JP4999007B2 - 抗原抗体反応を利用した標的物質検出用チップ - Google Patents
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Description
抗原抗体反応により標的物質を検出するためのチップであって、
該チップは標的物質の検出が認識される判定領域を1又は2以上有し、
それぞれの判定領域が、標的物質と抗原抗体反応を起こす検出用タンパク質を固定化した固定化領域を独立して2以上備える、
標的物質検出用チップ。
項2.
一の固定化領域と、これに隣接する固定化領域とが、少なくとも1〜500μmの間隔で隔てられている、項1に記載の標的物質検出用チップ。
項3.
1つの判定領域が有する固定化領域の数が、4〜2000である、項1〜2のいずれかに記載の標的物質検出用チップ。
項4.
判定領域を1〜100000個有する、項1〜3のいずれかに記載の標的物質検出用チップ。
項5.
検出用タンパク質が溶解した溶液をインクジェット方式により吐出することにより、該検出用タンパク質が固定化領域に固定化される、項1〜4のいずれかに記載の標的物質検出用チップ。
項6.
1つの固定化領域に吐出される液量が、0.1〜1000pl(ピコリットル)である、項5に記載の標的物質検出用チップ。
項7.
検体に含まれる標的物質を検出する方法であって、
請求項1〜6のいずれかに記載の標的物質検出用チップの判定領域に検体を接触させ、該判定領域内の検出用タンパク質と検体中の標的物質とを結合させる第一工程、
検出用タンパク質と結合した標的物質を検出する第二工程
を含む、標的物質検出方法。
項8.
項1〜6のいずれかに記載の標的物質検出用チップを備える、標的物質検出用キット。
本発明は、抗原抗体反応により標的物質を検出するためのチップであって、該チップは標的物質の検出が認識される判定領域を1又は2以上有し、それぞれの判定領域が、標的物質と抗原抗体反応を起こす検出用タンパク質を固定化した固定化領域を独立して2以上備える、標的物質検出用チップに係るものである。
本発明は、本発明のチップを用いて、特定の標的物質を検出する方法も提供する。
検体に含まれる標的物質を検出する方法であって、
前述する標的物質検出用チップの判定領域に検体を接触させ、該判定領域内の検出用タンパク質と検体中の標的物質とを結合させる第一工程、
検出用タンパク質と結合した標的物質を検出する第二工程
を含む、標的物質検出方法
にかかるものである。
また、本発明のチップをその一部として備える、抗原抗体反応検出用キットも、本発明の範囲内である。このようなキットとしては、本発明のチップの他、抗原抗体反応検出実験に用いられる各種試薬を備えたものが好ましい。例えば、検出用タンパク質が抗原である場合は、緩衝液、洗浄液の他、標的物質である各動物種の抗体を特異的に認識する標識物(例えば標識化二次抗体)、及び必要であれば該標識物の標識を検出するために必要な試薬等を備えるものである。また、検出用タンパク質が抗体である場合は、緩衝液、洗浄液の他、標的物質である抗原を認識する標識物(例えば標識化二次抗体)、及び必要であれば該標識物の標識を検出するために必要な試薬等を備えるものである。
COC樹脂基板(住友ベークライト(株)社製:BS−X2309)を購入し、判定領域とする部分に対し、濃度0.1mg/mlのPICP抗体(製品名: Anti-Human Procollagen Type I C-peptide (PIP),Monoclonal (Clone PC8-7); タカラバイオ(株)社製)を含む固相液(住友ベークライト(株)社製)溶液を、インクジェット方式[ヘッド部分(クラスターテクノロジー(株)社製パルスインジェクター)、駆動回路部分(WaveBuilderTM]を用いて吐出した。その際、比較のため、基板とインクジェットノズルの相対位置を固定して同一箇所に400滴の抗体溶液を吐出させ(以下、同一箇所に吐出する方式を「1点集中方式」ということがある)、判定領域としたものと、10行10列の計100点にそれぞれ4滴ずつ吐出させ(以下、複数ヶ所に分けて吐出する方式を「ドット配列方式」ということがある)、判定領域(近接するドット(固定化領域)間で、それらの中心点同士の距離は約150μm)としたもの両方を形成した(図1a:本発明に係るチップの作製に用いられるのは「ドット配列方式」である)。両者の総液滴数は共に400滴で同一であり、総液量は約11nl(ナノリットル)である(すなわち、1滴は約28pl(ピコリットル)である)。
