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TECHNISCHES GEBIET
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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine Sondenlösungszusammensetzung, die bei
der Herstellung eines reaktiven Chips eingesetzt wird, in dem eine
zur spezifischen Bindung an eine Zielsubstanz fähige Sonde in hoher Dichte
auf einem Substrat angeordnet und fixiert ist, einen unter Verwendung
dieser Zusammensetzung hergestellten reaktiven Chip sowie ein Verfahren
zur Herstellung des reaktiven Chips.
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STAND DER TECHNIK
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Zur
raschen Analyse einer Genstruktur oder eines Genexpressionsmodus
im industriellen Maßstab werden
verschiedene reaktive Chips angewandt. Ein solcher reaktiver Chip
weist mehrere tausend bis mehrere zehntausend Typen oder mehr an
verschiedenen Sonden auf, die als Spots auf einem Substrat, wie
z.B. einem Objektträger,
angeordnet und fixiert sind und eine Zielsubstanz spezifizieren
oder die Menge der Zielsubstanz in einer Sonde bestimmen können, wobei
als Index die Gegenwart oder Abwesenheit der Bindung der Zielsubstanz,
die beispielsweise fluoreszenzmarkiert ist, an die Sonde herangezogen
wird. Die auf einem Chip zu fixierende Sonde kann je nach Typ der
zu analysierenden Zielsubstanz variieren. Wenn beispielsweise DNA
oder RNA als Zielsubstanz verwendet wird, wird eine Sonde eingesetzt,
die in der Lage ist, sich komplementär daran zu binden (zu hybridisieren),
wie z.B. ein doppelsträngiges
oder einzelsträngiges
DNA-Fragment oder eine Polynucleotidkette oder eine Oligonucleotidkette,
sodass der Chip als DNA-Chip (oder DNA-Array) bezeichnet wird. Das „Spotten" einer Sonde bei
Verwendung eines DNA-Fragments als Sonde wird mithilfe eines Verfahrens,
bei dem das DNA-Fragment selbst auf einem Substrat fixiert wird,
oder eines Verfahrens durchgeführt,
bei dem ein DNA-Fragment mit einer bestimmten Basensequenz auf dem
Substrat synthetisiert wird. Bei jedem Verfahren sollte eine fixierte
Menge des jeweiligen Sondenmaterials an einer vorbestimmten Position
genau gespottet werden.
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Ein
bekanntes Verfahren zum Spotten eines Sondenmaterials auf ein Substrat
ist ein Verfahren, bei dem ein Stift verwendet wird, um eine Sondenlösung auf
das Substrat aufzubringen (aufzuspritzen), wie z.B. ein QUILL-Verfahren,
ein Pin-and-Ring-Verfahren, ein Federstiftverfahren und dergleichen.
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Im
Gegensatz zu solchen Verfahren haben die Anmelder dieser Anmeldung
ein Verfahren zum raschen und genauen Spotten einer äußerst geringen
Menge einer Sondenlösung
an einer bestimmten Position auf ein Substrat unter Verwendung einer
Strahldüse
entwickelt und ein Patent für
dieses Verfahren angemeldet (JP-A-2001-116750). Die Anmelder dieser Anmeldung
haben darüber
hinaus ein Patent auf ein Verfahren zur Herstellung eines DNA-Chips
angemeldet, das ermöglicht,
dass die Effizienz der Sondenlösung
wirksam erhöht
werden kann und der Spotdurchmesser einheitlich ist, und zwar indem
die DNA-Sondenlösung
mehrere Male wiederholt gespottet wird (wiederholtes Spritz-Spotten)
(JP-A-2001-186880).
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Andererseits
enthält
eine Sondenlösung
Carboxymethylcellulose und dergleichen, damit ein Sondenspot auf
einem Substrat stabil fixiert wird, und die Zusammensetzung der
Sondenlösung
ist ferner verbessert worden, um eine noch höhere Detektionsempfindlichkeit
und eine noch höhere
Spotdichte zu erzielen. In der JP-A-2000-295990 ist eine Sondenlösung (DNA-Lösung) offenbart,
die ein hydrophiles Polymer enthält.
In der JP-A-2001-66305 ist als Sondenlösung in einem Tintenstrahlverfahren
eine flüssige
Zusammensetzung offenbart, die aus einer Sonde, Harnstoff, Glycerin,
Thiodiglykol und Acetylenalkohol besteht.
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Für die Post-Genombildung,
die der raschen Identifizierung einer großen Anzahl an unbekannten Genen
und der Analyse derer Funktionen bedarf, besteht ein immer stärkerer Bedarf
an DNA-Chips und anderen reaktiven Chips, die als viel versprechende
Mittel dienen. Bei der Befriedigung einer solchen Bedarfs existieren nach
wie vor Probleme, die gelöst
werden müssen,
bevor eine kostengünstige
Bereitstellung und eine effiziente Massenherstellung eines reaktiven
Chips, der in der Lage ist, eine Zielsubstanz mit hoher Genauigkeit
zu identifizieren und zu quantifizieren, erreicht werden können. Ein
Problem steht in Zusammenhang mit einer weiteren Verbesserung der
Detektionsempfindlichkeit, die einer äußerst geringen Menge der zu
messenden Zielsubstanz bedarf, für
die eine weitere Stabilisierung der Spotform erforder lich ist. Eine
solche zusätzliche Stabilisierung
der Spotform ermöglicht
eine noch höhere
Dichte der Sondenspots und darüber
hinaus, dass unterschiedliche biologische Molekülsonden unter einheitlichen
Bedingungen gespottet werden können. Nichtsdestotrotz
stellt eine herkömmliche
Sondenlösungszusammensetzung
eine Einschränkung
hinsichtlich des Erhalts einer zufrieden stellenden stabilen Spotform
dar.
