DE69933283T2

DE69933283T2 - Photoaktivierbare nukleinsäure-derivate

Info

Publication number: DE69933283T2
Application number: DE69933283T
Authority: DE
Inventors: E. Patrick Eden Prairie GUIRE; J. Melvin Carver SWANSON; W. Gary St. Louis Park OPPERMAN
Original assignee: Surmodics Inc
Current assignee: Surmodics Inc
Priority date: 1998-02-24
Filing date: 1999-02-23
Publication date: 2007-04-26
Anticipated expiration: 2019-02-24
Also published as: US6506895B2; EP1064292A1; DE69933283D1; AU2872999A; EP1064292B1; WO1999043688A1; US20020086989A1; JP2002504695A; AU758328B2; CA2321098A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Immobilisierung von Nukleinsäuren. In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung feste Träger, wie etwa Oligonukleotid(„Oligo"-)-Chips, die solche Nukleinsäuren enthalten. In noch einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung photoreaktive Gruppen, Moleküle, die mit solchen Gruppen derivatisiert sind, und die Bindung solcher Moleküle an Trägeroberflächen durch die Aktivierung solcher Gruppen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Entwicklung von Oligonukleotid(„Oligo"-)sondenarrays (üblicher als „DNA-Chips" und „Gene Chip" (eine eingetragene Marke von Affymetrix, Inc.) bekannt) hat über die letzten paar Jahre signifikante Fortschritte gemacht und ist zum Mittelpunkt stetig steigender Aufmerksamkeit und erhöhter Signifikanz geworden. Siehe zum Beispiel Stipp, D., Fortune, S. 56, 31. März 1997. Siehe auch Bortman S., C&EN, S. 42, 9. Dezember 1996 und Travis, J., Science News 151:144–145 (1997).
Typischerweise zeigen Oligonukleotidsondenarrays spezifische Oligonukleotidsequenzen an genauen Stellen wie in einem informationsreichen Format. Im Gebrauch wird das Hybridisierungsmuster des fluoreszierend markierten Nukleinsäureziel verwendet, um Primärstrukturinformation für das Ziel zu gewinnen. Dieses Format kann auf einen breiten Bereich von Nukleinsäuresequenzanalyseproblemen angewendet werden, einschließlich Pathogenidentifikation, forensischen Anwendungen, Überwachung der mRNA-Expression und de-novo-Sequenzierung. Siehe zum Beispiel Lipshutz, R.J., et al., BioTechniques 19(3):442–447 (1995). Solche Arrays müssen manchmal mehrere Zehntausende, oder sogar Hunderttausende, einzelner Sonden tragen. Die Chips müssen auch einen breiten Bereich von Empfindlichkeiten bereitstellen, um Sequenzen nachzuweisen, die bei Niveaus von irgendwo von 1 bis 10.000 Kopien pro Zelle exprimiert werden.
Eine Vielzahl von Ansätzen ist für die Herstellung und/oder Verwendung von Oligonukleotidsondenarrays entwickelt worden. Siehe zum Beispiel Sigrist et al. (WO 91/16425), die ein Verfahren zur lichtinduzierten Immobilisierung von Biomolekülen auf chemisch „inerten" Oberflächen beschreiben; siehe auch Keana et al. in US 5,580,697 ; Weaver, et al. (WO 92/10092), die eine Synthesestrategie für die Schaffung chemischer Diversität im Großmaßstab auf einem Festphasenträger beschreiben. Das System setzt Festphasenchemie, photolabile Schutzgruppen und Photolithographie ein, um lichtgesteuerte, räumlich adressierbare, parallele chemische Synthese zu erreichen. Unter Verwendung der richtigen Sequenz von Masken und chemischen Stufenreaktionen kann ein definierter Satz von Oligos konstruiert werden, jeder in einer vordefinierten Position auf der Oberfläche des Arrays.
Unter Verwendung dieser Technologie hat Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA) große Mikroarrays von Oligonukleotiden entwickelt, die an Silicium-Wafern fixiert sind. Im Gebrauch wird ein Forscher mRNA aus einer Zelle oder anderen biologischen Quelle extrahieren, sie in cDNA überführen und die Probe mit einer fluoreszierenden Sonde markieren. Zu der Chip-gebundenen Sonde komplementäre Sequenzen werden an den Wafer hybridisieren und dem Forscher ermöglichen, ihre relativen Mengen durch Messen der Fluoreszenz jedes Flecks zu bestimmen. Bis heute sind Forscher zum Beispiel in der Lage gewesen, die Expression von mehr als 1000 menschlichen Genen auf diese Weise quantitativ zu messen.
Ein Nachteil des Affymetrix-Ansatzes ist die Beschränkung der Oligolänge, die an den Oberflächen fixiert werden kann. Mit gegenwärtigen Techniken ist es üblich, daß jeder Zugabeschritt, der in der Synthese von Oligos involviert ist, zu einigen Fehlern oder gekürzten Sequenzen führen wird. Mit Oligo-Chips ist es jedoch nicht möglich, herkömmlich Nachsynthese-Reinigungstechniken (z.B. HPLC) durchzuführen, um gekürzte Sequenzen zu entfernen, da die Oligo-Sequenzen an den Träger gebunden bleiben.
Synteni (Palo Alto, CA) stellt cDNA-Arrays durch Aufbringen von Polylysin auf Glasobjektträger her. Arrays von cDNAs werden auf die beschichteten Objektträger aufgedruckt, gefolgt von Einwirkung von UV-Licht, um die DNA mit dem Polylysin zu vernetzen. Nicht-umgesetztes Polylysin wird dann durch Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid blockiert. Diese Arrays, „Gene Expression Microarrays" (GEM^®) genannt, werden verwendet, indem cDNA, die aus einer normalen Zelle präpariert worden ist, mit einem fluoreszierenden Farbstoff markiert wird, dann cDNA aus einer abnormen Zelle mit einem fluroreszierenden Farbstoff einer unterschiedlichen Farbe markiert wird. Diese zwei markierten cDNA-Sonden werden gleichzeitig auf den Mikroarray aufgebracht, wo sie kompetitiv an die im Array angeordneten cDNA-Moleküle binden. Diese Zwei-Farben-Codierungstechnik wird verwendet, um die Unterschiede in der Genexpression zwischen zwei Zellproben zu identifizieren. (Heller, R.A., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:2150–2155 (1997)).
Andere haben eine photovernetzende Verbindung beschrieben, die als Psoralen bekannt ist. Psoralen ist eine polycyclische Verbindung mit einer planaren Konfiguration, die mit Nukleinsäure-Helices interkaliert. Wenn mit UV-Licht bestrahlt, induziert das interkalierte Psoralen die Bildung von Interstrangverknüpfungen innerhalb des DNA-Moleküls. Oligonukleotide, die am 5'-Terminus mit Psoralen derivatisiert worden sind, sind verwendet worden, um doppelsträngige (Pieles, U. und U. Englisch, Nucleic Acid Res., 17(1):285–299, 1989) oder Triplex-Nukleinsäuren in Lösung (Takasugi, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88(13):5602–5606 (1991)) zu vernetzen. Psoralen-Derivate sind auch verwendet worden, um DNA-Bindungsproteine mit DNA zu vernetzen (Sastry, S.S., et al., J. Biol. Chem., 272(6):3715–3723 (1997)).
In einer unterschiedlichen Anwendung sind Psoralen-Derivate verwendet worden, um funktionelle Gruppen kovalent an die Oberfläche fester Träger, wie etwa Polystyrol, zu binden. Diese funktionellen Gruppen ihrerseits werden dann verwendet, um thermochemisch Verbindungen an die Trägeroberfläche zu binden (Goodchild, J., Bioconjugate Chem., 1(3):165–187 (1990)). Gegenwärtig verwendet Nalge Nunc International dieses Verfahren, um Mikroplatten herzustellen, die Amin-funktionalisierte Oberflächen für die thermochemisch Bindung von Molekülen, wie etwa Nukleinsäuren, bereitzustellen. Siehe z.B. „DNA Assay Developments: Surface Chemistry and Formats for Molecular Screening and Diagnostics", B. Sullivan, et al., 4. Juni 1997, Nalge Nunc International Corporation Produktliteratur.
In anderer Sache hat die Rechtsnachfolgerin der vorliegenden Erfindung bereits eine Vielzahl von Anmeldungen zur Verwendung von Photochemie beschrieben und insbesondere photoreaktiven Gruppen, z.B. zur Bindung von Polymeren und anderen Molekülen an Trägeroberflächen. Siehe zum Beispiel US-Patent Nrn. 4,722,906, 4,979,959, 5,217,492, 5,512,329, 5,563,056, 5,673,460 und 5,714,360 und Internationale Patentanmeldung Nrn. WO 9639821 (Virus Inactivating Coatings), WO 9637165 (Capillary Endothelialization) und WO 9734935 (Chain Transfer Agents).
