritt-1). Dann wurde die B-E-NaPB aus jeder Kavität entfernt, um eine PUC-NH₂-irrmobilisierte Platte herzustellen.
In die PUC-NH₂-immobilisierte Platte wurden 3,2 Gew.-% Polymer (P1), jeweils 0,2 pmol/ml PUC, PUC' und PUC'' und eine 750 mM NaCl enthaltende 75 mM-Lösung von Natriumcitrat (als 5×SSC) in einer Menge von 100 μl/Kavität zugegeben und bei 55°C 1 Stunde lang zur Hybridisierung inkubiert. Die Lösung wurde aus jeder Kavität entfernt, und es wurde zweimal mit einer 300 mM NaCl enthaltenden 30 mM-Lösung von Natriumcitrat (als 2×SSC abgekürzt) bei 55°C gewaschen. 200 μl/Kavität der B-E-NaPB wurde zugegeben, und es wurde bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert (Blockierungsschritt-2); und dann wurde die B-E-NaPB aus jeder Kavität entfernt. 100 μl/Kavität einer Avidin-Meerrettichperoxidase (hergestellt von SIGMA-ALDRICH CO.)-Lösung, 10.000-fach verdünnt mit der B-E-NaPB (als Avidin-HRP abgekürzt) wurde zugegeben und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert (Avidin-Biotin-Reaktion). Jede Kavität wurde dann dreimal mit D-PBS gewaschen, 100 μl/Kavität der im HRP-Kit eingeschlossenen Substratlösung wurde zugegeben und die Mischung wurde bei 25°C 10 Minuten lang inkubiert (POD-Substratreaktion). Nachfolgend wurden 100 μl/Kavität der im HRP-Kit enthaltenen Stopp-Lösung ("reaction terminator") zugegeben und die Absorption bei 450 nm wurde mittels eines SPECTRA MAX250 (Mikrotiterplatten-Lesegerät, hergestellt von MOLECULAR DEVICES CORPORATION) gemessen. Im Übrigen war der hierin verwendete HRP-Kit das Coloring Kit T für Peroxidase (hergestellt von SUMITOMO BAKELITS CO., LTD.).
Aus den Ergebnissen der Messungen wurden die Verhältnisse von (Extinktion von PUC)/(Extinktion von PUC') und (Extinktion von PUC)/(Extinktion von PUC'') bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Beispiele 1-2 bis 1-9 und Vergleichsbeispiele 1-1 bis 1-2
Die Messungen wurden auf die gleiche Weise durchgeführt, wie in Beispiel 1-1, außer dass das Polymer (P1) ersetzt wurde durch jedes Polymer, das in Tabelle 3 gezeigt ist. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 1-3
Die Messungen wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1-1 durchgeführt, außer dass die 5×SSC-Lösung, enthaltend 3,2 Gew.-% Polymer (P1) und jeweils 0,2 pmol/ml PUC, PUC', PUC'', ersetzt wurde durch eine 5×SSC-Lösung, enthaltend jeweils 0,2 pmol/ml von PUC, PUC' und PUC''. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 1-4
Die Messungen wurden auf die gleiche Weise durchgeführt wie in Beispiel 1, außer dass die 5×SSC-Lösung, enthaltend 3,2 Gew.-% Polymer (P1) und jeweils 0,2 pmol/ml von PUC, PUC' und PUC'', ersetzt wurde durch eine 5×SSC-Lösung, enthaltend 1,0% Casein (hergestellt von SIGMA-ALDRICH CO.) und 0,1% N-LS (hergestellt von WAKO PURE CHEMICALS INDUSTRIES, LTD.). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 1-5

Die Messungen wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1-1 durchgeführt, außer dass die 5×SSC-Lösung, enthaltend 3,2 Gew.-% Polymer (P1) und jeweils 0,2 pmol/ml PUC, PUC' und PUC'', ersetzt wurde durch jeweils 0,2 pmol/ml von PUC, PUC' und PUC'' und durch eine 6×SSC-Lösung, enthaltend 10 mg/ml Ficol 400 (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech, Marke), 10 mg/ml Polyvinylpyrrolidon, 10 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,5 SDS (Denhardt-Lösung). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3