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Andererseits
wird in einer herkömmlichen
Sondenlösungszusammensetzung üblicherweise
ein salzhältiger
Puffer, wie z.B. SSC-Puffer, Natriumcarbonatpufter, Natriumacetatpuffer
und dergleichen, verwendet, um die Viskosität der Sondenlösung zu
erhöhen.
Auch beim Fixieren einer Sonde über
eine kovalente Bindung zwischen einem Epoxy-beschichteten Substrat
und einer modifizierten Aminogruppe auf der Sonde wird vorzugsweise
ein salzhältiger
Puffer (insbesondere SSC-Puffer und dergleichen) zur Steigerung
der Wirksamkeit der kovalenten Bindung verwendet. Die Verwendung
eines solchen salzhältigen
Puffers kann jedoch ein Problem hinsichtlich mangelhafter Spotform
aufgrund von Salzausfällung
darstellen.
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Zudem
erfordert ein herkömmliches
Herstellungsverfahren von reaktiven Chips einen Wasserzugabeschritt
nach dem Spotten, um zu verhindern, dass der Spot trocknet sowie
einen Wärmebehandlungs-
und Fixierungsschritt. Das Weglassen solcher Schritte ist ein Ziel,
das erreicht werden soll, um reaktive Chips bei geringen Kosten
massenfertigen zu können.
Insbesondere von dem in der JP-A-2001-186880 geoffenbarten wiederholten
Spritz-Spotten ist zu erwarten, dass das Weglassen der Schritte
stark zur Erhöhung
der Produktionseffizienz und Reduzierung der Kosten beitragen wird.
Nichtsdestotrotz ist ein herkömmliches
Verfahren zur Herstellung eines reaktiven Chips oder einer Modifizierung
der Zusammensetzung der Sondenprobenlösung bei der Lösung oben
beschriebener Probleme nicht gänzlich
erfolgreich.
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Die
Erfindung wurde unter oben den beschriebenen Bedingungen entwickelt,
und ihr Ziel ist die Bereitstellung einer neuen Sondenlösungszusammensetzung,
die gleichzeitig eine Verbesserung der Detektionsempfindlichkeit,
eine Stabilisierung der Spotform sowie eine Vereinfachung des Herstellungsverfahrens
ermöglicht.
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Ein
weiteres Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines reaktiven
Chips, der unter Verwendung der oben beschriebenen Zusammensetzung
hergestellt wird, sowie ein Verfahren zur Herstellung des reaktiven Chips.
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OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung stellt somit eine wie in Anspruch 1 dargelegte Sondenlösungszusammensetzung
bereit.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
dieser Sondenlösung
sind zusätzlich
zumindest 10–3 Mol/l
Salz enthalten.
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Die
Erfindung stellt auch einen reaktiven Chip bereit, der die Sondenlösungszusammensetzung
als einen auf dem Substrat fixierten Spot umfasst.
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Die
Erfindung stellt darüber
hinaus ein Verfahren zur Herstellung eines reaktiven Chips bereit,
welches das Spotten der Sondenlösungszusammensetzung
auf ein Substrat und das Fixieren dieses Flüssigkeitszusammensetzungsspots
auf dem Substratumfasst.
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In
den bevorzugten Ausführungsformen
dieses Herstellungsverfahrens erfolgt das Spotten mithilfe eines
Tintenstrahlverfahrens, wobei der Spot der Sondenlösungszusammensetzung
ohne Zugabe von Wasser fixiert wird und das Spotten zweimal oder öfter wiederholt
wird, um die Sondenlösungszusammensetzung
in Form eines Laminats zu fixieren.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
die Ergebnisse der Messung der Signalintensität in einem DNA-Chip, der unter
Verwendung der jeweiligen Sondenlösungszusammensetzungen hergestellt
wurde, die eine wässrige
Lösung
von Natriumsialat in verschiedenen Konzentrationen enthielten.
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BESTE ART DER DURCHFÜHRUNG DER
ERFINDUNG
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Die
Erfindung stellt eine wie in Anspruch 1 dargelegte Sondenlösungszusammensetzung
bereit.
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Das
Feuchthaltemittel kann beispielsweise eine Substanz sein, die fähig ist,
Restwasser in einem Ausmaß von
90% oder mehr zurückzuhalten,
wenn es 10 min lang bei 25 °C
und 40% r.F. stehen gelassen wird nachdem, verglichen mit der anfänglich zugetropften
Menge, 1 ml einer wässrigen
Lösung,
die diese enthält, auf
ein Filterpapier aufgetropft wurde. Ein solches Feuchthaltemittel
kann ein Molekulargewicht von 300 bis 2.000 und eine Viskosität von 1
bis 20 cP aufweisen. In der Sondenlösungszusammensetzung der vorliegenden
Erfindung werden speziell eine oder mehrere von Sialinsäure, Sialinsäuresalz,
Sialinsäureoligomer,
Sialinsäureoligomersalz,
Sialsäure
und Sialsäuresalz
(im weiteren Verlauf kollektiv als "Sialinsäureanaloge" bezeichnet) verwendet. Ein Sialinsäure-(Salz-)Oligomer
ist ein Dimer bis Hexamer von Sialinsäure(salz), und ein Sialsäure(salz)
ist ein Heptamer oder ein höheres
Oligomer von Sialinsäure(salz).
