DE60130309T2

DE60130309T2 - Verfahren, zur Inhibition einer Vorrichtung, welche zur Detektion von biochemisch aktiven Molekülen genutzt wird

Info

Publication number: DE60130309T2
Application number: DE60130309T
Authority: DE
Inventors: Yoshihide Asaka-shi Saitama Iwaki; Hiroshi Asaka-shi Saitama Shinoki; Osamu Asaka-shi Saitama Seshimoto
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2000-12-13
Filing date: 2001-12-13
Publication date: 2008-02-28
Anticipated expiration: 2021-12-14
Also published as: EP1215287A2; JP2002176977A; US6858392B2; EP1215287B1; EP1215287A3; US20020110903A1; JP3523188B2; DE60130309D1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Blockieren einer Vorrichtung zur Detektion von biochemisch aktiven Molekülen, wie zum Beispiel einer DNA-Detektionsvorrichtung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Genstrukturen von zahlreichen lebenden Körpern bzw. Lebewesen sowie die Funktionen von Genen im Genommaßstab sind in weitem Umfang studiert worden. Demgemäß sind schnell neue Technologien zum Analysieren der Genfunktionen entwickelt worden.
Ein DNA-Microarray (d.h. ein DNA-Chip), das aus einem festen Träger (d.h. Substrat) und einer großen Zahl von Spots bzw. Punkten von Sondenmolekülen, wie DNA-Fragmente oder Oligonucleotidmoleküle, die auf dem festen Träger in separaten Flächen aufgereiht und fixiert sind, wird im Allgemeinen nicht nur zur Basensequenzierung einer Nucleinsäure, sondern auch zum Analysieren der Expression, der Mutation und des Polymorphismus von Genen eingesetzt. Die analytischen Daten der genetischen Information sind vorzugsweise auch zur Studie von pharmakologisch aktiven Substanzen und ferner zur Diagnose und Verhinderung von Krankheiten einsetzbar.
In der Verfahrensweise zur Detektion einer Nucleinsäure, wie eines DNA-Fragments, unter Verwendung des DNA-Microarrays wird eine Nucleinsäureprobe (d.h. die Zielnucleinsäure), die mit einer radioisotopen(RI)-Markierung oder einer Fluoreszenzmarkierung ausgestattet ist, mit den Sondenmolekülen in den Spots des Microarrays in Kontakt gebracht. Falls die Zielnucleinsäure in einer bestimmten Basensequenz komplementär zu den Sondenmolekülen ist, wird die Zielnucleinsäure mit den Sondenmolekülen durch Hybridisierung kombiniert. Eine so hybridisierte Zielnucleinsäure wird durch Abtastung bzw. Feststellung ihrer radioisotopen Markierung oder Fluoreszenzmarkierung detektiert. Die Ergebnisse der Detektion werden dann bildweise analysiert. Die analytische Verfahrensweise unter Verwendung des DNA-Microarrays kann eine große Zahl von Daten auf der Zielnucleinsäure gleichzeitig ergeben, wobei eine extrem kleine Menge der Zielnucleinsäure eingesetzt wird.
Ein DNA-Microarray wird im Allgemeinen durch Synthetisieren von Sondenmolekülen (wie Oligonucleotide) auf einen festen Träger (was als „on-chip-Verfahren" bezeichnet wird) oder durch Fixieren einer Zahl von zuvor hergestellten DNA-Fragmenten oder Oligonucleotiden auf einem festen Träger hergestellt.
Das erstere on-chip-Verfahren wird durch Synthetisieren einer Zahl von Oligonucleotiden durch kombinatorische Synthese („combinatrial synthesis") in jedem der extrem kleinen Gebiete, die auf dem festen Träger vorbestimmt sind, durchgeführt. In der Syntheseverfahrensweise werden die Photolithographie und Fest(phasen)synthesetechnologie („solid synthesis technology") verwendet und eine Schutzgruppe wird selektiv durch Bestrahlung mit Licht entfernt.
Im letzteren Verfahren werden die zuvor hergestellten Sondenmoleküle, wie DNA-Fragmente oder Oligonucleotide, auf einen festen Träger in jedem der vorbestimmten kleinen Gebiete aufgetüpfelt bzw. „gespottet” und auf dem Träger durch kovalente Bindung oder ionische Bindung (d.h. elektrostatische Bindung) fixiert. Die Bindung wird im Allgemeinen auf die unten beschriebene Weise hergestellt.

(1) Im Fall, dass das Sondenmolekül ein DNA-Fragment, wie ein cDNA-Fragment (d.h. ein komplementäres DNA-Fragment, das unter Verwendung von mRNA als Matrize synthetisiert wird) oder ein PCR-Produkt (d.h. ein DNA-Fragement, das aus cDNA durch eine Vervielfältigungsverfahrensweise erzeugt wird), ist, wird eine wässrige Lösung der DNA-Fragmente auf einen festen Träger mit einer Beschichtung aus einer polykationischen Verbindung (wie Polylysin oder Polyethylenimin) mittels einer Spotting-Vorrichtung eines Microarray-Herstellungsgeräts gespottet, so dass die DNA-Fragmente elektrostatisch auf dem Träger fixiert werden können, wobei die elektrische Ladung jedes DNA-Fragments genutzt wird.
(2) Im Fall, dass das Sondenmolekül ein synthetisiertes Oligonucleotid ist, wird zuvor eine reaktive Gruppe in das Oligonucleotid eingebaut. Das Oligonucleotid mit der reaktiven Gruppe wird dann mit einem festen Träger, der eine reaktive Gruppe auf seiner Oberfläche aufweist, in einem wässrigen Medium unter Verwendung eines Spotting-Mittels in Kontakt gebracht, so dass die gewünschte kovalente Bindung zwischen der reaktiven Gruppe des Oligonucleotids und der reaktiven Gruppe auf dem festen Träger erzeugt wird. Beispiele der in das Oligonucleotid einzubauenden reaktiven Gruppen umfassen Amino, Aldehyd, Mercapto(-SH) und Biotin. Auf der Oberfläche des festen Trägers wird ein Silan-Kupplungsmittel mit Amino, Aldehyd, Epoxy oder dergleichen aufgebracht, um die reaktive Gruppe auf der Oberfläche einzubauen. Die Fixierung des Oligonucleotids durch kovalente Bindung ist vorteilhaft, da dies eine Bindung ergeben kann, die im Vergleich zur elektrostatischen Bindung in hohem Maße stabil ist.
(3) Im Fall, dass das Sondenmolekül PNA ist (d.h. eine Peptidnucleinsäure), wird eine reaktive Gruppe zuvor in die Sonden-PNA auf die gleiche Weise wie im Fall (2) wie oben unter Verwendung des Oligonucleotids eingebaut. Es ist bevorzugt, dass die Detektionsvorrichtungen (z.B. ein DNA-Microarray), hergestellt in den obenstehend beschriebenen Herstellungsverfahren, Sondenmoleküle nur auf dem festen Träger aufweisen, da, falls elektrostatische Gruppen oder reaktive Gruppen auf dem festen Träger ohne Abschlussgruppen („cap groups") bleiben, Zielmoleküle mit einer empfindlichen Markierung, wie einer Fluoreszenzmarkierung, nicht nur mit den Sondenmolekülen, sondern auch mit den elektrostatischen Gruppen oder reaktiven Gruppen kombinieren können. Die Zielmoleküle, die mit den elektrostatischen Gruppen und/oder reaktiven Gruppen kombiniert haben, produzieren ein Rauschen in den analytischen Verfahrensweisen.