	Art des Polymers (Abkürzung)	(Extinktion von PUC)/(Extinktion von PUC')	(Extinktion von PUC)/(Extinktion von PUC'')
Beispiel 1-1	(P1)	4,5	2,0
Beispiel 1-2	(P2)	4,0	2,6
Beispiel 1-3	(P3)	2,7	2,4
Beispiel 1-4	(P4)	2,6	2,3
Beispiel 1-5	(P6)	4,0	2,7
Beispiel 1-6	(P7)	3,8	2,2
Beispiel 1-7	(P8)	3,1	2,1
Beispiel 1-8	(P9)	3,1	2,5
Beispiel 1-9	(P10)	3,2	2,4
Vergleichsbeispiel 1-1	(P11)	2,4	1,6
Vergleichsbeispiel 1-2	(P12)	2,5	1,8
Vergleichsbeispiel 1-3	-	2,0	1,0
Vergleichsbeispiel 1-4	anderer Inhibitor	1,8	1,0
Vergleichsbeispiel 1-5	anderer Inhibitor	1,7	1,0

Aufgrund von Tabelle 3 kann darauf geschlossen werden, dass die Verhältnisse der Extinktion bei vollständiger Übereinstimmung ("full match") (Extinktion von PUC) zur Extinktion bei Mismatch (Extinktion von PUC' oder PUC'') in den Bei spielen höher sind als in den Vergleichsbeispielen. Dies bedeutet, dass die in den Beispielen verwendeten Inhibitoren spezifische Hybridisierung nicht hemmen, aber unspezifischer Hybridisierung hemmen, wodurch eine genauere Hybridisierung realisiert wird.
Produktionsbeispiel 1-1
In eine 96-Kavitäten-Mehrfachplatte ("96-well multiplate") (hergestellt von Nalge Nunc International, weiß) wurden 150 μl/Kavität 0,2 mg/ml Poly(lysinphenylalanin), gelöst in 5×SSC, dispensiert und 20 Stunden lang bei Raumtemperatur ruhig stehengelassen. Die Platte wurde mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,3) gewaschen. 200 μl/Kavität 650 μM 2-Iminothiolan-Hydrochlorid, gelöst in einem 200 mM Phosphatpuffer (pH 8,0), wurde zugegeben und bei Raumtemperatur 2 Stunden lang ruhig stehengelassen. Die Platte wurde mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen.
Ein Oligonucleotid, dessen 5'-Ende mit einem Aminolinker (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) für die Immobilisierung modifiziert war, (Sequenz: 5'-CATTAGGGATCCAGCCGTGAATTCGTCACT-3'), wurde in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und N-Succinimidyl-4-maleimidobutyrat (als GMBS abgekürzt), gelöst in Dimethylformamid (als DMF abgekürzt), wurde in einer Menge zugegeben, die der 5-fachen molaren Menge des Oligonucleotids entsprach. Die Reaktion wurde bei 37°C für 90 Minuten durchgeführt und das nicht-umgesetzte GMBS wurde entfernt, um ein Maleimid-verknüpftes Oligonucleotid zu erhalten. In eine vorher mit 2-Iminothiolan-Hydrochlorid behandelte 96 Kavitäten-Mehrfachplatte wurden 25 pmol/Kavität dieses Maleimid-verknüpften Oligonucleotids dispensiert und bei Raumtemperatur 20 Minuten lang umgesetzt. Nachdem die Reaktion vollständig war, wurde der Überstand verworfen, 250 μl/Kavität einer 0,8 mM Iodacetamidlösung wurde zugegeben und die Platte wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden lang stehengelassen. Nachfolgend wurde die Platte mit 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und 250 μl/Kavität eines Puffers, bestehend aus 50 mM Tris – 50 mM Natriumchlorid – 1% BSA, wurden zugegeben und die Platte wurde bei Raumtemperatur 20 Stunden lang stehengelassen, um dadurch eine Oligonucleotid-immobilisierte Platte herzustellen.
Produktionsbeispiel 1-2