Nach besten Wissen der Anmelderin lehrt jedoch weder der Stand der Technik noch gibt es kommerzielle Produkte, die die Aktivierung photoreaktiver Seitenketten involvieren, um Nukleinsäuren in einer spezifischen und kontrollierbaren Weise an Oberflächen zu bilden. Die Bildung einer Nukleinsäure an einer Oberfläche durch Bestrahlung wäre wohl empfänglich für strahlungsinduzierte Schädigung und wäre inherent nicht-spezifisch. Siehe zum Beispiel M. Pirrung, et al., J. Org. Chem., 63:241–246 (1998), die feststellt, daß „Bestrahlung [während Abspaltung der Schutzgruppen] mit Wellenlängen < 340 nm vermieden werden sollte... wegen der potentiellen photochemischen Schädigung an der DNA." Trotz der Entwicklungen bis heute besteht weiterhin ein Bedürfnis nach Verfahren und Reagentien, die die Immobilisierung von Nukleinsäuren auf einer Vielzahl von Trägermaterialien verbessern, z.B. um Oligonukleotidsondenarrays herzustellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine Zusammensetzung bereit, umfassend ein photoaktivierbares Nukleinsäure-Derivat, in Form einer Nukleinsäure mit einer oder mehreren daran gebundenen photoreaktiven Gruppen. Die photoreaktive(n) Gruppe(n) ist (sind) direkt oder indirekt, an einem oder mehreren Punkten entlang der Nukleinsäure vorzugsweise kovalent gebunden. Solche Gruppen können aktiviert werden, um die Nukleinsäure an die Oberfläche eines festen Trägers zu binden, wie etwa die Oberfläche eines Chips. Eine photoreaktive Gruppe dieser Erfindung ist getrennt und verschieden von welcher Gruppe oder Bindungen innerhalb der Nukleinsäure auch immer empfänglich für Strahlung sein könnten. Ihrerseits stellt die Photogruppe eine derivatisierte Nukleinsäure bereit, die selektiv und spezifisch aktiviert werden kann, um die Nukleinsäure an einen Träger zu binden und in einer Weise, die ihre gewünschte chemische oder biologische Funktion im wesentlichen erhält.
Wie hierin verwendet, ist eine „photoreaktive Verbindung", sofern nicht anders angegeben, eine Verbindung, die eine oder mehrere „photoreaktive Gruppen" ist oder enthält, und kann verwendet werden, um eine Nukleinsäure zu derivatisieren, um ein „photoaktivierbares Nukleinsäure-Derivat" zu bilden, mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppen, die, direkt oder indirekt, kovalent daran gebunden sind und davon abstehen. Mit „direkt", und seinen Inflektionen, ist gemeint, daß die photoreaktive Verbindung direkt an die Nukleinsäure gebunden ist, wohingegen das „indirekt", und seine Inflektionen, sich auf die Bindung einer photoreaktiven Verbindung und Nukleinsäure an eine übliche Struktur, wie etwa ein synthetisches oder natürliches Polymer, beziehen wird.
Die Anmelder haben entdeckt, daß photoreaktive Gruppen verwendet werden können, um derivatisierte Nukleinsäuren zu bilden, die ihrerseits aktiviert werden können, um die Nukleinsäuren an die Oberfläche eines Trägers in einer Weise zu binden, die die Verwendung der immobilisierten Nukleinsäure für ihren beabsichtigten Zweck nicht nachteilig beeinflußt.
Die vorliegende Erfindung stellt weiter ein Verfahren zur Herstellung solch einer Zusammensetzung bereit, zum Beispiel durch Derivatisieren einer Nukleinsäure mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppen. Die resultierende photoderivatisierte Nukleinsäure (z.B. Oligonukleotid) wird durch die Anwendung geeigneter Bestrahlung, und üblicherweise ohne die Notwendigkeit einer Oberflächenvorbehandlung, an einer Vielzahl polymerer Substratoberflächen kovalent immobilisiert werden. So stellt die vorliegende Erfindung, in einer Ausführungsform, ein Verfahren bereit, das sowohl die thermochemische Bindung einer oder mehrerer photoreaktiver Gruppen an eine Nukleinsäure als auch die photochemische Immobilisierung dieses Nukleinsäure-Derivats auf einer Substratoberfläche einschließt. Diese Erfindung ist besonders wertvoll für die Herstellung von Arrays immobilisierter Nukleinsäuren, z.B. durch die Verwendung von Druck- oder Photolitographietechniken.
Ein besonderer Vorteil der kovalenten Bindung von Nukleinsäuren an Oberflächen, in einer hierin beschriebenen bevorzugten Ausführungsform, ist, daß die Bereiche zwischen den Flecken immobilisierter Nukleinsäuren hydrophob bleiben, wodurch eine klare Trennung zwischen Flecken bereitgestellt wird. Es gibt auch deutliche Vorteile stabiler kovalenter Bindung gegenüber Adsorption. Stabile Bindungen sind wichtig in Anwendungen, wo stringente Hybridisierungen erforderlich sind oder wenn Amplifikationstechniken, wie etwa die Polymerasekettenreaktion (PCR), verwendet werden, die Thermocycling involvieren, oder wo mehrfache Sondierung erforderlich ist.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Nukleinsäuresondenarrays durch die Verwendung einer photoaktivierbaren Nukleinsäure-Zusammensetzung, wie hierin beschrieben, bereit. In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Nukleinsäuresondenarray bereit, das durch die Verwendung einer oder mehrerer photoaktivierbarer Nukleinsäure-Derivate hergestellt worden ist.
Das photoaktivierbare Nukleinsäure-Derivat kann jede geeignete Form annehmen, z.B. die Form einer einzelnen Nukleinsäure mit einer oder mehrerer Photogruppen. Im Gebrauch stellen die photoaktivierbaren Nukleinsäure-Derivate dieser Erfindung eine einzigartige und bequeme Methode zur Herstellung eines Nukleinsäuresondenarrays oder für andere Methoden, die Nukleinsäureimmobilisierung involvieren, bereit.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Photoaktivierbare Nukleinsäure-Derivate der vorliegenden Erfindung können in Form einer oder mehrerer photoreaktiver Gruppen bereitgestellt werden, die (z.B. direkt oder indirekt kovalent gebunden) an eine Nukleinsäure gebunden sind. Wie hierin verwendet, wird der Begriff „Nukleinsäure" jede aus der Gruppe der Polynukleotid-Verbindungen mit Basen einschließen, die von Purin und von Pyrimidin abgeleitet sind. Nukleinsäuren für besondere Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen im allgemeinen kurze, synthetische Sequenzen ein, die üblicher als Oligonukleotide bekannt sind. Die Nukleinsäure kann in jeder geeigneten Form vorliegen, z.B. einzelsträngig, doppelsträngig oder als ein Nukleoprotein. Beispiele für geeignete Nukleinsäuren schließen synthetisierte und/oder natürliche Moleküle von Desoxyribonukleinsäure (DNA) (wie etwa komplementäre DNA (cDNA)), Ribonukleinsäure (RNA) und Peptidnukleinsäure (PNA) ein. PNA ist ein DNA-Mimetikum, in dem die native Zuckerphosphat-DNA-Hauptkette durch ein Polypeptid ersetzt worden ist. Von diesem Ersatz wird gesagt, daß er die Stabilität des Moleküls erhöht sowie sowohl Affinität als auch Spezifität verbessert.
Eine oder mehrere Photogruppen können auf jede geeignete Weise (z.B. direkt) an die Nukleinsäure gebunden werden, z.B. durch Synthetisieren eines Oligonukleotids oder Derivatisieren eines natürlichen oder vorher synthetisierten Oligonukleotids, in solcher Weise, daß eine Photogruppe am 3'-Terminus, am 5'-Terminus, entlang der Länge des Oligonukleotids selbst (z.B. als Seitengruppe an einem mittleren Nukleotid oder Spacer innerhalb der Nukleinsäure) oder jede Kombination davon bereitgestellt wird.
Die Oligonukleotid-Komponente einer photoaktivierbaren Oligonukleotid-Zusammensetzung kann unter Verwendung jedes geeigneten Ansatzes synthetisiert werden, einschließlich Methoden, die auf der Phosphodiester-Chemie beruhen und, seit kurzem, auf Festphasen-Phosphoramidit-Techniken. Siehe allgemein T. Brown und D. Brown, „Modern Machine-Aided Methods of Oligonucleotide Synthesis", Kapitel 1, S. 1–24 in Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach, F. Eckstein, Hrg., IRL Press (1991).
Die schrittweise Synthese von Oligonukleotiden involviert im allgemeinen die Bildung sukzessiver Diester-Bindungen zwischen 5'-Hydroxylgruppen von gebundenen Nukleotid-Derivaten und den 3'-Hydroxylgruppen einer Abfolge freier Nukleotid-Derivate. Das Syntheseverfahren beginnt typischerweise mit der Bindung eines Nukleotid-Derivats an seinem 3'-Terminus mittels eines Linkerarms an einen festen Träger, wie etwa Silicagel oder Perlen aus Borsilicatglas, gepackt in eine Säule. Die Fähigkeit, eine Gruppe auf dem freien Nukleotid-Derivat zu aktivieren, erfordert, daß andere potentiell aktive Gruppen an anderer Stelle in der Reaktionsmischung durch reversible chemische Modifikationen „geschützt" werden. Das reaktive Nukleotid-Derivat ist ein freies Monomer, in dem die 3'-Phosphatgruppe substituiert worden ist, z.B. durch Dialkylphosphoramidit, das bei Aktivierung mit der freien 5'-Hydroxylgruppe des gebundenen Nukleotids reagiert, um einen Phosphittriester zu liefern. Der Phosphittriester wird dann vor dem nächsten Syntheseschritt zu einem stabilen Phosphotriester oxidiert.
Das 3'-Hydroxyl des immobilisierten Reaktanten wird durch seine Bindung an den Träger geschützt und das 5'-Hydroxyl des freien Monomers kann mit einer Dimethoxytrityl(DMT)-Gruppe geschützt werden, um Selbstpolymerisation zu verhindern. Eine 2-Cyanoethylgruppe wird üblicherweise verwendet, um das Hydroxyl des 3'-Phosphats zu schützen. Zusätzlich werden die reaktiven Gruppen auf den einzelnen Basen ebenfalls geschützt. Eine Vielzahl chemischer Techniken sind für den Schutz der exocyclischen Aminogruppen von Nukleotiden entwickelt worden. Die Verwendung von N-Acetyl-Schutzgruppen, um N-acetylierte Desoxynukleotide herzustellen, hat breite Akzeptanz für solche Zwecke gefunden.