Es ist bereits bekannt, ein Blockierungsmittel zum Vermeiden der Erzeugung einer ungünstigen Kombination zwischen den Zielmolekülen und den elektrostatischen Gruppen und/oder reaktiven Gruppen einzusetzen. Das Blockierungsmittel kann eingesetzt werden, indem das Blockierungsmittel in Kontakt gebracht wird mit einer Detektionsvorrichtung, die auf ihrer Oberfläche reaktive Gruppen und/oder elektrostatische Gruppen aufweist. Ein repräsentatives Blockierungsmittel, das im Handel erhältlich ist, ist Denhardt-Lösung. Zum Blockieren einer Detektionsvorrichtung, auf der reaktive Gruppen auf der(en) Oberfläche verbleiben, ist eine wässrige Monoethanolaminlösung bekannt.
Die WO 97/14815 beschreibt die Blockierung einer Detektionsvorrichtung unter Verwendung von Bernsteinsäureanhydrid oder seiner analogen Verbindung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Detektionsvorrichtung (z.B. ein Microarray zur Analyse von DNA oder DNA-Fragmenten) bereitzustel len, die eine hohe Detektionsgenauigkeit und einen geringen Detektionsfehler ergibt.
Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein verfahren zum Blockieren einer Vorrichtung zur Detektion von biochemisch aktiven Molekülen, wie DNA-Fragmenten und Proteinen, bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung liegt in einem Verfahren zum Blockieren einer Vorrichtung zur Detektion von biochemisch aktiven Molekülen, welches die Stufen umfasst:
Inkontaktbringen, in Gegenwart eines wässrigen Mediums, das ein oberflächenaktives Mittel enthält, einer Detektionsvorrichtung, die auf ihrer Oberfläche

(a) Sondenmoleküle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden, Polynukleotiden und Peptidnukleinsäuren,
(b) ionische reaktive Aminogruppen und
(c) nichtionische reaktive Gruppen aufweist, gleichzeitig oder einzeln mit Verbindungen, die mit den nichtionischen Reaktionsgruppen reagieren, um kovalente Bindungen zu erzeugen, und Dextransulfaten, die in Verbindung mit den ionischen reaktiven Aminogruppen elektrostatische Bindungen bilden; und Waschen der Oberfläche der Detektionsvorrichtung mit einem wässrigen Lösungsmittel oder mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel.

Die Erfindung liegt auch in einer Vorrichtung zur Detektion von biochemisch aktiven Molekülen, die mittels des obenstehend beschriebenen Verfahrens blockiert ist.
Im obenstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren ist Folgendes bevorzugt:

(1) Die nichtionischen reaktiven Gruppen sind ethylenisch ungesättigte Gruppen.
(2) Die ethylenisch ungesättigten Gruppen sind Vinylsulfonylgruppen oder deren Vorläufer mit der folgenden Formel: -L-SO₂-CR¹=CR²R³ worin jedes von R¹, R² und R³ unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, deren Alkylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, ist und L eine Verknüpfungsgruppe ist.
(3) Die wässrige Lösung enthält ferner eine Aminogruppe-enthaltende Verbindung, die eine positive Ladung zeigt.
(4) Die Aminogruppe-enthaltenden Verbindungen sind Glycine.
(5) Die Sondenmoleküle, ionischen reaktiven Gruppen und nichtionischen reaktiven Gruppen sind auf der Detektionsvorrichtung durch kovalente Bindung fixiert.

Die Erfindung liegt ferner in der Verwendung einer wässrigen Lösung, enthaltend ein oberflächenaktives Mittel, Dextransulfat und eine Aminogruppe-enthaltende Verbindung, die eine positive Ladung zeigt, im Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung.
In der obenstehend genannten wässrigen Lösung ist es bevorzugt, dass die Aminogruppe-enthaltende Verbindung Glycin ist.
Die Erfindung liegt ferner in einem Verfahren zum Blockieren einer Vorrichtung zur Detektion biochemisch aktiver Moleküle, welches die Stufen umfasst:
Inkontaktbringen, in Gegenwart eines wässrigen Mediums, das ein oberflächenaktives Mittel enthält, einer Detektionsvorrichtung, die auf ihrer Oberfläche (a) Sondenmoleküle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Oligonucleotiden, Polynucleotiden und Peptidnucleinsäuren, und (b) ionische reaktive Aminogruppen aufweist, gleichzeitig oder einzeln mit Dextransulfaten, die in Verbindung mit den ionischen reaktiven Aminogruppen elektrostatische Bindungen bilden; und
Waschen der Oberfläche der Detektionsvorrichtung mit einem wässrigen Lösungsmittel oder mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel.
Im obenstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren ist Folgendes bevorzugt:

(1) Das wässrige Medium enthält ein oberflächenaktives Mittel, insbesondere ein anionisches oberflächenaktives Mittel.
(2) Die ionischen reaktiven Gruppen sind Aminogruppen oder Mercaptogruppen.
(3) Die ionischen reaktiven Gruppen sind Aminogruppen und die Verbindungen, die elektrostatische Bindungen in Verbindung mit den ionischen reaktiven Gruppen bilden, sind Dextransulfate.
(4) Die Sondenmoleküle sind Nucleotidderivate, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Oligonucleotiden, Polynucleotiden und Peptidnucleinsäuren.
(5) Die Sondenmoleküle sind auf der Detektionsvorrichtung durch elektrostatische Bindung fixiert und ionische reaktive Gruppen sind auf der Detektionsvorrichtung durch kovalente Bindung fixiert.