4,8 mg anti-AFP-Antikörper-Klon Nr. 9, der mit AFP reagiert, wurde mit 39 μg Pepsin bei 37°C 30 Minuten lang umgesetzt und durch Gelfiltrationssäulenchromatographie gereinigt, was 2,4 mg einer F(ab')2-Fraktion ergab. Zu der erhaltenen Fraktion wurde 0,2 M 2-Mercaptoethanolamin in einer Menge zugegeben, die 1/20 des Volumens der F(ab')2-Fraktion war, um dadurch die Fab'-Fraktion durch Reduktion herzustellen.
Ein vollständig übereinstimmendes Oligonucleotid, dessen 5'-Ende mit einem Aminolinker modifiziert war, (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech; Sequenz: 5'-AGTGACGAATTCACGGCTGGATCCCTAATG-3', und ein Mismatch-Oligonucleotid, dessen 5'-Ende mit einem Aminolinker modifiziert war, (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech; Sequenz: 5'-GATTTTAGCTCTTCTTTGGAGAAAGTGGTG-3'), wurden jeweils in 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) gelöst und in DMF gelöstes GMBS wurde in einer Menge zugegeben, die das 5-Fache der molaren Menge des Oligonucleotids war. Die Umsetzung wurde bei 37°C 90 Minuten lang durchgeführt und das nicht-umgesetzte GMBS wurde entfernt, um Maleimidverknüpfte Oligonucleotide zu ergeben. Zu jedem der erhaltenen Maleimid-verknüpften Oligonucleotide wurde die Fab'-Fraktion des anti-AFP-Antikörpers in einer Menge zugegeben, die das 0,2-Fache der molaren Menge des Oligonucleotids war, umgesetzt und entsalzt, um dadurch einen vollständig übereinstimmenden ("full match") anti-Fab'-Oligonucleotid-Komplex (als FM-Komplex abgekürzt) und einen Mismatch-anti-Fab'-Oligonucleotid-Komplex (als MM-Komplex abgekürzt) herzustellen.
Beispiel 2-1
Eine FM-Komplex-Lösung, enthaltend 0,2 Gew.-% Polymer (P1) und eine MM-Komplex-Lösung, enthaltend 0,2 Gew.-% Polymer (P1), wurden in die im Produktionsbeispiel 1-1 hergestellte Oligonucleotid-immobilisierte Platte in einer Menge von 100 μl/Kavität dispensiert und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert. Die Platte wurde mit Tris-Triton-X (hiernach als Waschlösung (X) bezeichnet) gewaschen und 100 μl einer auf 100 ng/ml verdünnten Lösung des AFP-Antigens wurden zugegeben und bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert. Danach wurde die Platte mit der Waschlösung (X) gewaschen, 200 μl einer AMPPD-Lösung, ein Chemilumineszenz-Substrat, wurden zugegeben und bei 37°C 5 Minuten lang inkubiert. Die Platte wurde dann auf einem ARVOsx-Fluoreszenz-Plattenlesegerät (Wallac Beltold) ausgelesen und das Verhältnis von (Lumineszenz von FM-Komplex)/(Lumineszenz von MM-Komplex) wurde aus den Messergebnissen ermittelt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Beispiele 2-2 bis 2-9 und Vergleichsbeispiele 2-1 bis 2-3
Messungen wurden nach den gleichen Verfahrensweisen wie in Beispiel 2-1 durchgeführt, außer dass Polymer (P1) durch das jeweils in Tabelle 4 dargestellte Polymer ersetzt wurde. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt.
Vergleichsbeispiel 2-4
Die Messungen wurden nach den gleichen Verfahrensweisen wie in Beispiel 2-1 durchgeführt, außer dass die 0,2 Gew.-% Polymer (P1) enthaltende FM-Komplex-Lösung und die 0,2 Gew.-% Polymer (P1) enthaltende MM-Komplex-Lösung durch die FM- bzw. MM-Komplex-Lösungen ohne Polymer (P1) ersetzt wurden.

Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4

	Art des Polymers (Abkürzung)	(FM-Lumineszenz) /(MF-Lumineszenz)
Beispiel 2-1	(P1)	3,2
Beispiel 2-2	(P2)	2,9
Beispiel 2-3	(P3)	12,8
Beispiel 2-4	(P4)	44,5
Beispiel 2-5	(P6)	8,4
Beispiel 2-6	(P7)	4,3
Beispiel 2-7	(P8)	3,4
Beispiel 2-8	(P9)	6,8
Beispiel 2-9	(P10	39,1
Vergl. Beisp. 2-1	(P5)	1,5
Vergl. Beisp. 2-2	(P11)	1,9
Vergl. Beisp. 2-3	(P12)	1,4
Vergl. Besip. 2-4	-	1,1

Aus Tabelle 4 ist ersichtlich, dass die Verhältnisse der Lumineszenz des FM-Komplexes zu der Lumineszenz des MM-Komplexes in den Beispielen höher sind als in den Vergleichsbeispielen. Dies bedeutet, dass die spezifische Hybridisierung nicht gehemmt wurde, sondern dass die unspezifische Hybridisierung sogar bei 37°C gehemmt wurde, wodurch eine genauere Hybridisierung realisiert wurde.
Beispiel 3-1
Eine Oligo-DNA, deren 5'-Ende mit einer Aminogruppe modifiziert ist (als PUC2-NH₂ abgekürzt), mit der nachstehend gezeigten DNA-Sequenz zur Immobilisierung, die PUC mit einer zu PUC2-NH₂ komplementären Sequenz und die Mismatch-PUC' oder -PUC'', deren 5'-Ende mit Biotin modifiziert ist, und die SNPs von PUC sind, wurden verwendet. PUC2-NH₂ wird von ESPEC OLIGO SERVICE CORP. hergestellt.

PUC2-NH₂: 5'-(CH₂)₁₂TTTACAACGTCGTGACTGGG-3'

100 μl/Kavität einer 25 pmol/ml PUC2-NH₂-Lösung in E-NaPB wurden in eine DNA-BIND-Platte mit 96 Kavitäten ("DNA-BIND 96-well plate") (von Corning Incorporated hergestellt) dispensiert und über Nacht bei 4°C inkubiert (Immobilisierung von PUC2-NH₂). Die Lösung wurde dann aus jeder Kavität entfernt, und es wurde dreimal mit D-PBS gewaschen. 200 μl/Kavität des B-E-NaPB wurden zugegeben und bei 37°C 1 Stunde lang inkubiert (Blockierungsschritt-1). Der B-E-NaPB wurde dann aus jeder Kavität entfernt, um eine PUC2-NH₂-immobilisierte Platte herzustellen.
In die PUC2-NH₂-irrmobilisierte Platte wurden 100 μl/Kavität einer 5×SSC-Lösung, enthaltend 3,2 Gew.-% Polymer (P1) und jeweils 0,2 pmol/ml PUC, PUC' und PUC'', zugegeben und bei 25°C 1 Stunde lang inkubiert. Die Oligo-DNA-Lösung wurde aus jeder Kavität entfernt, und sie wurde zweimal mit 30 mM-Lösung von Natriumcitrat, enthaltend 0,1 SDS und 300 mM NaCl, bei 25°C gewaschen. 200 μl/Kavität des B-E-NaPB wurde zugegeben und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert (Blockierungsschritt-2), und der Be-E-NaPB wurde aus jeder Kavität entfernt. 100 μl/Kavität der Avidin-HRP-Lösung wurde zugegeben und bei 37°C 30 Minuten lang inkubiert (Avidin-Biotin-Reaktion). Jede Kavität wurde dann dreimal mit D-PBS gewaschen, 100 μl/Kavität der im HRP-Kit eingeschlossenen Substratlösung wurde zugegeben, und das Gemisch wurde bei 25°C 10 Minuten lang inkubiert (POD-Substratreaktion). Nachfolgend wurde 100 μl/Kavität der im HRP-Kit enthaltenen Stopp-Lösung ("reaction terminator") zugegeben und die Extinktion wurde bei 450 nm mittels SPECTRA MAX250 (Mikrotiterplatten-Lesegerät, von MOLECULAR DEVICES CORPORATION hergestellt) gemessen. Im Übrigen war das hierin verwendete HRP-Kit das Coloring Kit T für Peroxidase (von SUMITOMO BAKELITS CO., LTD.) hergestellt.
Aufgrund der Ergebnisse der Messungen wurden die Verhältnisse von (Extinktion von PUC)/(Extinktion von PUC') und (Extinktion von PUC)/(Extinktion von PUC'') bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Beispiele 3-2 bis 3-9 und Vergleichsbeispiele 3-1 bis 3-2
Messungen wurden nach den gleichen Verfahrensweisen wie in Beispiel 3-1 durchgeführt, außer dass Polymer (P1) jeweils durch das in Tabelle 5 gezeigte Polymer ersetzt wurde. Bei den Vergleichsbeispielen 3-1 und 3-2 wurde nur das Verhältnis von (Extinktion von PUC)/(Extinktion von PUC'') bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 3-3
Messungen wurden nach den gleichen Verfahrensweisen wie in Beispiel 3-1 durchgeführt, außer dass die 5×SSC-Lösung, enthaltend 3,2 Gew.-% Polymer (P1) und jeweils 0,2 pmol/ml PUC, PUC' und PUC'', ersetzt wurde durch eine 5×SSC-Lösung, enthaltend jeweils 0,2 pmol/ml PUC, PUC' und PUC''. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 3-4
Messungen wurden nach den gleichen Verfahrensweisen wie in Beispiel 3-1 durchgeführt, außer dass die 5–SSC-Lösung, enthaltend 3,2 Gew.-% Polymer (P1) und jeweils 0,2 pmol/ml PUC, PUC' und PUC'', ersetzt wurde durch eine 5×SSC-Lösung, enthaltend 1,0% Casein (von SIGMA-ALDRICH CO. hergestellt) und 0,1% N-LS (von WAKO PURE CHEMICALS INDUSTRIES, LTD. hergestellt). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Vergleichsbeispiel 3-5