Nach jeder Reaktion werden überschüssige Reagenzien von den Säulen heruntergewaschen, alle nicht-umgesetzten 5'-Hydroxylgruppen werden blockiert oder „abgedeckt", unter Verwendung von Essigsäureanhydrid, und die 5'-DMT-Gruppe wird unter Verwendung von Dichloressigsäure entfernt, um zu ermöglichen, daß das verlängerte gebundene Oligomer bei der nächsten Syntheserunde mit einem weiteren aktivierten Monomer reagiert.
Schließlich wird das vollständig zusammengebaute Oligonukleotid vom festen Träger abgespalten und von Schutzgruppen befreit, um mit HPLC oder irgendeiner anderen Methode gereinigt zu werden. Die nützlichen Reagenzien und Bedingungen für die Abspaltung hängen von der Natur der Bindung ab. Bei Esterbindungen, wie sie üblicherweise durch Verknüpfung über Succinylgruppen bereitgestellt werden, kann die Abspaltung gleichzeitig mit dem Abspalten der Schutzgruppen von den Basen unter Verwendung konzentrierten wäßrigen Ammoniumhydroxids erfolgen.
Eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann durch Modifizieren von Nukleinsäuren unter Verwendung von Techniken innerhalb der Fähigkeiten der Fachleute vor dem Hintergrund der vorliegenden Lehre hergestellt werden. Eine Übersicht über die Verfahren zur Modifizierung von Nukleinsäuren ist enthalten in Bioconjugate Chem., 3(1):165–186 (1990). Solche Verfahren schließen Modifikationen, die während chemischer Modifikationen nativer oder synthetischer DNA eingeführt werden, Oligonukleotid-Synthese und enzymatische Modifikationen ein.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung können Nukleinsäuren, entweder natürlich oder synthetische, mit photoreaktiven Gruppen derivatisiert werden, die zufällig entlang der Hauptkette oder an deren 3'- oder 5'-Enden gebunden sind. Die Basen, die auf den Nukleotiden vorliegen, die die Nukleinsäure ausmachen, besitzen zum Beispiel zahlreiche reaktive Gruppen, die unter Verwendung einer heterobifunktionellen photoreaktiven Verbindung derivatisiert werden können, die sowohl eine photoreaktive Gruppe als eine thermochemisch reaktive Gruppe aufweist, geeignet für kovalente Kopplung an die Basen. Dieser Ansatz wird typischerweise zu einer relativ nicht-selektiven Derivatisierung der Nukleinsäure führen, sowohl was die Stelle entlang der Hauptkette betrifft als auch die Anzahl von Photogruppen pro Molekül.
In einer alternativen und selektiveren Ausführungsform kann das Verfahren dieser Erfindung die Nachsynthese-Photoderivatisierung eines Oligonukleotids einschließen, das chemisch reaktive Gruppen während der Synthese an spezifischen Stellen eingebaut bekommen hat, z.B. entlang der Hauptkette oder an deren 3'- oder 5'-Enden. Kommerziell verfügbare Reagenzien oder feste Träger sind zum Beispiel verfügbar, die den Eigenbau von Amingruppen an einer dieser Stellen im Oligonukleotid erlauben. Diese Amingruppen werden dann mit einer photoreaktiven Verbindung kombiniert, die eine Photogruppe und einen N-Oxisuccinimidester (NOS) aufweist, was zur Bildung einer Amidbindung zwischen der Photogruppe und dem Oligonukleotid führt. Die Fachleute werden angesichts der vorliegenden Beschreibung die Art und Weise anerkennen, in der eine Vielzahl anderer Reaktionen zwischen elektrophilen und nukleophilen Spezies ähnliche Kopplungstechniken bereitstellen können. Die Reaktion zwischen Carbonsäurechloriden mit Aminen oder Maleimidgruppen mit Sulfhydrylgruppen kann zum Beispiel verwendet werden, um ebenfalls photoaktivierbare Nukleinsäure-Derivate bereitzustellen.
In einer weiteren Ausführungsform können ein oder mehrere der Nukleotidbausteine, die üblicherweise in der Oligo-Synthese verwendet werden, selbst mit einem Reagenz derivatisiert werden, das eine photoreaktive Gruppe enthält, durch Bindung des Reagenz an eine der reaktiven Funktionalitäten, die auf dem Basenrest des Nukleotids vorliegen. Das resultierende derivatisierte Nukleotid-Reagenz kann in einem automatisierten Synthesizer unter herkömmlichen Reaktionsbedingungen verwendet werden, um die Photogruppe an bezeichneten Punkten entlang der Kette oder an einem Ende des Nukleotids einzubauen. Zusätzlich können kommerziell erhältliche Nicht-Nukleotid-Reagenzien, die für den Einbau chemisch reaktiver Gruppen verwendet werden, wie oben beschrieben, mit der photoreaktiven Verbindung umgesetzt werden, um die photoreaktive Gruppe einzubauen, woraufhin sie im automatisierten Synthesizer verwendet werden können, um die photoaktivierbaren Nukleinsäuren herzustellen.
Eine Vielzahl von Reagenzien sind zur Verwendung bei der Modifizierung von Nukleinsäuren verfügbar, einschließlich derjenigen, die unter dem Markennamen „Biotin-Chem-Link" von Boehringer Mannheim (Indianapolis, IN) erhältlich sind. Dieses Cisplatin-Reagenz wird sich an die N7-Position von Guanosin- und Adenosin-Basen binden. In einer ähnlichen Weise kann eine photoreaktive Verbindung, die eine Cisplatin-Einheit enthält, zur Verwendung bei der Photoderiviatisierung von Nukleinsäuren synthetisiert werden.
In einem weiteren Aspekt können photoderivatisierte Nukleotide synthetisiert und unter Verwendung enzymatischer Techniken in Nukleinsäuren eingebaut werden. Zum Beispiel sind eine Vielzahl von Reagenzien verfügbar, die verwendet werden können, um Nukleinsäuren mit Biotin, Fluorescein und Digoxigenin (DIG) zu markieren. Eine Nukleinsäure kann mit einem photoaktivierbaren Didesoxyribonukleotid oder Desoxyribonukleotid unter Verwendung einer terminalen Transferase markiert werden, um einzelne bzw. mehrere Photogruppen am 3'-Ende der Nukleinsäure bereitzustellen.
Boehringer-Mannheim vertreibt auch einen DIG-Markierungskit, bezeichnet als „DIG-High Prime" für random-primed Markierung von DNA mit DIG-11-UTP. „Biotin High Prime"- und „Fluorescein-High-Prime"-Produkte sind ebenfalls erhältlich. In einer ähnlichen Weise kann DNA mit einem photoaktivierbaren Desoxyribonukleotid unter Verwendung des Klenow-Enzyms random-primed markiert werden, wie den Fachleuten klar sein wird.
Das Enzym DNA-Polymerase I wird üblicherweise für Nick-Translation von DNA verwendet. Durch Einbeziehung photoaktivierbarer Desoxyribonukleotide in die Mischung von Desoxynukleotidtriphosphaten („dNTPs") wird das resultierende polymerisierte Produkt eine oder mehrere photoreaktive Gruppen entlang seiner Länge enthalten. Auch kann, während einer Polymerasekettenreaktion (PCR), ein photoaktivierbares Desoxyribonukleotid in die Mischung von dNTPs zur Markierung von Amplifikationsprodukten einbezogen werden. Es ist auch möglich, ein Photoribonukleotid in RNA einzubauen, z.B. durch die Verwendung einer RNA-Polymerase (z.B. SP6 oder T7) und Standard-Transkriptionsprotokollen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung können Oligos mit photoreaktiven Gruppen derivatisiert werden, indem das intakte Oligo als ein Ligand entlang der Hauptkette eines Polymers gebildet oder gebunden wird, die eine oder mehrere photoreaktive Gruppen entlang ihrer Länge bereitstellt, z.B. wie beschrieben in der mitanhängigen US-Patentanmeldung Serial No. 08/916,913 für „Latent Reactive Polymers with Biologically Active Moities", eingereicht am 15. August 1997, deren Offenbarung hierin durch Bezugnahme miteinbezogen ist. Eine Reihe von Ansätzen kann für die Herstellung eines solchen polymeren Photooligoreagenz verwendet werden. In einer Ausführungsform kann das Oligo in Monomerform durch kovalente Bindung einer polymerisierbaren Vinylgruppe, wie etwa Acryloyl, an das Oligo, entweder an den Enden oder entlang der Hauptkette, hergestellt werden. Dies kann erreicht werden durch Reaktion von Acryloylchlorid mit einem Aminderivatisierten Oligo. Diese Oligo-Monomere können dann mit einem photoderivatisierten Monomer zusammen mit anderen Comonomeren, wie etwa Acrylamid oder Vinylpyrrolidon, copolymerisiert werden. Das resultierende Polymer liefert Photogruppen und Oligos, die zufällig entlang der Hauptkette des Polymers gebunden sind. Alternativ kann das Polymer mit der photoreaktivem Gruppe an einem Ende des Polymers durch Verwendung eines Kettenübertragungsreagenz mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppen als Teil der Struktur hergestellt werden.
