KR20010101092A - 운반체상에 ｄｎａ를 고정화시키는 방법 - Google Patents

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오미야 히사시
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Abstract

모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 그의 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 하나 이상의 성분을 포함하는 완충액중에서 DNA를 운반체와 접촉시키는 것을 특징으로하는, 운반체상에 DNA를 고정화하는 방법.

Description

운반체상에 ＤＮＡ를 고정화시키는 방법{Method for immobilizing DNA on a carrier}
인간을 포함한 유기체의 게놈 분석을 위한 프로젝트가 발전하면서, 다양한 유기체의 게놈 구조가 점차 밝혀지고 있다. 이와 함께, 약제의 발달 또는 건강 유지 또는 증진을 위해 게놈에 대한 광범위한 정보를 이용하기 위해 게놈의 기능을 분석하는 기술이 발전되어 왔다. DNA 칩 기술이 이 목적을 위한 주목할 만한 주된 기술 중 하나이다. DNA 칩은 다수의 다양한 유전자 또는 DNA 단편이 슬라이드 글라스와 같은 고체 지지체상에 어레이되고 고정화된 마이크로어레이(DNA 어레이)이다. DNA 칩은 유전자의 발현, 돌연 변이 또는 다형성(polymorphism)의 분석을 고도로 가속화시키는 방법으로서 매우 유용하다.
DNA 칩을 제조하기 위해 지지체상에 DNA를 고정화시키는 것이 필요하다. DNA를 고정화시키는 공지된 방법은 일반적으로 하기와 같이 두 그룹으로 분류된다.
한 그룹은 예를 들면, [Science, 251:767-773(1991) 및 Nucleic AcidsResearch, 20:1679-1684(1992)]에 기재된 바와 같이, DNA를 지지체에 공유 결합된 링커(linker)의 팁상에서 화학적으로 합성하는 방법이다. 그러한 방법은 합성될 수 있고 그의 서열이 공지된 DNA(올리고뉴클레오타이드)를 고정화시키는데 사용될 수 있다. 이 방법의 각 단계에서 수득률은 통상의 고체상(solid phase) 합성의 것보다 낮다고 언급되어 있다. 또한, 상기 방법은 반응 부위를 완전하게 실링(sealing)하기 위한 마이크로 장치를 필요로 한다.
나머지 한 그룹은 예를 들면, [Science, 270:467-470(1995) 및 Nucleic Acids Research, 22:5456-5465(1994)]에 기재된 바와 같이, 미리 합성된 DNA 또는 중합효소연쇄반응(PCR)에 의해 제조된 DNA(PCR 증폭 생성물)를 지지체에 공유 또는 비공유(또는 정전기적으로) 결합시키는 방법이다. 그러한 방법에 따라 누구나 어느 DNAs도 고정화시킬 수 있을 것으로 간주된다. 그러나, 예를 들면, 비공유결합인 경우, 합성 DNA와 같은 단쇄 DNA(올리고뉴클레오타이드)를 고정화시키는 것은 어렵다. PCR 생성물과 같은 장쇄 DNA가 비공유결합으로 지지체상에 고정화되는 경우, DNA를 일반적으로 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC), 트리스-하이드로클로라이드 /EDTA(TE) 또는 인산 완충처리된 염수(PBS)와 같은 염 용액중에 용해된 DNA를 변성시킨 후, 폴리리신 또는 폴리에틸렌이민과 같은 다원 양이온(polycation)으로 코팅된 슬라이드 글라스(지지체)상에 그를 점적(spotting)시켜 고정화시킨다. 이 경우, 세척 또는 표적 핵산과의 혼성화의 연속된 단계동안 상당량의 DNA가 지지체로부터 분리된다고 공지되어 있다. 이 현상이 표적 핵산의 검출 감도를 감소시키는 요인이다.
지지체로의 고정화 효율을 증가시키기 위해, 미리 DNA를 열 또는 알칼리 변성시키는 것이 필요하다. 변성이 없는 경우, 고정화 효율은 현저하게 감소된다는 것이 공지되어 있다. 또한, 다수의 DNA 용액을 DNA 칩 제조용 기기(어레이어)를 사용하여 슬라이드 글라스상에 고정화시키는 경우, 변성 단계는 전체 단계를 종결시켜 공정 과정이 자동화되는 것을 어렵게 한다.
고정화되는 DNA의 절대량은 지지체상에 점적되는 용액중의 DNA의 농도를 증가시킴으로써 증가된다. 그러나, 결과적으로 지지체의 고정화율은 증가하고 사용되는 DNA의 손실은 증가한다.
DNA 칩 제조용 기기(어레이어)를 사용하는 경우, DNA 어레이 제조를 위해 점적되는 DNA 용액의 부피는 1 나노리터이하 일 수 있다. 따라서, 특정 DNA 용액은 지지체 표면상에 확산되기 앞서 건조될 수 있고, 결과적으로 이종(heterogenous)의 도트들을 형성한다.
또한, 공유 결합인 경우, 적절한 작용 그룹(functional group)을 미리 DNA내로 도입시키는 것이 필요하다. 도입 방법은 복잡하다.
표적 핵산을 DNA 칩 등을 사용하여 검출하는 경우, 검출 감도는 단위 면적(또는 하나의 도트)중에 고정화된 DNA의 양에 따라 달라진다. 따라서, 하나의 도트중에 고정화되는 DNA의 양을 증가시키는 방법, 다시 말해, 고정화되는 DNA의 밀도를 증가시키는 방법이 매우 중요한 문제가 되어왔다. 또한, DNA 용액을 균일하게 확산시키면서 점적하는 방법 또한 매우 중요시 되어 왔다.
발명의 목적
본 발명의 목적은 (1)고체 지지체상에 DNA를 고정화시키는 유효한 방법,(2)상기 방법에 따라 제조되는, DNA가 그 위에 고정화된 물질, 및 (3)상기 물질을 사용하는 표적 핵산의 검출 방법을 제공한다.
발명의 요약
본 발명자는 집중적으로 연구하여 DNA를 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 포함하는 완충액중에 용해시킨 후, 지지체상에 점적함으로써 도트 면적 또는 단위 면적내 고정화되는 DNA의 양이 크게 증가된다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 또한 완충액중에 계면 활성제를 가함으로써 DNA 용액이 지지체상의 표면상에 균일하게 확산되도록 하면서 지지체상에 점적할 수 있다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 또한 고정화 기술 사용에 의한 DNA 고정화율 증가 및 단위 면적내의 DNA 고정화 밀도 증가의 결과로 엄격한 조건하에서 혼성화에 의한 표적 핵산의 검출 감도가 증가한다는 것을 발견하였다. 본 발명자는 이들 기술을 결합하여 표적 핵산을 검출하는 우수한 방법을 구성하였다. 따라서, 본 발명은 완성되었다.
