DE69828625T2

DE69828625T2 - Reagenzien und methoden zur bindung von zielmolekülen an eine oberfläche

Info

Publication number: DE69828625T2
Application number: DE69828625T
Authority: DE
Inventors: W. Lise DURAN; J. Melvin SWANSON; A. Richard AMOS; Sheau-Ping Hu; E. Patrick GUIRE
Original assignee: Surmodics Inc
Current assignee: Surmodics Inc
Priority date: 1997-09-30
Filing date: 1998-09-25
Publication date: 2005-12-29
Anticipated expiration: 2018-09-26
Also published as: WO1999016907A3; WO1999016907A2; EP1019424B1; EP1019424A2; AU9582898A; CA2304362C; DE69828625D1; JP4426092B2; AU737391B2; CA2304362A1; US5858653A; JP2001518604A

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Bindung von Zielmolekülen, wie etwa Oligonukleotiden (Oligos), an eine Oberfläche und Zusammensetzungen zur Verwendung in solchen Verfahren. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die resultierenden beschichteten Oberflächen selbst. In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung photochemischer und thermochemischer Mittel, um Moleküle an eine Oberfläche zu binden.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Immobilisierung von Desoxyribonukleinsäure (DNA) an Trägeroberflächen ist zu einem wichtigen Aspekt bei der Entwicklung von DNA-basierten Testsystemen sowie für andere Zwecke, einschließlich der Entwicklung mikrofabrizierter Anordnungen für DNA-Analyse, geworden. Siehe zum Beispiel „The Development of Microfabricated Arrays of DNA Sequencing and Analysis", O'Donnell-Maloney et al., TIBTECH 14:401–407 (1996). Im allgemeinen werden solche Verfahren auf der Oberfläche von Mikrovertiefungsplatten, Röhren, Perlen, Mikroskop-Objektträgern, Siliciumwafern oder Membranen durchgeführt, Insbesondere sind bestimmte Ansätze entwickelt worden, um die Wahrscheinlichkeit der Endpunktbindung eines synthetischen Oligos an eine Oberfläche zu ermöglichen oder zu verbessern. Endpunktbindung (d.h. wobei die Nukleinsäuresequenz durch das eine oder das andere terminale Nukleotid gebunden ist) ist wünschenswert, weil die gesamte Länge der Sequenz zur Hybridisierung an eine weitere Nukleinsäuresequenz verfügbar sein wird. Dies ist besonders vorteilhaft für den Nachweis von Einzelbasenpaaränderungen unter stringenten Hybridisierungsbedingungen.
Ausgewählter Stand der Technik schließt U.S.-Patent Nr. 4,973,493 (Guire et al.) ein, das sich mit einem Verfahren zur Verbesserung der Biokompatibilität fester Oberflächen beschäftigt. U.S.-Patent Nr. 4,722,906 (ebenfalls Guire et al.) beschäftigt sich mit einem Verfahren zur selektiv kovalenten Verknüpfung einer Zieleinheit mit einer chemischen Einheit oder einem Träger. WO 97/16544 (Swan et al.) beschäftigt sich mit wasserlöslichen Vernetzungsmitteln. Zusätzlich beschäftigt sich Newton, 1993, Nucleic Acids Research, 21(5):1155, mit der Herstellung von PCR-Produkten 5'-Einzelstrangschwänzen unter Verwendung von Primern, die neuartige Phosphoramidit-Zwischenstufen einbeziehen.
Hybridisierung ist das am routinemäßigsten verwendete Verfahren, um Nukleinsäuren durch Basenpaarung an auf einem festen Träger immobilisierte Sonden zu messen. Wenn kombiniert mit Amplifikationstechniken, wie etwa der Polymerasekettenreaktion (PCR) oder Ligasekettenreaktion (LCR), sind Hybridisierungstest ein starkes Tool für Diagnose und Forschung. Insbesondere sind Mikrovertiefungsplatten geeignet und nützlich zum Testen relativ großer Zahlen von Proben. Mehrere Verfahren sind zur Immobililsierung von Nukleinsäuresonden an Mikrovertiefungsplatten verwendet worden. Einige von diesen umfassen die Adsorption nicht-modifizierter oder modifizierter Oligos auf Polystyrol-Platten. Andere umfassen kovalente Immobilisierung. Verschiedene Verfahren sind auch verwendet worden, um die Empfindlichkeit von Hybridisierungstests zu erhöhen. Polymere Einfang- und Nachweissonden sind synthetisiert und verwendet worden, um Empfindlichkeiten bis herunter zu 10⁷ DNA-Molkülen/ml zu erhalten. Ein weiteres Verfahren verwendete verzweigte Oligos, um die Empfindlichkeit von Hybridisierungstests zu erhöhen. Noch ein weiteres Verfahren verwendete ein mehrstufiges Antikörper-verstärktes Verfahren. Andere Typen von Nukleinsäuresonden, wie etwa Ribonukleinsäure (RNA), komplementäre DNA (cDNA) und Peptidnukleinsäuren (PNAs), sind zur Hybridisierung von PCR-Produkten in diagnostischen Anwendungen ebenfalls auf Mikrovertiefungsplatten immobilisiert worden. Überdies sind PCR-Primer auf für Festphasen-PCR auf Mikrovertiefungsplatten immobilisiert worden.
Nur relativ wenige Ansätze zum Immobilisieren von DNA haben bis heute ihren Weg in kommerzielle Produkte gefunden. Ein solches Produkt ist bekannt als „NucleoLink^®" und ist erhältlich von Nalge Nunc International (siehe z.B. Nunc Tech Note Vol. 3, No. 17). In diesem Produkt wird die DNA mit einem Carbodiimid umgesetzt, um 5'-Phosphatgruppen zu aktivieren, die dann mit funktionellen Gruppen auf der Oberfläche reagieren. Nachteile dieses Ansatzes sind, daß er den Extraschritt des Hinzufügens des Carbodiimid-Reagens erfordert sowie eine fünfstündige Reaktionszeit zur Immobilisierung von DNA und er beschränkt ist auf einen einzigen Typ von Substratmaterial.
Als ein weiteres Beispiel hat Pierce kürzlich ein geschütztes DNA-Immobilisierungsprodukt eingeführt, das als „Reacti-Bind^® DNA Coating Solutions" bekannt ist (siehe „Instructions – Reacti-Bind^® DNA Coating Solution" 1/1997). Dieses Produkt ist eine Lösung, die mit DNA vermischt und auf solche Oberflächen wie Polystyrol oder Polypropylen aufgebracht wird. Nach Inkubierung über Nacht wird die Lösung entfernt, die Oberfläche mit Puffer gewaschen und getrocknet, woraufhin sie fertig zur Hybridisierung ist. Obgleich die Produktliteratur es als nützlich für alle üblichen Kunststoffoberflächen, die im Labor verwendet werden, beschreibt, hat es einige Einschränkungen. Die Anmelder waren zum Beispiel nicht in der Lage, brauchbare Immobilisierung von DNA auf Polypropylen unter Verwendung der Anweisungen des Herstellers zu zeigen. Überdies erfordert dieses Produkt große Mengen an DNA. Die Anweisungen geben an, daß die DNA in einer Konzentration zwischen 0,5 und 5 μg/ml verwendet werden sollte.
In ähnlicher Weise vertreibt Costar ein Produkt, das „DNA-BIND^®" genannt wird, zur Verwendung bei der Bindung von DNA an die Oberfläche einer Vertiefung in einer Mikrovertiefungsplatte (siehe z.B. den DNA-BIND^® "Application Guide"). Die Oberfläche der DNA-BIND^®-Platte wird mit einem nicht-geladenen, nicht-polymeren, heterobifunktionellen Reagens mit niedrigem Molekulargewicht, das eine N-Oxysuccinimid(NOS)-reaktive Gruppe enthält, beschichtet. Diese Gruppe reagiert mit solchen Nukleophilen wie primären Aminen. Das heterobifunktionelle Beschichtungsreagens enthält auch eine photochemische Gruppe und einen Spacerarm, der die reaktive Gruppe kovalent an die Oberfläche der Polystyrolplatte bindet. Danach kann Amin-modifizierte DNA kovalent an die NOS-Oberfläche gekoppelt werden. Die DNA wird modifiziert durch Zugabe eines primären Amins entweder während des Syntheseverfahrens zum naszierenden Oligomer oder enzymatisch an die vorgebildete Sequenz. Da das DNA-BIND^®-Produkt auf Polystyrol beruht, ist es von beschränktem Nutzen für diejenigen Anwendungen, die erhöhte Temperaturen erfordern, wie etwa thermische Cyclisierung.
Diese verschiedenen Produkte können für bestimmte Zwecke oder unter bestimmten Bedingungen nützlich sein, neigen aber alle dazu, an einem oder mehrere Nachteilen und Beschränkungen zu leiden. Insbesondere neigen sie entweder dazu, große Mengen an Oligo zu erfordern, Niveaus an Hintergrundrauschen zu liefern, die unangemessen hoch sind, und/oder es fehlt ihnen an Vielseitigkeit.
Es wäre hoch wünschenswert, in der Lage zu sein, solche Moleküle wie Oligos an eine Oberfläche in einer Weise zu binden, die einige oder alle der Nachteile dieser früheren Ansätze vermeidet.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren und eine Reagenszusammensetzung zur kovalenten Bindung von Zielmolekülen an die Oberfläche eines Substrats, wie etwa Mikrovertiefungsplatten, Röhren, Perlen, Mikroskop-Objektträger, Siliciumwafer oder Membranen, zur Verfügung. In einer bevorzugten Ausführungsform werden das Verfahren und die Zusammensetzung verwendet, um Nukleinsäuresonden auf Kunststoffmaterialien, wie etwa Mikrovertiefungsplatten, z.B. zur Verwendung in Hybridisierungstests, zu immobilisieren. Mikrovertiefungsplatten können zum Beispiel aus einer Vielzahl von Materialien hergestellt werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Polystyrol, Polycarbonat, Polyvinylchlorid und Polypropylen, und mit einem Reagens der Erfindung beschichtet werden. Die Reagenszusammensetzung kann dann verwendet werden, um eine Nukleinsäure sowohl anzuziehen als auch kovalent zu binden, die ihrerseits verwendet werden kann, um an ihren komplementären Strang zu hybridisieren.
Eine Reagenszusammensetzung der Erfindung enthält thermochemisch reaktive Gruppen (d.h. Gruppen mit einer von der Temperatur abhängigen Reaktionsgeschwindigkeit) und anziehende Gruppen, wobei die anziehenden Gruppen ionische Gruppen sind. Die Zusammensetzung enthält auch photoreaktive Gruppen. Zusätzlich kann das Reagens ein oder mehrere hydrophile Polymere umfassen, an die die thermochemisch reaktiven, anziehenden und/oder photoreaktiven Gruppen gebunden sind. Die photoreaktiven Gruppen (alternativ hierin als „Photogruppen" bezeichnet) werden verwendet, um Reagensmoleküle bei Anwendung einer geeigneten Energiequelle, wie etwa Licht, an die Oberfläche des Trägers zu binden. Die thermochemisch reaktiven Gruppen ihrerseits können verwendet werden, um kovalente Bindungen mit geeigneten und komplementären funktionellen Gruppen auf dem Zielmolekül zu bilden. Im allgemeinen werden die Reagensmoleküle an die Oberfläche durch Aktivierung der Photogruppen gebunden werden, woraufhin das Zielmolekül (z.B. ein Oligo) zum gebundenen Reagens angezogen wird, weitgehend aufgrund ionischer Wechselwirkungen zwischen anziehenden (ionischen) Gruppen auf dem gebundenen Reagens und entgegengesetzt geladenen Gruppen auf dem Ziel. Nachdem es zum gebundenen Reagens und damit zur Oberfläche angezogen worden ist, kann das Zielmolekül an das gebundene Reagens durch Reaktion zwischen den reaktiven Gruppen des gebundenen Reagens und geeigneten funktionellen Gruppen auf dem Zielmolekül thermochemisch gekoppelt werden. Die thermochemisch reaktiven Gruppen und ionischen Gruppen können entweder auf demselben Polymer oder auf unterschiedlichen Polymeren liegen, die gemeinsam auf der Oberfläche immobilisiert sind.
Obgleich wir nicht an eine Theorie gebunden sein möchten, scheint es, daß das Vorhandensein von ionischen Gruppen, z.B. kationischen Gruppen, wie etwa quartären Ammoniumgruppen oder protonierten (d.h. angesäuerten) tertiären Aminen, dazu dient, die Nukleinsäuresequenz mittels elektrostatischer und anderer Kräfte zur Oberfläche anzuziehen. Diese Anziehung ihrerseits verstärkt die Fähigkeit der reaktiven Gruppen, sich effizient mit entsprechenden reaktiven Gruppen auf der Nukleinsäuresequenz zu koppeln. Fakultativ und bevorzugt kann das Zielmolekül mit funktionellen Gruppen hergestellt oder versehen werden, die auf reaktive Gruppen auf dem Reagensmolekül zugeschneidert sind. Während ihrer Synthese können die Oligos zum Beispiel mit solchen funktionellen Gruppen wie Amin- und Sulfhydrylgruppen hergestellt werden.
Die Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur Bindung eines Zielmaleküls, wie etwa eines Oligos, an eine Oberfläche bereit, indem ein Reagens, wie hierin beschrieben, eingesetzt wird. Ihrerseits stellt die Erfindung eine Oberfläche mit daran mittels eines solchen Reagens gebundenen Nukleinsäuren zur Verfügung, ebenso wie ein Material (z.B. eine Mikrovertiefungsplatte), die solch eine Oberfläche bereitstellt.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Zusammensetzung zur Verfügung, die ein Reagens (Reagentien) dieser Erfindung in Kombination mit einem Zielmolekül umfaßt (umfassen), das eine oder mehrere funktionelle Gruppen enthält, die mit der (den) thermochemisch reaktiven Gruppe(n) des Reagens reaktiv sind.