Jedes dieser Sialinsäureanaloge
kann jedes beliebige im Handel erhältliche Produkt, wie z.B. ein
getrocknetes Produkt, sein.
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Die
in der Lösungszusammensetzung
der vorliegenden Erfindung eingesetzte Sonde ist ein biologisches
Molekül,
das spezifisch an eine Zielsubstanz bindet. Wenn die Zielsubstanz
beispielsweise ein DNA-Fragment ist, das von einer Genom-DNA (z.B.
cDNA) stammt, ist die Sonde eine solche, die mit dem DNA-Fragment
auf Grundlage der Komplementarität,
wie z.B. einem einzelsträngigen
DNA-Fragment, RNA-Fragment, einer Nucleotidkette (Polynucleotid
mit 100 Basen oder mehr, oder Oligonucleotid mit weniger als 100
Basen) und dergleichen hybridisiert. Wenn die Zielsubstanz ein Protein
ist, ist die Sonde eine solche, die spezifisch an einen Teil der
Aminosäuresequenz
des Proteins bindet, wie z.B. ein Protein oder Peptid. Es ist auch
möglich
als Sonde einen Antikörper
zu verwenden, der in der Lage ist, an ein Epitop eines Proteins sowie
an dessen Fab, F(ab')2, Fv-Fragmente und dergleichen zu binden.
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Die
Konzentration der Sonde in dieser Sondenlösungszusammensetzung kann je
nach Typ und Molekulargewicht der Sonde variieren, und im Fall beispielsweise
eines DNA-Fragments oder einer Nucleotidkette 0,1 bis etwa 5 μg betragen.
Die Konzentration des Feuchthaltemittels kann je nach dessen Feuchthaltevermögen oder
Viskosität
variieren und im Fall eines Sialinsäureanalogs 1 bis 15 Gew.-%
betragen.
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Andere
Bestandteile der Lösungszusammensetzung
als die Sonde und das Feuchthaltemittel können jenen einer Sondenlösung gleichen,
die bei der Herstellung eines bekannten reaktiven Chips verwendet
werden. Eine Sonde und ein Feuchthaltemittel können beispielsweise mit einem
Puffer bei einem pH von 7 bis 8 vermischt werden, um eine Sondenlösungszusammensetzung
herzustellen. Obwohl der Puffer ein salzfreier Puffer sein kann,
ist er vorzugsweise ein salzhältiger
Puffer, wie z.B. SSC-Puffer, Natriumcarbonatpuffer, Natriumacetatpuffer
und dergleichen. Ein salzfreier Puffer kann Hydrochlorid, Hydrobromid,
Sulfat, Nitrat, Acetat, Benzoat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat,
Citrat, Oxalat, Methansulfonat, Toluolsulfonat, Aspartat, Glutamat und
dergleichen enthalten. Die Salzkonzentration kann zumindest 10–3 Mol/l,
vorzugsweise 10–2 bis 1 Mol/l, betragen,
wie nachstehend unter VERSUCH geoffenbart ist.
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Ein
typisches Beispiel für
eine Sondenlösungszusammensetzung
der Erfindung enthält
bei Verwendung eines DNA-Fragments als Sonde eine wässrige Lösung von
Natriumsialat, und das DNA-Fragment wurde in 10% (Gew./Vol.) bzw.
0,01% (Gew./Vol.) Endkonzentration in TE-Puffer (pH 8, 0,01 M Tris-HCl,
0,001 M EDTA) gelöst.
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Wie
in den Beispielen angeführt,
können
eine Lösung,
die eine Sialinsäure
enthält,
und eine Lösung, die
eine Sonden enthält,
getrennt hergestellt und anschließend miteinander vermischt
werden, um die Sondenlösungszusammensetzung
herzustellen. In einem solchen Fall können sämtliche Typen der auf einen
reaktiven Chip zu spottenden Sondenlösungszusammensetzungen durch
Bereitstellung einer großen
Men ge einer Lösung
eines Sialinsäureanalogs
und Vermischen mit mehreren Typen der Sondenlösungen getrennt voneinander
wirksam hergestellt werden.
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Nachstehend
werden ein reaktiver Chip der Erfindung und ein Verfahren zu dessen
Herstellung erläutert.
Der reaktive Chip ist dadurch gekennzeichnet, dass die oben beschriebene
Sondenlösungszusammensetzung
als Spot auf einem Substrat fixiert ist. Das Substrat kann ein Objektträger sein,
der in einem herkömmlichen
reaktiven Chip eingesetzt wird, wobei das in der JP-A-2001-186880
geoffenbarte mit Poly-L-lysin
beschichtete Substrat besonders bevorzugt wird.
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Dieses
Substrat ermöglicht
es, dass die Sonde über
elektrostatische Bindung zwischen der negativen Ladung auf einer
DNA selbst und der positiven Ladung auf einer Aminosäure am Substrat
fixiert werden kann. Wenn ein mit Epoxy beschichtetes Substrat verwendet
wird, verwendet man vorzugsweise eine salzhältige Sondenlösungszusammensetzung.