따라서, 본 발명은 하기의 것들을 제공한다:
(1) 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 포함하는 완충액중에서 DNA를 지지체와 접촉시키는 것을 포함하는, DNA를 지지체상에 고정화시키는 방법;
(2) 상기 (1)에 있어서, 모르폴린 유도체가 C1-3알킬 그룹으로 치환된 N-알킬모르폴린인 방법;
(3) 상기 (1)에 있어서, 모르폴린 또는 모르폴린 유도체의 염이 광산(mineral acid)과의 염, 유기산과의 염 및 지방산과읨 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 염인 방법;
(4) 상기 (1)에 있어서, 탄산염이 나트륨염 , 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염 및 트리에틸아민염으로부터 선택되는 염인 방법;
(5) 상기 (1)에 있어서, 완충액이 모르폴린, 모르폴린 유도체 및 그의 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 적어도 하나의 탄산염과 함께 포함하는 방법;
(6) 상기 (1) 내지 (5)중 어느 한 항에 있어서, 완충액의 pH가 7 내지 11인 방법;
(7) 상기 (1) 내지 (6)중 어느 한 항에 있어서, 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질의 완충액중의 농도가 10 내지 500 mM인 방법;
(8) 상기 (1) 내지 (7)중 어느 한 항에 있어서, DNA가 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 유도체인 방법;
(9) 상기 (1) 내지 (8)중 어느 한 항에 있어서, 완충액중의 DNA의 농도가 0.1 내지 2.0mg/㎖인 방법;
(10) 상기 (1) 내지 (9)중 어느 한 항에 있어서, 완충액이 추가로 적어도 하나의 염을 포함하는 방법;
(11) 상기 (1) 내지 (10)중 어느 한 항에 있어서, 완충액이 추가로 적어도 하나의 계면 활성제를 포함하는 방법;
(12) 상기 (1) 내지 (11)중 어느 한 항에 있어서, 지지체가 글라스 또는 석영으로부터 제조되거나, 글라스 또는 석영의 표면을 처리하여 제조된 물질인 방법;
(13) 상기 (12)에 있어서, 표면을 실란 커플링제 또는 다원 양이온으로 처리하는 방법;
(14) 상기 (1) 내지 (13)중 어느 한 항에 있어서, DNA를 변성화하지 않고 고정화시키는 방법;
(15) 상기 (14)에 있어서, DNA가 더블 스트랜드 DNA인 방법;
(16) 적어도 하나의 계면 활성제를 포함하는 완충제중에서 DNA를 지지체와 접촉시키는 것을 포함하는, DNA를 지지체상에 고정화시키는 방법;
(17) 상기 (16)에 있어서, 계면 활성제가 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및 양쪽성 계면 활성제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법;
(18) 상기 (17)에 있어서, 계면 활성제가 수크로오스 모노카프레이트, 수크로오스 모노라우레이트 및 디기토닌(digitonin)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법;
(19) 상기 (16) 내지 (18)중 어느 한 항에 있어서, 완충액이 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 포함하는 방법;
(20)상기 (19)에 있어서, 완충액의 pH가 7 내지 11인 방법;
(21) 상기 (19) 또는 (20)에 있어서, 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질의 완충액중의 농도가 10 내지 500 mM인 방법;
(22) 상기 (16) 내지 (21)중 어느 한 항에 있어서, DNA가 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 유도체인 방법;
(23) 상기 (16) 내지 (22)중 어느 한 항에 있어서, 완충액중의 DNA의 농도가 0.1 내지 2.0mg/㎖인 방법;
(24) 상기 (15) 내지 (23)중 어느 한 항에 있어서, 완충액이 추가로 적어도 하나의 염을 포함하는 방법;
(25) 상기 (16) 내지 (24)중 어느 한 항에 있어서, 지지체가 글라스 또는 석영으로부터 제조되거나, 글라스 또는 석영의 표면을 처리하여 제조된 물질인 방법;
(26) 상기 (25)에 있어서, 표면을 실란 커플링제 또는 다원 양이온으로 처리한 방법;
(27) 상기 (16) 내지 (26)중 어느 한 항에 있어서, DNA를 변성화하지 않고 고정화시키는 방법;
(28) 상기 (27)에 있어서, DNA가 더블 스트랜드 DNA인 방법;
(29) 상기 (1) 내지 (28)중 어느 하나에 정의된 방법에 따라 제조되는, DNA가 그위에 고정화된 물질;
(30) (29)에 있어서, DNA가 더블 스트랜드 DNA인 물질;
(31) 상기 (29) 또는 (30)에 정의된, DNA가 그 위에 고정화된 물질을 사용하여 표적 핵산을 검출하는 것을 포함하는 표적 핵산의 검출 방법;
(32) 상기 (31)에 있어서, DNA가 그 위에 고정화된 물질을 엄격한 조건하에서 표적 핵산과 혼성화시키는 것을 포함하는 방법;
(33) 상기 (32)에 있어서, 고정화된 DNA를 변성시키지 않고 엄격한 조건하에서 물질상에 고정화된 DNA를 표적 핵산과 혼성화시키는 방법;
(34) 엄격한 조건하에서 고정화된 DNA를 변성시키지 않고 표적 핵산과 혼성화하는데 사용될 수 있는, 더블 스트랜드 DNA 가 지지체상에 고정화되어 있는 물질;
(35) 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 포함하는, DNA를 고정화시키기 위한 완충액;
(36) 적어도 하나의 계면 활성제를 포함하는, DNA를 고정화시키기 위한 완충액;
(37) 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질 및 적어도 하나의 계면 활성제를 포함하는, DNA를 고정화시키기 위한 완충액.
도면의 간단한 설명
도 1은 계면 활성제의 첨가의 점적에 대한 효과를 나타낸 도이다.
도 2는 계면 활성제의 첨가의 점적에 대한 효과를 나타낸 도이다.
본 발명은 DNA 칩 등의 제조에 유용한 DNA를 고체 지지체상에 고정화시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 방법에 따라 DNA가 그 위에 고정화된 물질 및 상기 물질을 사용하는 표적 핵산의 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염(이하, 간단하게 필수 완충액 성분으로 언급한다)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 포함하는 완충액은 생화학 연구에 통상 사용되는 예를 들면, 필수 완충액 성분을 포함하는 완충액일 수 있다.
필수 완충액 성분으로서 모르폴린, 모르폴린 유도체 및 그의 염의 예로는, 제한하는 것은 아니지만, 모르폴린, C1-3알킬 그룹으로 치환된 N-알킬모르폴린(예: N-메틸모르폴린, N-에틸모르폴린 또는 N-프로필모르폴린), 및 광산(예: 염산 또는 탄산), 유기산(예: 아세트산, 락트산 또는 시트르산) 또는 지방산(예: 라우르산 또는 스테아르산)과의 그의 염을 포함한다.