Ein Beispiel für ein besonders bevorzugtes Reagens ist zum Beispiel eines, das hierin als ein „PhotopolyQuat" beschrieben ist, in dem mehrere Photogruppen und mehrere kationische Gruppen (in der Form quartärer Ammoniumgruppen) an eine hydrophile polymere Hauptkette gebunden sind. Solch ein Reagens stellt außergewöhnliche Vielseitigkeit zur Verfügung, wenn es gleichzeitig mit einem PhotopolyNOS in optimalen Konzentrationen und Verhältnissen zur Immobilisierung von Zielmolekülen immobilisiert wird.
Unter Verwendung solcher Reagentien haben die Anmelder festgestellt, daß Einfangsonden kovalent an eine Vielzahl von Oberflächen immobilisiert werden können, einschließlich Oberflächen, die ansonsten die Sonden nicht adsorbieren würden (wie etwa Polypropylen und Polyvinylchlorid). Die resultierenden Oberflächen liefern Signale, die vergleichbar mit oder besser als diejenigen sind, die mit modifizierten Oligos erhalten werden, die an Polystyrol oder Polycarbonat adsorbiert sind.
Das vorliegende Immobilisierungsreagens und -verfahren können in Amplifikationsverfahren in einer Weise verwendet werden, die einfacher ist als diejenigen, die bisher berichtet worden sind, und können auch verbesserte Oberflächen für die kovalente Immobilisierung von Nukleophil-derivatisierten Nukleinsäuren liefern. Zusätzlich zu immobilisierten Sonden für Amplifikationsverfahren und Hybridisierungstests können die Reagentien dieser Erfindung verbesserte Nukleinsäureimmobilisierung für Festphasensequenzierung und für Immobilisierung von Primern für PCR und andere Amplifikationstechniken liefern.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Eine bevorzugte Reagenszusammensetzung der vorliegenden Erfindung umfaßt eine hydrophile Hauptkette, die eine oder mehrere ionische Gruppen trägt, die die Fähigkeit besitzen, ein entsprechendes Zielmolekül anzuziehen, zusammen mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppen, die nützlich sind zur Bindung des Reagens an eine Oberfläche, und einer oder mehreren thermochemisch reaktiven Gruppen, die nützlich sind zur Ausbildung einer kovalenten Bindung mit der entsprechenden reaktiven Gruppe des Zielmoleküls. Fakultativ und bevorzugt kann die Zusammensetzung die Verwendung von zwei oder mehr unterschiedlichen Reagensmolekülen einschließen, wobei das erste eine hydrophile Hauptkette umfaßt, die eine oder mehrere ionische Gruppen trägt, die die Fähigkeit besitzen, ein entsprechendes Zielmolekül anzuziehen, zusammen mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppen, die nützlich sind zur Bindung des Reagens an eine Oberfläche. Das zweite Reagensmolekül umfaßt eine hydrophile Hauptkette, die eine oder mehrere thermochemisch reaktive Gruppen trägt, die nützlich sind zur Ausbildung einer kovalenten Bindung mit der entsprechenden funktionellen Gruppe des Zielmoleküls, zusammen mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppen, die nützlich sind zur Bindung des Reagens an eine Oberfläche. Fakultativ ist nur eines der Reagensmoleküle erforderlich, um die photoreaktiven Gruppen zu haben, da jenes Reagens in der Lage ist, das zweite Polymer durch photochemische Vernetzung mit zu immobilisieren. In diesem Falle muß das Reagensmolekül jedoch zwei oder mehr photoreaktive Gruppen aufweisen, um Kopplung an die Oberfläche und an das zweite Polymer zu liefern.
In einer weiteren Erweiterung der Erfindung ist es nicht notwendig, daß sowohl die ionische Gruppe als auch die thermochemisch reaktive Gruppe als Teil eines hydrophilen Polymers eingearbeitet werden. Ein kleines heterobifunktionelles Molekül, das eine oder mehrere photoreaktive Gruppen und eine oder mehrere thermochemisch reaktive Gruppen aufweist, getrennt durch einen geeigneten Spacer, kann zum Beispiel mit einem photoreaktiven hydrophilen Polymer verwendet werden, das die ionische Gruppe aufweist, um die Immobilisierung von Nukleinsäuresequenzen zu bewerkstelligen. Umgekehrt kann ein heterobifunktionelles Molekül, das eine oder mehrere photoreaktive Gruppen und eine oder mehrere ionische Gruppen aufweist, getrennt durch einen geeigneten Spacer, mit einem photoreaktiven hydrophilen Polymer verwendet werden, das die thermochemisch reaktive Gruppe aufweist. Obgleich bevorzugt, ist die Verwendung einer hydrophilen polymeren Hauptkette nur fakultativ, da sowohl ionische Gruppen als auch thermochemisch reaktive Gruppen als zwei getrennte photoreaktive heterobifunktionelle Moleküle oder als ein einziges photoreaktives Molekül, das beide Typen von Gruppen trägt, eingearbeitet werden können.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist es möglich, Nukleinsäuresequenzen ohne die Verwendung der photoreaktiven Gruppe zu immobilisieren. Die zu beschichtende Oberfläche des Materials kann zum Beispiel mit thermochemisch reaktiven Gruppen versehen werden, die verwendet werden können, um hydrophile Polymere zu immobilisieren, die ionische und thermochemisch reaktive Gruppen, wie oben beschrieben, aufweisen. Eine Oberfläche kann zum Beispiel mit einem Ammoniak-Plasma behandelt werden, um eine begrenzte Zahl reaktiver Amine auf der Oberfläche des Materials einzubringen. Wenn diese Oberfläche dann mit einem hydrophilen Polymer behandelt wird, das sowohl die quartäre Ammoniumgruppe als auch NOS-Gruppen aufweist, kann das Polymer durch Reaktion der NOS-Gruppen mit Aminen auf der Oberfläche immobilisiert werden. Vorzugsweise liegen die NOS-Gruppen auf dem Polymer im Überschuß relativ zu den Aminen auf der Oberfläche vor, um sicherzustellen, daß eine ausreichende Zahl dieser thermochemisch reaktiven Gruppen im Anschluß an die Immobilisierung zurückbleibt, um Kopplung mit der Nukleinsäuresequenz zu ermöglichen.
Die Fachleute, denen die vorliegende Erfindung gegeben wird, werden in der Lage sein, geeignete ionische Gruppen in Abhängigkeit vom Typ des interessierenden Zielmoleküls zu identifizieren und auszuwählen. Zielmoleküle schließen Plasmid-DNA, Cosmid-DNA, Bakteriophagen-DNA, genomische DNA (schließt ohne Beschränkung Hefe-, Viren-, Bakterien-, Säuger-, Insekten-DNA ein), RNA, cDNA, PNA und Oligos ein, sind aber nicht hierauf beschränkt.
Geeignete ionische Gruppen schließen quartäre Ammoniumsalze, protonierte tertiäre Amine und weitere kationische Gruppen, wie etwa Phosphoniumverbindungen, ein. Ebenfalls eingeschlossen sind tertiäre Amingruppen, die protoniert werden können, wenn sie in eine saure Umgebung gegeben werden. Quartäre Ammoniumsalze schließen quartäre Alkylammoniumverbindungen, wie etwa [3-(Methacryloylamino)propyl]trimethylammoniumchlorid (MAPTAC), sowie quartäre aromatische Ammoniumgruppen, wie etwa Pyridiniumverbindungen, ein. Phosphoniumverbindungen schließen Polymere ein, die aus solchen Monomeren wie Tributyl(4-vinylbenzyl)phosphoniumchlorid hergestellt sind, und sind beschrieben in J. Appl. Polymer Sci. 53:1237 (1994), dessen Offenbarung ebenfalls hierin durch Bezugnahme mit einbezogen wird.
Eine polymere Hauptkette kann entweder synthetisch oder natürlichen Ursprungs sein und ist vorzugsweise ein synthetisches Polymer, das ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Oligomeren, Homopolymeren und Copolymeren besteht, die aus Additions- oder Kondensationspolymerisation stammen. Natürlich vorkommende Polymere, wie etwa Polysaccharide, Polypeptide, können ebenso verwendet werden. Bevorzugte Hauptketten sind insofern biologisch inert, als sie keine biologische Funktion bereitstellen, die mit ihrer Verwendung in der beschriebenen Art und Weise inkonsistent oder dafür schädlich sind.
Solche Polymer-Hauptketten können Acryle, wie etwa diejenigen, die aus Hydroxyethylacrylat, Hydroxyethylmethacrylat, Glycerylacrylat, Glycerylmethacrylat, Acrylamid und Methacrylamid polymerisiert sind, Vinyle, wie etwa Polyvinylpyrrolidon und Polyvinylalkohol, Nylons, wie etwa Polycaprolactam, Polylauryllactam, Polyhexamethylenadipamid und Polyhexamethylendodecandiamid, Polyurethane und Polyethylenoxid einschließen.
Die polymeren Hauptketten der Erfindung werden ausgewählt, um hydrophile Hauptketten bereitzustellen, die in der Lage sind, die gewünschte Anzahl und den gewünschten Typ von ionischen Gruppen, Photogruppen und thermochemisch reaktiven Gruppen zu tragen, wobei die Kombination vom ausgewählten Reagens abhängt. Die polymere Hauptkette wird auch ausgewählt, um einen Spacer zwischen der Oberfläche und den verschiedenen ionischen und thermochemisch reaktiven Gruppen bereitzustellen. Auf diese Weise kann das Reagens an eine Oberfläche oder an ein benachbartes Reagensmolekül gebunden werden, um die anderen Gruppen mit ausreichend Bewegungsfreiheit, um optimale Aktivität zu zeigen, zu versehen. Die Polymer-Hauptketten sind vorzugsweise hydrophil (z.B. wasserlöslich), wobei Polyacrylamid und Polyvinylpyrrolidon besonders bevorzugte Polymere sind.
Reagentien der Erfindung tragen eine oder mehrere latent reaktive (vorzugsweise photoreaktive) Seitengruppen, die kovalent an die Polymer-Hauptkette gebunden sind. Photoreaktive Gruppen sind hierin definiert und bevorzugte Gruppen sind ausreichend stabil, um unter Bedingungen gelagert zu werden, bei denen sie ihre Eigenschaften beibehalten. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,002,582, dessen Offenbarung hierin durch Bezugnahme mit einbezogen wird. Latent reaktive Gruppen können ausgewählt werden, die auf verschiedene Bereiche des elektromagnetischen Spektrums ansprechen, wobei diejenigen, die auf ultraviolette und sichtbare Bereiche des Spektrums ansprechen (hierin als „photoreaktiv" bezeichnet) besonders bevorzugt sind.
Photoreaktive Gruppen reagieren auf spezifische angewendete äußere Stimuli, um die Erzeugung von aktiven Spezies zu durchlaufen, mit resultierender kovalenter Bindung an eine benachbarte chemische Struktur, wie z.B. bereitgestellt durch dasselbe oder ein unterschiedliches Molekül. Photoreaktive Gruppen sind diejenigen Gruppen von Atomen in einem Molekül, die ihre kovalenten Bindungen unverändert unter Lagerbedingungen beibehalten, aber die, bei Aktivierung durch eine äußere Energiequelle, kovalente Bindungen mit anderen Molekülen bilden.
Die photoreaktiven Gruppen erzeugen aktive Spezies, wie etwa freie Radikale und insbesondere Nitrene, Carbene und angeregte Zustände von Ketonen, bei Absorption elektromagnetischer Energie. Photoreaktive Gruppen können ausgewählt werden, um auf verschiedene Bereiche des elektromagnetischen Spektrums anzusprechen, und photoreaktive Gruppen, die auf z.B. ultraviolette und sichtbare Bereiche des Spektrums ansprechen, sind bevorzugt und können hierin hin und wieder als „photochemische Gruppe" oder „Photogruppe" bezeichnet werden.
Photoreaktive Arylketone sind bevorzugt, wie etwa Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnliche Heterocyclen (d.h. heterocyclische Analoge von Anthron, wie etwa diejenigen, die N, O oder S in der 10-Position aufweisen) oder ihre substituierten (z.B. ringsubstituierten) Derivate. Die funktionellen Gruppen solcher Ketone sind bevorzugt, da sie ohne weiteres in der Lage sind, den hierin beschriebenen Aktivierungs-/Inaktivierungs-/Reaktivierungs-Zyklus zu durchlaufen. Benzophenon ist eine besonders bevorzugte photoreaktive Einheit, da sie zu photochemischer Anregung mit anfänglicher Bildung eines angeregten Singulettzustandes in der Lage ist, der Intersystem-Crossing zum Triplett-Zustand durchläuft. Der angeregte Triplett-Zustand kann in Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen durch Abstraktion eines Wasserstoffatoms (zum Beispiel von einer Trägeroberfläche) eingeführt werden, wodurch ein Radikalen-Paar geschaffen wird. Anschließender Kollaps des Radikalen-Paares führt zur Bildung einer neuen Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung. Wenn eine reaktive Bindung (z.B. Kohlenstoff-Wasserstoff) nicht zur Bindung verfügbar ist, ist die durch ultraviolettes Licht induzierte Anregung der Benzophenongruppe reversibel und das Molekül kehrt bei Entfernung der Energiequelle zum Energieniveau des Grundzustandes zurück. Photoaktivierbare Arylketone, wie etwa Benzophenon oder Acetophenon, sind insofern von besonderer Bedeutung, als diese Gruppen mehrfacher Reaktivierung in Wasser unterliegen und somit erhöhte Beschichtungseffizienz bereitstellen. Daher sind photoreaktive Arylketone besonders bevorzugt.