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Die
zu spottende Sondenlösungszusammensetzung
kann beispielsweise eine Lösungszusammensetzung
sein, die 100 bis 20.000 Arten unterschiedlicher Sonden enthält, wobei
die Zusammensetzung Spots ausbildet, die jeweils einen Durchmesser
von 50 bis 500 μm
aufweisen und etwa 100 bis 1.000 μm
voneinander beabstandet sind.
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Ein
Spotting-Verfahren zur Herstellung eines solchen reaktiven Chips
kann ein herkömmliches
Stiftverfahren sein, wobei jedoch vorzugsweise das in der JP-A-2001-116750 und der JP-A-2001-186881
geoffenbarte Tintenstrahlverfahren angewandt wird. Eine mit solchen
Verfahren gespottete Sonde kann in zufrieden stellender Form mithilfe
eines Feuchthaltemittels auf einem Substrat fixiert werden. Wenn
ein salzhältiger
Puffer verwendet wird, wird zudem eine Ausfällung des Salzes unterdrückt und
eine zufrieden stellende Spotform erhalten. Eine so zufrieden stellende
Spotform führt
zu erhöhter
Detektionsempfindlichkeit und höherer
Spotdichte.
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Nach
dem Spotten wird jeder Spot mit einem Verfahren, das jenem der herkömmlichen
Herstellung von reaktiven Chips gleicht, auf einem Substrat fixiert,
was das Kühlen,
die Zugabe von Wasser zu den Spots (unter Beibehaltung der Feuchtigkeit
von etwa 80% über
einen bestimmten Zeitraum), das Fixieren durch Sintern und Trocknen
und dergleichen umfasst. Nichtsdestotrotz kann der oben beschriebene
Wasserzugabeschritt im Verfahren ausgelassen werden, ohne dass die
Spotform dadurch in irgendeiner Weise beeinträchtigt wird (wie z.B. Doughnut-förmig wird),
da die gespottete Sondenlösungszusammensetzung
Feuchthaltevermögen
aufweist.
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Auch
im Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung ist das in der
JP-A-2001-186880
geoffenbarte wiederholte Spritz-Spotten eine bevorzugte Ausführungsform.
In einem solchen Fall kann die Wirkung des wiederholten Spritzens
zusätzlich
verbessert werden, da basierend auf jedem einzelnen Spotten eine
zufrieden stellende Spotform beibehalten werden kann. Da beim wiederholten
Spritzen auch keine Wasserzugabe erforderlich ist, bedarf es zur
Herstellung eines reaktiven Chips nur einer geringen Anzahl an Schritten.
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Die
Erfindung wird in den nachstehenden Beispielen und Versuchen, die
nicht als Einschränkung
der Erfindung zu verstehen sind, genauer beschrieben.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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(1) Herstellung von Flüssigkeitszusammensetzungen
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Lyophilisiertes
Natrium- (Na-) Sialat wurde in den in Tabelle 1 angeführten Bestandteilen
gelöst
und der pH eingestellt, um eine Natriumsialatlösung mit einer Endkonzentration
im Bereich von 9 bis 48% herzustellen. Tabelle
1
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Andererseits
wurden die von Hefe (Saccharomyces cerevisiae) stammenden DNAs (Y1-10B
und Y53-1A) gereinigt und jeweils in 200 μl TE-Puffer gelöst, um jeweilige
DNA-Lösungen
herzustellen. Die mittels Absorptionsphotometrie gemessene DNA-Konzentration dieser
Lösungen
betrug 3 μg/ml.
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Die
DNA-Lösung
(20 μl),
die Natriumsialatlösung
mit der jeweiligen Konzentration (20 μl) und reines Wasser (20 μl) wurden
vermischt, um die jeweilige in Tabelle 2 gezeigte Flüssigkeitszusammensetzung (DNA/Natriumsialatlösung) herzustellen. Tabelle
2
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(2) DNA-Chip-Herstellung
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Jede
oben in Schritt (1) beschriebene hergestellte Flüssigkeitszusammensetzung (DNA/Natriumsialatlösung) wurde
in eine mit einer Tintenstrahldüse
(beispielsweise die in der JP-A-2001-186881 beschriebene Vorrichtung)
ausgestattete Mikropipette gefüllt
und 200 pl davon auf einen mit Poly-L-lysin beschichteten Objektträger gespottet.
Anschließend
wurde zu jedem gespotteten Bereich Wasser zugesetzt, was anschließend bei
etwa 80 °C
1 Stunde lang gesintert wurde, um Fixierung zu bewir ken, wodurch
16 Arten von DNA-Chips mit darauf fixierten DNA-Sonden erhalten
wurden.