市販のPICP ELISAキット(製品名:PIP(Procollagen typeI C-peptide)EIA Kit(Precoated);タカラバイオ(株)社製;製品コードMK101)のプロトコールに従い、濃度640ng/ml のPICP抗原(製品名: ヒト培養細胞由来プロコラーゲン; タカラバイオ(株)社製)を、標識抗体(製品名: ペルオキシダーゼ標識抗 PIP モノクローナル抗体; タカラバイオ(株)社製)にて6倍希釈した溶液を検体液とした。この溶液に実施例1で作製したチップを浸し、室温にて1時間振とうさせた後、洗浄液にて5分間、5回振とう洗浄し、未反応抗原を取り除いた。検出は、PIERCE社のSuperSignal West Dura Extended Draton Substrateを用い、ペルオキシダーゼ活性により生じた化学発光を、ATTO社Light-Capture AE-6971のCCDカメラにて検出した.また、得られた化学発光シグナル強度を、ATTO CS Analyzer software ver2.0を用いて定量化した。
チップ作製のため、実施例1と同一の固相基板(表面処理有り)を用意し、固相液(住友ベークライト(株)社製)にて濃度0.1mg/mlに希釈したPICP抗体(製品名: Anti-Human Procollagen Type I C-peptide (PIP), Monoclonal (Clone PC8-7); タカラバイオ(株)社製)溶液を1点集中方式により吐出し、固定化した。このとき、1カ所に200滴吐出した判定領域と、1カ所に100滴吐出した判定領域をそれぞれ複数作製した(図3a)。なお、吐出した1滴の液量は約65plである。固定化後、実施例1と同様にしてブロッキング処理を行った。
チップ作製のため、実施例1と同一の固相基板(表面処理有り)を用意し、2滴ずつ100カ所に吐出するドット配列方式により、濃度0.1mg/mlのPICP抗体を含む固相液(住友ベークライト(株)社製)溶液を吐出し、固定した(近接するドット(固定化領域)間で、それらの中心点同士の距離は約150μm)(図4a)。なお、1滴の液量は約65plとした。固定化後、実施例1と同様にしてブロッキング処理を行った。
PMMAとCOCの2種類の樹脂製基板(PMMA:日東樹脂工業(株) CLAREX、COC:住友ベークライト(株)、ともに表面処理なし)に対して、ArFエキシマレーザの照射による、抗体の基板への付着性向上の検討を行った。なお、PMMAは400mm×550mmで市販されているアクリル板をチップサイズに切断して使用した。レーザー照射は、波長193nm、フルーエンス50J/cm2、パルス幅20ns、周波数1Hzの条件でおこなった。
12 ドット配列方式により作製した判定領域
13 固定化領域
21 チップ
22 DAKOペンで描いた枠
Claims (8)
- 抗原抗体反応により標的物質を検出するためのチップであって、
該チップは標的物質の検出が認識される判定領域を1又は2以上有し、
それぞれの判定領域が、標的物質と抗原抗体反応を起こす検出用タンパク質を固定化した固定化領域を独立して2以上備え、
一の固定化領域と、これに隣接する固定化領域とが、1〜500μmの間隔で隔てられ、
1つの固定化領域の面積が0.0001〜0.1mm 2 である、
標的物質検出用チップ。 - 1つの判定領域が有する固定化領域の数が、4〜2000である、請求項1に記載の標的物質検出用チップ。
- 判定領域の面積が0.01〜100mm 2 である、請求項1又は2に記載の標的物質検出用チップ。
- 判定領域を1〜100000個有する、請求項1〜3のいずれかに記載の標的物質検出用チップ。
- 検出用タンパク質が溶解した溶液をインクジェット方式により吐出することにより、該検出用タンパク質が固定化領域に固定化される、請求項1〜4のいずれかに記載の標的物質検出用チップ。
- 1つの固定化領域に吐出される液量が、0.1〜1000pl(ピコリットル)である、請求項5に記載の標的物質検出用チップ。
- 検体に含まれる標的物質を検出する方法であって、
請求項1〜6のいずれかに記載の標的物質検出用チップの判定領域に検体を接触させ、該判定領域内の検出用タンパク質と検体中の標的物質とを結合させる第一工程、
検出用タンパク質と結合した標的物質を検出する第二工程
を含む、標的物質検出方法。 - 請求項1〜6のいずれかに記載の標的物質検出用チップを備える、標的物質検出用キット。
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