Die Azide stellen eine bevorzugte Klasse von photoreaktiven Gruppen dar und schließen Arylazide (C₆R₅N₃), wie etwa Phenylazid und insbesondere 4-Fluor-3-nitrophenylazid, Acylazide (-CO-N₃), wie etwa Benzoylazid und p-Methylbenzoylazid, Azidoformiate (-O-CO-N₃), wie etwa Ethylazidoformiat, Phenylazidoformiat, Sulfonylazide (-SO₂-N₃), wie etwa Benzolsulfonylazid, und Phosphorylazide (RO)₂PON₃, wie etwa Diphenylphosphorylazid und Diethylphosphorylazid, ein. Diazoverbindungen stellen eine weitere Klasse photoreaktiver Gruppen dar und schließen Diazoalkane (-CHN₂), wie etwa Diazomethan und Diphenyldiazomethan, Diazoketone (-CO-CHN₂), wie etwa Diazoacetophenon und 1-Trifluormethyl-1-diazo-2-pentanon, Diazoacetate (-O-CO-CHN₂), wie etwa t-Butyl-Diazoacetat und Phenyldiazoacetat, und beta-Keto-alpha-diazoacetate (-CO-CN₂-CO-O-), wie etwa t-Butyl-alpha-diazoacetoacetat, ein. Weitere photoreaktive Gruppen schließen die Diazirine (-CHN₂), wie etwa 3-Trifluormethyl-3-phenyldiazirin, und Ketene (-CH=C=O), wie etwa Keten und Diphenylketen, ein. Photoaktivierbare Arylketone, wie etwa Benzophenon und Acetophenon, sind insofern von besonderer Bedeutung, als diese Gruppen mehrfacher Reaktivierung in Wasser unterliegen und daher erhöhte Beschichtungseffizienz bereitstellen.
Bei Aktivierung der photoreaktiven Gruppen werden die Reagensmoleküle aneinander und/oder an die Materialoberfläche durch kovalente Bindung durch Reste der photoreaktiven Gruppen kovalent gebunden. Beispielhafte photoreaktive Gruppen und ihre Reste bei Aktivierung, sind wie folgt dargestellt.
Die Fachleute, denen die vorliegende Beschreibung gegeben wird, werden in der Lage sein, geeignete thermochemisch reaktive Gruppen, um für kovalente Immobilisierung von in geeigneter Weise derivatisierten Nukleinsäuresequenzen zu sorgen, zu identifizieren und auszuwählen. Eine Amino-derivatisierte Nukleinsäuresequenz wird zum Beispiel eine kovalente Kopplungsreaktion mit einem aktivierten Ester, wie etwa einem NOS-Ester, durchlaufen, um eine Amid-Verknüpfungsgruppe zu liefern. Ähnliche aktivierte Ester, wie etwa p-Nitrophenyl- und Pentafluorphenylester, würden ebenfalls Amid-Verknüpfungen liefern, wenn sie mit Amingruppen umgesetzt würden. Die Fachleute würden auch zahlreiche weitere Amin-reaktive funktionelle Gruppen erkennen, wie etwa Isocyanate, Thioisocyanate, Carbonsäurechloride, Epoxide, Aldehyde, Alkylhalogenide und Sulfonatester, wie etwa Mesylat, Tosylat und Tresylat, von denen jede als die thermochemisch reaktive Gruppe dienen könnte.
In einem weiteren Beispiel kann die Nukleinsäuresequenz mit einer Sulfhydrylgruppe unter Verwendung von im Stand der Technik gut bekannten Techniken derivatisiert werden. Die entsprechende thermochemisch reaktive Gruppe wäre zum Beispiel eine Maleimid-Ringstruktur oder ein α-Iodacetamid. Jede dieser Strukturen würde ohne weiteres reagieren, um eine kovalente Verknüpfung mit der Sulfhydryl-derivatisierten Nukleinsäuresequenz zu liefern.
Die funktionalisierten Polymere dieser Erfindung können hergestellt werden durch geeignete Derivatisierung eines vorgebildeten Polymers oder bevorzugter durch Polymerisation eines Satzes von Comonomeren, um das gewünschte Substitutionsmuster zu ergeben. Der letztere Ansatz ist bevorzugt wegen der Leichtigkeit der Veränderung des Verhältnisses der verschiedenen Comonomere und durch die Fähigkeit, das Einbeziehungsniveau in das Polymer zu steuern. Eine Kombination dieser zwei Ansätze kann ebenfalls verwendet werden, um optimale Strukturen bereitzustellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden zum Beispiel Monomere mit einer polymerisierbaren Gruppe an einem Ende des Moleküls hergestellt, getrennt durch eine Spacergruppe von einer photoreaktiven oder thermochemisch reaktiven Gruppe am anderen Ende. Polymerisierbare Vinylgruppen, wie etwa Acrylamide, Acrylate oder Maleimide, können zum Beispiel durch einen kurzen Kohlenwasserstoff-Spacer an einen aktivierten Ester, wie etwa einen NOS-Ester, oder an eine photoreaktive Gruppe, wie etwa ein substituiertes Benzophenon, gekoppelt werden. Diese Verbindungen können unter Verwendung von Techniken der organischen Synthese, die den Fachleuten gut bekannt sind, hergestellt und gereinigt werden. Einige der gewünschten Monomere sind kommerziell erhältlich, wie etwa MAPTAC, N-[3-(Dimethylamino)propyl]methacrylamid (DMAPMA), und N-(3-Aminopropyl)methacrylamid-Hydrochlorid (APMA), wobei diese Verbindungen quartäre Ammoniumsalze, tertiäre Amine bzw. primäre Amine entlang der Hauptkette des Polymers bereitstellen.
Copolymere können aus den obigen Monomeren unter Verwendung von Techniken, die den Fachleuten bekannt sind, ebenso hergestellt werden. Vorzugsweise durchlaufen diese Monomere und Copolymere radikalische Polymerisation von Vinylgruppen unter Verwendung von Azo-Initiatoren, wie etwa 2,2'-Azobisisobutyronitril (AIBN), oder Peroxiden, wie etwa Benzoylperoxid. Die für die Polymerisation ausgewählten Monomere werden auf der Grundlage der Natur des endgültigen Polymerproduktes ausgewählt. Ein photoreaktives Polymer, das quartäre Ammoniumgruppen enthält, wird zum Beispiel aus einem Monomer hergestellt, das die photoreaktive Gruppe enthält, und einem zweiten Monomer, das eine quartäre Ammoniumgruppe enthält. Ein photoreaktives Polymer, das eine NOS-Gruppe enthält, wird hergestellt aus einem Monomer, das die photoreaktive Gruppe enthält, und einem zweiten Monomer, das den aktivierten NOS-Ester enthält. Ein photoreaktives Polymer, das sowohl quartäre Ammoniumgruppen als auch NOS-Ester enthält, wird unter Verwendung aller drei Monomere hergestellt.
Die Zusammensetzung des endgültigen Polymers kann durch das Molverhältnis der Monomere, die zur Polymerisationsreaktion zugeführt werden, gesteuert werden. Typischerweise werden diese funktionalisierten Monomere in relativ geringen Molprozentanteilen des Gesamtmonomergehaltes der Polymerisationsreaktion verwendet, wobei der Rest der Zusammensetzung aus einem Monomer besteht, das weder photoreaktiv noch thermochemisch reaktiv gegenüber der Nukleinsäuresequenz ist. Beispiele für solche Monomere schließen Acrylamid und N-Vinylpyrrolidon ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Auf der Grundlage der relativen Reaktivitäten der verwendeten Monomere ist die Verteilung der Monomere entlang der Hauptkette weitgehend statistisch.
In einigen Fällen kann die thermochemisch reaktive Gruppe auf der Hauptkette des Polymers selbst als ein polymerisierbares Monomer wirken, wenn sie während der Polymerisation vorliegt, wodurch die Einführung jener Gruppe in einem zweiten Schritt erforderlich ist, im Anschluß an die anfängliche Bildung des Polymers. Die Herstellung eines photoreaktiven Polymers, das Maleimid entlang der Hauptkette aufweist, kann zum Beispiel durch eine anfängliche Herstellung eines Polymers, das sowohl photoreaktive Gruppen als auch Amingruppen enthält, unter Verwendung der obenbeschriebenen Techniken, gefolgt von einer Reaktion der Amingruppen mit einem heterobifunktionellen Molekül, das eine Maleimidgruppe und ein Isocyanat enthält, verbunden durch einen kurzen Kohlenwasserstoff-Spacer, bewerkstelligt werden. Eine breite Vielfalt solcher Polymermodifikationstechniken ist unter Verwendung typischer organischer Reaktionen, die den Fachleuten bekannt sind, verfügbar.
Die Erfindung wird weiter unter Bezugnahme auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele beschrieben werden. Es wird den Fachleuten klar sein, daß viele Veränderungen in den beschriebenen Ausführungsformen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Somit sollte der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht durch die in dieser Anmeldung beschriebenen Ausführungsformen beschränkt werden, sondern nur durch Ausführungsformen, die durch die Sprache der Ansprüche beschrieben sind, und durch die Äquivalente dieser Ausführungsformen. Sofern nicht anders angegeben, sind alle Prozentanteile gewichtsbezogen. Strukturen der verschiedenen „Verbindungen", die in diesen Beispielen identifiziert werden, sind in Tabelle 9 zu finden, die unten einbezogen ist.
BEISPIELE
Beispiel 1
Darstellung von 4-Benzoylbenzoylchlorid (BBA-Cl) (Verbindung I)
4-Benzoylbenzoesäure (BBA), 1,0 kg (4,42 mol), wurde zu einem trockenen 5 Liter-Mortonkolben, ausgestattet mit einem Rückflußkühler und Überkopfrührer, zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 645 ml (8,84 mol) Thionylchlorid und 725 ml Toluol. Dimethylformamid, 3,5 ml, wurde dann zugegeben und die Mischung wurde bei Rückfluß für 4 Stunden erhitzt. Nach Abkühlung wurden die Lösemittel unter verringertem Druck abgezogen und das restliche Thionylchlorid wurde durch drei Eindampfungen unter Verwendung von 3 × 500 ml Toluol entfernt. Das Produkt wurde aus 1:4 Toluol:Hexan umkristallisiert, um 988 g (91 % Ausbeute) nach Trocknung in einem Vakuumofen zu ergeben. Der Produktschmelzpunkt betrug 92–94°C. Die Analyse durch kernmagnetische Resonanz (NMR) bei 80 MHz (¹H-NMR (CDCl₃)) war konsistent mit dem gewünschten Produkt: aromatische Protonen 7,20–8,25 (m, 9H). Alle chemischen Verschiebungswerte sind in ppm feldabwärts von einem inneren Tetramethylsilan-Standard angegeben. Die endgültige Verbindung wurde zur Verwendung in der Darstellung eines Monomers aufbewahrt, das in der Synthese photoaktivierbarer Polymere verwendet wird, wie zum Beispiel beschrieben in Beispiel 3.
Beispiel 2
Darstellung von N-(3-Aminopropyl)methacrylamid-Hydrochlorid (APMA) (Verbindung II)
Eine Lösung von 1,3-Diaminopropan, 1.910 g (25,77 mol), in 1.000 ml CH₂Cl₂ wurde zu einem 12 Liter-Mortonkolben zugegeben und auf einem Eisbad abgekühlt. Eine Lösung von t-Butylphenylcarbonat, 1.000 g (5,15 mol), in 250 ml CH₂Cl₂ wurde dann tropfenweise mit einer Geschwindigkeit zugegeben, die die Reaktionstemperatur unter 15°C hielt. Im Anschluß an die Zugabe wurde die Mischung auf Raumtemperatur erwärmt und 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 900 ml CH₂Cl₂ und 500 g Eis verdünnt, gefolgt von der langsamen Zugabe von 2.500 ml 2,2 N NaOH. Nach Testen, um sicherzustellen, daß die Lösung basisch war, wurde das Produkt in einen Schütteltrichter überführt und die organische Schicht wurde entfernt und als Extrakt #1 zur Seite gestellt. Die wäßrige Phase wurde dann mit 3 × 1.250 ml CH₂Cl₂ extrahiert, wobei jede Extraktion als eine separate Fraktion behalten wurde. Die vier organischen Extrakte wurden dann nacheinander mit einer einzigen 1.250 ml-Portion von 0,6 N NaOH gewaschen, beginnend mit Fraktion #1 und fortschreitend bis zu Fraktion #4. Dieser Waschvorgang wurde ein zweites Mal mit einer frischen 1.250 ml-Portion von 0,6 N NaOH wiederholt. Die organischen Extrakte wurden dann vereinigt und über Na₂SO₄ getrocknet. Filtration und Verdampfung von Lösemittel bis zu einem konstanten Gewicht ergab 825 g N-Mono-t-BOC-1,3-diaminopropan, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Eine Lösung von Methacrylsäureanhydrid, 806 g (5,23 mol), in 1.020 ml CHCl₃ wurde in einen 12 Liter-Mortonkolben, der mit einem Überkopfrührer ausgestattet war, gegeben und auf einem Eisbad abgekühlt. Phenothiazin, 60 mg, wurde als ein Inhibitor zugesetzt, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von N-Mono-t-BOC-1,3-diaminopropan, 825 g (4,73 mol), in 825 ml CHCl₃. Die Zugabegeschwindigkeit wurde so gesteuert, daß die Reaktionstemperatur zu jeder Zeit unter 10°C blieb. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde das Eisbad entfernt und die Mischung stehengelassen, um über Nacht zu rühren. Das Produkt wurde mit 2.400 ml Wasser verdünnt und in einen Schütteltrichter überführt. Nach gründlichem Mischen wurde die wäßrige Schicht entfernt und die organische Schicht wurde mit 2.400 ml 2 N NaOH gewaschen, was sicherstellte, daß die wäßrige Schicht basisch war. Die organische Schicht wurde dann über Na₂SO₄ getrocknet und filtriert, um Trocknungsmittel zu entfernen. Eine Portion des CHCl₃-Lösemittels wurde unter verringertem Druck abgezogen, bis das kombinierte Gewicht des Produkts und Lösemittels ungefähr 3.000 g betrug. Das gewünschte Produkt wurde dann durch langsame Zugabe von 11,0 Litern Hexan zur gerührten CHCl₃-Lösung ausgefällt, gefolgt von Lagerung über Nacht bei 4°C. Das Produkt wurde durch Filtration isoliert und der Feststoff wurde zweimal mit einer Lösemittelkombination aus 900 ml Hexan und 150 ml CHCl₃ gespült. Gründliches Trocknen des Feststoffes ergab 900 g N-[N'-(t-Butyloxycarbonyl)-3-aminopropyl]-methacrylamid, Schmp. 85,8°C nach DSC. Die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) Amid-NHs 6,30–6,80, 4,55–5,10 (m, 2H), Vinylprotonen 5,65, 5,20 (m, 2H), Methylene benachbart zu N 2,90–3,45 (m, 4H), Methyl 1,95 (m, 3H), restliches Methylen 1,50–1,90 (m, 2H) und t-Butyl 1,40 (s, 9H).