In noch einer weiteren Ausführungsform kann ein photoreaktives Polymer (z.B. ein vorgeformtes synthetisches oder natürlich vorkommendes Polymer, das selbst mit Photogruppen versehen ist) mit Oligos derivatisiert werden, um eine Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung zu bilden. In diesem Ansatz kann ein Polymer hergestellt, oder modifiziert, werden, um chemisch reaktive Gruppen aufzuweisen, die entlang der Hauptkette des Polymers angeordnet sind, von denen jede mit geeignet substituierten Oligos reagieren kann. Polymere, die aktivierte Gruppen, wie etwa NOS-Ester, besitzen, können zum Beispiel mit Oligos umgesetzt werden, die Amin-Funktionalität enthalten, was zu kovalenter Bindung des Oligos an die Polymer-Hauptkette durch eine Amidbindung führt. Der polymere Abschnitt selbst kann mit Photogruppen derivatisiert werden, entweder vor, während oder nach seiner Bindung an das Oligo. Ein photoderivatisiertes Polymer kann zum Beispiel hergestellt werden durch Polymerisieren von Monomeren, die photoderivatisierte Monomere einschließen, oder eine oder mehrere Photogruppen können zum gebildeten Polymer in einer Weise hinzugefügt werden, die ähnlich ist zu derjenige, die oben im Hinblick auf Oligos beschrieben ist. Alternativ können Polymere hergestellt werden, die endständige photoreaktive Gruppen aufweisen, durch die Verwendung eines Kettenübertragungsreagenz mit einer Photogruppe als Teil seiner Struktur. Das Oligo würde dann in einem zweiten Schritt zu den reaktiven Gruppen hinzugefügt werden.
Photoreaktive Gruppen
Eine bevorzugte Zusammensetzung dieser Erfindung schließt eine oder mehrere latent reaktive (vorzugsweise photoreaktive) Seitengruppen ein, die, direkt oder indirekt, kovalent an eine Nukleinsäure gebunden sind. Photoreaktive Gruppen sind hierin definiert, und bevorzugte Gruppen sind ausreichend stabil, um unter Bedingungen gelagert zu werden, bei denen sie ihrer Eigenschaften beibehalten. Siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,002,582. Latent reaktive Gruppen können ausgewählt werden, die auf verschiedene Bereiche des elektromagnetischen Spektrums ansprechen, wobei diejenigen, die auf ultraviolette und sichtbare Bereiche des Spektrums ansprechen (hierin im weiteren als „photoreaktiv" bezeichnet), besonders bevorzugt sind.
Photoreaktive Gruppen reagieren auf spezifische angewendete äußere Stimuli, um die Erzeugung aktiver Spezies mit resultierender kovalenter Bindung an eine benachbarte chemische Struktur zu durchlaufen, z.B. wie bereitgestellt durch dasselbe oder ein unterschiedliches Molekül. Photoreaktive Gruppen sind diejenigen Gruppen von Atomen in einem Molekül, die ihre kovalenten Bindungen unter Lagerungsbedingungen unverändert beibehalten, die aber, bei Aktivierung durch eine äußere Energiequelle, kovalente Bindungen mit anderen Molekülen bilden.
Die photoreaktiven Gruppen erzeugen aktive Spezies, wie etwa freie Radikale und insbesondere Nitrene, Carbene und angeregte Zustände von Ketonen, bei Absorption elektromagnetischer Energie. Photoreaktive Gruppen können ausgewählt werden, um auf verschiedene Abschnitte des elektromagnetischen Spektrums anzusprechen, und photoreaktive Gruppen, die auf z.B. ultraviolette und sichtbare Abschnitte des Spektrums ansprechen, sind bevorzugt und werden hierin gelegentlich als „photochemische Gruppe" oder „Photogruppe" bezeichnet.
Photoreaktive Arylketone sind bevorzugt, wie etwa Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Anthron-ähnliche Heterocyclen (d.h. heterocyclische Analoge von Anthron, wie etwa diejenigen mit N, O oder S in der 10-Position) oder ihre substituierten (z.B. ringsubstituierten) Derivate. Beispiele für bevorzugte Arylketone schließen heterocyclische Derivate von Anthron, einschließlich Acridon, Xanthon und Thioxanthon, und deren ringsubstituierte Derivate ein. Besonders bevorzugt sind Thioxanthon und seine Derivate, mit Anregungsenergien von mehr als etwa 360 nm.
Die funktionellen Gruppen solcher Ketone sind bevorzugt, da sie ohne weiteres in der Lage sind, den hierin beschriebenen Aktivierungs/Inaktivierungs/Reaktivierungs-Zyklus zu durchlaufen. Benzophenon ist eine besonders bevorzugte photoreaktive Einheit, da es zu photochemischer Anregung mit der anfänglichen Bildung eines angeregten Singulettzustandes in der Lage ist, der Intersystem-Crossing zum Triplett-Zustand durchläuft. Der angeregte Triplett-Zustand kann sich in Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen durch Abstraktion eines Wasserstoffatoms (zum Beispiel von einer Trägeroberfläche) einschieben, wodurch ein Radikalenpaar geschaffen wird. Anschließender Kollaps des Radikalenpaares führt zur Bildung einer neuen Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung. Wenn eine reaktive Bindung (z.B. Kohlenstoff-Wasserstoff) für Bindung nicht zur Verfügung steht, ist die durch ultraviolettes Licht induzierte Anregung der Benzophenon-Gruppe reversibel und das Molekül kehrt bei Entfernung der Energiequelle zum Grundzustands-Energieniveau zurück. Photoaktivierbare Arylketone, wie etwa Benzophenon oder Acetophenon, sind insofern von besonderer Wichtigkeit, als diese Gruppen mehrfacher Reaktivierung in Wasser unterliegen und daher erhöhte Beschichtungseffizienz liefern.
Die Azide stellen eine bevorzugte Klasse photoreaktiver Gruppen dar und schließen Arylazide (C₆R₅N₃), wie etwa Phenylazid und insbesondere 4-Fluor-3-nitrophenylazid, Acylazide (-CO-N₃), wie etwa Benzoylazid und p-Methylbenzoylazid, Azidoformiate (-O-CO-N₃), wie etwa Ethylazidoformiat, Phenylazidoformiat, Sulfonylazide (-SO₂-N₃), wie etwa Benzolsulfonylazid, und Phosphorylazide (RO)₂PON₃, wie etwa Diphenylphosphorylazid und Diethylphosphorylazid, ein. Diazoverbindungen stellen eine weitere Klasse photoreaktiver Gruppen dar und schließen Diazoalkane (-CHN₂), wie etwa Diazomethan und Diphenyldiazomethan, Diazoketone (-CO-CHN₂), wie etwa Diazoacetophenon und 1-Trifluormethyl-1-diazo-2-pentanon, Diazoacetate (-O-CO-CHN₂), wie etwa t-Butyldiazoacetat und Phenyldiazoacetat, und beta-Keto-alpha-diazoacetate (-CO-CN₂-CO-O-), wie etwa t-Butyl-alpha-diazoacetoacetat, ein. Weitere photoreaktive Gruppen schließen die Diazirine (-CHN₂), wie etwa 3-Trifluormethyl-3-phenyldiazirin, und Ketene (-CH=C=O), wie etwa Keten und Diphenylketen, ein.

Bei Aktivierung der photoreaktiven Gruppen werden die Reagenzmoleküle durch kovalente Bindungen durch Reste der photoreaktiven Gruppen kovalent aneinander und/oder die Materialoberfläche gebunden. Beispielhafte photoreaktive Gruppen und deren Reste bei Aktivierung sind wie folgt dargestellt.

Photoreaktive Gruppe	Restfunktionalität
Arylazide	Amin R-NH-R'
Acylazide	Amid R-CO-NH-R'
Azidoformiate	Carbamat R-O-CO-NH-R'
Sulfonylazide	Sulfonamid R-SO₂-NH-R'
Phosphorylazide	Phosphoramid (RO)₂PO-NH-R'
Diazoalkane	Neue C-C-Bindung
Diazoketone	Neue C-C-Bindung und Keton
Diazoacetate	Neue C-C-Bindung und Ester
beta-Keto-alpha-diazoacetate	Neue C-C-Bindung und beta-Ketoester
Aliphtisches Azo	Neue C-C-Bindung
Diazirine	Neue C-C-Bindung
Ketene	Neue C-C-Bindung
Photoaktivierte Ketone	Neue C-C-Bindung und Alkohol

Die photoaktivierbaren Nukleinsäuren der Erfindung können auf jede Oberfläche mit Kohlenstoff-Wasserstoff-Bindungen aufgebracht werden, mit denen die photoreaktiven Gruppen reagieren können, um die Nukleinsäuren an Oberflächen zu immobilisieren. Beispiele für geeignete Substrate schließen Polypropylen, Polystyrol, Poly(vinylchlorid), Polycarbonat, Poly(methylmethacrylat), Parylene und jedes der zahlreichen Organosilane, die verwendet werden, um Glas oder andere anorganische Oberflächen vorzubehandeln, ein, sind aber nicht hierauf beschränkt. Die photoaktivierbaren Nukleinsäuren können auf Oberflächen in Arrays aufgedruckt, dann durch gleichförmige Bestrahlung photoaktiviert werden, um sie auf der Oberfläche in spezifischen Mustern zu immobilisieren. Sie können auch sequentiell gleichförmig auf die Oberfläche aufgebracht, dann durch Bestrahlung durch eine Reihe von Masken hindurch photoaktiviert werden, um spezifische Sequenzen in spezifischen Bereichen zu immobilisieren. So können mehrfache sequentielle Aufträge spezifischer photoderivatisierter Nukleinsäuren mit mehrfachen Bestrahlungen durch unterschiedliche Masken hindurch und sorgfältiges Waschen, um nicht-gekoppelte Photonukleinsäuren nach jedem Photokopplungsschritt zu entfernen, verwendet werden, um Arrays immobilisierter Nukleinsäuren herzustellen. Die photoaktivierbaren Nukleinsäuren können auch gleichförmig auf Oberflächen durch Auftrag und Photoimmobilisierung immobilisiert werden.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden nicht-beschränkenden Beispiele weiter beschrieben werden. Es wird für die Fachleute deutlich sein, daß viele Veränderungen in den beschriebenen Ausführungsformen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen. Somit sollte der Schutzumfang der vorliegenden Erfindung nicht auf die in dieser Anmeldung beschriebenen Ausführungsformen beschränkt werden, sondern nur durch die Ausführungsformen, die durch die Sprache der Ansprüche beschrieben sind. Sofern nicht anders angegeben, sind alle Prozentanteile gewichtsbezogen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Darstellung eines Benzophenon-substituierten Oligonukleotids
(a) Darstellung von N-Succinimidyl-6-(4-benzoylbenzamido)hexanoat (BBA-EAC-NOS)
4-Benzoylbenzoylchlorid, 60 g (0,246 mol), hergestellt wie beschrieben in Beispiel 3(a), wurde in 900 ml Chloroform gelöst. Die 6-Aminohexansäure, 33,8 g (0,258 mol), wurde in 750 ml 1N NaOH gelöst und die Säurechloridlösung wurde mit Rühren zugegeben. Die Mischung wurde für 45 Minuten bei Raumtemperatur kräftig gerührt, um eine Emulsion zu erzeugen. Das Produkt wurde dann mit 75 ml 12 N HCl angesäuert und mit 3 × 500 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck eingedampft. Die 6-(4-Benzoylbenzamido)hexansäure wurde aus Toluol/Ethylacetat (3/1 nach Volumen) umkristallisiert, um 77,19 g (93% Ausbeute) Produkt zu ergeben, m.p. 106,5–109,5°C.