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(3) Messung
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(3-1) Herstellung von markierter cDNA
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Als
Probe für
5 DNA-Chips wurden 5 μl
einer Hefe-mRNA, 1 μl
mit DEPC behandeltes Wasser und 1 μl eines Oligo-Primers vermischt
und 5 min auf 70 °C
sowie 3 min auf 42 °C
erhitzt. Dazu wurden 4 μl
5 × Reaktionspuffer,
2 μl dNTP-Gemisch,
2 μl 100
mM DTT, 2 μl
1 mM FluoroLink dUTP und 2,5 μl
an 40 Einheiten RNase-Inhibitor eingemischt. Dazu wurde 1 μl SuperScript
II zugesetzt und das Gemisch 40 min auf 42 °C erhitzt und anschließend weitere
0,5 μl SuperScript
II zugesetzt und 40 min auf 42 °C
erhitzt, 20 μl
sterilisiertes Wasser, 5 μl
0,5 M EDTA und 10 μl
1 N NaOH zugesetzt und dann 60 min auf 65°C erhitzt. Das Gemisch wurde 60
min mit 25 μl
Tris (1 M, pH 7,5) neutralisiert, durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 8.000
U/min unter Verwendung von Microcon 30 filtriert, mit 250 μl sterilisiertem
Wasser versetzt, zweimal einer 10-minütigen Zentrifugation bei 8.000
U/min unterzogen, gefolgt von einer 45-sekündigen Zentrifugation bei 3.000
U/min, wodurch markierte cDNA erhalten wurde.
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(3-2) Hybridisierung
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Zuerst
wurden 24,5 μl
markierte cDNA, 8,75 μl
20 × SSC
und 1,75 μl
10% SDS vermischt und das Gemisch anschließend 3 min auf 95 °C erhitzt,
15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und zweimal in einem Volumen
von jeweils 17,5 μl
pro DNA-Chip gespottet.
Der Chip wurde vorsichtig mit einem Deckglas bedeckt, während jegliche
Restluftblasen vermieden wurden, und es folgte eine 16-stündige Inkubation
bei 65 °C
in feuchter Umgebung.
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Anschließend wurde
das Deckglas in 2 × SSC-0,1%
SDS sanft abgenommen und der Chip zweimal mit 2 × SSC-0,1% SDS gewaschen, zweimal
mit 2 × SSC-0,1%
SDS gewaschen, auf 55 °C
erhitzt, mit 0,2 × SSC-0,1%
SDS, 0,2 × SSC
und 0,05 × SSC
gespült,
zentrifugiert und getrocknet.
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(3-3) Fluorimetrie
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Der
DNA-Chip wurde nach der Hybridisierung in einem Abtastfeld (BM KIKI
Scanner) platziert und bei einer Laserleistung von 80%, einem PMT
von 80% und einem Auflösungsgrad
von 10 μm
gemessen.
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(3-4) Ergebnisse
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 1 angeführt. Wie aus 1 hervorgeht,
zeigt der unter Verwendung der Sondenlösungszusammensetzung hergestellte
DNA-Chip, der Natriumsialat enthält,
besonders bei einer Konzentration von 3 bis 14% eine starke Signalintensität.
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Beispiel 2
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(1) Herstellung von Flüssigkeitszusammensetzungen
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Jedes
der lyophilisierten Natrium- (Na-) Sialate und getrockneten Oligomere
(Dimer, Trimer, Tetramer, Pentamer, Hexamer) davon wurde ähnlich wie
in Beispiel 1 gelöst
und der pH eingestellt, um eine Natriumsialatlösung herzustellen, deren Endkonzentration
30% betrug.
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Andererseits
wurden die von Hefe (Saccharomyces cerevisiae) stammenden DNAs (Y1-10B
und Y53-1A) gereinigt und jeweils in 100 μl TE-Puffer gelöst, um jeweilige
DNA-Lösungen
herzustellen. Die mittels Absorptionsphotometrie gemessenen DNA-Konzentration jeder
der Lösungen
betrug 3,03 μg/ml.
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Die
DNA-Lösung
(20 μl),
die jeweilige Natriumsialatlösung
(20 μl)
und reines Wasser (20 μl)
wurden vermischt, um eine in Tabelle 3 angegebene Flüssigkeitszusammensetzung
(DNA/Natriumsialatlösung)
herzustellen. Tabelle
3
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(2) DNA-Chipherstellung
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Jede
oben in Schritt (1) beschriebene hergestellte Flüssigkeitszusammensetzung (DNA/Natriumsialatlösung) wurde
in eine mit einer Tintenstrahldüse
(beispielsweise die in der JP-A-2001-186881 beschriebene Vorrichtung)
ausgestattete Mikropipette gefüllt
und 200 pl davon auf einen mit Poly-L-lysin beschichteten Objektträger gespottet.
Anschließend
wurde zu jedem gespotteten Bereich Wasser zugesetzt, was anschließend bei
etwa 80 °C
1 Stunde lang gesintert wurde, um Fixierung zu bewirken, wodurch
7 Arten von DNA-Chips mit darauf fixierten DNA-Sonden erhalten wurden.
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(3) Messung
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(3-1) Herstellung markierter c-DNA
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Als
Probe für
5 DNA-Chips wurden 5 μl
einer Hefe-mRNA, 1 μl
mit DEPC behandeltes Wasser und 1 μl eines Oligo-Primers vermischt
und 5 min auf 70 °C
sowie 3 min auf 42 °C
erhitzt. Dazu wurden 4 μl
5 × Reaktionspuffer,
2 μl dNTP-Gemisch,
2 μl 100
mM DTT, 2 μl
1 mM FluoroLink dUTP und 2,5 μl
an 40 Einheiten RNase-Inhibitor eingemischt. Dazu wurde 1 μl SuperScript
II zugesetzt und das Gemisch 40 min auf 42 °C erhitzt und anschließend weitere
0,5 μl SuperScript
II zugesetzt und 40 min auf 42 °C
erhitzt, 20 μl
sterilisiertes Wasser, 5 μl
0,5 M EDTA und 10 μl
1 N NaOH zugesetzt und dann 60 min auf 65°C erhitzt. Das Gemisch wurde mit
25 μl eines
Tris (1 M, pH 7,5) neutralisiert, durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 8.000
U/min unter Verwendung von Microcon 30 filtriert, mit 250 μl sterilisiertem
Wasser versetzt, zweimal einer 10-minütigen Zentrifugation bei 8.000
U/min unterzogen, gefolgt von einer 45-sekündigen Zentrifugation bei 3.000
U/min, wodurch markierte cDNA erhalten wurde.