Ein 2 Liter-Dreihalsrundkolben wurde mit einem Überkopfrührer und einem Begasungsrohr ausgestattet. Methanol, 700 ml, wurde zum Kolben zugegeben und auf einem Eisbad abgekühlt. Während des Rührens wurde HCl-Gas in das Lösemittel mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 5 Litern/Minute für insgesamt 40 Minuten eingeleitet. Die Molarität der letztendlichen HCl/MeOH-Lösung wurde zu 8,5 M durch Titration mit 1 N NaOH unter Verwendung von Phenolphthalein als einem Indikator bestimmt. Das N-[N'-(t-Butyloxycarbonyl)-3-aminopropyl]methacrylamid, 900 g (3,71 mol), wurde zu einem 5 Liter-Mortonkolben zugegeben, der mit einem Überkopfrührer und einem Gasauslaßadapter ausgestattet war, gefolgt von der Zugabe von 1.150 ml Methanol-Lösemittel. Einige Feststoffe verblieben im Kolben mit diesem Lösemittel-Volumen. Phenothiazin, 30 mg, wurde als ein Inhibitor zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 655 ml (5,57 mol) der 8,5 M HCl/MeOH-Lösung. Die Feststoffe lösten sich mit der Entwicklung von Gas langsam auf, aber die Reaktion war nicht exotherm. Die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, um vollständige Reaktion sicherzustellen. Jegliche Feststoffe wurden durch Filtration entfernt und zusätzliche 30 mg Phenothiazin wurden zugesetzt. Das Lösemittel wurde dann unter verringertem Druck gestrippt und der resultierende feste Rückstand wurde mit 3 × 1.000 ml Isopropanol mit Verdampfung unter verringertem Druck einer azeotropen Destillation unterzogen. Schließlich wurde das Produkt in 2.000 ml von unter Rückfluß kochendem Isopropanol gelöst und 4.000 ml Ethylacetat wurden langsam unter Rühren zugegeben. Die Mischung ließ man langsam abkühlen und wurde bei 4°C über Nacht aufbewahrt. Verbindung II wurde durch Filtration isoliert und wurde bis zu konstantem Gewicht getrocknet, was eine Ausbeute von 630 g mit einem Schmelzpunkt von 124,7°C nach DSC ergab. Die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (D₂O) Vinyl-Protonen 5,60, 5,30 (m, 2H), Methylen benachbart zu Amid-N 3,30 (t, 2H), Methylen benachbart zu Amin-N 2,95 (t, 2H), Methyl 1,90 (m, 3H) und restliches Methylen 1,65–2,10 (m, 2H). Die endgültige Verbindung wurde zur Verwendung in der Darstellung eines Monomers aufbewahrt, das verwendet wurde zur Synthese von photoaktivierbaren Polymeren, wie zum Beispiel in Beispiel 3 beschrieben.
Beispiel 3
Darstellung von N-[3-(4-Benzoylbenzamidozpropyl]methacrylamid (BBA-APMA) (Verbindung III)
Verbindung II, 120 g (0,672 mol), hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 2 beschrieben ist, wurde zugegeben zu einem trockenen 2 Liter-Dreihalsrundkolben, der ausgerüstet war mit einem Überkopfrührer. Phenothiazin, 23–25 mg, wurde als ein Inhibitor zugegeben, gefolgt von 800 ml Chloroform. Die Suspension wurde auf einem Eisbad unter 10°C abgekühlt und 172,5 g (0,705 mol) Verbindung I, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wurden als ein Feststoff zugegeben. Triethylamin, 207 ml (1,485 mol), in 50 ml Chloroform wurde dann tropfenweise über einen 1- bis 1,5-stündigen Zeitraum zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt und Rühren bei Umgebungstemperatur wurde für 2,5 Stunden fortgesetzt. Das Produkt wurde dann mit 600 ml 0,3 N HCl und 2 × 300 ml 0,07 N HCl gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wurde das Chloroform unter verringertem Druck abgezogen und das Produkt wurde zweimal aus 4:1 Toluol:Chloroform umkristallisiert, wobei 23–25 mg Phenothiazin in jeder Umkristallisation verwendet wurden, um Polymerisation zu verhindern. Typische Ausbeuten an Verbindung III waren 90% mit einem Schmelzpunkt von 147–151°C. Die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) aromatische Protonen 7,20–7,95 (m, 9H), Amid-NH 6,55 (breites t, 1H), Vinyl-Protonen 5,65, 5,25 (m, 2H), Methylene benachbart zu Amid-Ns 3,20–3,60 (m, 4H), Methyl 1,95 (s, 3H) und restliches Methylen 1,50–2,00 (m, 2H). Die endgültige Verbindung wurde zur Verwendung in der Darstellung eines Monomers aufbewahrt, das verwendet wurde zur Synthese von photoaktivierbaren Polymeren, wie zum Beispiel in den Beispielen 9–11 beschrieben.
Beispiel 4
Darstellung von N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat (MAL-EAC-NOS) (Verbindung IV)
Ein funktionalisiertes Monomer wurde auf dieselbe Art und Weise hergestellt und wurde verwendet, wie beschrieben in den Beispielen 9 und 12, um aktivierte Estergruppen auf der Hauptkette eines Polymers einzuführen. 6-Aminohexansäure, 100,0 g (0,762 mol), wurde in 300 ml Essigsäure in einem 3 Liter-Dreihalskolben gelöst, der mit einem Überkopfrührer und Trockenrohr ausgerüstet war. Maleinsäureanhydrid, 78,5 g (0,801 mol), wurde in 200 ml Essigsäure gelöst und zur 6-Aminohexansäure-Lösung zugegeben. Die Mischung wurde eine Stunde gerührt, während sie auf einem siedenden Wasserbad erhitzt wurde, was zur Bildung eines weißen Feststoffes führte. Nach Abkühlung über Nacht bei Raumtemperatur wurde der Feststoff durch Filtration gesammelt und mit 2 × 50 ml Hexan gespült. Nach dem Trocknen betrug die typische Ausbeute der (Z)-4-Oxo-5-aza-2-undecendisäure 158–165 g (90–95%) mit einem Schmelzpunkt von 160–165°C. Die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (DMSO-d₆) Amid-Proton 8,65–9,05 (m, 1H), Vinyl-Protonen 6,10, 6,30 (d, 2H), Methylen benachbart zu Stickstoff 2,85–3,25 (m, 2H), Methylen benachbart zu Carbonyl 2,15 (t, 2H) und restliche Methylene 1,00–1,75 (m, 6H).
(Z)-4-Oxo-S-aza-2-undecendisäure, 150,0 g (0,654 mol), Essigsäureanhydrid, 68 ml (73,5 g, 0,721 mol), und Phenothiazin, 500 mg, wurden zu einem 2 Liter-Dreihalsrundkolben zugegeben, der mit einem Überkopfrührer ausgerüstet war. Triethylamin, 91 ml (0,653 mol), und 600 ml THF wurden zugegeben und die Mischung wurde auf Rückfluß unter Rühren erhitzt. Nach insgesamt 4 Stunden Rückfluß wurde die dunkle Mischung auf <60°C abgekühlt und in eine Lösung von 250 ml 12 N HCl in 3 Litern Wasser gegossen. Die Mischung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und wurde dann durch ein Filtrationskissen (Celite 545, J.T. Baker, Jackson, TN) filtriert, um Feststoffe zu entfernen. Das Filtrat wurde mit 4 × 500 ml Chloroform extrahiert und die vereinigten Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet. Nach der Zugabe von 15 mg Phenothiazin, um Polymerisation zu verhindern, wurde das Lösemittel unter verringertem Druck abgezogen. Die 6-Maleimidohexansäure wurde aus 2:1 Hexan:Chloroform umkristallisiert, um typische Ausbeuten von 76–83 g (55–60%) mit einem Schmelzpunkt von 81–85°C zu ergeben. Die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) Maleimid-Protonen 6,55 (s, 2H), Methylen benachbart zu Stickstoff 3,40 (t, 2H), Methylen benachbart zu Carbonyl 2,30 (t, 2H) und restliche Methylene 1,05–1,85 (m, 6H).
Die 6-Maleimidohexansäure, 20,0 g (94,7 mmol), wurde in 100 ml Chloroform unter einer Argonatmosphäre gelöst, gefolgt von der Zugabe von 41 ml (0,47 mol) Oxalylchlorid. Nach Rühren für 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Lösemittel unter verringertem Druck abgezogen, wobei 4 × 25 ml zusätzliches Chloroform verwendet wurden, um das letzte des überschüssigen Oxalylchlorids zu entfernen. Das Säurechlorid wurde in 100 ml Chloroform gelöst, gefolgt von der Zugabe von 12,0 g (0,104 mol) N-Hydroxysuccinimid und 16,0 ml (0,114 mol) Triethylamin. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Produkt mit 4 × 100 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Abziehen des Lösemittels ergab 24,0 g Produkt (82%), das ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) Maleimid-Protonen 6,60 (s, 2H), Methylen benachbart zu Stickstoff 3,45 (t, 2H), Succinimidyl-Protonen 2,80 (s, 4H), Methylen benachbart zu Carbonyl 2,55 (t, 2H) und restliche Methylene 1,15–2,00 (m, 6H). Die endgültige Verbindung wurde zur Verwendung in der Synthese von photoaktivierbaren Polymeren aufbewahrt, wie zum Beispiel in den Beispielen 9 und 12 beschrieben.
Beispiel 5
Darstellung von N-Succinimidyl-6-methacrylamidohexanoat (MA-EAC-NOS) (Verbindung V)
Ein funktionalisiertes Monomer wurde auf dieselbe Art und Weise hergestellt und wurde verwendet, wie beschrieben in Beispiel 11, um aktivierte Estergruppen auf der Hauptkette eines Polymers einzuführen. 6-Aminocapronsäure, 4,00 g (30,5 mmol), wurde in einen trockenen Rundkolben gegeben, der mit einem Trockenrohr ausgerüstet war. Methacrylsäureanhydrid, 5,16 g (33,5 mmol), wurde dann zugegeben und die Mischung wurde bei Raumtemperatur für vier Stunden gerührt. Das resultierende dicke Öl wurde dreimal mit Hexan trituriert und das restliche Öl wurde in Chloroform gelöst, gefolgt von Trocknen über Natriumsulfat. Nach Filtration und Eindampfung wurde ein Teil des Produktes durch Silicagelflashchromatographie unter Verwendung eines 10% Methanol-in-Chloroform-Lösemittelsystems gereinigt. Die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, 1 mg Phenothiazin wurde zugegeben und das Lösemittel wurde unter verringertem Druck abgezogen. Die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) Carbonsäure-Proton 7,80–8,20 (b, 1H), Amid-Proton 5,80–6,25 (b, 1H), Vinyl-Protonen 5,20 und 5,50 (m, 2H), Methylen benachbart zu Stickstoff 3,00–3,45 (m, 2H), Methylen benachbart zu Carbonyl 2,30 (t, 2H), Methylgruppe 1,95 (m, 3H) und restliche Methylene 1,10–1,90 (m, 6H).
6-Methacrylamidohexansäure, 3,03 g (15,2 mmol), wurde in 30 m trockenem Chloroform gelöst, gefolgt von der Zugabe von 1,92 g (16,7 mmol) N-Hydroxysuccinimid und 6,26 g (30,4 mmol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid. Die Reaktion wurde in einer trockenen Atmosphäre über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der Feststoff wurde dann durch Filtration entfernt und ein Teil wurde durch Silicagelflashchromatographie gereinigt. Nicht-polare Verunreinigungen wurden unter Verwendung eines Chloroform-Lösemittels entfernt, gefolgt von Elution des gewünschten Produktes unter Verwendung eines 10% Tetrahydrofuran-in-Chloroform-Lösemittels. Die geeigneten Fraktionen wurden gepoolt, 0,2 mg Phenothiazin wurden zugegeben und das Lösemittel wurde unter verringertem Druck abgezogen. Dieses Produkt, das geringe Mengen 1,3-Dicyclohexylharnstoff als eine Verunreinigung enthielt, wurde ohne weitere Reinigung verwendet. Die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) Amid-Proton 5,60–6,10 (b, 1H), Vinyl-Protonen 5,20 und 5,50 (m, 2H), Methylen benachbart zu Stickstoff 3,05–3,40 (m, 2H), Succinimidyl-Protonen 2,80 (s, 4H), Methylen benachbart zu Carbonyl 2,55 (t, 2H), Methyl 1,90 (m, 3H) und restliche Metyhlene 1,10–1,90 (m, 6H). Die endgültige Verbindung wurde zur Verwendung in der Synthese photoaktivierbarer Polymere aufbewahrt, wie zum Beispiel beschrieben in Beispiel 11.