Die 6-(4-Benzoylbenzamido)hexansäure, 60 g (0,177 mmol), wurde zu einem trockenen Kolben zugegeben und in 1200 ml trockenem 1,4-Dioxan gelöst. N-Hydroxysuccinimid, 21,4 g (0,186 mol), wurde zugegeben, gefolgt von 41,9 g (0,203 mol) 1,3-Dicyclohexylcarbodiimid, und die Mischung wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter einem Trockenrohr, um die Reaktion vor Feuchtigkeit zu schützen, gerührt. Nach Filtration, um den 1,3-Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, wurde das Lösemittel unter verringertem Druck abgezogen, und das resultierende Öl wurde mit 300 ml Dioxan verdünnt. Alle verbleibenden Feststoffe, die sich bildeten, wurden durch Filtration entfernt, und nach Entfernen des Lösemittels wurde das BBA-EAC-NOS zweimal aus Ethanol umkristallisiert, um 60,31 g eines weißen Feststoffes zu ergeben, m.p. 123–126°C.
(b) Photoderivatisierung eines Amino-modifizierten Oligonukleotids
Eine 30-basige oligomere (-mer) Sonde (Sequenz (oder „Seq")1), synthetisiert mit einem 5'-Amino-Modifikator, der einen C-12-Spacer enthält (Amin-Sequenz 1), wurde speziell hergestellt bei Midland Certified Reagent Company (Midland, TX). Oligonukleotid Amin-Sequenz 1, 100 μg (10 nmol, 39,4 μl einer 2,54 mg/ml Vorratslösung in Wasser), wurde auf einem Rüttler in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit 43,8 μg (100 nmol, 8,8 μl einer 5 mg/ml Vorratslösung in DMF) BBA-EAC-NOS, hergestellt wie oben in Beispiel 1(a) beschrieben, und 4 μl 1M Natriumbicarbonatpuffer, pH 9, vermischt. Die Reaktion lief bei Raumtemperatur für 3 Stunden. Um nicht-umgesetztes BBA-EAC-NOS zu entfernen, wurde die Reaktion mit 148 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, 10 mM Na₂HPO₄, 150 mM NaCl, pH 7,2) verdünnt und dann auf eine NAP-5-Säule (Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) gemäß den Spezifikationen des Herstellers geladen. PBS wurde verwendet, um die Säule zu äquilibrieren und die Oligonukleotide von der Säule zu eluieren. Die NAP-5-Säule, die Sephadex (eingetragene Marke) G-25-Gel enthält, trennte Oligonukleotide von der Verbindung mit kleinem Molekulargewicht. Insgesamt 3,1 A₂₆₀-Einheiten oder 96 μg Benzophenon-derivatisiertes Oligonukleotid Sequenz 1 wurde gewonnen.
Beispiel 2
Bewertung des Benzophenon-substituierten Oligonukleotids
Die Oligos Amin-Sequenz 1 und Benzophenon-Sequenz 1 wurden bei 5 pmol/0,1 ml pro Vertiefung in Mikrowellplatten aus Polypropylen (PP, Corning Costar, Cambridge, MA) im Inkubationspuffer (50 mM Phosphatpuffer, pH 8,5, 1 mM EDTA, 15% Na₂SO₄) bei Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Die Hälfte der Platten wurde mit einer Dymax-Lampe (Modell Nr. PC-2, Dymax Corporation, Torrington, CT) beleuchtet, die einen Heraeus-Kolben (W.C. Heraeus GmbH, Hanau, Bundesrepublik Deutschland) und einen Cut-Off-Filter enthielt, der alles Licht unter 300 nm abblockte. Die Beleuchtungsdauer betrug 2 Minuten bei einer Intensität von 1–2 mW/cm² im Wellenlängenbereich von 330–340 nm. Die restliche Hälfte der Platten, die nicht beleuchtet wurden, dienten als die adsorbierten Oligo-Kontrollen. Alle Platten wurden dann mit PBS, die 0,05 % Tween 20 (eingetragene Marke) enthielt, unter Verwendung eines Microplate Auto Washer (Modell E1 403H, Bio-Tek Instruments, Winooski, VT) gewaschen.
Hybridisierung wurde durchgeführt, wie unten beschrieben, unter Verwendung einer komplementären Nachweissonde (Sequenz 2) oder des nicht-komplementären Oligonukleotids (Sequenz 3). Beide Oligos wurden bezogen von der Mayo Clinic (Rochester, MN). Die Platten wurden bei 55°C für 30 Minuten mit Hybridisierungspuffer blockiert, der 5 × SSC (0,75 M NaCl. 0,075 M Citrat, pH 7,0), 0,1% Lauroylsarcosin, 1% Casein und 0,02% Natriumdodecylsulfat (SDS) enthielt. Als die Nachweissonde an der immobilisierten Sonde hybridisiert war, wurde ein Aliquot von 50 fmol Nachweissonde in 0,1 ml pro Vertiefung zugegeben und für 1 Stunde bei 55°C inkubiert. Die Platten wurden dann mit 2 × SSC, das 0,1% SDS enthielt, für 5 Minuten bei 55°C gewaschen. Die gebundene Nachweissonde wurde getestet durch Zugabe von 0,1 ml eines Konjugats aus Streptavidin und Meerrettichperoxidase (SA-HRP, Pierce, Rockford, IL) bei 0,5 μg/ml, das für 30 Minuten bei 37°C inkubiert wurde. Die Platten wurden dann mit PBS/Tween gewaschen, gefolgt von der Zugabe von Peroxidasesubstrat (H₂O₂ und Tetramethylbenzidin, Kirkegard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD) und Messung bei 655 nm, 20 Minuten später, auf einem Mikrowell-Plattenlesegerät (Modell 3550, Bio-Rad Labs, Cambridge, MA).
Die in Tabelle 1 aufgelisteten Ergebnisse zeigen, daß das beleuchtete Benzophenonderivatisierte Oligonukleotid ein höheres Hybridisierungssignal lieferte als die adsorbierte Oligonukleotidkontrolle. Im Gegensatz dazu gab es keinen Unterschied zwischen den Hybridisierungssignalen, die von den beleuchteten und den adsorbierten nicht-derivatisierten Oligonukleotiden erzeugt wurden. Tabelle 1: Hybridisierungssignale (A₆₅₅ ± Standardabweichung) aus Amin-Sequenz 1 und Benzophenon-Sequenz 1 auf PP-Mikrowellplatten.
Beispiel 3
Darstellung und Bewertung eines Photopolymers, das mit Oligonukleotiden derivatisiert ist
(a) Darstellung von 4-Benzoylbenzoylchlorid (BBA-Cl)
4-Benzoylbenzoesäure (BBA), 1 kg (4,42 mol), wurde zu einem trockenem 5 Liter-Mortonkolben zugegeben, der mit Rückflußkondensator und Überkopfrührer ausgestattet war, gefolgt von der Zugabe von 645 ml (8,84 mol) Thionylchlorid und 725 ml Toluol. Dimethylformamid, 3,5 ml, wurde dann zugegeben, und die Mischung wurden bei Rückfluß für 4 Stunden erhitzt. Nach Abkühlung wurden die Lösemittel unter verringertem Druck abgezogen und das restliche Thionylchlorid wurde durch drei Verdampfungen unter Verwendung von 3 × 500 ml Toluol entfernt. Das Produkt wurde aus Toluol/Hexan (1/4 nach Volumen) umkristallisiert, um 988 g (91% Ausbeute) nach Trocknen in einem Vakuumofen zu ergeben. Produkt-Schmelzpunkt betrug 92–94°C. Kernmagnetische Resonanz(NMR)-Analyse bei 80 MHz (¹H-NMR (CDCl₃)) war konsistent mit dem gewünschte Produkt: aromatische Protonen 7,20–8,25 (m, 9H). Alle chemischen Verschiebungswerte waren in ppm feldabwärts von einem internen Tetramethylsilan-Standard. Die Endverbindung wurde zur Verwendung bei der Herstellung eines Monomers aufbewahrt, das bei der Synthese von photoaktivierbaren Polymeren verwendet wurde, wie zum Beispiel in Beispiel 3(c) beschrieben, oder für heterobifunktionelle Verbindungen, wie zum Beispiel in Beispiel 1(a) beschrieben.