Messungen wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 3-1 durchgeführt, außer dass die 5×SSC-Lösung, enthaltend 3,2 Gew.-% Polymer (P1) und jeweils 0,2 pmol/ml PUC, PUC' und PUC'', ersetzt wurde durch jeweils 0,2 pmol/ml PUC, PUC' und PUC'' und eine 6×SSC-Lösung, enthaltend 10 mg/ml Ficol 400 (von Amersham Pharmacia Biotech hergestellt, Marke), 10 mg/ml Polyvinylpyrrolidon, 10 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,5 SDS (Denhardt-Lösung). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 5

	Art des Polymers (Abkürzung)	(Extinktion von PUC)/(Extinktion von PUC')	(Extinktion von PUC)/(Extinktion von PUC'')
Beispiel 3-1	(P1)	5,1	2,3
Beispiel 3-2	(P2)	4,5	2,9
Beispiel 3-3	(P3)	3,1	2,5
Beispiel 3-4	(P4)	2,7	2,8
Beispiel 3-5	(P6)	4,2	3,0
Beispiel 3-6	(P7)	4,0	2,8
Beispiel 3-7	(P8)	3,6	2,6
Beispiel 3-8	(P9)	3,4	2,8
Beispiel 3-9	(P10)	3,6	2,8
Vergleichsbeispiel 3-1	(P11)	-	1,8
Vergleichsbeispiel 3-2	(P12)	-	2,0
Vergleichsbeispiel 3-3	-	2,0	1,0
Vergleichsbeispiel 3-4	anderer Inhibitor	1,8	1,0
Vergleichsbeispiel 3-5	anderer Inhibitor	1,6	1,0

Aufgrund von Tabelle 5 wird verstanden, dass die Verhältnisse der Extinktion bei vollständiger Übereinstimmung (Extinktion von PUC) zu der Extinktion bei Mismatch (Extinktion von PUC' oder PUC'') in den Beispielen höher sind als in den Vergleichsbeispielen. Dies bedeutet, dass die spezifische Hybridisierung nicht gehemmt wurde, sondern dass die unspezifische Hybridisierung gehemmt wurde, wodurch eine genauere Hybridisierung realisiert wurde.