Beispiel 6
Darstellung von 4-Brommethylbenzophenon (BMBP) (Verbindung VI)
4-Methylbenzophenon, 750 g (3,82 mol), wurde zu einem 5 Liter-Mortonkolben zugegeben, der mit einem Überkopfrührer ausgerüstet war, und in 2.850 ml Benzol gelöst. Die Lösung wurde dann auf Rückfluß erhitzt, gefolgt von der tropfenweisen Zugabe von 610 g (3,82 mol) Brom in 330 ml Benzol. Die Zugabegeschwindigkeit betrug ungefähr 1,5 ml/min und der Kolben wurde mit einem 90 Watt(90 Joule/s)-Halogenstrahler bestrahlt, um die Reaktion einzuleiten. Eine Zeituhr wurde mit der Lampe verwendet, um 10% Betriebszyklus (5 Sekunden an, 40 Sekunden aus) bereitzustellen, gefolgt in einer Stunde von einem 20%-Betriebszyklus (10 Sekunden an, 40 Sekunden aus). Am Ende der Zugabe wurde das Produkt durch Gaschromatographie analysiert und es wurde festgestellt, daß es 71% der gewünschten Verbindung VI, 8% des Dibromproduktes und 20% nicht-umgesetztes 4-Methylbenzophenon enthielt. Nach Abkühlung wurde die Reaktionsmischung mit 10% Natriumbisulfit in 100 ml Wasser gewaschen, gefolgt von einem Waschen mit 3 × 200 ml Wasser. Das Produkt wurde über Natriumsulfat getrocknet und zweimal aus 1:3 Toluol:Hexan umkristallisiert. Nach Trocknen unter Vakuum wurden 635 g Verbindung VI isoliert, die eine Ausbeute von 60% lieferten und einen Schmelzpunkt von 112–114°C aufwiesen. Die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) aromatische Protonen 7,20–7,80 (m, 9H) und benzylische Protonen 4,48 (s, 2H). Die endgültige Verbindung wurde zur Verwendung in der Darstellung eines photoaktivierbaren Kettenübertragungsmittels, wie beschrieben in Beispiel 7, aufbewahrt.
Beispiel 7
Darstellung von N-(2-Mercaptoethyl)-3,5-bis(4-benzoylbenzyloxy)benzamid (Verbindung VII)
3,5-Dihydroxybenzoesäure, 46,2 g (0,30 mol), wurde in einen 250 ml-Kolben eingewogen, der mit einem Soxhlet-Extraktor und einem Rückflußkühler ausgerüstet war. Methanol, 48,6 ml, und konzentrierte Schwefelsäure, 0,8 ml, wurden zum Kolben zugegeben und 48 g 3A-Molekülsiebe wurden in den Soxhlet-Extraktor gegeben. Der Extraktor wurde mit Methanol gefüllt und die Mischung wurde bei Rückfluß über Nacht erhitzt. Gaschromatographische Analyse des resultierenden Produktes zeigte eine 98% Umsetzung zum gewünschten Methylester. Das Lösemittel wurde unter verringertem Druck abgezogen, um ungefähr 59 g Rohprodukt zu ergeben. Das Produkt wurde im folgenden Schritt ohne weitere Reinigung verwendet. Eine kleine Probe wurde zuvor für NMR-Analyse gereinigt, was zu einem mit dem gewünschten Produkt konsistenten Spektrum führte: ¹H-NMR (DMSO-D₆) aromatische Protonen 6,75 (d, 2H) und 6,38 (t, 1H) und Methylester 3,75 (s, 3H).
Das gesamte Methylesterprodukt aus obigem wurde in einen 2 Liter-Kolben mit einem Überkopfrührer und Rückflußkühler gegeben, gefolgt von der Zugabe von 173,25 g (0,63 mol) Verbindung VI, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 7 beschrieben ist, 207 g (1,50 mol) Kaliumcarbonat und 1.200 ml Aceton. Die resultierende Mischung wurde dann über Nacht unter Rückfluß gekocht, um vollständige Reaktion zu ergeben, wie angezeigt durch Dünnschichtchromatographie (TLC). Die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt und das Aceton wurde unter verringertem Druck abgezogen, um 49 g Rohprodukt zu ergeben. Die Feststoffe wurden mit 1 Liter Wasser verdünnt und mit 3 × 1 Liter Chloroform extrahiert. Die Extrakte wurden mit der Aceton-löslichen Fraktion vereinigt und über Natriumsulfat getrocknet, was 177 g Rohprodukt lieferte. Das Produkt wurde aus Acetonitril umkristallisiert, um 150,2 g eines weißen Feststoffes zu ergeben, eine 90% Ausbeute für die ersten zwei Schritte. Der Schmelzpunkt des Produktes betrug 131,5°C (DSC) und die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) aromatische Protonen 7,25–7,80 (m, 18H), 7,15 (d, 2H) und 6,70 (t, 1H), benzylische Protonen 5,05 (s, 4H) und Methylester 3,85 (s, 3H).
Das Methyl-3,5-bis-(4-benzoylbenzyloxy)benzoat, 60,05 g (0,108 mol) wurde in einen 2 Liter-Kolben gegeben, gefolgt von der Zugabe von 120 ml Wasser, 480 ml Methanol und 6,48 g (0,162 mol) Natriumhydroxid. Die Mischung wurde bei Rückfluß für drei Stunden erhitzt, um die Hydrolyse des Esters zu vervollständigen. Nach Abkühlung wurde das Methanol unter verringertem Druck abgezogen und das Natriumsalz der Säure wurde in 2.400 ml warmem Wasser gelöst. Die Säure wurde unter Verwendung konzentrierter Salzsäure ausgefällt, filtriert, mit Wasser gewaschen und in einem Vakuumofen getrocknet, um 58,2 g eines weißen Feststoffes (99% Ausbeute) zu ergeben. Der Schmelzpunkt des Produktes betrug 188,3°C (DSC) und die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (DMSO-d₆) aromatische Protonen 7,30–7,80 (m, 18H), 7,15 (d, 2H) und 6,90 (t, 1H) und benzylische Protonen 5,22 (s, 4H).
Die 3,5-Bis-(4-benzoylbenzyloxy)benzoesäure, 20,0 g (36,86 mmol), wurde zu einem 250 ml-Kolben zugegeben, gefolgt von 36 ml Toluol, 5,4 ml (74,0 mmol) Thionylchlorid und 28 μl N,N-Dimethylformamid. Die Mischung wurde für vier Stunden unter Rückfluß gekocht, um das Säurechlorid zu bilden. Nach Abkühlung wurden das Lösemittel und überschüssiges Thionylchlorid unter verringertem Druck abgezogen. Restliches Thionylchlorid wurde durch vier zusätzliche Eindampfungen unter Verwendung von jeweils 20 ml Chloroform entfernt. Das Rohmaterial wurde aus Toluol umkristallisiert, um 18,45 g Produkt zu ergeben, eine 91% Ausbeute. Der Schmelzpunkt des Produktes betrug 126,9°C (DSC) und die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) aromatische Protonen 7,30–7,80 (m, 18H), 7,25 (d, 2H) und 6,85 (t, 1H) und benzylische Protonen 5,10 (s, 4H).
Das 2-Aminoethanthiol-Hydrochlorid, 4,19 g (36,7 mmol), wurde zu einem 250 ml-Kolben zugegeben, der mit einem Überkopfrührer ausgerüstet war, gefolgt von 15 ml Chloroform und 10,64 ml (76,5 mmol) Triethylamin. Nach Abkühlung der Amin-Lösung auf einem Eisbad wurde eine Lösung von 3,5-Bis-(4-benzoylbenzyloxy)benzoylchlorid, 18,4 g (32,8 mmol), in 50 ml Chloroform tropfenweise über einen 50-minütigen Zeitraum zugegeben. Abkühlung auf Eis wurde 30 Minuten fortgesetzt, gefolgt von Erwärmen auf Raumtemperatur für zwei Stunden. Das Produkt wurde mit 150 ml Chloroform verdünnt und mit 5 × 250 ml 0,1 N Salzsäure gewaschen. Das Produkt wurde über Natriumsulfat getrocknet und zweimal aus 15:1 Toluol:Hexan umkristallisiert, um 13,3 g Produkt zu ergeben, eine 67% Ausbeute. Der Schmelzpunkt des Produktes betrug 115,9°C (DSC) und die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (DMSO-d₆) aromatische Protonen 7,20–7,80 (m, 18H), 6,98 (d, 2H) und 6,65 (t, 1H), Amid-NH 6,55 (breites t, 1H), benzylische Protonen 5,10 (s, 4H), Methylen benachbart zu Amid-N 3,52 (q, 2H), Methylen benachbart zu SH 2,10 (q, 2H) und SH 1,38 (t, 1H). Die endgültige Verbindung wurde zur Verwendung als ein Kettenübertragungsmittel in der Synthese von photoaktivierbaren Polymeren aufbewahrt, wie zum Beispiel beschrieben in Beispiel 12.
Beispiel 8
Darstellung von N-Succinimidyl-11-(4-benzoylbenzamido)undecanoat (BBA-AUD-NOS) (Verbindung VIII)
Verbindung I (50 g, 0,204 mol), hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 1 beschrieben ist, wurde in 2500 ml Chloroform gelöst, gefolgt von der Zugabe einer Lösung von 43,1 g (0,214 mol) 11-Aminoundecansäure und 60,0 g (1,5 mol) Natriumhydroxid in 1500 ml Wasser. Die Mischung wurde für eine Stunde in einem 5-Liter-Mortonkolben kräftig gerührt, um gründliche Mischung der zwei Schichten sicherzustellen. Die Mischung wurde mit 250 ml konzentrierter Salzsäure angesäuert und zusätzliche 30 Minuten gerührt. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wässrige wurde mit 3 × 500 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurde über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und eingedampft, um einen Feststoff zu ergeben. Das Produkt wurde aus Toluol umkristallisiert, um 68,37 g (82%) 11-(4-Benzoylbenzamido)undecansäure mit einem Schmelzpunkt von 107–109°C zu ergeben. Die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) aromatische Protonen 7,20–7,80 (m, 9H), Amid-NH 6,30 (breites t, 1H), Methylen benachbart zu Amid-N 3,35 (m, 2H), Methylen benachbart zu Carbonyl 2,25 (t, 2H) und restliche Methylene 1,00–1,80 (m, 16H).
Die 11-(4-Benzoylbenzamido)undecansäure, 60,0 g (0,146 mol), wurde unter Erwärmen in 1200 ml wasserfreiem 1,4-Dioxan in einem ofengetrockneten 2000 ml-Kolben gelöst. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurden 17,7 g (0,154 mol) N-Hydroxysuccinimid und 33,2 g (0,161 mol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid zur Lösung zugegeben und die Mischung wurde über Nacht unter einer trockenen Atmosphäre gerührt. Die Feststoffe wurden dann durch Filtration entfernt, wobei der Filterkuchen mit 1,4-Dioxan gespült wurde. Das Lösemittel wurde dann unter Vakuum abgezogen und das Produkt wurde zweimal aus Ethanol umkristallisiert. Nach gründlichem Trocknen in einem Vakuumofen wurden 53,89 g (73% Ausbeute) eines weißen Feststoffes mit einem Schmelzpunkt von 97–99°C erhalten. Die Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) aromatische Protonen 7,20–7,80 (m, 9H), Amid-NH 6,25 (breites t, 1H), Methylen benachbart zu Amid-N 3,35 (m, 2H), Methylene am Succinimidyl-Ring 2,75 (s, 4H), Methylen benachbart zu Carbonyl 2,55 (t, 2H) und restliche Methylene 1,00–1,90 (m, 16H).
Beispiel 9
Darstellung eines Copolymers aus Acrylamid BBA-APMA und MAL-EAC-NOS (Random Photo PA-PolyNOS) (Verbindungen IX, A-C)
Ein photoaktivierbares Copolymer der vorliegenden Erfindung wurde auf die folgende Art und Weise hergestellt. Acrylamid, 4,298 g (60,5 mmol), wurde in 57,8 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst, gefolgt von 0,219 g (0,63 mmol) Verbindung III, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist, 0,483 g (1,57 mmol) Verbindung IV, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 4 beschrieben ist, 0,058 ml (0,39 mmol) N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) und 0,154 g (0,94 mmol) 2,2'-Azobisisobutyronitril (AIBN). Die Lösung wurde mit einer Heliumspülung für 3 Minuten, gefolgt von einer Argonspülung für zusätzliche 3 Minuten, von Sauerstoff befreit. Das verschlossene Gefäß wurde dann über Nacht bei 60°C erhitzt, um die Polymerisation durchzuführen. Das feste Produkt wurde durch Filtration isoliert und der Filterkuchen wurde gründlich mit THF und CHCl₃ gespült. Das Produkt wurde in einem Vakuumofen bei 30°C getrocknet, um 5,34 g eines weißen Feststoffes zu ergeben. Die NMR-Analyse (DMSO-d₆) bestätigte das Vorhandensein der NOS-Gruppe bei 2,75 ppm und die Photogruppen-Beladung wurde zu 0,118 mMol BBA/g Polymer bestimmt. Das MAL-EAC-NOS machte 2,5 Mol-% der polymerisierbaren Monomere in dieser Reaktion aus, um Verbindung IX-A zu ergeben.
Das obige Verfahren wurde verwendet, um ein Polymer mit 5 Mol-% Verbindung IV herzustellen. Acrylamid, 3,849 g (54,1 mmol), wurde in 52,9 ml THF gelöst, gefolgt von 0,213 g (0,61 mmol) Verbindung VI, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist, 0,938 g (3,04 mmol) Verbindung IV, wurde hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 4 beschrieben ist, 0,053 ml (0,35 mmol) TEMED und 0,142 g (0,86 mmol) AIBN. Der resultierende Feststoff, Verbindung IX-B, ergab, wenn er wie oben beschrieben isoliert wurde, 4,935 g Produkt mit einer Photogruppen-Beladung von 0,101 mmol BBA/g Polymer.