(b) Darstellung von N-(3-Aminopropyl)methacrylamid-Hydrochlorid (APMA)
Eine Lösung von 1,3-Diaminopropan, 1910 g (25,77 mol), in 1000 ml CH₂Cl₂ wurde zu einem 12 Liter-Mortonkolben zugegeben und auf einem Eisbad gekühlt. Eine Lösung von t-Butylphenylcarbonat, 1000 g (5,15 mol), in 250 ml CH₂Cl₂ wurde dann tropfenweise mit einer Geschwindigkeit zugegeben, die die Reaktionstemperatur unter 15°C hielt. Im Anschluß an die Zugabe wurde die Mischung auf Raumtemperatur erwärmt und für 2 Stunden gerührt. Die Reaktionsmischung wurde mit 900 ml CH₂Cl₂ und 500 g Eis verdünnt, gefolgt von der langsamen Zugabe von 2500 ml 2,2 N NaOH. Nach Testen, um sicherzustellen, daß die Lösung basisch war, wurde das Produkt in einen Trenntrichter überführt, und die organische Schicht wurde entfernt und als Extrakt #1 zur Seite gestellt. Die wäßrige Schicht wurde dann mit 3 × 1250 ml CH₂Cl₂ extrahiert, wobei jede Extraktion als eine separate Fraktion gehalten wurde. Die vier organischen Extrakte wurden dann nacheinander mit einer einzelnen 1250 ml-Portion 0,6 N NaOH gewaschen, beginnend mit Fraktion #1 und fortschreitend bis zu Fraktion #4. Dieser Waschvorgang wurde ein zweites Mal mit einer frischen 1250 ml-Portion und 0,6 N NaOH wiederholt. Die organischen Extrakte wurden dann vereinigt und über Na₂SO₄ getrocknet, Filtration und Verdampfung von Lösemittel bis zu einem konstanten Gewicht ergab 825 g N-Mono-t-BOC-1.3-diaminopropan, das ohne weitere Reinigung verwendet wurde.
Eine Lösung von Methacrylsäureanhydrid, 806 g (5,23 mol), in 1020 ml CHCl₃ wurde in einen 12 Liter-Mortonkolben gegeben, der mit Überkopfrührer ausgestattet war, und auf einem Eisbad gekühlt. Phenothiazin, 60 mg, wurde als ein Inhibitor zugegeben, gefolgt von der tropfenweise Zugabe von N-Mono-t-BOC-1,3-diaminopropan, 825 g (4,73 mol), in 825 ml CHCl₃. Die Zugabegeschwindigkeit wurde so gesteuert, daß die Reaktionstemperatur zu allen Zeiten unter 10°C gehalten wurde. Nachdem die Zugabe abgeschlossen war, wurde das Eisbad entfernt und die Mischung über Nacht rühren gelassen. Das Produkt wurde mit 2400 ml Wasser verdünnt und in einen Trenntrichter überführt. Nach gründlichem Mischen wurde die wäßrige Schicht entfernt, und die organische Schicht wurde mit 2400 ml 2 N NaOH gewaschen, wobei sichergestellt wurde, daß die wäßrige Schicht basisch war. Die organische Schicht wurde dann über Na₂SO₄ getrocknet und filtriert, um Trocknungsmittel zu entfernen. Eine Portion des CHCl₃-Lösemittels wurde unter verringertem Druck abgezogen, bis das vereinigte Gewicht des Produktes und Lösemittels ungefähr 3000 g betrug. Das gewünschte Produkt wurde dann durch langsame Zugabe von 11 Litern Hexan zur gerührten CHCl₃-Lösung ausgefällt, gefolgt von Aufbewahrung über Nacht bei 4°C. Das Produkt wurde durch Filtration isoliert, und der Feststoff wurde zweimal mit einer Lösemittelkombination aus 900 ml Hexan und 150 ml CHCl₃ gespült. Gründliches Trocknen des Feststoffes ergab 900 g N-[N'-(t-Butyloxycarbonyl)-3-aminopropyl]methacrylamid, m.p. 85.8°C nach DSC. Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) Amid-NHs 6,30–6,80, 4,55–5,10 (m, 2H), Vinylprotonen 5,65, 5,20 (m, 2H), Methylene benachbart zu N 2,90–3,45 (m, 4H), Methyl 1,95 (m, 3H), restliches Methylen 1,50–1,90 (m, 2H) und t-Butyl 1,40 (s, 9H).
Ein 2 Liter-Dreihalsrundkolben wurde mit einem Überkopfrührer und Gaseinlaßrohr ausgestattet. Methanol, 700 ml, wurde zum Kolben zugegeben und auf einem Eisbad gekühlt. Während gerührt wurde, wurde HCl-Gas mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 5 Litern/Minute für insgesamt 40 Minuten in das Lösemittel eingeleitet. Die Molarität der endgültigen HCl/MeOH-Lösung wurde durch Titration mit 1 N NaOH unter Verwendung von Phenolphthalein als einem Indikator zu 8,5 M bestimmt. Das N-[N'-(t-Butyloxycarbonyl)-3-aminopropyl]methacrylamid, 900 g (3,71 mol), wurde zu einem 5 Liter-Mortonkolben zugegeben, der mit einem Überkopfrührer und Gasauslaßadapter ausgestattet war, gefolgt von der Zugabe von 1.150 ml Methanol-Lösemittel. Etwas Feststoff verblieb bei diesem Lösemittelvolumen im Kolben. Phenothiazin, 30 mg, wurde als ein Inhibitor zugesetzt, gefolgt von der Zugabe von 655 ml (5,57 mol) der 8,5 M HCl/MeOH-Lösung. Die Feststoffe lösten sich langsam mit der Gasentwicklung auf, aber die Reaktion war nicht exotherm. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt, um vollständige Reaktion sicherzustellen. Alle Feststoffe wurden dann durch Filtration entfernt und zusätzliche 30 mg Phenothiazin wurden zugegeben. Das Lösemittel wurde dann unter verringertem Druck gestrippt, und der resultierende feste Rückstand wurde mit 3 × 1.000 ml Isopropanol mit Verdampfung unter verringertem Druck azeotrop destilliert. Schließlich wurde das Produkt in 2.000 ml unter Rückfluß kochendem Isopropanol gelöst und 4.000 ml Ethylacetat wurden langsam unter Rühren zugegeben. Die Mischung wurde langsam abkühlen gelassen und wurde bei 4°C über Nacht aufbewahrt. Das N-(3-Aminopropyl)methacrylamid-Hydrochlorid wurde durch Filtration isoliert und wurde bis zu konstantem Gewicht getrocknet, was eine Ausbeute von 630 g mit einem Schmelzpunkt von 124,7°C nach DSC ergab. Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (D₂O) Vinylprotonen 5,60, 5,30 (m, 2H), Methylen benachbart zu Amid-N 3,30 (t, 2H), Methylen benachbart zu Amin-N 2,95 (t, 2H), Methyl 1,90 (m, 3H) und restliches Methylen 1,65–2,10 (m, 2H). Die Endverbindung wurde zur Verwendung bei der Herstellung eines Monomers aufbewahrt, das bei der Synthese von photoaktivierbaren Polymeren verwendet wurde, wie zum Beispiel in Beispiel 3(c) beschrieben.
(c) Darstellung von N-[3-(4-Benzoylbenzamido)propyl]methacrylamid (BBA-APMA)
APMA, 120 g (0,672 mol), hergestellt gemäß der allgemeinen Methode, die in Beispiel 3(b) beschrieben ist, wurde zu einem trockenen 2 Liter-Dreihalsrundkolben zugegeben, der mit einem Überkopfrührer ausgestattet war. Phenothiazin, 23–25 mg, wurde als ein Inhibitor zugegeben, gefolgt von 800 ml Chloroform. Die Suspension wurde auf einem Eisbad unter 10°C abgekühlt und 172,5 g (0,705 mol) BBA-Cl, hergestellt gemäß der allgemeinen Methode, die in Beispiel 3(a) beschrieben ist, wurden als ein Feststoff zugegeben. Triethylamin, 207 ml (1,485 mol), in 50 ml Chloroform wurde dann tropfenweise über einen 1- bis 1,5-stündigen Zeitraum zugegeben. Das Eisbad wurde entfernt, und Rühren bei Umgebungstemperatur wurde für 2,5 Stunden fortgesetzt. Das Produkt wurde dann mit 600 ml 0,3 N HCl und 2 × 300 ml 0,07 N HCl gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wurde das Chloroform unter verringertem Druck abgezogen und das Produkt wurde zweimal aus Toluol/Chloroform (4/1 nach Volumen) unter Verwendung von 23–25 mg Phenothiazin in jeder Umkristallisation, um Polymerisation zu verhindern, umkristallisiert. Typische Ausbeute an BBA-APMA betrug 90%, mit einem Schmelzpunkt von 147–151°C. Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) aromatische Protonen 7,20–7,95 (m, 9H), Amid-NH 6,55 (breites t, 1H), Vinylprotonen 5,65, 5,25 (m, 2H), Methylene benachbart zu Amid-Ns 3,20–3,60 (m, 4H), Methyl 1,95 (s, 3H) und restliches Methylen 1,50–2,00 (m, 2H). Die Endverbindung wurde zur Verwendung bei der Synthese von photoaktivierbaren Polymeren aufbewahrt, wie zum Beispiel beschrieben in Beispiel 3(e).