필수 완충액 성분으로서 탄산염은, 제한하는 것은 아니지만, 알칼리 금속, 알칼리토 금속, 암모늄 또는 유기 아민과의 탄산 염. 예로서 탄산나트륨, 탄산수소나트륨, 칼륨나트륨, 탄산수소칼륨, 탄산마그네슘, 탄산수소마그네슘 또는 트리에틸아민 탄산염을 포함한다.
그러한 필수 완충액 성분은 단독, 또는 둘 이상의 성분과 함께 사용될 수 있다. 실시예에서, 모르폴린, 모르폴린 유도체 및 그의 염중 어느 하나 및 탄산염들중 어느 하나가 함께 사용된다.
본 발명에서 사용되는 완충액의 pH는 바람직하게 7 내지 10, 더욱 바람직하게 8 내지 10으로 조정된다.
완충액의 염의 농도는 바람직하게 10 내지 500mM, 더욱 바람직하게 50 내지 200mM이다.
본 발명에서, 완충액은 또한 상기 언급된 필수 완충액 성분외에도 염화나트륨과 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 본 발명의 완충액은 하나 이상의 계면 활성제를 포함할 수 있다. 계면 활성제의 추가에 의해 DNA 용액이 지지체의 표면상에 균질하게 확산되도록 조절되는 한, 어느 계면 활성제도 바람직하게 사용될 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명은 적어도 하나의 계면 활성제를 포함하는 완충액중에서 DNA를 지지체와 접촉시키는 것을 포함하는 DNA를 지지체상에 고정화시키는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 계면 활성제는 특정의 것으로 제한되지 않는다. 고정화할 때 계면 활성제의 추가에 의해 지지체의 표면상에 DNA 용액이 균질하게 확산되도록 조절되는 한, 어느 계면 활성제도 바람직하게 사용될 수 있다.
계면 활성제는 그들의 성분에 기초하여, 비이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양쪽성 계면 활성제 등으로 분류된다. 그들이 상기 언급된 활성을 갖는 한, 그들중 어느 것도 본 발명에 사용될 수 있다. 예를 들면, 하기 계면 활성제가 본 발명에서 사용될 수 있다: 비이온성: 노니데트 P-40(Nonidet P-40), 트리톤 X-100(Triton X-100), 트윈-20(Tween-20), n-옥틸-β-D-글루코사이드, n-헵틸-β-D-티오글루코사이드, n-옥틸-β-D-티오글루코사이드, n-도데실-β-D-말토사이드, 수크로오스 모노카프레이트, 수크로오즈 모노라우레이트, 디기토닌, 헵타노일-N-메틸글루크아미드(MEGA-7), 옥타노일-N-메틸글루크아미드(MEGA-8), 노나노일-N-메틸글루크아미드(MEGA-9), 데카노일-N-메틸글루크아미드(MEGA-10), N,N-비스[3-D-글루콘아미도프로필]콜아미드(BIGCHAP) 및 N,N-비스[3-D-글루콘아미도프로필]데옥시콜아미드(데옥시-BIGCHAP). 음이온성: 데옥시콜산, 소듐 콜레이트, 사코실(Sarkosyl) 및 소듐 도데실 설페이트(SDS). 양쪽성: 3-[3-(콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(CHAPS) 및 3-[3-(콜아미도프로필)디메틸암모니오]-2-하이드록시-1-프로판설포네이트(CHAPSO). 특히, 본 발명에서 비이온성 계면 활성제가 바람직하게 사용된다.
계면 활성제는 지지체의 표면상에 DNA 용액이 균질하게 확산되게 하는 범위내의 농도로 사용될 수 있다. 본 발명을 제한하려는 것은 아니지만, 예를 들면, 계면 활성제는 최종 농도 0.001 내지 0.1%로 사용될 수 있다.
고정화에 적절하면, 계면 활성제의 존재에 DNA를 지지체상에 고정화시키기 위해 사용되는 완충액은 특정의 것으로 제한되지 않는다. 예를 들면, 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 포함하는 완충액이 바람직하게 사용된다. 사용될 수 있는 완충액중의 완충액 성분의 유형, 농도, pH 등은 상기 기재된 바와 같다. 이들은 고정화되는 DNA 및 사용되는 지지체에 따라 적절하게 선택될 수 있다.
지지체상에 고정화하기 위한 상기 언급된 계면 활성제를 포함하는 완충액중에 용해된 DNA를 사용하여 고정화시킬 때 DNA 용액은 지지체의 표면상에 균일하게 확산되고, 결과적으로 형성된 도트의 분산은 감소된다. 표적 핵산을 검출하기 위해 상기 기재된 바와 같이 제조된 DNA가 그 위에 고정화된 물질을 사용할 때, 통상의 것보다 더욱 정확한 정량의 데이타를 수득할 수 있다. 계면 활성제를 가하여 지지체 상에 고정화되는 DNA의 양을 증가시킴으로써 고감도로 표적 핵산을 검출할 수 있다.
상기 기재된 성분을 포함하는 DNA를 고정화하기 위한 완충액이 본 발명에 포함된다.
이하 사용되는 바, DNAs는 제한하는 것은 아니지만, 세포 또는 조직으로부터 추출된 폴리뉴클레오타이드, PCR 증폭 생성물과 같이 시험관내에서 효소적으로 합성된 DNA, 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드 및 그의 유도체를 포함한다. DNA는 싱글 스트랜드 또는 더블 스트랜드일 수 있다. 이하 사용되는 바, 올리고뉴클레오타이드는 상대적으로 짧은 DNA를 언급한다. 본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 올리고뉴클레오타이드는 길이 DNA의 6 내지 100 염기를 의미한다. 바람직하게, 길이 DNA의 8 내지 50 염기가 본 발명에서 올리고뉴클레오타이드로 사용된다. 본 명세서에서 폴리뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드보다 긴 DNA를 언급한다.
유도체는 지지체의 표면상에 고정화될 수 있게 변형되는 한 특정의 것으로 제한되지 않는다. 아미노 그룹 또는 티오 그룹과 같은 작용 그룹이 5-말단에 도입된 DNA가 구체화된다.
본 발명에서 지지체상에 고정화되는 DNA는 표적 핵산과 혼성화될 수 있는 한 특정의 것으로 제한되지 않는다. 싱글 스트랜드 및 더블 스트랜드 두가지 모두 바람직하게 사용될 수 있다. 더블 스트랜드가 사용되는 경우, 이것은 적절한 방법에 의해 싱글 스트랜드 DNAs로 변형된 후에 표적 핵산과의 혼성화용으로 사용될 수 있다.
고정화되는 DNA의 농도는 바람직하게 0.05 내지 5.0mg/㎖, 더욱 바람직하게 0.1 내지 2.0mg/㎖이다.