Das obige Verfahren wurde verwendet, um ein Polymer mit 10 Mol-% Verbindung IV herzustellen. Acrylamid, 3,241 g (45,6 mmol) wurde in 46,4 ml THF gelöst, gefolgt von 0,179 g (0,51 mmol) Verbindung III, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist, 1,579 g (5,12 mmol) Verbindung IV, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 4 beschrieben ist, 0,047 ml (0,31 mmol) TEMED und 0,126 g (0,77 mmol) AIBN. Der resultierende Feststoff, Verbindung IX-C, ergab, wenn er wie oben beschrieben isoliert wurde, 4,758 g Produkt mit einer Photogruppen-Beladung von 0,098 mMol BBA/g Polymer.
Beispiel 10
Darstellung eines Copolymers aus Acrylamid, BBA-APMA und [3-(Methacryloylamino)propyl]trimethylammoniumchlorid (Random Photo PA-PolyQuat) (Verbindung X, A-B)
Ein photoaktivierbares Copolymer der vorliegenden Erfindung wurde auf die folgende Art und Weise hergestellt. Acrylamid, 10,681 g (0,150 mol), wurde in 150 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, gefolgt von 0,592 g (1,69 mmol) Verbindung III, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist, 3,727 g (16,90 mmol) [3-(Methacryloylamino)propyl]trimethylammoniumchlorid (MAPTAC), zugeführt als 7,08 ml einer 50% wässrigen Lösung, 0,169 ml (1,12 mmol) TEMED und 0,333 g (2,03 mmol) AIBN. Die Lösung wurde mit einer Heliumspülung für 4 Minuten, gefolgt von einer Argonspülung für zusätzliche 4 Minuten, von Sauerstoff befreit. Das verschlossene Gefäß wurde dann über Nacht bei 55°C erhitzt, um die Polymerisation durchzuführen. Die DMSO-Lösung wurde mit Wasser verdünnt und gegen entionisiertes Wasser unter Verwendung eines Schlauches mit einem Molekulargewichtsschnitt von 12.000–14.000 dialysiert. Lyophilisierung der resultierenden Lösung ergab 14,21 g eines weißen Feststoffes. Die NMR-Analyse (D₂O) bestätigte das Vorhandensein der Methylgruppen auf den quartären Ammoniumgruppen bei 3,10 ppm, und die Photogruppen-Beladung wurde zu 0,101 mmol BBA/g Polymer bestimmt.
Die Verbindung III machte 1 Mol-% des polymerisierbaren Monomers in dieser Reaktion aus, um Verbindung X-A zu ergeben.
Das obige Verfahren wurde verwendet, um ein Polymer mit 2 Mol-% Verbindung III herzustellen. Acrylamid, 10,327 g (0,144 mol), wurde in 145 ml DMSO gelöst, gefolgt von 1,148 g (3,277 mmol) Verbindung III, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist, 3,807 g (17,24 mmol) MAPTAC, zugeführt als 7,23 ml einer 50% wässrigen Lösung, 0,164 ml (1,09 mmol) TEMED und 0,322 g (1,96 mmol) AIBN. Die Aufarbeitung, wie oben beschrieben, ergab 12,54 g Produkt (Verbindung X-B) mit einer Photogruppen-Beladung von 0,176 mmol BBA/g Polymer.
Beispiel 11
Darstellung eines Copolymers aus Acrylamid BBA-APMA, MA-EAC-NOS und [3-(Methacryloylamino)propyl]trimethylammoniumchlorid (Random PhotoPA-PolyNOS-Poly Quat)(Verbindung XI)
Ein photoaktivierbares Copolymer der vorliegenden Erfindung wurde auf die folgende Art und Weise hergestellt. Das Wasser im kommerziell verfügbaren 50% wässrigen MAPTAC wurde durch azeotrope Destillation mit Chloroform entfernt. Die wässrige MAPTAC-Lösung, 20 ml, die 10,88 g MAPTAC enthielten, wurde mit 20 ml DMSO und 100 ml Chloroform verdünnt. Diese Mischung wurde in einem Schwerer-als-Wasser-Flüssig-Flüssig-Extraktor, der wasserfreies Natriumsulfat enthielt, für insgesamt 80 Minuten unter Rückfluß gekocht. Ein langsamer Luftstrom wurde während des Kochens unter Rückfluß aufrechterhalten, um die Polymerisation des Monomers zu hemmen. Am Ende des Kochens unter Rückfluß wurde das überschüssige Chloroform unter verringertem Druck abgezogen, um eine DMSO-Lösung von MAPTAC mit einer ungefähren Konzentration von 352 mg/ml zurückzulassen.
Acrylamid, 1,7 g (23,90 mmol), wurde in 57,7 ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst, gefolgt von 0,215 g (0,614 mmol) Verbindung III, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist, 1,93 ml (0,677 g, 3,067 mmol) der obigen MAPTAC/DMSO-Lösung, 0,91 g (3,068 mmol) Verbindung V, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 5 beschrieben ist, und 0,060 g (0,365 mmol) AIBN. Die Lösung wurde mit einer Heliumspülung für 4 Minuten, gefolgt von einer Argonspülung für zusätzliche 4 Minuten, von Sauerstoff befreit. Das verschlossene Gefäß wurde dann über Nacht bei 55°C erhitzt, um die Polymerisation durchzuführen. Das Polymer wurde durch Gießen der Reaktionsmischung in 600 ml Diethylether isoliert. Die Feststoffe wurde durch Zentrifugieren abgetrennt und das Produkt wurde mit 200 ml Diethylether und 200 ml Chloroform gewaschen. Verdampfung des Lösemittels unter Vakuum ergab 3,278 g Produkt mit einer Photobeladung von 0,185 mmol BBA/g Polymer.
Beispiel 12
Copolymer aus Acrylamid und MAL-EAC-NOS unter Verwendung von N-(2-Mercaptoethyl)-3,5-bis(4-benzoylbenzyloxy)benzamid (End-Point Diphoto PA-PolyNOS)(Verbindung XII)
Ein photoaktivierbares Copolymer der vorliegenden Erfindung wurde auf die folgende Art und Weise hergestellt. Acrylamid, 3,16 g (44,5 mmol), wurde in 45,0 ml Tetrahydrofuran gelöst, gefolgt von 0,164 g (1 mmol) AIBN, 0,045 ml (0,30 mmol) TEMED, 0,301 g (0,5 mmol) Verbindung VII, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren von Beispiel 7, und 1,539 g (5 mmol) Verbindung IV, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 4 beschrieben ist. Die Lösung wurde mit einer Heliumspülung für 4 Minuten, gefolgt von einer Argonspülung für zusätzliche 4 Minuten, von Sauerstoff befreit. Das verschlossene Gefäß wurde dann über Nacht bei 55°C erhitzt, um die Polymerisation durchzuführen. Das ausgewählte Polymer wurde durch Filtration isoliert und wurde mit Chloroform gewaschen.
Das Endprodukt wurde in einem Vakuumofen getrocknet, um 4,727 g Polymer mit einer Photogruppen-Beladung von 0,011 mmol BBA/g Polymer zu liefern.
Beispiel 13
Copolymer aus N-[3-(Dimethylamino)propyl]methacrylamid und BBA-APMA (Random Photo PA-Poly Tertiary Amine)(Verbindung XIII)
Ein photoaktivierbares Copolymer der vorliegenden Erfindung wurde auf die folgende Art und Weise hergestellt. N-[3-(Dimethylamino)propyl]methacrylamid, 33,93 g (0,2 mol), wurde in 273 ml DMSO gelöst, gefolgt von 16,6 ml konzentrierter HCl und 6,071 g (17,3 mmol) Verbindung III, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist. Schließlich wurden 0,29 ml (1,93 mmol) TEMED, 0,426 g (2,6 mmol) AIBN und 100 ml Wasser zur Reaktionsmischung zugegeben. Die Lösung wurde mit einer Heliumspülung für 10 Minuten von Sauerstoff befreit und der Kopfraum wurde dann mit Argon gefüllt. Das verschlossene Gefäß wurde über Nacht bei 55°C erhitzt, um die Polymerisation durchzuführen. Das Produkt wurde dann gegen entionisiertes Wasser fÜr mehrere Tage unter Verwendung eines Schlauches mit einem MWCO von 12.000 bis 14.000 dialysiert. Das Produkt wurde im Anschluß an die Dialyse filtriert, um jegliche Feststoffe zu entfernen, und wurde lyophilisiert, um 47,27 g eines festen Produktes zu ergeben. Es wurde festgestellt, daß das Polymer eine Photobeladung von 0,33 mmol BBA/g Polymer aufwies.
Beispiel 14
Vergleich von Random Photo PA-PolyNOS (Verbindung IX-C) mit Random Photo PA-PolyNOS-PolyQuat (Verbindung XI) auf Polystyrol(PS)-Mikrovertiefungsplatten
Verbindung IX-C und Verbindung XI wurden getrennt in entionisiertem Wasser mit 5 mg/ml gelöst. Die PS-Platten (PS, Medium Bind, Corning Costar, Cambridge, MA), die 100 μl Verbindung IX und Verbindung XI in getrennten Vertiefungen enthielten, wurden mit einer Dymax-Lampe (Modell Nr. PC-2, Dymax Corporation, Torrington, CT), die einen Heraeus-Kolben (W.C. Heraeus GmbH, Hanau, Bundesrepublik Deutschland) enthielt, bestrahlt. Die Bestrahlungsdauer betrug 1,5 Minuten mit einer Intensität von 1–2 mW/cm² im Wellenlängenbereich von 330–340 nm. Die Beschichtungslösung wurde dann verworfen und die Vertiefungen wurden für 2 Stunden luftgetrocknet. Die Platten wurden dann für eine zusätzliche Minute bestrahlt. Die beschichteten Platten wurden unmittelbar verwendet, um Oligos zu immobilisieren, die für bis zu 2 Monate in einem verschlossenen Beutel aufbewahrt worden waren.
Die 50-basige oligomere(-mere)-Einfangsonde 5'-NH₂-GTCTGAGTCGGAGCCAGGGCGGCCGCCAACAGCAGGAGCAGCGTGCACGG-3'(ID 1) (synthetisiert mit einem 5'-Amino-Modifikator, der einen C-12-Spacer enthält) mit 10 pmol/Vertiefung wurde in PS-Vertiefungen in 50 mM Phosphatpuffer, pH 8,5, 1 mM EDTA bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung der komplementären 5'-Biotin-CCGTGCACGCTGCTCCTGCTGTTGGCGGCCGCCCTGGCT-CCGACTCAGAC-3'-(ID 3)-Nachweissonde oder des nicht-komplementären 5'-Biotin-CGGTGGATGGAGCAGGAGGGGCCCGAGTATTGGGAGCGGGAGACACAGAA-3'-(ID 4)-Oligos, wobei beide mit einer 5'-Biotin-Modifikation synthetisiert wurden, wie folgt durchgeführt.
Die Platten mit immobilisierter Einfangsonde wurde mit phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS, 10 mM Na₂PO₄, 150 mM NaCl, pH 7,2), die 0,05% Tween 20 enthielt, unter Verwendung eines Microplate Auto Washer (Modell EL 403H, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) gewaschen. Die Platten wurden dann bei 55°C für 30 Minuten mit Hybridisierungspuffer geblockt, der aus 5X SCC (0,75 M NaCl, 0,075 M Citrat, pH 7,0), 0,1 % Lauroylsarcosin, 1 % Casein und 0,02% Natriumdodecylsulfat bestand. Als die Nachweissonde an die Einfangsonde hybridisiert wurde, wurden 50 fmol Nachweissonde in 100 μl pro Vertiefung zugegeben und für eine Stunde bei 55°C inkubiert. Die Platten wurden dann mit 2X SSC, das 0,1% Natriumdodecylsulfat enthielt, für 5 Minuten bei 55°C gewaschen. Die gebundene Nachweissonde wurde durch Zugabe von 100 μl eines Konjugats aus Streptavidin und Meerrettichperoxidase (SA-HRP, Pierce, Rockford, IL) mit 0,5 μg/ml und Inkubieren für 30 Minuten bei 37°C getestet. Die Platten wurden dann mit PBS/Tween gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Peroxidase-Substrat (H₂O₂ und Tetramethylbenzidin, Kirkegard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) und Messung bei 655 nm auf einem Mikrovertiefungsplattenablesegerät (Modell 3550, Bio-Rad Labs, Cambridge, MA). Die Platten wurde nach 10 Minuten abgelesen.
Die in Tabelle 1 aufgelisteten Ergebnisse zeigen, daß Mikrovertiefungsplatten, die mit Verbindung IX-C beschichtet waren, Amin-Einfangsonden nicht wirksam immobilisierten. Im Vergleich lieferte jedoch Verbindung XI, als eine Beschichtung, signifikante Bindung und gute Hybridisierungssignale. Verbindung-IX-C-Reagens passivierte höchstwahrscheinlich die Oberflächen und verhinderte die Assoziation von Einfangoligos. Im Gegensatz dazu wurde das Oligo, wenn Verbindung XI verwendet wurde, zur Oberfläche durch ionische Wechselwirkungen angezogen, wo es dann mit den NOS-Gruppen kovalent gebunden werden konnte.
Tabelle 1: Hybridisierungssignale (A₆₅₅) von PS-Mikrovertiefungsplatten, beschichtet mit Verbindung IX-C und Verbindung XI.