(d) Darstellung von N-Succinimidyl-6-maleimidohexanoat (MAL-EAC-NOS)
Ein funktionalisiertes Monomer wurde auf die folgende Weise hergestellt und wurde verwendet, wie beschrieben in Beispiel 3(e), um aktivierte Estergruppen auf der Hauptkette eines Polymers einzuführen. 6-Aminohexansäure, 100 g (0,762 mol), wurde in 300 ml Essigsäure in einem 3 Liter-Dreihalskolben gelöst, der mit einem Überkopfrührer und Trockenrohr ausgestattet war. Maleinsäureanhydrid, 78,5 g (0,801 mol), wurde in 200 ml Essigsäure gelöst und zur 6-Aminohexansäure-Lösung zugegeben. Die Mischung wurde eine Stunde gerührt, während sie auf einem siedenden Wasserbad erhitzt wurde, was zur Bildung eines weißen Feststoffes führte. Nach Abkühlen über Nacht bei Raumtemperatur wurde der Feststoff durch Filtration gesammelt und mit 2 × 50 ml Hexan gespült. Nach Trocknung betrug die typische Ausbeute der (Z)-4-Oxo-5-aza-2-undecendisäure 158–165 g (90–95%) mit einem Schmelzpunkt von 160–165°C. Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (DMSO-d₆) Amidproton 8,65–9,05 (m, 1H), Vinylprotonen 6,10, 6,30 (d, 2H), Methylen benachbart zu Stickstoff 2,85–3,25 (m, 2H), Methylen benachbart zu Carbonyl 2,15 (t, 2H) und restliche Methylene 1,00–1,75 (m, 6H).
(Z)-4-Oxo-5-aza-2-undecendisäure, 150 g (0,654 mol), Essigsäureanhydrid, 68 ml (73,5 g, 0,721 mol), und Phenothiazin, 500 mg, wurden zu einem 2 Liter-Dreihalsrundkolben zugegeben, der mit einem Überkopfrührer ausgestattet war. Triethylamin, 91 ml (0,653 mol), und 600 ml THF wurden zugegeben und die Mischung wurde unter Rühren auf Rückfluß erhitzt. Nach insgesamt 4 Stunden Rückfluß wurde die dunkle Mischung auf < 60°C abgekühlt und in eine Lösung von 250 ml 12 N HCl in 3 Litern Wasser gegossen. Die Mischung wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und wurde dann durch ein Celite 545-Kissen filtriert, um Feststoffe zu entfernen. Das Filtrat wurde mit 4 × 500 ml Chloroform extrahiert, und die vereinigten Extrakte wurden über Natriumsulfat getrocknet. Nach Zugabe von 15 mg Phenothiazin, um Polymerisation zu verhindern, wurde das Lösemittel unter verringertem Druck abgezogen. Die 6-Maleimidohexansäure wurde aus Hexan/Chloroform (2/1 nach Volumen) umkristallisiert, um typische Ausbeuten von 76–83 g (55–60%) mit einem Schmelzpunkt von 81–85°C zu ergeben. Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) Maleimidprotonen 6,55 (s, 2H), Methylen benachbart zu Stickstoff 3,40 (t, 2H), Methylen benachbart zu Carbonyl 2,30 (t, 2H) und restliche Methylene 1,05–1,85 (m, 6H).
Die 6-Maleimidohexansäure, 20 g (94,7 mmol), wurde in 100 ml Chloroform unter einer Argonatmosphäre gelöst, gefolgt von der Zugabe von 41 ml (0,47 mol) Oxalylchlorid. Nach Rühren für 2 Stunden bei Raumtemperatur wurde das Lösemittel unter verringertem Druck abgezogen, wobei 4 × 25 ml zusätzliches Chloroform verwendet wurden, um das letzte des überschüssigen Oxalylchlorids zu entfernen. Das Säurechlorid wurde in 100 ml Chloroform gelöst, gefolgt von der Zugabe von 12 g (0,104 mol) N-Hydroxysuccinimid und 16 ml (0,114 mol) Triethylamin. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Produkt mit 4 × 100 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Entfernung des Lösemittels ergab 24 g Produkt (82%), das ohne weitere Reinigung verwendet wurde. Analyse auf einem NMR-Spektrometer war konsistent mit dem gewünschten Produkt: ¹H-NMR (CDCl₃) Maleimidprotonen 6,60 (s, 2H), Methylen benachbart zu Stickstoff 3,45 (t, 2H), Succinimidylprotonen 2,80 (s, 4H), Methylen benachbart zu Carbonyl 2,55 (t, 2H) und restliche Methylene 1,15–2,00 (m, 6H). Die Endverbindung wurde zur Verwendung bei der Synthese von photoaktivierbaren Polymeren aufbewahrt, wie zum Beispiel in Beispiel 3(e) beschrieben.
(e) Darstellung eines Copolymers aus Acrylamid, BBA-APMA und MAL-EAC-NOS
Ein photoaktivierbares Copolymer der vorliegenden Erfindung wurde auf die folgende Weise hergestellt. Acrylamid, 3,849 g (54,1 mmol), wurde in 52,9 ml Tetrahydrofuran (THF) gelöst, gefolgt von 0,213 g (0,61 mmol) BBA-APMA, hergestellt gemäß der allgemeinen Methode, die in Beispiel 3(c) beschrieben ist, 0,938 g (3,04 mmol) MAL-EAC-NOS, hergestellt gemäß der allgemeinen Methode, die in Beispiel 3(d) beschrieben ist, 0,053 ml (0,35 mmol) N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin (TEMED) und 0,142 g (0,86 mmol) 2,2'-Azobisisobutyronitril (AIBN). Die Lösung wurde mit einer Heliumspülung für 4 Minuten, gefolgt von einer Argonspülung für weitere 4 Minuten, von Sauerstoff befreit. Das verschlossene Gefäß wurde dann über Nacht bei 55°C erhitzt, um die Polymerisation zu vollenden. Das feste Produkt wurde durch Filtration isoliert, und der Filterkuchen wurde gründlich mit THF und CHCl₃ gespült. Das Produkt wurde in einem Vakuumofen bei 30°C getrocknet, um 5,234 g eines weißen Feststoffes zu ergeben. NMR-Analyse (DMSO-d₆) bestätigte das Vorhandensein der NOS-Gruppe bei 2,75 ppm, und die Photogruppen-Beladung wurde zu 0,104 mmol BBA/g Polymer bestimmt. MAL-EAC-NOS stellte 5 Mol-% der polymerisierbaren Monomere in dieser Reaktion dar.
(f) Darstellung und Bewertung eines Photopolymers, das mit Oligonukleotiden derivatisiert ist
Eine 40-mer-Sonde (Sequenz 4) wurde mit einer Amin-Modifikation, wie beschrieben für Sequenz 1, synthetisiert. Das Oligo Amin-Sequenz 4, 40 μg (15 μl einer 2,67 mg/ml Vorratslösung in Wasser) wurde mit 80 μg (80 μl einer 1 mg/ml Lösung, frisch hergestellt in Wasser) eines Copolymers von Acrylamid, BBA-APMA, und MAL-EAC-NOS, hergestellt wie beschrieben in Beispiel 3(e), und 305 μl Inkubationspuffer inkubiert. Die Reaktionsmischung wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Die resultierende Photopoly-Sequenz 4 wurde ohne weitere Reinigung für die Immobilisierung verwendet.
Amin-Sequenz 4 und Photopoly-Sequenz 4 wurden bei 10 pmol Oligo/0,1 ml pro Vertiefung in PP- und Poly(vinylchlorid)-Mikrowellenplatten (PVC, Dynatech, Chantilly, VA) in 50 mM Phosphatpuffer, pH 8,5, 1 mM EDTA für 1,5 Stunden bei 37°C inkubuiert. Die Platten wurden beleuchtet oder adsorbiert, wie beschrieben in Beispiel 2. Hybridisierung wurde durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 2, unter Verwendung des komplementären Sequenz-3-Nachweisoligonukleotids oder des nicht-komplementären Sequenz-2-Oliogonukleotids. Die Ergebnisse aus Tabelle 2 zeigen, daß das beleuchtete Photopoly-Oligonukleotid 13- und 2-fach höhere Hybridisierungssignale aufwies als die adsorbierte Kontrolle auf PP- bzw. PVC-Oberflächen. Im Gegensatz dazu trug die Beleuchtung nicht zur Immobilisierung von Amin-Sequenz 4 bei.
Tabelle 2: Hybridisierungssignale (A₆₅₅ ± Standardabweichung) aus Amin-Sequenz 4 und Photopoly-Sequenz 4 auf PP- und PVC-Mikrowellplatten
Beispiel 4
Darstellung eines mit Benzophenon markierten Oligonukleotids durch Direktsynthese
(a) Darstellung von 4-Brommethylbenzophenon BMBP)
4-Methylbenzophenon, 750 g (3,82 mol), wird zu einem 5 Liter-Mortonkolben zugegeben, der mit einem Überkopfrührer ausgestattet ist, und in 2.850 ml Benzol gelöst. Die Lösung wird dann auf Rückfluß erhitzt, gefolgt der tropfenweisen Zugabe von 610 g (3,82 mol) Brom in 330 ml Benzol. Die Zugabegeschwindigkeit beträgt ungefähr 1,5 ml/min, und der Kolben wird mit einem 90 Watt (90 Joule/s) Halogenstrahler beleuchtet, um die Reaktion einzuleiten. Ein Timer wird mit der Lampe verwendet, um einen 10%-Betriebszyklus (5 Sekunden an, 40 Sekunden aus) bereitzustellen, gefolgt von einer Stunde mit einem 20%-Betriebszyklus (10 Sekunden an, 40 Sekunden aus). Nach Abkühlung wird die Reaktionsmischung mit 10 g Natriumbisulfit in 100 ml Wasser gewaschen, gefolgt von Waschen mit 3 × 200 ml Wasser. Das Produkt wird über Natriumsulfat getrocknet und zweimal aus Toluol/Hexan (1/3 nach Volumen) umkristallisiert. Die Endverbindung wird zur Verwendung bei der Herstellung eines für die Derivatisierung von Nukleinsäuren geeigneten Reagenz aufbewahrt, wie beschrieben in Beispiel 4(b).