본 발명에서 DNA를 고정화시키기 위해 사용되는 지지체는 실질적으로 불용성 물질로부터 제조되는 한, 특정의 것으로 제한되지 않는다. 상기 물질의 예로는, 종이, 나일론, 셀룰로오스, 니트로셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 유도체, 플라스틱 및 폴리카보네이트, 폴리스티렌 및 폴리프로필렌과 같은 플라스틱 유도체, 자기성 또는 비자기성 물질, 석영 및 글라스를 포함한다. 상기 물질은 다공성, 활면, 중합 또는 비중합성일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 지지체는 상기 물질로부터 제조된 것들로 제한되지 않는다. 표면상에 고정화되는 DNAs를 포함할 수 있는 한, DNA 칩 또는 바이오센서용 캐리(carry)로서 사용될 수 있는 어느 지지체도 사용될 수 있다. 예를 들면, 그의 표면상에 친수성 또는 소수성 작용 그룹, 예로서 하이드록실 그룹, 아민 그룹, 티올 그룹, 알데히드 그룹, 에폭시 그룹, 카르복실 그룹 또는 아실 그룹을 갖는 지지체가 바람직하게 사용될 수 있다. 그러한 작용 그룹은 그 자체 또는 적절한 유도체로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 카르복실 그룹인 경우, N-하이드록시숙신이미드에스테르와 같이 활성화된 에스테르 유도체로서 사용될 수 있다.
지지체는 지지체에 대한 물질의 특성에 따라 그들의 표면상에 작용 그룹을 갖는 것을 포함한다.
지지체의 표면을 처리하여 그의 표면상에 친수성 또는 소수성 작용 그룹을 갖도록 할 수 있는 경우, 지지체의 표면상에 친수성 또는 소수성 작용 그룹을 갖지 않는 지지체를 제한없이 사용할 수 있다.
표면 처리에 의해 제조된 그러한 지지체의 예는 글라스 또는 석영을 아미노알킬실란과 같은 상업적으로 이용가능한 실란 커플링제, 폴리리신 용매 또는 폴리에틸렌이민과 같은 다원 양이온, 또는 아미노알킬실란 및 글루타르알데히드로 처리하여 제조된 것을 포함한다. 상기 기재된 바와 같은 도입된 작용 그룹을 갖는 슬라이드 글라스를 시그마(Sigma)사로부터 상업적으로 이용할 수 있다.
본 발명의 지지체상에 DNA를 고정화시키는 방법은 하기에서 상세히 설명한다.
고정화되는 DNA를 그 자체 또는 알카리 또는 열 변성 후, 상기 언급된 필수 완충액 성분을 포함하는 완충액중에 용해시킨다. 완충액은 임의로 중성 염 및/또는 계면 활성제를 포함할 수 있다.
DNA를 포함하는 일정량의 생성된 완충액을 마이크로피펫, 마이크로디스펜서 또는 DNA 칩 제조용 기구를 사용하여 지지체(예: 슬라이드 글라스)상에 점적한다. DNA가 점적된 지지체를 습윤 인큐베이터내에서 예를 들면, 1시간동안 인큐베이션시킨다. 이어서, DNA를 자외선 조사에 의해 교차결합(crosslink)시킨다. 지지체를0.2% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 수용액중에서 세척한 후 증류수로 세척하고 건조시킨다.
세척 또는 혼성화 단계동안 상기 언급된 고정화 방법에 따라 고정화된 DNA는 통상의 방법에 대한 것보다 다소 덜 분리될 수 있다. 또한, 상기 고정화 방법을 사용하여 도트 면적내 또는 단위 면적내 DNA 고정화율을 증가시킬 수 있다. 즉, 단위 면적내 고정화되는 DNA의 밀도를 증가시킬 수 있다. 따라서, 상기 언급된 방법에 따라 고정화된 DNA를 갖는 지지체를 사용하여 표적 핵산을 검출하는 감도를 통상의 방법과 비교하여 증가시킬 수 있다.
또한, 통상의 방법의 경우 점적에 앞서 필수적인 변성을 포함하는 고정화의 것과 일치하는 효율로 본 발명의 방법에서는 변성하지 않고 고정화를 수행할 수 있다.
지지체로의 DNA 고정화율은 지지체상에 형광 물질(예: 로다민(Rhodamine))로 레이블링된(labelled) DNA를 고정화시키고, 지지체상의 도트로부터 발산되는 형광의 세기를 FMBIO II Multi-View(Takara Shuzo)와 같은 형광 이미지 분석기를 사용하여 측정하여 평가될 수 있다. 고정화율은 하기 식 1에 따라 계산될 수 있다.
식 1 :
고정화율(%) =
고정화된 DNA의 밀도는 예를 들면, 하기와 같이 측정될 수 있다. 형광 물질(예: 로다민)으로 레이블링된 DNA를 고정화시킨다. DNA가 그 위에 고정화된 도트로부터 발산되는 형광 세기를 FMBIO II Multi-View와 같은 형광 이미지 분석기를 사용하여 측정할 수 있다. 사용된 형광-레이블링된 DNA의 양 및 형광 세기에 대하여 작성된 눈금 커브(calibaraiton curve)에 기초하여 도트내 고정화된 DNA의 양을 계산할 수 있다.
단위 면적내 고정화되는 DNA의 양, 즉, 고정화되는 DNA의 밀도는 예를 들면, 형광 이미지 분석기를 사용하여 도트의 면적을 측정하여 평가될 수 있다.
다르게는, 미리 예정된 양의 DNA 용액을 본 발명의 DNA 고정화 방법에 따라 지지체상에 점적하고, 고정화율을 평가한다. 측정된 고정화율 및 점적된 DNA의 양에 기초하여 고정화되는 DNA의 양을 계산할 수 있다. 도트 면적은 예를 들면, 현미경을 사용하여 측정될 수 있다. 또한 고정화된 DNA 및 상기 기재된 바와 같이 측정된 면적에 기초하여 고정화되는 DNA의 밀도를 평가할 수 있다.
상기와 같이 수득된 DNA가 그 위에 고정화된 물질 또한 본 발명에 포함된다.
DNA가 그 위에 고정화된 물질을 사용하는 표적 핵산의 검출 방법 또한 본 발명에 포함된다. 이 방법에서, DNA가 그 위에 고정화된 물질을 엄격한 조건(stringent conditions) 하에서 표적 핵산과 혼성화시킨다.
이하 사용되는 바, 엄격한 조건은 (Molecular cloning, A laboratory manual, 2nd ed., pp. 9.47-9.51(1989, Cold Spring Harbor Laboratory))에 기재된 것을 언급한다. 예를 들면, 조건은 특히, 고정화된 DNA와 혼성화되는 표적 핵산 일부의 염기 서열 길이에 따라 달라질 수 있지만, DNA로서 올리고뉴클레오타이드가 고정화된 물질을 하기와 같은 엄격한 조건하에서 표적 핵산과 혼성화시킨다. 혼성화되는 부분의 길이에 기초하여 Tm값을 계산한다. 높은 이온 강도를 갖는 용액(예: 6 x SSC 또는 6 x SSPE)중에서 20 내지 25℃으로 계산된 Tm값보다 낮은 온도에서 혼성화를 수행한다. 일반적으로, 연속되는 세척 단계에서 세척 완충액의 염 농도를 바꾸면서 12 내지 20℃에 의한 Tm 값보다 낮은 온도에서 세척을 수행하는 것이 바람직하다.