Die Erfindung liegt ferner in einer Vorrichtung zur Detektion von biochemisch aktiven Molekülen, die mittels des obenstehend genannten Verfahrens blockiert ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 erläutert schematisch ein erfindungsgemäßes Blockierungsverfahren, das auf eine Detektionsvorrichtung anwendbar ist, auf der Sondenmoleküle kovalent fixiert sind.
2 erläutert schematisch ein erfindungsgemäßes Blockierungsverfahren, das auf eine Detektionsvorrichtung anwendbar ist, auf der Sondenmoleküle durch elektrostatische Bindung fixiert sind.
3 zeigt einen DNA-Chip, der blockiert ist und der Hybridisierung in Beispiel 1 unterworfen wurde.
4 zeigt einen DNA-Chip, der blockiert ist und der Hybridisierung in Beispiel 2 unterworfen wurde.
5 zeigt einen DNA-Chip, der blockiert ist und der Hybridisierung in Beispiel 3 unterworfen wurde.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINGUNG
Ein typisches erfindungsgemäßes Blockierungsverfahren, das auf eine Detektionsvorrichtung anwendbar ist, auf der Sondenmoleküle kovalent fixiert sind, ist in 1 erläutert.
Der feste Träger (I), der ionische reaktive Gruppen X⁺ (z.B. Aminogruppen, -NH₂ _, oder Mercaptogruppen, -SH) auf seiner Oberfläche aufweist, wird mit einer reaktiven Verbindung, die zwei reaktive Gruppen E, G aufweist (z.B. eine divinylsulfonische Verbindung), in Kontakt gebracht, in der E mit der ionischen reaktiven Gruppe X⁺ unter Erzeugung einer kovalenten Bindung reagiert. G kann zu E gleich oder davon verschieden sein.
Der feste Träger (II) weist nun die reaktiven Verbindungen an einigen der ionischen reaktiven Gruppen X auf. Jedoch bleiben einige reaktive Gruppen X⁺ auf dem festen Träger nicht umgesetzt. Der feste Träger (II) wird dann mit Sondenmolekülen in Kontakt gebracht, die eine reaktive Gruppe Q aufweisen, so dass der feste Träger (III) die Sondenmoleküle auf dem Träger kovalent fixiert aufweist. Jedoch bleiben einige reaktive Gruppen G auf dem festen Träger nicht umgesetzt.
Der feste Träger (III) wird dann dem erfindungsgemäßen Blockierungsverfahren unterworfen, das eine Kombination von Blockierungsmitteln (d.h. Blocker) in Gegenwart eines wässrigen Mediums einsetzt. Die Blocker umfassen einen Blocker mit einer ionischen Gruppe Z^–, die eine elektrostatische Bindung mit der ionischen reaktiven Gruppe X⁺ bildet, und einen Blocker mit einer reaktiven Gruppe T, die mit der reaktiven Gruppe G, die auf dem festen Träger verbleibt, reagiert. In das wässrige Medium, das vorzugsweise ein oder zwei Blocker enthält, ist vorzugsweise ein oberflächenaktives Mittel, wie ein anionisches oberflächenaktives Mittel, eingearbeitet.
Schließlich wird der feste Träger (IV), der durch die Kombination von Blockern blockiert worden ist, mit einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser, vorzugsweise kochendes Wasser) oder einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (z.B. ein niederer Alkohol) gewaschen und dann getrocknet.
Das Blockierungsmittel, das die ionische Gruppe Z^– aufweist, ist vorzugsweise Dextransulfat, ein Mucopolysaccharid mit einer Sulfonylgruppe, Taurin mit einer Sulfonylgruppe, ein Polypeptid mit einer Carboxylgruppe oder ein Polysaccharid mit einer Carboxylgruppe. Eine wässrige Lösung, die das Blockierungsmittel enthält, enthält weiterhin vorzugsweise eine puffernde Verbindung, wie Glycin.
Das Blockierungsmittel, das die reaktive Gruppe T aufweist, ist vorzugsweise eine Verbindung mit einer Aminogruppe, einer Mercaptogruppe oder einer Hydroxylgruppe. Verbindungen, die ein aktives Wasserstoffatom aufweisen, wie Glycin, sind bevorzugt.
Ein typisches erfindungsgemäßes Blockierungsverfahren, das auf eine Detektionsvorrichtung anwendbar ist, auf der Sondenmoleküle durch elektrostatische Bindung fixiert sind, ist in 2 gezeigt.
Der feste Träger (I), der ionische reaktive Gruppen X⁺ (z.B. Aminogruppen, -NH₂, oder Mercaptogruppen, -SH) auf seiner Oberfläche aufweist, wird mit Sondenmolekülen, die eine ionische Gruppe J aufweisen, in Kontakt gebracht, so dass der feste Träger (IIIa) die Sondenmoleküle elektrostatisch fixiert auf dem Träger aufweist. Jedoch bleiben einige ionische reaktive Gruppen X⁺ auf dem festen Träger nicht umgesetzt.
Der feste Träger (IIIa) wird dann dem erfindungsgemäßen Blockierungsverfahren unterworfen, das ein Blockierungsmittel (d.h. einen Blocker) in Gegenwart eines wässrigen Mediums einsetzt. Der Blocker weist eine ionische Gruppe Z^– auf, die eine elektrostatische Bindung mit der ionischen reaktiven Gruppe X⁺, die auf dem festen Träger verbleibt, bildet. In das wässrige Medium, das vorzugsweise den Blocker enthält, ist vorzugsweise ein anionisches, oberflächenaktives Mittel eingearbeitet.
Schließlich wird der feste Träger (IVa), der durch den Blocker blockiert worden ist, mit einem wässrigen Lösungsmittel (z.B. Wasser, vorzugsweise kochendes Wasser) oder einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel (z.B. ein niederer Alkohol) gewaschen und dann getrocknet.
Der feste Träger kann ein beliebiger der bekannten festen Träger oder ihrer äquivalenten Materialien sein, zum Beispiel eine Glasplatte, eine Keramikplatte, eine Harzplatte, eine Metallplatte, eine Glasplatte, bedeckt mit einer Polymerbeschichtung, eine Glasplatte, bedeckt mit einer Metallbeschichtung, und eine Harzplatte, bedeckt mit einer Metallbeschichtung. Der feste Träger kann eine poröse Struktur aufweisen.
Um die Sondenmoleküle auf dem festen Träger durch kovalente Bindung zu fixieren, sollte der Träger eine Vielzahl von ionischen reaktiven Gruppen auf der Oberfläche aufweisen. Die ionischen reaktiven Gruppen werden auf dem festen Träger zum Beispiel durch Beschichtung von dessen Oberfläche mit einer polykationischen Verbindung (z.B. Poly-L-Lysin, Polyethylenimin oder Polyalkylimin) bereitgestellt. Die Poly-L-Lysin-Beschichtung ist bevorzugt. Andernfalls kann die Oberfläche des festen Trägers mit einem Silan-Kupplungsmittel, enthaltend eine ionische reaktive Gruppe (z.B. Amino oder Mercapto), behandelt werden, so dass die ionische reaktive Gruppe auf der Oberfläche des festen Trägers bereitgestellt wird. Die ionische reaktive Gruppe ist vorzugsweise eine Aminogruppe. Wenn das Silan-Kupplungsmittel eingesetzt wird, wird das Silan-Kupplungsmittel auf der Oberfläche des festen Trägers über kovalente Bindung fixiert. Wenn das Aminogruppen-enthaltende Polymer eingesetzt wird, wird das Polymer auf der Oberfläche des festen Trägers durch elektrostatische Bindung fixiert. Die kovalente Bindung ist unter dem Gesichtspunkt der stabilen und zuverlässigen Fixierung bevorzugt.
Beispiele für die Silan-Kupplungsmittel umfassen γ-Aminopropyltriethoxysilan, N-β-(Aminoethyl)-γ-aminopropyltrimethoxysilan und N-β-(Aminoethyl)-γ-aminopropylmethyldimethoxysilan. Am stärksten bevorzugt ist γ-Aminopropyltriethoxysilan.