(b) Darstellung von 4-Benzoylbenzylether-C₁₂-phosphoramidit
1,12-Dodecandiol, 5 g (24,7 mmol), wird in 50 ml wasserfreiem THF in einem trockenen Kolben unter Stickstoff gelöst. Das Natriumhydrid, 0,494 g einer 60% Dispersion in Mineralöl (12,4 mmol), wird in Portionen über einen fünfminütigen Zeitraum zugegeben. Die resultierende Mischung wird bei Raumtemperatur für eine Stunde gerührt. BMBP, 3,40 g (12,4 mmol), hergestellt mit der allgemeinen Methode, die in Beispiel 4(a) beschrieben ist, wird als ein Feststoff zusammen mit Natriumiodid (0,185 g, 1,23 mmol) und Tetra-n-butylammoniumbromid (0,398 g, 1,23 mmol) zugegeben. Die Mischung wird bei einem milden Rückfluß für 24 Stunden gerührt. Die Reaktion wird dann abgekühlt, mit Wasser gequencht, mit 5% HCl angesäuert und mit Chloroform extrahiert. Die organischen Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet, und das Lösemittel wird unter Vakuum abgezogen. Das Produkt wird auf einer Silicagel-Flashchromatographiesäule unter Verwendung von Chloroform, um nicht-polare Verunreinigungen zu eluieren, gefolgt von Elution des Produktes mit Chloroform:Ethylacetat (80/20 nach Volumen), gereinigt. Das Poolen geeigneter Fraktionen liefert die gewünschte Verbindung nach Abziehen des Lösemittels unter verringertem Druck.
Das Etherprodukt von oben, 0,100 g (0,252 mmol), wird in Chloroform unter einer Argonatmosphäre gelöst. N,N-Diisopropylethylamin, 0,130 g (1 mmol), wird zugegeben, und die Temperatur wird unter Verwendung eines Eisbades auf 0°C eingestellt. 2-Cyanoethyldiisopropylchlorphosphoramidit, 0,179 g (0,756 mmol), wird dann in drei gleichen Portionen über etwa 10 Minuten zugegeben. Rühren wird für insgesamt 3 Stunden fortgesetzt, woraufhin die Reaktion mit 5% NaHCO₃ gequencht und mit 5 ml Chloroform verdünnt wird. Die organische Schicht wird abgetrennt, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft, um ein Rückstandsöl zu liefern. Das Rohprodukt wird auf einer Silicagel-Flashchromatographiesäule unter Verwendung eines Lösemittels aus 5% Methanol in Chloroform, gefolgt von einem Lösemittelsystem aus Ammoniumhydroxid/Methanol/Chloroform (0,5/2,5/7 nach Volumen), gereinigt. Die geeigneten Fraktionen werden gepoolt und das Lösemittel wird entfernt, um das gewünschte Produkt zu liefern, das für Derivatisierung einer Nukleinsäure geeignet ist.
(c) Darstellung eines mit Benzophenon markierten Oligonukleotids
Ein 30-meres Oligonukleotid wird auf Silicaperlen unter Verwendung von standardmäßigen Oligonukleotid-Verfahren synthetisiert, und die Perlen werden in ein verschlossenes Gefäß unter einer Argonatmosphäre eingebracht. Lösungen von 12,5 mg (22 μmol) des Phosphoramidits, hergestellt in Beispiel 4(b), in 0,5 ml Chloroform und 5 mg (71 μmol) Tetrazol in 0,5 ml Acetonitril werden dann zugegeben. Die Mischung wird dann für 1 Stunde vorsichtig bewegt, gefolgt von der Entfernung des Überstandes. Die Perlen werden mit Chloroform, Acetonitril und Methylenchlorid gewaschen, gefolgt von einer Oxidation für 5 Minuten mit 1,5 ml einer 0,1 M Iod-Lösung in THF/Pyridin/Wasser (40/20/1 nach Volumen). Nach Entfernung dieser Lösung werden die Perlen mit Methylenchlorid gewaschen und mit einem Argonstrom getrocknet. Konzentriertes Ammoniumhydroxid wird dann zu den Perlen zugegeben, und sie werden für 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Die Ammoniumhydroxid-Lösung wird dann entfernt, und die Perlen werden mit einem weiteren 1 ml Ammoniumhydroxid gespült. Die vereinigten Lösungsextrakte werden dann bei 55°C über Nacht aufbewahrt, gefolgt von Lyophilisation, um das photomarkierte Oligonukleotid zu isolieren.

Claims

Zusammensetzung, umfassend ein photoaktivierbares Nukleinsäure-Derivat, umfassend eine Nukleinsäure mit einer oder mehreren daran gebundenen photoreaktiven Gruppen, wobei die photoreaktiven Gruppen jeweils eine aktive Spezies, ausgewählt aus Nitrenen, Carbenen und angeregten Zuständen von Ketonen nach Absorption von elektromagnetischer Energie, bilden.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Photogruppe(n) photoaktivierbare Arylketone umfasst/umfassen.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Arylketone ausgewählt sind aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Derivaten davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die photoreaktive(n) Gruppe(n) direkt und kovalent an die Nukleinsäure gebunden ist/sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei mindestens eine photoreaktive Gruppe entweder an das 3'- oder 5'-Ende der Nukleinsäure gebunden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die endständige photoreaktive Gruppe ein photoaktivierbares Arylketon umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Arylketon ausgewählt ist aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Derivaten davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die photoreaktive(n) Gruppe(n) indirekt und kovalent an die Nukleinsäure gebunden ist/sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei die Nukleinsäure und die photoreaktive(n) Gruppe(n) an eine bekannte Struktur, ausgewählt aus synthetischen und natürlichen Polymeren, gebunden sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei mindestens eine photoreaktive Gruppe indirekt entweder an das 3'- oder 5'-Ende der Nukleinsäure gebunden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die endständige photoreaktive Gruppe ein photoaktivierbares Arylketon umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das Arylketon ausgewählt ist aus Acetophenon, Benzophenon, Anthrachinon, Anthron und Derivaten davon.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Nukleinsäure ein synthetisches Oligonukleotid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei das Oligonukleotid mit einem Phosphoramiditsyntheseverfahren synthetisiert wurde.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung umfassend ein photoaktivierbares Nukleinsäure-Derivat, wobei das Verfahren die Schritte des Derivatisierens einer Nukleinsäure mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppen umfasst, wobei die photoreaktiven Gruppen jeweils eine aktive Spezies, ausgewählt aus Nitrenen, Carbenen und angeregten Zuständen von Ketonen nach Absorption von elektromagnetischer Energie, bilden.
Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Nukleinsäure entweder durch enzymatische Modifizierung oder chemische Modifizierung derivatisiert wird.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Nukleinsäure durch eine chemische Modifizierung derivatisiert wird, die die Schritte des Einbauens einer thermochemisch reaktiven Gruppe in ein synthetisches Oligonukleotid und des Umsetzens des sich daraus ergebenden Oligonukleotids mit einer photoreaktiven Verbindung, die eine entsprechende reaktive Gruppe und eine photoreaktive Gruppe enthält, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die Reaktion zwischen der thermochemisch reaktiven Gruppe und der entsprechenden reaktiven Gruppe ausgewählt ist aus Reaktionen zwischen einer Amingruppe und einem N-Oxysuccinimidester, einem Carbonsäurechlorid und einem Amin, und einer Maleimidgruppe und einer Sulfhydrylgruppe.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Schritt der chemischen Modifizierung den Einbau einer oder mehrerer photoreaktiver Gruppen in die Nukleinsäure mit einem heterobifunktionellen Reagenz, das eine thermochemisch reaktive Gruppe und eine photoreaktive Gruppe enthält, umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines photoaktivierbaren Nukleinsäure-Derivats, wobei das Verfahren die Schritte des kovalenten Bindens einer oder mehrerer photoreaktiver Gruppen an ein synthetisches Oligonukleotid während der Oligonukleotidsynthese umfasst, wobei die photoreaktiven Gruppen jeweils eine aktive Spezies, ausgewählt aus Nitrenen, Carbenen und angeregten Zuständen von Ketonen nach Absorption von elektromagnetischer Energie, bilden.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das Verfahren die Schritte a) Bereitstellen eines oder mehrerer Nukleotidbausteine, derivatisiert mit einer oder mehreren photoreaktiven Gruppen, und b) Verwenden des derivatisierten Nukleotids bei der Synthese eines Oligonukleotids auf eine Weise, die zulässt, dass die photoreaktive Gruppe an einer oder mehreren vorgesehenen Stellen an das Oligonukleotid gebunden wird, umfasst.
Verfahren zur Behandlung einer Oberfläche, umfassend den Schritt des Bereitstellens einer Zusammensetzung nach Anspruch 1 und des Aktivierens der photoreaktiven Gruppen unter Bedingungen, die zum Binden der Nukleinsäure an die Oberfläche geeignet sind.