올리고뉴클레오타이드외의 DNA, 즉, 폴리뉴클레오타이드가 고정화된 물질에 대한 엄격한 조건은 (Molecular cloning, A laboratory manual, 2nd ed., pp. 9.52-9.55(1989)에 기재된 것을 언급하고, 제한없이 폴리뉴크레오타이드와 표적 핵산과의 혼성화 및 68℃에서 세척에 의해 구체화된다.
표적 핵산은 특정의 것으로 제한되지 않는다. 예를 들면, 지지체상에 고정화된 DNAs중에서 표적 핵산과 혼성화되는 DNA를 스크린하기 위한 어느 핵산도 표적으로서 사용될 수 있다.
본 발명에 따라, DNA 변성없이 DNA가 그 위에 고정화된 지지체는 변성없이 혼성화를 위해 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 더블-스트랜드 DNA가 지지체상에 고정화되고 고정화된 DNA를 알칼리- 또는 열 변성하지 않고 엄격한 조건하에서 표적 핵산과 혼성화하기 위해 사용될 수 있는 물질을 제공한다.
본 발명을 제한하는 것은 아니지만, 그러한 물질은 예를 들면, 모르폴린 완충액 또는 탄산염 완충액중에 용해된 더블-스트랜드 DNA를 점적하는 방법 등에 따라 제조될 수 있다. 더블-스트랜드 DNAs가 지지체상에 고정화되어 있고 변성없이엄격한 조건하에서 표적 핵산과 혼성화를 사용될 수 있는 모든 물질이 본 발명에 포함된다.
따라서, DNA의 지지체내로의 고정화 내지 물질을 사용한 표적 핵산의 검출로의 일련의 단계는 본 발명의 지지체상에 DNA를 고정화시키는 방법 또는 본 발명의 DNA가 그 위에 고정화된 물질을 사용하여 단순화될 수 있다.
그러한 단계의 단순화로 시간 또는 사용되는 시약과 관련하여 작동 효율이 증가되고 변성에 기인한 지지체로부터의 DNA의 분리가 감소되고 표적 핵산의 검출 감도가 증가한다.
상기 기재된 바, 본 발명의 DNA를 지지체상에 고정화시키기 위한 방법을 사용하여, 지지체상의 단위 면적내 고정화되는 DNA의 양을 증가시킬 수 있고, 고정화 율 또는 고정화된 DNA의 밀도를 증가시킬 수 있다. 지지체상의 단위 면적내 고정화된 DNA의 양을 증가시키고, 고정화율 또는 고정화된 DNA의 밀도를 증가시키는 DNA가 고정화되는 물질은 상기 방법에 따라 제공될 수 있다. 또한, 표적 핵산 검출감도는 언급된 물질을 사용하여 증가될 수 있다.
하기 실시예는 또한 본 발명을 상세히 설명하지만 그의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
DNA용 용매의 PCR 증폭 생성물의 고정화에 대한 효과
(1)형광-레이블링된 PCR 증폭 생성물의 제조
인간 트랜스페린 수용체 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA(GenBank 수탁번호 X01060, 4738bp)를 주형으로 사용하여 PCR에 의해 유전자에 대한 약 1kb의 단편을 증폭시켰다. PCR을 위해 사용된 두개의 프라이머의 염기 서열을 SEQ ID NOS :1 및 2로 나타낸다. SEQ ID : 1의 프라이머를 5'-말단에 로다민 X(PE Biosystems, 이하 ROX로 언급함)로 형광 레이블링한 후 사용하였다.
(2)시험용 완충액의 제조 및 DNA 고정화 방법
하기 조성물을 갖도록 제조된 용액을 주어진 농도로 희석시키고 표 1에 나타낸 바와 같은 다양한 시험용 완충액으로 사용하였다. 20 x SSC : 3M 염화나트륨을 포함하는 0.3M 소듐 시트레이트. TE : 1mM EDTA를 포함하는 10mM 트리스-하이드로클로라이드(pH 8.0). PBS : PBS 정제를 사용하여 제조됨(Takara shuzo). 100mM 시트레이트 완충액: 주어진 값으로 pH를 조정하기 위해 100mM 시트르산 용액을 100mM 소듐 시트레이트 용액과 혼합하여 제조됨. 500mM 탄산염 완충액 : 주어진 값으로 pH를 조정하기 위해 500mM 탄산나트륨 용액과 500mM 탄산수소나트륨을 혼합하여 제조됨. 500mM 모르폴린 완충액 : 500mM N-메틸모르폴린의 pH를 희석된 염산을 사용하여 주어진 값으로 조정하여 제조됨. 50mM 붕산염 완충액 : 50mM 염화칼륨을 포함하는 50mM 붕산 용액의 pH를 2N 수산화나트륨을 사용하여 주어진 값으로 조정하여 제조됨.
형광-레이블링된 PCR 증폭 생성물을 0.7mg/㎖(1μM)의 농도로 각 용액에 용해시켰다. 생성된 용액을 DNA 용액으로서 사용하였다. DNA 용액 각 0.2㎕를 변성 또는 변성없이 아미노알킬실란로 처리된 슬라이드 글라스(Sigma)상에 점적하였다.슬라이드 글라스를 공기 건조시킨 후, 습윤된 인큐베이터내에서 1시간동안 37℃에인큐베이션시켰다.
슬라이드 글라스를 60mJ에서 자외선으로 조사시킨 후, 15분동안 용액중에 적셔 유리 아미노 그룹을 차단하였다. 5g의 숙신 산무수물(Nacalai Tesque)을 315㎖의 N-메틸-2-피리돈(Nacalai Tesque)중에 용해시키고 추가로 35㎖의 0.2M 붕산염 완충액(pH 8)을 그에 가하여 용액을 제조하였다. 최종적으로, 슬라이드 글라스를 2분동안 0.2% SDS 용액중에서 세척한 후 증류수로 세척하고 실온에서 건조시켰다. 슬라이드 글라스를 하기와 같은 엄격한 혼성화 조건에 가하였다. 0.2% SDS를 포함하는 4 x SSC를 슬라이드 글라스상의 점적된 DNAs의 부분상에 점적하였다. 점적을 커버 글라스로 덮어 공기 거품을 포함하지 않도록 하였다. 가장자리를 단단히 밀봉하고 슬라이드 글라스를 2 내지 6시간동안 37 내지 40℃에서 인큐베이션시켰다. 밀봉을 제거한 후, 슬리이드 글라스를 30분동안 0.1% SDS를 포함하는 0.2 x SSC로 세척한 후 30분동안 0.2 x SSC로 세척하고 건조시켰다.