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(3-2) Hybridisierung
-
Zuerst
wurden 24,5 μl
markierte cDNA, 8,75 μl
20 × SSC
und 1,75 μl
10% SDS vermischt und das Gemisch anschließend 3 min auf 95 °C erhitzt,
15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und zweimal in einem Volumen
von jeweils 17,5 μl
pro DNA-Chip gespottet.
Der Chip wurde vorsichtig mit einem Deckglas bedeckt, während jegliche
Restluftblasen vermieden wurden, und es folgte eine 16-stündige Inkubation
bei 65 °C
in feuchter Umgebung.
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Anschließend wurde
das Deckglas in 2 × SSC-0,1%
SDS sanft abgenommen und der Chip zweimal mit 2 × SSC-0,1% SDS gewaschen, zweimal
mit 2 × SSC-0,1
SDS gewaschen, auf 55 °C
erhitzt, mit 0,2 × SSC-0,1%
SDS, 0,2 × SSC
und 0,05 × SSC
gespült,
zentrifugiert und getrocknet.
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(3-3) Fluorimetrie
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Der
DNA-Chip wurde nach der Hybridisierung in einem Abtastfeld (BM KIKI
Scanner) platziert und bei einer Laserleistung von 80%, einem PMT
von 80% und einem Auflösungsgrad
von 10 μm
gemessen.
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(3-4) Formbewertung
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Die
Form eines Spots, der die auf das Glas fixierte DNA-Sonde enthielt,
wurde mithilfe eines Stereomikroskops einer Sichtprüfung unterzogen
und die Häufigkeit
des Auftretens von Satelliten ermittelt. Auf Grundlage des Fluoreszenzbilds
wurde jeder Satellit, der nicht visuell identifiziert werden konnte,
nach der Hybridisierung identifiziert und die Häufigkeit des Auftretens von
Satelliten ermittelt.
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(3-5) Ergebnisse
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 4 angeführt. Wie aus Tabelle 4 hervorgeht,
zeigt der unter Verwendung der Sondenlösungszusammensetzung, die eine
wässrige
Lösung
eines Sialinsäureanalogs
enthielt, hergestellte DNA-Chip eine signifikant niedrigere Häufigkeit
des Auftretens von Satelliten mit mangelhafter Form, was auf die
Fähigkeit
hinweist, verglichen mit dem DNA-Chip unter Verwendung einer Sondenlösungs zusammensetzung,
die reines Wasser enthält,
eine zufrieden stellende Spotform bereitstellen zu können. Tabelle
4
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Beispiel 3
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(1) Herstellung von Flüssigkeitszusammensetzungen
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Lyophilisiertes
Natrium- (Na-) Sialat und Carboxylmethylcellulose (CMC) wurden in
den in Tabelle 5 angeführten
Bestandteilen gelöst
und der pH eingestellt, um eine Natriumsialatlösung mit einer Endkonzentration
im Bereich von 6 bis 42% und eine CMC-Lösung im Ausmaß von 2%
herzustellen. Tabelle
5
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Andererseits
wurden die von Hefe (Saccharomyces cerevisiae) stammenden DNAs (Y1-10B
und Y53-1A) gereinigt und jeweils in 120 μl TE-Puffer gelöst, um jeweilige
DNA-Lösungen
herzustellen. Die mittels Absorptionsphotometrie gemessene DNA-Konzentration dieser
Lösungen
betrug 3,2 μg/ml.
-
Die
DNA-Lösung
(20 μl),
die Natriumsialatlösung
mit der jeweiligen Konzentration (20 μl) und reines Wasser (20 μl) wurden
vermischt, um eine Flüssigkeitszusammensetzung
(DNA/Natriumsialatlösung)
herzustellen, in der die jeweilige Natriumsialatkonzentration 2,
7, 10 oder 14 betrug. Eine Flüssigkeitszusammensetzung,
in der die CMC-Konzentration 0,5% (DNA/CMC-Lösung) betrug, wurde ebenfalls
hergestellt.
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(2) DNA-Chip-Herstellung
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Jede
oben in Schritt (1) beschriebene hergestellte Flüssigkeitszusammensetzung wurde
in eine mit einer Tintenstrahldüse
(beispielsweise die in der JP-A-2001-186881 beschriebene Vorrichtung) ausgestattete Mikropipette
gefüllt
und 200 pl davon auf einen mit Poly-L-lysin beschichteten Objektträger gespottet.
Anschließend
wurde zu jedem gespotteten Bereich der Hälfte der Objektträger (3 Objektträger) auf
jede der jeweils gespotteten Flüssigkeitszusammensetzung
Wasser zugesetzt, was anschließend
bei etwa 80 °C
1 Stunde lang gesintert wurde, um Fixierung zu bewirken, wodurch
DNA-Chips mit darauf fixierten DNA-Sonden erhalten wurden. Die andere
Hälfte
der Objektträger
(3 Objektträger)
wurden ohne Zugabe von Wasser gesintert und fixiert, wodurch DNA-Chips
erhalten wurden (Tabelle 6 und 7).