Claims

Verwendung eines Polymers (H) mit einer unspezifische Hybridisierung hemmenden Wirkung als ein Inhibitor unspezifischer Hybridisierung, wobei das Polymer in seinem Molekül wenigstens eine der Carboxyl- und Sulfongruppen und Phosphorylcholin-artige Gruppen hat und ein gewichtsmittleres Molekulargewicht von 1.000 bis 5.000.000 hat.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Phosphorylcholinartige Gruppe eine Gruppe ist, die von einem Monomer abgeleitet ist, das eine Phosporylcholin-artige Gruppe, wie sie durch die Formel (1) wiedergegeben ist, umfasst:
worin X einen zweiwertigen organischen Rest bedeutet, Y eine Alkylenoxygruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet, Z ein Wasserstoffatom oder R⁵O(C=O)- bedeutet, mit der Maßgabe, dass R⁵ eine Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 10 Kohlenstoffatomen bedeutet; R¹ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet, R², R³ und R⁴ dieselben oder unterschiedliche Gruppen sind und jede ein Wasserstoffatom oder eine Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet; m 0 oder 1 ist und n eine ganze Zahl von 1 bis 4 bezeichnet.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer (H) ein Polymer ist, das durch Polymerisation einer Monomerzusammensetzung, die 5 bis 95 Molprozent eines Monomers mit einer Phosphorylcholin-artigen Gruppe, 5 bis 95 Molprozent wenigstens eines Monomers mit einer Carboxylgruppe und ein Monomer mit einer Sulfongruppe umfasst, erhalten wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Polymer (H) ein Polymer ist, das durch Polymerisation einer Monomerzusammensetzung, die 5 bis 90 Molprozent eines Monomers mit einer Phosphorylcholin-artigen Gruppe, 5 bis 90 Molprozent wenigstens eines Monomers mit einer Carboxylgruppe und ein Monomer mit einer Sulfongruppe und 5 bis 60 Molprozent eines hydrophoben Monomers umfasst, erhalten wird.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das hydrophobe Monomer ein Monomer ist, wie es durch die Formel (2) wiedergegeben wird:
worin R⁶ ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe bedeutet, L¹ -C₆H₄-, -C₆H₁₀-, -(C=O)O-, -O-, -(C=O)NH-, -O(C=O)oder -O(C=O)O- bedeutet und L² ein Wasserstoffatom, -(CH₂)_g-L³ oder ((CH₂)_p-O)_h-L³ bedeutet, wobei g und h jeweils eine ganze Zahl von 1 bis 24 bezeichnen, p eine ganze Zahl von 3 bis 5 bezeichnet und L³ ein Wasserstoffatom, eine Methylgruppe, -C₆H₅ oder -OC₆H₅ bedeutet.
Verfahren zur klinischen Analyse, umfassend die Stufen: (1) Inkontaktbringen einer Probe mit einem Testagens, das zur Hybridisierung mit einer spezifischen Nukleinsäuresubstanz in der Anwesenheit eines Inhibitors unspezifischer Hybridisierung, der ein Polymer (H) mit einer unspezifische Hybridisierung hemmenden Wirkung umfasst, fähig ist, unter besonderen Bedingungen zur Hybridisierung der spezifischen Nukleinsäuresubstanz mit dem Testagens, wobei das Polymer in seinem Molekül wenigstens eine der Carboxyl- und Sulfongruppen und Phosphorylcholin-artige Gruppen hat und ein gewichtsmittleres Molekulargewicht von 1.000 bis 5.000.000 hat, und (2) Detektion eines durch Hybridisierung mit dem Testagens in Stufe (1) gebildeten Reaktanden.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei in Stufe (1) eine Menge des Inhibitors so ist, dass der Gehalt an Polymer (H) des Inhibitors in einem Hybridisierungssystem 0,0001 bis 20 Gewichtsprozent ist.