(3)고정화율 측정
고정화 후 즉시 및 혼성 조건하에서의 처리 후 즉시 형광 이미지 분석기 FMBIO II Multi-View를 사용하여 형광 세기를 측정하였다. 각 형광 세기의 값에 기초하여 고정화율을 계산하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.
표 1
DNA용 용매 고정화율(%)
3 x SSC 2.3
1 x SSC 1.7
TE (pH8.0) 5.5
PBS (pH7.6) 4.7
100mM 시트레이트 완충액 (pH4.0) 8.5
100mM 시트레이트 완충액 (pH6.0) 3.9
100mM 글리신 완충액 (pH9.5) 1.8
50mM 탄산염 완충액 (pH9.5) 30.2
50mM 모르폴린 완충액 (pH9.0) 58.6
50mM 붕산염 완충액 (pH9.0) 2.6
표 1에 나타난 바와 같이, DNA를 모르폴린 완충액 또는 탄산염 완충액중에 점적하였을 때 얻은 고정화율이 통상의 용매 SSC, PBS 또는 TE를 사용하여 얻은 것과 비교하여 현저하게 증가하였음이 확인되었다.
실시예 2
모르폴린 완충액 및 탄산염 완충액의 pH 및 완충액 염 농도의 PCR 증폭 생성물의 고정화에 대한 효과
(1)모르폴린 완충액 및 탄산염 완충액의 pH의 PCR 증폭 생성물의 고정화에 대한 효과
모르폴린 완충액으로 N-메틸모르폴린 하이드로클로라이드(표 2에서 NMM) 및 탄산염 완충액을 사용하였다.
PCR 증폭 생성물을 NMM 완충액(pH 7-10) 및 탄산염 완충액(pH 9.5-10.5) 각각에 용해시켰다. 실시예 1에 기재된 바와 같이 고정화를 수행하였다. 형광 세기에 기초하여 고정화율을 측정하였다. 결과를 표 2에 나타낸다.
표 2
DNA용 용매 고정화율(%)
완충액 pH
50mM NMM 완충액 7.07.58.08.59.09.59.9 41.246.541.043.258.647.027.9
50mM 탄산염 완충액 9.510.010.5 30.225.820.8
표 2에 나타낸 바와 같이, pH(7.0 내지 9.9)의 넓은 범위를 갖는 NMM 완충액에 대하여 높은 고정화율을 얻었다. 탄산염 완충액에 대하여, 고정화율이 pH(9.5 내지 10.5)의 넓은 범위에서 안정적임을 확인하였다.
(2)모르폴린 완충액 및 탄산염 완충액의 완충액 염 농도의 PCR 증폭 생성물의 고정화에 대한 효과
시험을 위해 상기 (1)에 기재된 바와 같은 NMM 완충액(pH 9.5) 및 탄산염 완충액(pH 9.5)을 사용하였다. 시험되는 각 완충액의 염의 농도를 표 3에 나타내었다. 고정화 및 고정화율 측정은 상기 (1)에 기재된 바와 같다. 결과를 표 3에 나타낸다.
표 3
DNA용 용매 고정화율(%)
완충액 농도(mM)
NMM 완충액(pH 9.5) 1050100200500 73.964.867.758.949.8
탄산염 완충액(pH 9.5) 1050100200 41.637.828.444.7
표 3에 나타낸 바와 같이, 넓은 범위의 염 농도(10mM 내지 500mM)를 갖는NMM 완충액에 대하여 높은 고정화율을 얻었다. 또한, 넓은 범위의 염 농도(10mM 내지 200mM)를 갖는 탄산염 완충액에 대하여 높은 고정화율을 얻었다.
실시예 3
지지체 표면 처리의 PCR 증폭 생성물 고정화에 대한 효과
PCR 증폭 생성물을 농도 1μM에 50mM의 N-메틸모르폴린 하이드로클로라이드 (NMM) 완충액(pH 8.0 또는 9.0) 또는 50mM 탄산염 완충액(pH 9.5 또는 10.5)중 하나에 용해시켰다. 생성된 용액의 각 0.2㎕을 표 4에 나타낸 바와 같이 다양하게 표면 처리된 슬라이드 글라스, 즉, 아미노알킬실란로 처리된 슬리이드 글라스(Sigma), 폴리리신으로 처리된 슬리이드 글라스(Sigma) 및 아미노알킬실란 및 글루타르알데히드로 처리된 슬리이드 글라스상에 점적하였다. 아미노알킬실란으로 처리된 슬리이드 글라스를 2.5% 글루타르알데히드 수용액에 1시간동안 적시고, 증류수로 3회 세척하고 공기 건조시켜 아미노알킬실란 및 글루타르알데히드로 처리된 슬리이드 글라스를 제조하였다.
반대로, 대조군으로서 처리하지 않은 슬라이드 글라스를 사용하여 유사하게 고정화를 수행하였다.
고정화율을 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과를 표 4에 나타낸다.
표 4
지지체의 표면 처리 DNA용 용매 고정화율(%)
비처리 50mM NMM 완충액 (pH 8.0)(pH 9.0) 30.720.4
50mM 탄산염 완충액(pH 9.5)(pH10.5) 5.12.3
아미노알킬실란 50mM NMM 완충액(pH 8.0)(pH 9.0) 41.058.6
50mM 탄산염 완충액(pH 9.5)(pH10.5) 30.220.8
아미노알킬실란 및 글루타르알데히드 50mM NMM 완충액(pH 8.0)(pH 9.0) 48.552.7
50mM 탄산염 완충액(pH 9.5)(pH10.5) 16.716.7
폴리리신 50mM NMM 완충액(pH 8.0)(pH 9.0) 45.277.1
50mM 탄산염 완충액(pH 9.5)(pH10.5) 27.231.0
표 4에 나타낸 바와 같이, 아미노알킬실란 또는 폴리리신으로 처리된 슬라이드 글라스에 대하여 얻은 고정화율이 처리하지 않은 슬라이드 글라스에 대하여 얻은 고정화율과 비교하여 증가되었음이 확인되었다. 또한, 아미노알킬실란 및 글루타르알데히드로 처리된 슬라이드 글라스에 대하여 얻은 고정화율이 처리하지 않은 슬라이드 글라스에 대하여 얻은 고정화율과 비교하여 증가되었음을 확인하였다.