Tabelle
7
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(3) Messung
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(3-1) Herstellung markierter cDNA
-
Als
Probe für
5 DNA-Chips wurden 5 μl
einer Hefe-mRNA, 1 μl
mit DEPC behandeltes Wasser und 1 μl eines Oligo-Primers vermischt
und 5 min auf 70 °C
sowie 3 min auf 42 °C
erhitzt. Dazu wurden 4 μl
5 × Reaktionspuffer,
2 μl dNTP-Gemisch,
2 μl 100
mM DTT, 2 μl
1 mM FluoroLink dUTP und 2,5 μl
an 40 Einheiten RNase-Inhibitor eingemischt. Dazu wurde 1 μl SuperScript
II zugesetzt und das Gemisch 40 min auf 42 °C erhitzt und anschließend weitere
0,5 μl SuperScript
II zugesetzt und 40 min auf 42 °C
erhitzt, 20 μl
sterilisiertes Wasser, 5 μl
0,5 M EDTA und 10 μl
1 N NaOH zugesetzt und dann 60 min auf 65°C erhitzt. Das Gemisch wurde mit
25 μl Tris
(1 M, pH 7,5) neutralisiert, durch 5-minütiges Zentrifugieren bei 8.000
U/min unter Verwendung von Microcon 30 filtriert, mit 250 μl sterilisiertem
Wasser versetzt, zweimal einer 10-minütigen Zentrifugation bei 8.000
U/min unterzogen, gefolgt von einer 45-sekündigen Zentrifugation bei 3.000
U/min, wodurch markierte cDNA erhalten wurde.
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(3-2) Hybridisierung
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Zuerst
wurden 24,5 μl
markierte cDNA, 8,75 μl
20 × SSC
und 1,75 μl
10% SDS vermischt und das Gemisch anschließend 3 min auf 95 °C erhitzt,
15 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und zweimal in einem Volumen
von jeweils 17,5 μl
pro DNA-Chip gespottet.
Der Chip wurde vorsichtig mit einem Deckglas bedeckt, während jegliche
Restluftblasen vermieden wurden, und es folgte eine 16-stündige Inkubation
bei 65 °C
in feuchter Umgebung.
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Anschließend wurde
das Deckglas in 2 × SSC-0,1%
SDS sanft abgenommen und der Chip zweimal mit 2 × SSC-0,1% SDS gewaschen, zweimal
mit 2 × SSC-0,1%
SDS gewaschen, auf 55 °C
erhitzt, mit 0,2 × SSC-0,1%
SDS, 0,2 × SSC
und 0,05 × SSC
gespült,
zentrifugiert und getrocknet.
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(3-3) Formbewertung auf Grundlage von
Fluorimetrie
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Der
DNA-Chip wurde nach der Hybridisierung in einem Abtastfeld (BM KIKI
Scanner) platziert und bei einer Laserleistung von 80%, einem PMT
von 80% und einem Auflösungsgrad
von 10 μm
gemessen. Anschließend
wurde die Anzahl jener Spots ermittelt, die jeweils über eine
Form verfügten,
die keine einheitliche Helligkeit innerhalb des Spots aufwiesen
und eine veränderliche
Fluoreszenzintensität
ergaben.
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(3-4) Ergebnisse
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 8 angeführt. Wenn herkömmliche
CMC ohne Wasserzugabe verwendet wurde, betrugt die Wahrscheinlichkeit
des Auftretens von mangelhaften Spots 100%. Im Gegensatz dazu stellte
sich beim DNA-Chip, der unter Verwendung der Sondenlösungszusammensetzung,
die Natriumsialat enthielt, hergestellt wurde heraus, dass er in
der Lage ist, die Bildung von mangelhaften Spots bei einer Konzentration
von 2 bis 14% sogar ohne Wasserzugabe nahezu vollständig zu
verhindern.
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Beispiel 4
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(1) Herstellung von Flüssigkeitszusammensetzungen
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Eine
Lösung
von 20 × SSC
wurde hergestellt, mit der 3 M Natriumchlorid und 0,3 M Natriumcitrat
vermischt und auf einen pH von 7,0 eingestellt wurden. Anschließend wurde
Sialinsäure
in Wasser gelöst,
um eine 10%ige Sialinsäurelösung herzustellen.
Lyophilisierte Oligo-DNA (Basenlänge
50) wurde in gereinigten Wasser mit 100 pmol/μl (1,65 μg/μl) gelöst. Jede dieser Lösungen wurde
im Verhältnis
DNA-Lösung:50
pmol/μl,
1 × SSC
(0,3 M Natriumchlorid und 0,03 M Natriumcitrat) und Sialinsäurelösung:1%
vermischt, wodurch eine Flüssigkeitszusammensetzung
(DNA/SSC/Sialinsäurelösung) erhalten
wurde. Als Kontrolle wurde auch eine Sialinsäure-freie Flüssigkeitszusammensetzung
(DNA/SSC) hergestellt.
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(2) DNA-Chip-Herstellung
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Jede
oben in Schritt (1) beschriebene hergestellte Flüssigkeitszusammensetzung (DNA/SSC/Sialinsäurelösung) wurde
in eine mit einer Tintenstrahldüse
(beispielswiese die in der JP-A-2001-186881 beschriebene Vorrichtung)
ausgestattete Mikropipette gefüllt
und 200 pl davon auf einen mit Epoxysilan beschichteten Objektträger gespottet.