Eine Kombination der Bearbeitung eines festen Trägers mit einem Silan-Kupplungsmittel in Kombination mit einer Beschichtung mit einer polykationischen Verbindung („a poly-cation") ist ebenfalls einsetzbar.
Beispiele für im Handel erhältliche feste Träger mit vorbehandelter Oberfläche umfassen PLL (Polylysin-beschichtete Platte, erhältlich von Sigma Corp.), CMT-GAPS (Aminosilan-beschichtete Platte, erhältlich von Corning Corp.), MAS (Aminosilan-beschichtete Platte, erhältlich von Matsunami Glass Co., Ltd.), Silanate (Polysilan-beschichtete Platte, erhältlich von Gliner Corp.), Sinelite (Polysilan-beschichtete Platte, erhältlich von Telechem Corp.), Objektträger mit der Bezeichnung DNA-Ready Typ I oder II (Aminosilan-beschichtete Platte, erhältlich von Clonetech Corp.), Sililate (Silan-Aldehyd-beschichtete Platte, erhältlich von Gliner Corp.), Sililate (Silan-Aldehyd-beschichtete Platte, erhältlich von Telechem Corp.) und 3D-Link (aktive Carbonsäure-behandelte Platte, Thermotex Corp.).
Die Sondenmoleküle, wie DNA-Fragmente oder synthetische Oligonucleotide, werden dann auf der Oberfläche des festen Trägers fixiert. Die Verfahrensweise zum Fixieren der Sondenmoleküle auf dem festen Träger wird durchgeführt, indem eine wässrige Lösung der Sondenmoleküle mit der Oberfläche des festen Trägers in Kontakt gebracht wird. Zum Fixieren der Sondenmoleküle auf dem festen Träger durch kovalente Bindung weisen die Sondenmoleküle vorzugsweise eine reaktive Gruppe auf, die mit der reaktiven Gruppen des festen Trägers kombiniert wird, wobei eine Verknüpfungskette verwendet wird, die zum Beispiel unter Verwendung einer Verbindung mit ethylenisch ungesättigten Gruppen hergestellt werden kann.
Vorzugsweise sind die ethylenisch ungesättigten Gruppen Vinylsulfonylgruppen oder deren Vorläufer mit der folgenden Formel: -L-SO₂-CR¹=CR²R³ worin jedes von R¹, R² und R³ unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, deren Alkylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, ist und L eine Verknüpfungsgruppe ist.
Die Verbindungen mit den Vinylsulfonylgruppen weisen vorzugsweise die folgende Formel auf: X¹-SO₂-L-SO₂-X² in der jedes von X¹ und X² eine Vinylgruppe ist und L eine Verknüpfungsgruppe ist.
Repräsentative Vinylsulfonyl-enthaltende Verbindungen sind 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamid)ethan oder 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamid)propan.
Ansonsten kann die Verknüpfungskette aus einer Alkylengruppe, wie einer Hexylengruppe, oder einer N-Alkylaminoalkylengruppe, wie einer N-Methylaminohexylengruppe, hergestellt werden.
Das Sondenmolekül kann eine Peptidnucleinsäure (d.h. PNA) sein, die durch Austauschen der Phosphodiesterbindung der DNA durch eine Peptidbindung hergestellt werden kann.
In erfindungsgemäßen Verfahren können die Sondenmoleküle auf dem festen Träger durch elektrostatische Bindung fixiert werden. Die Fixierung der Sondenmoleküle auf einem festen Träger ist per se bereits bekannt. Zum Beispiel wird die Glasfläche („glas sheet") mittels eines Aminosilan-Kupplungsmittels behandelt oder mit einer polykationischen Verbindung (z.B. Polylysin oder Polyethylenimin) beschichtet, so dass eine kationische Gruppe auf der Glasfläche fixiert wird. Die so behandelte Glasfläche wird mit einem DNA-Fragment, das eine anionische Gruppe, wie eine Phosphorsäuregruppe (oder Phosphatgruppe), aufweist, oder einem synthetisierten Oligonucleotid oder DNA, in das/die eine geeignete anionische Gruppe eingebaut ist, in Kontakt gebracht, so dass eine elektrostatische Bindung zwischen dem festen Träger und den Sondenmolekülen gebildet werden kann.
Zur Fixierung der Sondenmoleküle auf dem festen Träger werden die Sondenmoleküle und gegebenenfalls ein wasserlösliches Verdickungsmittel in einem wässrigen Medium, wie destilliertem Wasser oder SSC (d.h. Standard-Salz-Citrat-Puffer oder Sole und Citratpuffer) gelöst oder dispergiert, um eine wässrige Sondenmoleküllösung zum Spotten herzustellen. Die wässrige Sondenmoleküllösung weist im Allgemeinen eine Viskosität im Bereich von 1 bis 100 mPa·s auf. Wenn das Spotten mittels eines Spotters vom Hohlnadeltyp („quill-pin type") erfolgt, weist die wässrige Lösung vorzugsweise eine Viskosität von 2 bis 50 mPa·s, stärker bevorzugt eine Viskosität von 2 bis 20 mPa·s, auf. Falls das Verdickungsmittel ein wasserlösliches Polymer ist, wird das Polymer vorzugsweise in einer wässrigen Lösung in einer Menge von 0,1 bis 5 Gew.-%, stärker bevorzugt in einer Menge von 0,3 bis 3 Gew.-%, gelöst. Falls das Verdickungsmittel ein mehrwertiger Alkohol oder ein Saccharid ist, wird es vorzugsweise in einem wässrigen Medium in einer Menge von 5 bis 50 Gew.-%, stärker bevorzugt in einer Menge von 10 bis 40 Gew.-%, gelöst.
Im Allgemeinen wird die wässrige Lösung einmal in eine Kunststoffplatte mit 96 oder 384 Vertiefungen eingegeben und dann unter Verwendung eines Spotting-Mittels auf einen festen Träger gespottet. Das Spotting-Mittel vom Nadeltyp, in dem die wässrige Lösung gehalten werden kann, wird allgemein eingesetzt. Die Nadel, die die Lösung (ent)hält wird dann mit der Oberfläche des festen Trägers in Kontakt gebracht, um die Lösung auf den festen Träger zu transferieren. Die Nadel kann eine solide Nadel sein, die keine Vertiefung an ihrer Spitze aufweist oder sie kann eine Hohlnadel („quill pin") sein, die eine Vertiefung an ihrer Spitze aufweist. Die Hohlnadel wird bevorzugt eingesetzt. Andere bekannte Spotting-Systeme, wie ein Tintenstrahlsystem oder ein Kapillarsystem, sind auch verwendbar.
Die wässrige Lösung wird unter der Bedingung auf den festen Träger gespottet, dass jeder Tropfen der Lösung im Allgemeinen ein Volumen von 100 pl bis 1 μl, vorzugsweise 1 bis 100 nl, hat. Die Sondenmoleküle werden vorzugsweise in einer Menge von 10² bis 10⁵/cm² auf den festen Träger gespottet. Als mol an Sondenmolekül ausgedrückt, werden 1 bis 10^–15 mol in jedem Spot platziert. Als Gewicht ausgedrückt, werden mehrere ng oder weniger an Sondenmolekülen in jedem Spot platziert. Das Spotten der wässrigen Lösung erfolgt auf dem festen Träger unter Bildung einer großen Zahl von Punkten, d.h. Spots, die beinahe die gleiche Form und Größe aufweisen. Es ist wichtig diese Punkte so zu formen, dass sie beinahe die gleich Form und Größe aufweisen, falls die Hybridisierung quantitativ analysiert werden soll. Mehrere Punkte werden getrennt voneinander mit einem Abstand von 1,5 mm oder weniger, vorzugsweise 100 bis 300 μm, erstellt. Ein Punkt hat vorzugsweise einen Durchmesser von 50 bis 300 μm.
Das bekannte DNA-Microarray weist auf seiner Oberfläche eine große Zahl von Punkten oder Spots, gebildet aus Sondenmolekülen, auf. Die Sondenmoleküle, die in einem Spot vorliegen, sind im Allgemeinen zueinander gleich. Jedoch können die in verschiedenen Spots vorliegenden Sondenmoleküle die gleichen oder verschiedene sein.