실시예 4
올리고뉴클레오타이드의 고정화
실시예 1에서 사용된 SEQ ID NO:1의 프라이머의 것과 동일한 염기 서열을 갖고 ROX가 5'-말단에 결합되어 있는 길이 20 염기의 올리고뉴클레오타이드(이하 ROX 올리고로 언급함), 및 6개의 알킬렌 쇄를 갖는 알킬아미노 링커(PE Biosystems) 및 ROX가 각각 5'-말단 및 3'-말단에 결합되어 있는 올리고뉴클레오타이드(이하, ROX 아미노 올리고로 언급함)를 DNA 합성기를 사용하여 합성하였다. 이들 합성된 DNAs를 10μM의 농도에 50mM N-메틸모르폴린 하이드로클로라이드(NMM) 완충액 (pH 9.5)또는 50mM 탄산염 완충액(pH 9.5)중에 용해시키고 실시예 3에 기재된 바와 같이 다양하게 표면 처리된 슬라이드 글라스상에 고정화 시험을 위해 사용하였다.
반대로, 대조군으로 TE중에 용해된 DNA에 대하여 고정화를 조사하였다.
아미노알킬실란(AAS)로 처리된 슬라이드 글라스 및 아미노알킬실란 및 글루타르알데히드로 처리된 슬라이드 글라스를 사용하였다.
이 실시예에서, DNAs를 고정화시킨 후, 세척한 슬라이드 글라스를 추가로 5분동안 PBS-0.25% 수소화붕소 나트륨을 포함하는 100% 에탄올의 3:1의 혼합물(Wako Pure Chemical Industries)에 적신 후, 상기 기재된 바와 같이 세척하고 건조하여 지지체상의 알데히드 그룹과 DNA중의 아미노 그룹사이의 공유 결합의 결과로 형성된 쉬프 염기를 안정 아민으로 환원시켰다.
고정화율을 실시예 3에 기재된 바와 같이 측정하였다. 결과를 표 5에 나타낸다.
표 5
DNA용 용매 DNA 유형 지지체의 표면 처리 고정화율(%)
TE ROX 올리고 AASAAS + GA 0.71.4
ROX 아미노 올리고 AASAAS + GA 0.91.6
NMM완충액 ROX 올리고 AASAAS + GA 5.813.2
ROX 아미노 올리고 AASAAS + GA 19.165.6
탄산염 완충액 ROX 올리고 AASAAS + GA 4.47.7
ROX 아미노 올리고 AASAAS + GA 16.625.7
AAS;아미로알킬실란 GA: 글루타르알데히드.
표 5에 나타낸 바와 같이, NNM 완충액 또는 탄산염 완충액의 사용이 ROX 아미노 올리고 및 아미노알킬실린 및 글루타르알데히드로 처리된 슬라이드 글라스의 결합에 대한 고정화율을 증가시킴을 확인하였다. 반대로, TE를 사용한 대조군에 대한 고정화율은 고정화되는 올리고뉴클레오타이드의 유형 또는 지지체의 표면 처리와는 관계없이 낮았다.
실시예 5
혼성화에 의한 표적 핵산 검출
혼성화에 의한 표적 핵산 검출을 조사하였다.
(1)DNA의 고정화
실시예 1에서 사용한 인간 트랜스페린 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA(4738bp)를 주형으로 사용하여, 0.1kb, 0.2kb, 0.5kb, 1.0kb 및 1.5kb의 DNA 단편을 각각 SEQ ID NOS: 1 및 3, 1 및 4, 1 및 5, 1 및 2 또는 1 및 6의 염기 서열을 갖는 프라이머쌍을 사용하여 PCR-증폭시켰다. 각 PCR 증폭 생성물을 1μM 농도에 50mM N-메틸모르폴린-하이드록클로라이드 완충액(pH 9.5)에 용해시켰다. 대조군으로, 3 x SSC 또는 TE를 사용하여 유사한 방법으로 DNA 용액을 제조하였다. 생성된 DNA 용액 각 0.2㎕를 아미노알킬실란으로 처리된 슬라이드 글라스상에 점적하였다. DNAs를 고정화시키기 위해 실시예 1에 기대된 바와 같이 슬라이드 글라스를 고정화시켰다.
(2)표적 핵산과의 혼성화
SEQ ID NO: 1의 염기 서열을 갖고 5'-말단에 ROX로 레이블링된 올리고뉴클레오타이드를 화학적으로 합성하였다. 올리고뉴클레오타이드을 1μM의 농도에 0.2%SDS 를 포함하는 4 x SSC중에 용해시켰다. 생성된 용액을 표적 핵산 용액으로 사용하였다. 용액을 2분동안 95℃에서 가열한 후 신속하게 냉각시켰다. 3 내지 5㎕의 용액을 상기 (1)에서 DNAs가 고정화된 슬라이드 글라스상에 점적하였다. 슬라이드 글라스를 커버 글라스로 덮어 공기 거품을 포함하지 않도록 하였다. 가장자리를 단단히 밀봉하고 슬라이드 글라스를 2 내지 6시간동안 37 내지 40℃에서 인큐베이션하였다. 밀봉을 제거한 후, 슬라이드 글라스를 30분동안 0.1 SDS를 포함하는 0.2 x SSC중에서 세척하였다.
(3)표적 핵산 검출
이미지를 판독하고 형광 세기를 측정하기 위해 슬라이드 글라스를 FMBIO II Multi-View내에 세팅하였다. 결과를 표 6에 나타낸다.
표 6
고정화된 DNA 표적 핵산에 대한 형광 세기(피그 면적)
용매 길이(kb)
3 x SSC 0.10.20.51.01.5 2057354357
TE 0.10.20.51.01.5 2315142319
NMM 완충액 0.10.20.51.01.5 3499977981
표 6에 나타낸 바와 같이, NMM 완충액중에 점적된 DNA에 대한 혼성화 후의 형광 세기가 SSC 또는 TE를 사용하여 얻은 것과 비교하여 현저하게 증가되었음을확인하였다.
실시예 6
계면 활성제 첨가의 점적에 대한 효과
첨가되는 계면 활성제의 점적되는 DNA 용액의 양 및 도트의 형태에 대한 효과를 연구하기 위해 다양한 계면 활성제(양이온성, 음이온성 및 비이온성)를 함유하는 DNA 용액을 점적하여 마이그로어레이를 제조하였다.