Anschließend
wurde der Objektträger
8 Stunden lang in einem Inkubator bei 42 °C unter 50% Feuchtigkeit umgesetzt,
um kovalent Bindung zu bewirken, gefolgt vom Fixieren, um einen
DNA-Chip mit einer darauf fixierten Oligonucleotid-DNA-Sonde zu
erhalten. Die Kontrollflüssigkeitszusammensetzung wurde ähnlich angewandt,
um einen DNA-Chip herzustellen.
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(3) Messung
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(3-1) Herstellung markierter c-DNA
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5 μl einer Ratten-mRNA
(Clontech, 5 μg/μl), 1 μl mit DEPC
behandeltes Wasser und 1 μl
eines Oligo- (dt-) Primers wurden vermischt und 5 min auf 70 °C sowie 3
min auf 42 °C
erhitzt. Dazu wurden 4 μl
5 × Reaktionspuffer,
2 μl dNTP-Gemisch,
2 μl 100
mM DTT, 2 μl
1 mM FluoroLink dUTP und 2,5 μl
an 40 Einheiten RNase-Inhibitor eingemischt. Dazu wurde 1 μl reverse
Transferase (SuperScript II) zugesetzt und das Gemisch 40 min auf
42 °C erhitzt
und anschließend
weiters 1 μl
SuperScript II zugesetzt und 40 min auf 42 °C erhitzt, 20 μl sterilisiertes
Wasser, 5 μl
0,5 M EDTA (pH 8) und 25 μl
1 N Tris HCl (pH 7,5) zugesetzt, um Neutralisation zu bewirken,
gefolgt von einer Reinigung über
eine QIAGENTM-Säule, wonach die markierte cDNA unter
Einsatz von reinem Wasser erhalten wurde.
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(3-2) Hybridisierung
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Zuerst
wurden 11,25 μl
markierte cDNA, 8 μl
20 × SSC
und 0,7 μl
10% SDS vermischt und das Gemisch anschließend 3 min auf 95 °C erhitzt,
5 min bei Raumtemperatur stehen gelassen und zweimal in einem Volumen
von jeweils 15 μl
pro DNA-Chip gespottet,
vorsichtig mit einem (24 × 32
mm großen)
Deckglas bedeckt und 16 Stunden lang bei 65 °C in feuchter Umgebung inkubiert.
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Anschließend wurde
das Deckglas beim Eintauchen des DNA-Chips in 2 × SSC-0,1 SDS sanft abgenommen
und der Chip zweimal 5 min in 2 × SSC-0,1% SDS stehen gelassen,
mit 1 × SSC
gewaschen, mit 0,5 × SSC
gewaschen, 2 min lang bei 900 U/min zentrifugiert und getrocknet.
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(3-3) Fluorimetrie
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Der
DNA-Chip wurde nach der Hybridisierung in einem Abtastfeld (BM KIKI
Scanner) platziert und bei einer Laserleistung von 70%, einem PMT
von 60% und einem Auflösungsgrad
von 5 μm
gemessen.
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(3-4) Ergebnisse
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Die
Ergebnisse sind in
9 angeführt. Im
Gegensatz zum DNA-Chip, der unter Verwendung einer herkömmlichen
Sondenlösungszusammensetzung
(DNA/SSC) hergestellt wurde, zeigt der mit der erfinderischen Sondenlösungszusammensetzung
(DNA/SSC/Sialinsäurelösung) hergestellte
DNA-Chip eine höhere Signalintensität für jede der
gemessen genetischen cDNAs. Tabelle
9
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VERSUCH
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Es
wurde der bevorzugte Bereich für
die Konzentration einer Sondenlösungszusammensetzung überprüft.
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(1) Verfahren
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Ähnlich wie
in Beispiel 4, mit Ausnahme der Änderung
der Salzkonzentration für
den SSC-Puffer, wurde eine Lösungszusammensetzung
(DNA/SSC/Sialinsäurelösung) hergestellt
und verwendet, um einen DNA-Chip herzustellen. Auch ähnlich wie
in Beispiel 4 wurde eine markierte cDNA hergestellt, hybridisiert
und Fluorimetrie unterzogen.
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Die
Ergebnisse der Detektion von myokardialem cDNA-Actin sind in Tabelle
10 angeführt.
Wie aus diesen Ergebnissen hervorgeht, kann eine hohe Signalintensität erhalten
werden, indem zumindest 10
–3 mol/l, vorzugsweise
10
–2 bis
1 mol/l, enthalten sind. Tabelle
10
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Gewerbliche Anwendbarkeit
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Wie
oben beschrieben, stellt die Erfindung eine neue Sondenlösungszusammensetzung
bereit, die zur Fixierung einer Sonde verwendet wird, die zur spezifischen
Bindung an eine Zielsubstanz in der Lage ist, indem die Sonde auf
ein Substrat gespottet wird. Daraus ergibt sich eine erhöhte Detektionsempfindlichkeit
eines reaktiven Chips, eine höhere
Spotdichte, und es kann ein vereinfachtes Herstellungsverfahren
erhalten werden, wodurch ein sehr genauer reaktiver Chip zu geringen
Kosten in großen
Mengen bereitgestellt werden kann.