Beispiel 15
Beschichtung von verschiedenen Mikrovertiefungsplatten mit einer Mischung aus Random Photo PA-PolyNOS (Verbindung IX-B) und Random Photo PA-PolyQuat (Verbindung-X-B)
Eine Beschichtungslösung, die eine Mischung aus 5 mg/ml Verbindung IX-B und 0,5 mg/ml Verbindung X-B enthielt, wurden in entionisiertem Wasser hergestellt. Diese Mischung wurde verwendet, um Polypropylen(PP, Corning Costar, Cambridge, MA)-, PS-, Polycarbonat (PC, Corning Costar, Cambridge, MA)- und Polyvinylchlorid(PVC, Dynatech, Chantilly, VA)-Multivertiefungen zu beschichten, wie beschrieben in Beispiel 14. Ein 30-meres Einfangoligo 5'-NH₂-GTCTGAGTCGGAGCCAGGGCGGCCGCCAAC-3' (ID 2) (synthetisiert mit einem 5'-Amino-Modifikator, der einen C-12 Spacer enthält) mit 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 oder 10 pmol/Vertiefung wurde bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Hybridisierung wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben in Beispiel 14, unter Verwendung von komplementärem ID 3-Nachweisoligo oder nicht-komplementären ID 4-Oligo. Da PP-Platten optisch nicht transparent sind, wurde die Inhalte jeder Vertiefung nach 20 Minuten Inkubation mit dem chromogenen Substrat in PS-Vertiefungen überführt. Die Hybridisierungssignale wurden in den PS-Platten gemessen. Die anderen Platten wurden ohne Überführung nach 10 Minuten abgelesen. Signalniveaus sind aufgrund der unterschiedlichen Geometrien der Mikrovertiefungsplatten, die aus verschiedenen Materialien hergestellt sind, nur innerhalb derselben Substratgruppe vergleichbar. Tabelle 2 listet die Hybridisierungssignale auf und zeigt die Beziehung zwischen der Intensität der Hybridisierungssignale und der Menge der Einfangsonde, aufgebracht auf verschiedene Mikrovertiefungsplatten, beschichtet mit einer Mischung aus Verbindung IX-B und Verbindung X-B. Auf PP- und PVC-Platten war die Adsorption von Sonden sehr gering und die Beschichtungen mit den polymeren Reagentien verbesserten die Signale dramatisch. Das Signal stieg mit ansteigender Zugabe von Einfangsonde zu den beschichteten Vertiefungen, pendelte sich aber bei ungefähr 3 pmol/Vertiefung Einfangsonde ein. Das Plateau in der erzeugten Signalgröße beruhte nicht auf einem Sättigungsniveau der Hybridisierung, sondern stattdessen auf den Grenzen der Farbveränderungsreaktion im kolorimetrischen Test.
Oligo-Derivate adsorbieren effizient auf nicht-beschichteten PS- und PC-Mikrovertiefungsplatten und führen zu spezifischen Hybridisierungssignalen. Cros et al. (U.S.-Patent Nr. 5,510,084) berichteten auch, daß Amin-funktionalisierte Oligos befriedrigend auf Polystyrol-Mikrovertiefungsplatten durch unbekannte Mechanismen adsorbierten. Es gibt jedoch eine merkbare Variabilität in der Adsorptionsmenge auf nicht-beschichteten PS-Platten unter verschiedenen Chargen (Chevier et al. FEMS 10:245, 1995). Tabelle 2: Hybridisierungssignale (A₆₅₅) von verschiedenen Mikrovertiefungsplatten-Materialien, beschichtet mit einer Mischung aus Verbindung IX-B und Verbindung X-B. Zugesetztes Einfangoligo (pmol/Vertiefung)

Komp.:: Komplementäre Nachweissonde wurde für Hybridisierung zugegeben.
NK:: Nicht-komplementäre Nachweissonde wurde für Hybridisierung zugegeben.

Beispiel 16
Bewertung von End-Point Diphoto PA-polyNOS (Verbindung XII) und Random Photo PA-PolyQuat (Verbindung X-B) auf PP- und PVC-Mikrovertiefungsplatten
Eine Beschichtungslösung, die eine Mischung aus 5 mg/ml von Verbindung XII und 0,5 mg/ml von Verbindung X-B enthielt, wurde mit entionisiertem Wasser hergestellt. Diese Mischung der zwei Reagentien wurde verwendet, um PP- und PVC-Mikrovertiefungsplatten unter Bedingungen zu beschichten, die vergleichbar waren zu denjenigen, die in Beispiel 14 beschrieben sind. Das 30-mere ID 2-Einfangoligo mit 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 oder 10 pmol/Vertiefung in 0,1 ml wurde bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Hybridisierung wurde durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 14, unter Verwendung von komplementärem ID 3-Nachweis-Oligo oder nicht-komplementärem ID 4-Oligo. Die in Tabelle 3 aufgelisteten Hybridisierungssignale zeigen die Beziehung zwischen der Intensität der Hybridisierungssignale und der auf PP- und PVP-Mikrovertiefungsplatten, die mit einer Mischung aus Verbindung XII und Verbindung X-B beschichtet sind, aufgebrachten Menge an Einfangsonde. Das Signal stieg mit steigenden Einfangoligos, die zu den beschichteten Vertiefungen zugegeben wurden, aber pegelte sich bei ungefähr 1 pmol/Vertiefung ein. Das Signal-Rausch-Verhältnis (von komplementären gegenüber nicht-komplementären Nachweissonden) war so hoch wie 26 bzw. 11 für beschichtete PP- bzw. PVC-Oberflächen.
Tabelle 3: Hybridisierungssignale (A₆₅₅) von PP- und PVC-Platten, beschichtet mit einer Mischung aus Verbindung XII und Verbindung X-B.
Beispiel 17
Sequentielle Beschichtung mit Random Photo PA-PolyQuat (Verbindung X-B) und BBA-AUD-NOS (Verbindung VIII)
Verbindung X-B mit 0,1 mg/ml in entionisiertem Wasser wurde in PP- und PVC-Vertiefungen für 20 Minuten inkubiert. Die Platten wurden bestrahlt, wie zuvor beschrieben in Beispiel 14, wobei die Lösung sich für 1,5 Minuten in den Vertiefungen befand. Die Lösung wurde verworfen und die Vertiefungen wurden getrocknet. Verbindung VIII mit 0,5 mg/ml Isopropylalkohol (IPA) wurde in den mit Verbindung X-B beschichteten Vertiefungen für 5 Minuten inkubiert. Die Lösung wurde dann entfernt, die Platte getrocknet und bestrahlt, wie beschrieben in Beispiel 14, für eine Minute nachdem die Vertiefungen getrocknet waren. Das 30-mere ID 2-Einfangoligo mit 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3 oder 10 pmo/Vertiefung in 0,1 ml wurde bei 4°C über Nacht inkubiert. Die Hybridisierung wurde durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 14, unter Verwendung von komplementärem ID 3-Nachweisoligo oder nicht-komplementärem ID 4-Oligo. Tabelle 4 enthält die Hybridisierungssignale und zeigt die Beziehung zwischen der Intensität der Hybridisierungssignale und der auf PP- und PVC-Mikrovertiefungsplatten, die mit Verbindung X-B beschichtet sind, gefolgt von Verbindung VIII-Beschichtung, aufgebrachten Menge an Einfangsonde. Das Signal stieg mit ansteigender Einfangsonde, die zu den beschichteten Vertiefungen zugegeben wurde, pegelte sich aber bei 1 pmol/Vertiefung Einfangoligo ein. Die Signale waren bis zu 29- bzw. 11-mal höher für beschichtete PP- bzw.- PVC-Oberflächen, verglichen mit den nicht-beschichteten Kontrollen.
Tabelle 4: Hybridisierungssignale (A₆₅₅) von PP- und PVC-Mikrovertiefungsplatten, beschichtet mit Verbindung X-B, gefolgt von Verbindung VIII-Beschichtung.
Beispiel 18
Vergleich von Random Photo PA-PolyQuat (Verbindung X-A) mit einer Mischung aus Random Photo PA-PolyNOS (Verbindung IX-A) und Random Photo PA-PolyQuat Verbindung X-A)
Verbindung X-A mit 0,5 oder 0,1 mg/ml wurde in PP-Mikrovertiefungsplatten für 10 Minuten inkubiert. Die Platten wurden dann bestrahlt, wie in Beispiel 14 beschrieben. Eine Beschichtungslösung, die eine Mischung aus Verbindung IX-A und Verbindung X-A enthielt, wurde in zwei Verhältnissen hergestellt, 5/0,5 mg/ml und 0,5/0,1 mg/ml Verbindung IX-A/Verbindung X-A, in entionisiertem Wasser, um PP-Mikrovertiefungsplatten zu beschichten. Die Lösung wurde in den Vertiefungen für 10 Minuten inkubiert und die Vertiefungen wurden bestrahlt, wie in Beispiel 14 beschrieben. Das 30-mere ID 2-Einfangoligo mit 1 pmol/Vertiefung wurde in jeder Vertiefung bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Die Hybridisierung wurde durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 14, unter Verwendung von komplementären ID 3-Nachweisoligo oder nicht-komplemertären ID 4-Oligo. Die in Tabelle 5 aufgelisteten Ergebnisse zeigen, daß die Beschichtung, die die Kombination aus Verbindung IX-A und Verbindung X-A enthielt, höhere Signale ergab, verglichen mit denjenigen von Verbindung X-A-Beschichtung allein.
Tabelle 5: Hybridisierungssignale (A₆₅₅) von mit Verbindung X-A beschichteten PP-Mikrovertiefungsplatten.
Beispiel 19
Vergleich von nicht-modifiziertem Oligo gegenüber Amin-modifiziertem Oligo auf Random Photo PA-PolyNOS (Verbindung IX-B) und Random Photo PA-PolyQuat (Verbindung X-B) auf beschichteten Mikrovertiefungsplatten
Eine Beschichtungslösung, die eine Mischung aus Verbindung IX-B (5 mg/ml) und Verbindung X-B (0,5 mg/ml) enthielt, wurde in entionisiertem Wasser hergestellt, um PP-, PS- und PVC-Mikrovertiefungsplatten zu beschichten. Die Lösung wurde für ungefähr 10 Minuten inkubiert und bestrahlt, wie in Beispiel 14 beschrieben. Das 30-mere Einfang-5'-NH₂-TTCTGTGTCTCCCGCTCCCAATACTCGGGC-3'(ID 5)-Oligo mit 1 pmol/Vertiefung wurde an die Vertiefungen in 50 mM Phosphatpuffer, pH 8,5, 1 mM EDTA bei 4°C über Nacht gekoppelt. Die Hybridisierung wurde durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 14, unter Verwendung von komplementärem Nachweisoligo ID 4 und nicht-komplementärem Oligo ID 3. Um den Effekt der Amin-Funktionalität mit Einfangoligos zu bestimmen, wurde auch eine nicht-modifizierte 30-mere Einfangsonde 5'-TTCTGTGTCTCC CGCTCCCAATACTCGGGC-3' (ID 6) (ohne Amin) zu den beschichteten Oberflächen zugegeben und getestet. Die in Tabelle 6 dargestellten Ergebnisse zeigen, daß, wenn ein Oligo mit der 5'-Amin-Modifikation als die Einfangsonde auf mit Verbindung IX-B/Verbindung X-B beschichteten Oberflächen verwendet wurde, das Hybridisierungssignal niedriger war als 30% desjenigen mit Amin-Modifikation.
Tabelle 6: Signale (A₆₅₅), erzeugt aus Hybridisierungsreaktionen mit entweder ID 5- oder ID 6-Oligos auf mit Verbindung IX-B/X-B beschichteten Mikrovertiefungsplatten.
Beispiel 20
Oligo-Beladungsdichten auf Mikrovertiefungsplatten beschichtet mit Random Photo PA-PolyNOS (Verbindung IX-A) und Random Photo PA-PolyQuat (Verbindung X-A)
Radioaktiv markierte Tests wurden durchgeführt, um Oligo-Beladungsdichten zu bestimmen und Ergebnisse aus dem kolorimetrischen Testsystem zu verifizieren. In diesem Beispiel wurden Kombinationsbeschichtungen aus Verbindung IX-A und Verbindung X-A auf PVC-Vertiefungen durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 14. Die 30-meren Einfangoligos ID 2 und ID 5 wurden auf beschichteten Vertiefungen immobilisiert. Eine radioaktiv markierte ID 2-Sonde wurde verwendet, um die Beladungsdichte immobilisierter Einfangoligos auf der Vertiefüngsoberfläche zu bestimmen. Eine radioaktiv markierte ID 3-Nachweissonde, die komplementär zu ID 2 war, aber nicht zu ID 5, wurde verwendet, um Hybridisierungsreaktionen der immobilisierten Einfangsonden zu messen. Oligos ID 2 und ID 3 wurden am 3'-Ende unter Verwendung terminaler Transferase (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) und α-³²P-ddATP (3000 Ci/mmol, Amersham, Arlington Heights, IL) gemäß den Spezifikationen der Hersteller radioaktiv markiert. ³²P-markierte ID 2- und nicht-markierte ID 2- und ID 5-Einfangsonden wurden in beschichteten Vertiefungen mit 50 pmol/Vertiefung für 2,25 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden gewaschen und blockiert, wie beschrieben in Beispiel 14.
Die Vertiefungen mit den nicht-markierten Einfangsonden wurden mit der ³²P-markierten ID 3-Nachweissonde in Hybridisierungspuffer für 1 Stunde bei 55°C hybridisiert. Vertiefungen, die die ³²P-markierte Einfangsonde enthielten, wurden in Hybridisierungspuffer ohne die ID 3-Sonde inkubiert. Nach dreimaligem Waschen mit 2X SSC, das 0,1% SDS enthielt, für 5 Minuten bei 55°C und dreimaliges Waschen mit PBS/0,05% Tween wurden die Platten in einzelne Vertiefungen zerschnitten und in Tetrahydrofuran gelöst. Die Radioaktivitätsmenge in jeder Vertiefung wurde durch Szintillationszählung in Aquasol-2 Fluor (DuPont NEN, Boston, MA) gemessen. Die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen, daß sowohl Verbindung IX-A als auch Verbindung X-A erforderlich war, um gute Immobilisierung von Einfangsonden zu ergeben. Auch erhöhte das Erhöhen der Konzentrationen von Verbindung IX-A und Verbindung X-A die Menge an immobilisiertem Einfangoligo. Bei den höchsten getesteten Konzentrationen war das Signal-Rausch-Verhältnis höher als 3000 zu 1.