Nachdem die wässrige Lösung auf den festen Träger gespottet ist, wird die gespottete Lösung inkubiert, namentlich um die gespottete Lösung für eine bestimmte Zeitdauer bei Raumtemperatur oder unter Erwärmung (bei 25-50°C und 70% rF oder mehr) zu halten, um die gespotteten Sondenmoleküle so fest auf der Trägeroberfläche zu fixieren. Im Verlauf der Inkubation können eine UV-Bestrahlung oder eine Oberflächenbehandlung unter Verwendung von Natriumborhydrid oder eines Schiff-Reagenzes („Shiff reagent") auf die gespottete Lösung angewendet werden. Die UV-Bestrahlung unter Erhitzung wird bevorzugt angewendet. Es wird angenommen, dass diese Behandlungen wirksam sind zur Stärkung der gewünschten kovalenten Bindung zwischen der Oberfläche des festen Trägers und den gespotteten Sondenmolekülen.
Dann wird der inkubierte feste Träger mit einem wässrigen Lösungsmittel gewaschen. Das zum Waschen eingesetzte wässrige Lösungsmittel enthält vorzugsweise ein oberflächenaktives Mittel, wie Natriumdodecylsulfat, oder eine Pufferzusammensetzung, wie einen Sole-Citrat-Puffer. Das Waschen wird vor zugsweise in einem warmen oder heißen wässrigen Lösungsmittel durchgeführt, um die im Wesentlichen gesamte Menge des Verdickungsmittels aus der Oberfläche des festen Trägers zu entfernen und ferner freie Sondenmoleküle, die nicht auf dem Träger fixiert worden sind, herauszuwaschen.
Das erfindungsgemäße DNA-Detektions-Microarray weist bevorzugt eine große Zahl von Spots oder Punkten (im Allgemeinen mehrere hundert bis zehntausende) auf, in denen eine große Zahl von Sondenmolekülen auf dem festen Träger durch kovalente Bindung fixiert ist. Der CV, der relativ zur Variation von Bedingungen bzw. Zuständen der verschiedenen Spots ist, beträgt vorzugsweise weniger als 6,5%.
Das DNA-Detektions-Microarray wird dann dem erfindungsgemäßen Blockierungsverfahren, das hierin vorstehend beschrieben ist, unterworfen.
[Detektion komplementärer DNA-Fragmente]
Ein Ziel-DNA-Fragment oder ein Proben-DNA-Fragment, das der Analyse betreffend das Vorhandensein eines komplementären DNA-Fragments zu unterwerfen ist, kann aus zahlreichen Quellen erhalten werden. Bei der Genanalyse kann das Ziel-DNA-Fragment aus einer Zelle oder aus Gewebe eines Eukaryonten hergestellt werden. Bei der Genomanalyse kann das Ziel-DNA-Fragment aus anderen Geweben als Erythrozyten erhalten werden. Bei der Analyse von mRNA wird die Zielprobe aus Geweben erhalten, in denen mRNA exprimiert wird. Falls das DNA-Microarray ein auf seinem festen Träger fixiertes Oligonucleotid aufweist, weist das Ziel-DNA-Fragment vorzugsweise ein geringes Molekulargewicht auf. Die Ziel-DNA kann mittels eines PCR-Verfahrens vervielfältigt werden.
An das Ziel-DNA-Fragment wird eine RI-Markierung oder eine Nicht-RI-Markierung mittels eines bekannten Verfahrens angeheftet. Die Nicht-RI-Markierung wird bevorzugt verwendet. Beispiele für die Nicht-RI-Markierungen umfassen eine Fluoreszenzmarkierung, eine Biotinmarkierung und eine Chemilumineszenz-Markierung. Die Fluoreszenzmarkierung wird am bevorzugtesten eingesetzt. Beispiele für die Fluoreszenzmarkierungen umfassen Cyaninfarbstoffe (z.B. Cy3 und Cy5, die zu den Cy Dye^TM-Reihen gehören), das Rhodamin-6G-Reagenz, N-Acetoxy-N²-acetylaminofluoren (AAF) und AAIF (ein Iodidderivat von AAF). Die mit verschiedenen Fluoreszenzindikatoren markierten Ziel- oder Proben-DNA-Fragmente können simultan analysiert werden, falls die Fluoreszenzindikatoren ein Fluoreszenzspektrum verschiedener Peaks aufweisen. Auch eine elektrisch leitfähige Markierung ist einsetzbar.
Die Hybridisierung wird durchgeführt, indem eine wässrige Probenlösung, die die Ziel-DNA-Fragmente enthält, auf das DNA-Microarray gespottet wird. Das Spotten erfolgt im Allgemeinen in einer Menge von weniger als mehrere μg, vorzugsweise im Bereich von 1 bis 100 nl. Die Hybridisierung wird durchgeführt, indem das DNA-Microarray mit der darauf gespotteten Probenlösung für 6 bis 20 Stunden bei einer Temperatur zwischen Raumtemperatur und 70°C gehalten wird. Nachdem die Hybridisierung vollständig bzw. abgeschlossen ist, wird das DNA-Microarray mit einer wässrigen Pufferlösung, die ein oberflächenaktives Mittel enthält, gewaschen, um freie (nicht fixierte) Proben-DNA-Fragmente zu entfernen. Das oberflächenaktive Mittel ist vorzugsweise Natriumdodecylsulfat (SDS).
Die Pufferlösung kann eine Citratpufferlösung, eine Phosphatpufferlösung, eine Boratpufferlösung, eine Tris-Pufferlösung oder eine Good-Pufferlösung sein. Die Citratpufferlösung wird bevorzugt eingesetzt.
Die Hybridisierung auf dem DNA-Microarray ist darin charakteristisch, dass eine extrem kleine Menge der Proben- oder Ziel-DNA-Fragmente einer Analyse unterworfen werden kann. Um die gewünschte Hybridisierung in zweckdienlicher Weise durchzuführen, sollten optimale Bedingungen festgestellt werden.
Das DNA-Microarray mit den hybridisierten DNA-Fragmenten auf seiner Oberfläche wird getrocknet und dann der Detektion von Signalen der Fluoreszenzmarkierung oder einer anderen Markierung unterworfen. Die Fluoreszenzmarkierung wird mittels eines Fluorometers detektiert. Fluorometer verschiedener Typen sind bekannt. Im Fluorometer wird das DNA-Microarray, auf dem mehrere Spots die DNA-Fragmente, ausgestattet mit der Fluoreszenzmarkierung, aufweisen, abgetastet, um die Orte der Zielspots zu detektieren. Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben.
[Beispiel 1] – Blockierung eines DNA-Chips mit kovalenter Bindung [1]
(1) Fester Träger mit Vinylsulfonylgruppen
Eine Glasplatte (25 mm × 75 mm) wurde in eine wässrige Lösung von 2 Gew.-% Aminopropylethoxysilan (erhältlich von Shin-etsu Chemical Industry Co., Ltd.) für 10 Minuten eingetaucht und dann herausgenommen. Die Glasplatte wurde nachfolgend mit Ethanol gewaschen und für 10 Minuten bei bzw. auf 110°C getrocknet, um so eine Glasplatte mit einer Beschichtung aus der Aminosilanverbindung herzustellen. Auf die beschichtete Glasplatte wurde eine wässrige Phosphatpufferlösung (pH 8,5), enthaltend 5 Gew.-% 1,2-Bis(vinylsulfonylacetamid)ethan, gespottet. Nach einer Stunde wurde die gespottete Glasplatte mit Acetonitril gewaschen und für eine Stunde unter verringertem Druck getrocknet, wodurch eine Glasplatte erhalten wurde, die auf ihrer Oberfläche Spots reaktiver Vinylsulfonylgruppen aufweist.
(2) Fixierung von Sondenmolekülen
Sondenmoleküle (DNA-Fragmente aus doppelsträngiger DNA (454 bp), deren Einerstrang durch eine Aminogruppe am 5'-Ende modifiziert ist) werden in sterilisiertem Wasser dispergiert, um eine wässrige Dispersion (1 × 10^–6 M) herzustellen. Die wässrige Dispersion wurde auf die in (1) hergestellte Glasplatte gespottet und über Nacht bei konstanter (Luft)Feuchte gehalten, um die Sondenmoleküle durch kovalente Bindung auf der Glasplatte zu fixieren. Der so hergestellte DNA-Chip wies Sondenmoleküle auf, die in Form eines Arrays auf seiner Oberfläche angeordnet waren.
(3) Blockierungsverfahren
Der in (2) hergestellte DNA-Chip wurde für 30 Minuten in eine der folgenden drei Blockierungslösungen eingetaucht:

A: im Handel erhältliche Denhardt-Lösung
B: wässrige Glycinlösung [0,1 M Glycin + 0,1 M NaCl (pH 8,5)]
C: wässrige Blockierungslösung gemäß der Erfindung [0,1 M Glycin, 0,1 M Natriumchlorid (pH 8,5), 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 2% Dextransulfat]

Der DNA-Chip wurde einer Blockierungsbehandlung unter Verwendung von einer der oben genannten Lösungen unterworfen, für 3 Minuten auf 95°C erhitzt, für 3 Minuten in kaltes Ethanol getaucht und getrocknet.
(4) Fixierung von Zielmolekülen (Hybridisierung)
Eine Ziel-DNA (454 bp), die mit einer Fluoreszenzmarkierung (FluoroLink Cy5, Amersham Pharmacia Biotech Corp.) am 5'-Ende von einem Strang markiert ist, wurde in 50 μl einer wässrigen Lösung zur Hybridisierung (5 × SSC-Lösung und 0,5 Gew.-% SDS) dispergiert. Die Dispersion wurde auf jedem der in (2) oben hergestellten DNA-Chips gespottet und (dieser) wurde dann der Blockierungsverfahrensweise in (3) oben unterworfen. Der DNA-Chip wurde mit einem Mikroskopiedeckglas abgedeckt und für 20 Stunden bei 60°C in einer Kammer mit konstanter (Luft)Feuchte inkubiert. Der so inkubierte DNA-Chip wurde mit einer Reihe von Waschverfahrensweisen, bestehend aus einem Waschschritt mit einer Mischlösung aus 0,1 Gew.-% SDS und 2 × SSC bei Raumtemperatur, einem Waschschritt mit einer Mischlösung von 0,1 Gew.-% SDS und 0,2 × SSC bei 37°C und einem Waschschritt mit einer wässrigen 0,2 × SSC-Lösung bei Raumtemperatur, gewaschen.
Der DNA-Chip, der den Waschverfahrensweisen unterworfen worden war, wurde für 20 Sekunden bei 600 UpM zentrifugiert und bei Raumtemperatur getrocknet.
(5) Fluorometrische Messung der Oberfläche des DNA-Chips
Die Verteilung der Zielmoleküle, auf dem DNA-Chip durch Hybridisierung fixiert, wurde mittels Fluorometrie untersucht. Ferner wurde die Stärke der Hintergrundfluoreszenz auf jedem DNA-Chip gemessen.
(6) Ergebnisse
Das Bild der Fluoreszenzstärke, beobachtet auf jedem DNA-Chip, auf dem die Zielmoleküle, die eine Fluoreszenzmarkie rung aufweisen, fixiert waren, ist in 3 der angehängten Figuren gezeigt.