Tabelle 7: Dichten von immobilisierten Einfangoligos und hybridisierten ³²P-Nachweisoligos.
Beispiel 21
Vergleich zwischen Random Photo-PA-Polytertiary Amine (Verbindung XIII), Random Photo-PA-PolyNOS (Verbindung IX-A) und einer Mischung aus Random Photo PA-PolyNOS (Verbindung IX-A) und Random Photo-PA-Polytertiary Amine (Verbindung XIII)
Verbindung XIII mit 0,02 mg/ml in entionisiertem Wasser wurde in PP-Mikrovertiefungsplatten für 10 Minuten inkubiert. Die Vertiefungen wurden bestrahlt, wie beschrieben in Beispiel 14. Verbindung IX-A wurde auf PP-Vertiefungen mit 2 mg/ml in entionisiertem Wasser aufgebracht, wie beschrieben für Verbindung XIII. Eine Beschichtungslösung, die eine Mischung aus 2 mg/ml Verbindung IX-A und 0,02 mg/ml Verbindung XIII in entionisiertem Wasser enthielt, wurde hergestellt und aufgebracht, wie beschrieben für Verbindung XIII. Das 30-mere ID 2-Einfangoligo mit 5 pmol/Vertiefung wurde in jeder Vertiefung bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Die Hybridisierung wurde durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 14, unter Verwendung von komplementärem ID 3-Nachweisoligo und nicht-komplementärem ID 4-Oligo. Die Inhalte jeder Vertiefung wurden nach einer 10-minütigen Inkubation mit Peroxidase-Substrat in PS-Vertiefungen überführt. Die in Tabelle 8 aufgelisteten Ergebnisse zeigen, daß die Kombination von Verbindung IX-A und Verbindung XIII höhere Signale ergaben, verglichen mit denjenigen von Verbindung IX-A- oder Verbindung XIII-Beschichtung allein.
Tabelle 8: Hybridisierungssignal (A₆₅₅) von beschichteten PP-Mikrovertiefungsplatten.
Beispiel 22
Nukleinsäuresequenzimmobilisierung auf einer Amin-derivatisierten Oberfläche
Ein Copolymer der vorliegenden Erfindung wird auf die folgende Art und Weise hergestellt. Acrylamid, 5,686 g (80,0 mmol), wird in 100 ml DMSO gelöst, gefolgt der Zugabe von 3,083 g (10,0 mmol) Verbindung IV, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 4 beschrieben ist, und 2,207 g (10,0 mmol) MAPTAC, zugeführt als eine trockene DMSO- Lösung, hergestellt gemäß dem allgemeinen Verfahren, das in Beispiel 11 beschrieben ist. TEMED, 0,134 ml (0,89 mmol), und AIBN, 0,197 g (1,20 mmol), werden zur Mischung zugegeben und das System wird mit einer Heliumspülung für 5 Minuten, gefolgt von einer Argonspülung für zusätzliche 5 Minuten, von Sauerstoff befreit. Das geschlossene Gefäß wird bei 55°C erhitzt, um die Polymerisation durchzuführen. Das Polymer wird isoliert, indem die Reaktionsmischung in 800 ml Diethylether gegossen und zentrifugiert wird, um die Feststoffe abzutrennen. Das Produkt wird mit 200 ml Diethylether, gefolgt von 200 ml Chloroform, gewaschen. Das Polymer wird unter Vakuum getrocknet, um restliches Lösemittel zu entfernen.
Eine Polymeroberfläche wird durch Plasmabehandlung unter Verwendung einer 3:1-Mischung aus Methan- und Ammoniak-Gasen derivatisiert. (Siehe z.B. das allgemeine Verfahren, das in U.S.-Patent 5,643,580 beschrieben ist). Eine Mischung aus Methan (490 SCCM) und Ammoniak (161 SCCM) wird in die Plasmakammer zusammen mit dem zu beschichtenden Polymerteil eingebracht. Die Gase werden bei einem Druck von 0,2–0,3 Torr gehalten und eine 300–500 Watt-Glimmentladung wird innerhalb der Kammer aufgebaut. Die Probe wird für insgesamt 3–5 Minuten unter diesen Bedingungen behandelt. Die Bildung einer Amin-derivatisierten Oberfläche wird verifiziert durch eine Verringerung des Wasserkontaktwinkels, verglichen mit der nicht-beschichteten Oberfläche.
Die Amin-derivatisierte Oberfläche wird für 10 Minuten bei Raumtemperatur mit einer 10 mg/ml Lösung des obigen Polymers in einem 50 mM Phosphatpuffer, pH 8,5, inkubiert. Im Anschluß an diese Reaktionszeit wird die Beschichtungslösung entfernt und die Oberfläche wird gründlich mit entionisiertem Wasser gewaschen und gründlich getrocknet. Immobilisierung von oligomeren Einfangsonde und Hybridisierung wird durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 14.
Tabelle 9: Verbindungen.

Claims

Reagenszusammensetzung zur Bindung eines Zielmoleküls an die Oberfläche eines Substrats, wobei die Reagenszusammensetzung eine oder mehrere Gruppen zur Anziehung des Zielmoleküls zum Reagens, eine oder mehrere photoreaktive Gruppen zur Bindung der Reagenszusammensetzung an die Oberfläche bei Anwendung von Energie aus einer Quelle für elektromagnetische Strahlung und eine oder mehrere thermochemisch Amin-reaktive oder Sulfhydryl-reaktive Gruppen zur Ausbildung kovalenter Bindungen mit den entsprechenden funktionellen Gruppen auf dem angezogenen Zielmolekül umfaßt, wobei die anziehenden Gruppen ionische Gruppen sind.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die anziehenden Gruppen und thermochemisch reaktiven Gruppen Seitengruppen auf einer oder mehreren hydrophilen polymeren Hauptketten sind.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zielmolekül eine Nukleinsäure ist.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die ionischen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus quartären Ammoniumgruppen und protonierten tertiären Aminen besteht.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine funktionelle Gruppe umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Amin- und Sulfhydrylgruppen besteht.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenszusammensetzung eine hydrophile polymere Hauptkette umfaßt.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die ionischen Gruppen quartäre Ammoniumgruppen umfassen.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus photoreaktiven Arylketonen besteht.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Arylketone jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnlichen Heterocyclen besteht.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Zielmolekül eine Nukleinsäure ist, die anziehenden Gruppen ionische Gruppen sind und die photoreaktiven Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus photoreaktiven Arylketonen besteht.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Arylketone jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnlichen Heterocyclen besteht.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenszusammensetzung in der Form einer Zusammensetzung bereitgestellt ist, die eine erste Reagenskomponente, die eine hydrophile Hauptkette umfaßt, die eine oder mehrere anziehende Gruppen und eine oder mehrere photoreaktive Gruppen umfaßt, und eine zweite Reagenskomponente, die eine hydrophile Hauptkette umfaßt, die eine oder mehrere thermochemisch Amin-reaktive oder Sulfhydryl-reaktive Gruppen und eine oder mehrere photoreaktive Gruppen umfaßt, umfaßt.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Zielmolekül eine Nukleinsäure ist.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die anziehenden Gruppen ionische Gruppen sind.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die ionischen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus quartären Ammoniumgruppen und protonierten tertiären Aminen besteht.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine funktionelle Gruppe umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Amin- und Sulfhydrylgruppen besteht.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus photoreaktiven Arylketonen besteht.
Reagenszusammensetzung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Arylketone jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnlichen Heterocyclen besteht.
Verfahren zur Bindung eines Zielmoleküls an die Oberfläche eines Substrats, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt: (a) Bereitstellen, auf der Oberfläche des Substrats, einer Reagenszusammensetzung, die eine oder mehrere Gruppen zur Anziehung des Zielmoleküls zur Reagenszusammensetzung, eine oder mehrere photoreaktive Gruppen zur Bindung der Reagenszusammensetzung an die Oberfläche bei Anwendung von Energie aus einer Quelle für elektromagnetische Strahlung und eine oder mehrere thermochemisch Amin-reaktive oder Sulfhydryl-reaktive Gruppen zur Ausbildung von kovalenten Bindungen mit entsprechenden funktionellen Gruppen auf dem angezogenen Zielmolekül umfaßt, wobei die anziehenden Gruppen ionische Gruppen sind, (b) Bringen des Zielmoleküls in ausreichende Nähe zur Oberfläche, um zu ermöglichen, daß die anziehenden Gruppen das Zielmolekül zur gebundenen Reagenszusammensetzung anziehen, und (c) Erlauben, daß die thermochemisch reaktiven Gruppen kovalente Bindungen mit dem angezogenen Zielmolekül bilden.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die anziehenden Gruppen und thermochemisch reaktiven Gruppen Seitengruppen auf einer oder mehreren hydrophilen polymeren Hauptketten sind.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß das Zielmolekül eine Nukleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die ionische Gruppen ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus quartären Ammoniumgruppen und protonierten tertiären Aminen besteht.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine funktionelle Gruppe umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Amin- und Sulfhydrylgruppen besteht.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenszusammensetzung eine hydrophile polymere Hauptkette umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die ionischen Gruppen quartäre Ammoniumgruppen umfassen.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Gruppen ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus photoreaktiven Arylketonen bestehen.
Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Arylketone jeweils unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnlichen Heterocyclen besteht.
Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß das Zielmolekül eine Nukleinsäure ist und die photoreaktiven Gruppen ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus photoreaktiven Arylketonen besteht.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Arylketone jeweils unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnlichen Heterocyclen besteht.
Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenszusammensetzung in der Form einer Zusammensetzung bereitgestellt wird, die eine erste Reagenskomponente, die eine hydrophile Hauptkette umfaßt, die eine oder mehrere anziehende Gruppen und eine oder mehrere photoreaktive Gruppen umfaßt, und eine zweite Reagenskomponente, die eine hydrophile Hauptkette umfaßt, die eine oder mehrere thermochemisch Amin-reaktive oder Sulfhydryl-reaktive Gruppen und eine oder mehrere photoreaktive Gruppen umfaßt, umfaßt.
Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Zielmolekül eine Nukleinsäure ist.
Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß die ionischen Gruppen ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus quartären Ammoniumgruppen und protonierten tertiären Aminen besteht.
Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine funktionelle Gruppe umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Amin- und Sulfhydrylgruppen besteht.
Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Gruppen ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus photoreaktiven Arylketonen besteht.
Verfahren nach Anspruch 34, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Arylketone jeweils unabhängig ausgewählt werden aus der Gruppe, die aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnlichen Heterocyclen besteht.
Substratoberfläche, beschichtet mit einem Zielmolekül und einer Reagenszusammensetzung mit dem Verfahren nach Anspruch 19.
Oberfläche nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß das Zielmolekül eine Nukleinsäure ist.
Oberfläche nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die ionischen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus quartären Ammoniumgruppen und protonierten tertiären Aminen besteht.
Oberfläche nach Anspruch 37, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine funktionelle Gruppe umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Amin- und Sulfhydrylgruppen besteht.
Oberfläche nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus photoreaktiven Arylketonen besteht.
Oberfläche nach Anspruch 40, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Arylketone jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnlichen Heterocyclen besteht.
Oberfläche nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenszusammensetzung in der Form einer Zusammensetzung bereitgestellt ist, die eine erste Reagenskomponente, die eine hydrophile Hauptkette umfaßt, die eine oder mehrere anziehende Gruppen und eine oder mehrere photoreaktive Gruppen umfaßt, und eine zweite Reagenskomponente, die eine hydrophile Hauptkette umfaßt, die eine oder mehrere thermochemisch Amin-reaktive oder Sulfhydryl-reaktive Gruppen oder eine oder mehrere photoreaktive Gruppen umfaßt, umfaßt.
Oberfläche nach Anspruch 42, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus photoreaktiven Arylketonen besteht.
Oberfläche nach Anspruch 43, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Arylketone jeweis unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnlichen Heterocyclen besteht.
Oberfläche, die eine beschichtete Reagenszusammensetzung nach Anspruch 1 umfaßt.
Oberfläche nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß das Zielmolekül eine Nukleinsäure ist.
Oberfläche nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß die ionischen Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus quartären Ammoniumgruppen und protonierten tertiären Aminen besteht.
Oberfläche nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleinsäure eine funktionelle Gruppe umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Amin- und Sulfhydrylgruppen besteht.
Oberfläche nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus photoreaktiven Arylketonen besteht.
Oberfläche nach Anspruch 49, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Arylketone jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnlichen Heterocyclen besteht.
Oberfläche nach Anspruch 45, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagenszusammensetzung in der Form einer Zusammensetzung bereitgestellt ist, die eine erste Reagenskomponente, die eine hydrophile Hauptkette umfaßt, die eine oder mehrere anziehende Gruppen und eine oder mehrere photoreaktive Gruppen umfaßt, und eine zweite Reagenskomponente, die eine hydrophile Hauptkette umfaßt, die eine oder mehrere thermochemisch Amin-reaktive oder Sulfhydryl-reaktive Gruppen und eine oder mehrere photoreaktive Gruppen umfaßt, umfaßt.
Oberfläche nach Anspruch 51, dadurch gekennzeichnet, daß die photoreaktiven Gruppen ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus photoreaktiven Arylketonen besteht.
Oberfläche nach Anspruch 52, dadurch gekennzeichnet daß die photoreaktiven Arylketone jeweils unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnlichen Heterocyclen besteht.