Die Stärke der Hintergrundfluoreszenz, die auf jedem DNA-Chip gemessen wurde, ist nachstehend angegeben:

A (blockiert unter Verwendung von Denhardt-Lösung):	15.000
B (blockiert unter Verwendung einer wässrigen Glycinlösung):	12.000
C (blockiert unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lösung):	3.500

Die in 3 gezeigten Ergebnisse und die Stärke der Hintergrundfluoreszenz weisen darauf hin, dass die Verwendung der Kombination der Blockierungsmittel gemäß der Erfindung die Stärke der Hintergrundfluoreszenz stark verringert und Spots mit einer sauberen Form ergibt.
[Beispiel 2] – Blockierung eines DNA-Chips mit kovalenter Bindung [2]
(1) Herstellung eines DNA-Chips mit kovalent fixierten Sondenmolekülen
Die Verfahrensweisen von (1) und (2) von Beispiel 1 wurden wiederholt, um einen DNA-Chip mit Sondenmolekülen herzustellen, die auf seiner Oberfläche in Form eines Arrays angeordnet waren.
(2) Blockierungsverfahrensweise
Der in (1) oben hergestellte DNA-Chip wurde für 30 Minuten in eine der folgenden drei Blockierungslösungen getaucht:

D: wässrige Glycin/Tensid-Lösung [0,1 M Glycin + 0,1 M NaCl (pH 8,5) + 0,2% SDS]
E: wässrige Glycinlösung [0,1 M Glycin + 0,1 M NaCl (pH 8,5)]
F: wässrige erfindungsgemäße Blockierungslösung [0,1 M Glycin, 0,1 M Natriumchlorid (pH 8,5), 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 2% Dextransulfat]

Der DNA-Chip wurde einer Blockierungsbehandlung unter Verwendung von einer der drei oben genannten Lösungen unterworfen, für 3 Minuten auf 95°C erhitzt, für 3 Minuten in kaltes Ethanol getaucht und getrocknet.
(3) Fixierung von Zielmolekülen (Hybridisierung)
Die in (4) von Beispiel 1 beschriebene Hybridisierungsverfahrensweise wurde wiederholt.
(4) Fluorometrische Messung der Oberfläche des DNA-Chips
Die Verteilung der Zielmoleküle auf dem DNA-Chip durch Hybridisierung fixiert, wurde mittels Fluorometrie untersucht. Ferner wurde die Stärke der Hintergrundfluoreszenz auf jedem DNA-Chip gemessen.
(5) Ergebnisse
Das Bild der Fluoreszenzstärke, beobachtet auf jedem DNA-Chip, auf dem die Zielmoleküle, die eine Fluoreszenzmarkierung aufweisen, fixiert waren, ist in 4 der angehängten Figuren gezeigt.

D (blockiert unter Verwendung von Denhardt-Lösung):	7.500
E (blockiert unter Verwendung einer wässrigen Glycinlösung):	14.000
F (blockiert unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lösung):	3.000

Die in 4 gezeigten Ergebnisse und die Stärke der Hintergrundfluoreszenz weisen darauf hin, dass die Verwendung der Kombination der Blockierungsmittel gemäß der Erfindung die Stärke der Hintergrundfluoreszenz stark verringert und Spots mit einer sauberen Form ergibt.
[Beispiel 3] – Blockierung eines DNA-Chips mit elektrostatischer Bindung
(1) Herstellung eines DNA-Chips mit elektrostatisch fixierten Sondenmolekülen
Auf einen silanbeschichteten Glasobjektträger, hergestellt für DNA-Microarrays (GMT-GAPS, erhältlich von Corning Corp.), wurde eine wässrige Dispersion, die in sterilisiertem Wasser 1 × 10^–6 M Sondenmoleküle (DNA-Fragmente aus doppelsträngiger DNA (454 bp), deren Einerstrang durch eine Aminogruppe am 5'-Ende modifiziert ist) enthält, gespottet. Der gespottete Glasobjektträger wurde für 1 Stunde auf 80°C erhitzt und ultravioletten Strahlen (120 mJ) ausgesetzt, um einen DNA-Chip herzustellen. Der so hergestellte DNA-Chip wies Sondenmoleküle auf, die durch elektrostatische Bindung fixiert und in der Form eines Arrays auf dessen Oberfläche angeordnet waren.
(2) Blockierungsverfahren
Der in (1) oben hergestellte DNA-Chip wurde für 30 Minuten in eine der folgenden drei Blockierungslösungen getaucht:

G: im Handel erhältliche Denhardt-Lösung
H: wässrige Bernsteinsäureanhydridlösung [die durch Auflösen von 35 ml 1-Methyl-2-pyrrolidon, 0,01 M Borsäure (pH 8,0) und 5 g Bernsteinsäureanhydrid in 315 ml Wasser hergestellt wurde]
I: wässrige erfindungsgemäße Blockierungslösung [0,1 M Glycin, 0,1 M Natriumchlorid (pH 8,5), 0,2% Natriumdodecylsulfat (SDS) und 2% Dextransulfat]

Der DNA-Chip wurde einer Blockierungsbehandlung unter Verwendung einer der obenstehend genannten Lösungen unterworfen, für 3 Minuten auf 95°C erhitzt, für 3 Minuten in kaltes Ethanol getaucht und getrocknet.
(3) Fixierung der Zielmoleküle (Hybridisierung)
Die in (4) von Beispiel 1 beschriebene Hybridisierungsverfahrensweise wurde wiederholt.
(4) Fluorometrische Messung der Oberfläche des DNA-Chips
Die Verteilung der Zielmoleküle, auf dem DNA-Chip durch Hybridisierung fixiert, wurde mittels Fluorometrie untersucht. Ferner wurde die Stärke der Hintergrundfluoreszenz auf jedem DNA-Chip gemessen.
(5) Ergebnisse
Das Bild der Fluoreszenzstärke, beobachtet auf jedem DNA-Chip, auf dem die Zielmoleküle, die eine Fluoreszenzmarkierung aufweisen, fixiert waren, ist in 5 der angehängten Figuren gezeigt.

G (blockiert unter Verwendung von Denhardt-Lösung):	8.000
H (blockiert unter Verwendung einer wässrigen Bernsteinsäureanhydridlösung):	4.500
I (blockiert unter Verwendung der erfindungsgemäßen Lösung):	2.500

Die in 5 gezeigten Ergebnisse und die Stärke der Hintergrundfluoreszenz weisen darauf hin, dass die Verwendung der Kombination der Blockierungsmittel gemäß der Erfindung die Stärke der Hintergrundfluoreszenz stark verringert und Spots mit einer sauberen Form ergibt.

Claims

Verfahren zum Blockieren einer Vorrichtung zur Detektion von biochemisch aktiven Molekülen, welches die Stufen umfasst: Inkontaktbringen, in Gegenwart eines wässrigen Mediums, das ein oberflächenaktives Mittel enthält, einer Detektionsvorrichtung, die auf ihrer Oberfläche (a) Sondenmoleküle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden, Polynukleotiden und Peptidnukleinsäuren, (b) ionische reaktive Aminogruppen und (c) nicht-ionische reaktive Gruppen aufweist, gleichzeitig oder einzeln mit Verbindungen, die mit den nicht-ionischen Reaktionsgruppen reagieren, um kovalente Bindungen zu erzeugen, und Dextransulfaten, die in Verbindung mit den ionischen reaktiven Aminogruppen elektrostatische Bindungen bilden; und Waschen der Oberfläche der Detektionsvorrichtung mit einem wässrigen Lösungsmittel oder mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die nicht-ionischen reaktiven Gruppen ethylenisch ungesättigte Gruppen sind.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die ethylenisch ungesättigten Gruppen Vinylsulfonylgruppen oder deren Vorläufer sind, die die Formel: -L-SO₂-CR¹=CR²R³ aufweisen, worin jedes von R¹, R² und R³ unabhängig ein Wasserstoffatom, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Arylgruppe mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder eine Aralkylgruppe mit 7 bis 26 Kohlenstoffatomen, deren Alkylgruppe 1 bis 6 Kohlenstoffatome aufweist, ist und L eine Verknüpfungsgruppe ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die wässrige Lösung ferner eine Aminogruppe-enthaltende Verbindung, die eine positive Ladung aufweist, enthält.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Aminogruppe-enthaltende Verbindung Glycin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Sondenmoleküle, ionischen reaktiven Gruppen und nicht-ionischen reaktiven Gruppen durch kovalente Bindung auf der Detektionsvorrichtung fixiert sind.
Vorrichtung zur Detektion biochemisch aktiver Moleküle, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6 blockiert ist.
Verwendung einer wässrigen Lösung, die ein oberflächenaktives Mittel, Dextransulfat und eine Aminogruppe-enthaltende Verbindung, die eine positive Ladung aufweist, enthält, im Verfahren nach Anspruch 1.
Verwendung einer wässrigen Lösung nach Anspruch 8, wobei die Aminogruppe-enthaltende Verbindung Glycin ist.
Verfahren zum Blockieren einer Vorrichtung zur Detektion biochemisch aktiver Moleküle, welches die Stufen umfasst: Inkontaktbringen, in Gegenwart eines wässrigen Mediums, das ein oberflächenaktives Mittel enthält, einer Detektionsvorrichtung, die auf ihrer Oberfläche (a) Sondenmoleküle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden, Polynukleotiden und Peptidnukleinsäuren, und (b) ionische reaktive Aminogruppen aufweist, gleichzeitig oder einzeln mit Dextransulfaten, die in Verbindung mit den ionischen reaktiven Aminogruppen elektrostatische Bindungen bilden; und Waschen der Oberfläche der Detektionsvorrichtung mit einem wässrigen Lösungsmittel oder mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das wässrige Medium ein oberflächenaktives Mittel enthält.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die ionischen reaktiven Gruppen Aminogruppen oder Mercaptogruppen sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die ionischen reaktiven Gruppen Aminogruppen sind und die Verbindungen, die in Verbindung mit den ionischen reaktiven Gruppen elektrostatische Bindungen bilden, Dextransulfate sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Sondenmoleküle Nukleotidderivate, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Oligonukleotiden, Polynukleotiden und Peptidnukleinsäuren, sind.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Sondenmoleküle auf der Detektionsvorrichtung durch elektrostatische Bindung fixiert sind und ionische reaktive Gruppen auf der Detektionsvorrichtung durch kovalente Bindung fixiert werden.
Vorrichtung zur Detektion biochemisch aktiver Moleküle, die durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 15 blockiert ist.