간단하게, 형광 물질을 포함하는 DNA 용액을 최종 농도 0.15mg/㎕의 연어 정자 DNA(Funakoshi), 0.1μM의 Cy5-dUTP(Amersham Pharmacia), 200mM의 수산화나트륨, 300mM의 소듐 아세테이트 및 0.1%의 표 7에 나타낸 다양한 계면 활성제 중 하나를 혼합하여 제조하였다. 또한, 계면 활성제를 제외한 상기 기재된 것과 동일한 조성물을 갖는 형광 물질을 포함한 DNA 용액을 대조군으로서 제조하였다. 각 DNA 용액에 대해, 직경 130μM의 팁을 갖는 핀이 장치된 GMS 417 어레이어(Genetic MicroSystems)를 사용하여 40개의 도트를 MAS-코팅된 슬라이드 글라스(Matsunami Glass, 이하 MAS로 언급함), 아미노프로필트리에톡시실란 (APS)--코팅된 슬라이드 글라스(Matsunami Glass, 이하 APS로 언급함) 또는 폴리-L-리신 (PLL)-코팅된 슬라이드 글라스(Matsunami Glass, 이하 PLL로 언급함)상에 점적하였다. 도트의 형태를 평가하기 위해 점적 후 즉시 공촛점 레이져 형광 현미경(confocla laser fluorescience microscope) GMS 418 어레이 스캐너(Genetic MicroSystems)을 사용하여 슬라이드 글라스를 판독하였다. 상기 기재된 바와 같이 판독된 이미지에 기초하여 이미지 분석 소프트웨어 Imagene(BioDiscovery)를 사용하여 도트에 대한 형광세기를 측정하였다. 40개 도트에 대하여 측정된 형광 세기의 평균을 계산하였다. 계산된 값을 표 7에 나타내었다. 각 점적의 전형적인 형태은 도 1에 나타내었다. Cy5-dUTP를 첨가하지 않은 것을 제외하고 상기 기재된 바와 같이 제조된 DNA 용액을 점적하고 GMS 418 어레이 스캐너를 사용하여 동일한 검출 감도로 시그날을 판독한 경우 도트에 대하여 어느 형광도 검출되지 않았다.
표 7
계면 활성제 형광 세기
MAS APS PLL
계면 활성제 비처리세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB)데옥시콜산벤즈알코늄 클로라이드사코실소듐 도데실 설페이트(SDS)노니데트 P-40트리톤 X-100트윈-20 1098032281874516441531622602159141315111187 91522611177562653175922130512383104276579 656218471703022061726215395154011432710260
표 7에 나타낸 바와 같이, 각각의 표면 처리된 슬라이드 글라스에 대한 도트의 형광 세기(즉, 점적된 DNA 용액의 양)은 대조군으로서 계면 활성제가 첨가되지 않았을 때 얻은 세기와 비교하여 특정 계면 활성제가 첨가된 경우에만 증가하였다. 예를 들면, 양은 데옥시콜산, 사코실(Sarkosyl), SDS, 노니데트 P-40(Nonidet P-40) 또는 트리톤 X-100(Triton X-100)을 가한 경우 양은 증가하였고, 반면에 CTAB 또는 벤즈알코늄 클로라이드를 사용한 경우에는 양은 증가하지 않았다. 트윈-20을 사용한 경우 APS 슬라이드 글라스에 대한 양은 증가하지 않았다. 도 1에 나타난 바와 같이, 점적된 도트에 대한 점적 크기가 증가되었음을 관찰하였고, 이는 시그날 검출에 대한 유효 피셀 수의 증가를 암시한다. 일부의 계면 활성제 또는 슬라이드글라스에 대하여 점적내의 이종(heterogenetiry)의 시그날 세기가 관찰되었다.
더 많은 유형의 계면 활성제를 추가로 조사하였다. 특이적으로, 점적된 DNA 용액의 양 및 도트의 형태를 표 8에 나타낸 비이온성 계면 활성제를 주로 사용하여 상기 기재된 바와 같이 연구하였다. 결과를 표 8 및 도 2에 요약하였다. 이들 계면 활성제를 사용하면서 Cy5-dUTP를 첨가하지 않은 경우, 뚜렷한 점적 또한 검출되지 않았다.
표 8
계면 활성제 형광 세기
MAS APS PLL
계면 활성제 비처리CHAPSCHAPSOBIGCHAP데옥시-BIGCHAPn-옥틸-β-D-글루코사이드n-헵틸-β-D-티오글루코사이드n-옥틸-β-D-티오글루코사이드n-도데실-β-D-말토사이드MEGA-8MEGA-9MEGA-10수크로오스 모노카프레이트수크로오즈 모노라우레이트소듐 콜레이트디기토닌 18118240122654021554311941686528069452453191312441143472252434637342993174856038 7932126691458611082191288909141201996120254342444911402225135236251726057063 3417147361701412491195397086140582129816669541665241168121985172331855051221
표 8에 나타낸 바와 같이, 슬라이드 글라스의 유형과는 관계없이 점적된 DNA 용액의 양은 계면 활성제를 첨가하지 않은 대조군과 비교할 때, 계면 활성제가 첨가된, 형광 물질을 포함하는 DNA 용액을 점적한 거의 모든 경우에 증가하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 점적에 대한 점적 크기가 증가되었음을 관찰하였고, 점적된 DNA 용액의 양의 증가되었음을 관찰하였고, 이는 시그날 검출에 대한 유효 피셀 수의 증가를 암시한다. 이들 계면 활성제중 하나가 첨가되는 경우 거의 모든 슬라이드 글라스에 대하여 점적내의 이종(heterogenetiry)의 시그날 세기가 감소하엿음을 관찰되었다. 이들 결과는 그러한 계면 활성제를 DNA 용액에 가하여 지지체 상에 포함된 DNA 용액의 양은 증가되고, 포함된 DANs로부터 유래된 시그날의 정량화에 유효한 동질의 도트가 형성된다는 것을 증명한다.
실시예 7
계면 활성제 첨가의 PCR 증폭 생성물의 고정화 및 표적 핵산 검출 감도에 대한 효과
실시예 6에서 도트의 형태 및 점적된 DNA 용액의 양의 개선에 현저한 효과를 나타낸 일부의 계면 활성제의 핵산 고정화 및 고정화된 핵산과의 혼성화에 의한 표적 핵산 검출 감도에 대한 효과를 조사하였다.
(1)형광-레이블링된 DNA 단편의 제조
주형으로 실시예 1에서 사용된 인간 트랜스페린 유전자를 포함하는 플라스미드 DNA(4738bp) 및 SEQ ID NOS :1 및 4의 염기 서열을 갖는 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 0.2kb DNA 단편을 증폭시켰다. PCR을 위해 사용되는 두개의 프라이머 중 하나인 SEQ ID NO :1의 프라이머를 5'-말단에 Cy3으로 형광-레이블링한 후 사용하였다. PCR 증폭 생성물을 이소프로판올 침전에 의해 정제한 후 동결건조시켰다.
(2)DNA 용액 제조
표 9에 나타낸 바와 같은 다양한 계면 활성제 중 하나를 포함하는 각 DNA 용액이 하기 조성물을 포함하도록 제조하였다. 특이적으로, 상기 기재된 바와 같이 제조된 형광 레이블링된 PCR 단편을 농도 0.15μg/㎕에 0.1%의 계면 활성제중 하나, 200mM 수산화나트륨 및 30mM 소듐 아세테이트(pH 5.2)를 포함하는 용액중에 용해시켰다. 생성된 용액을 DNA 용액으로 사용하였다. 대조군으로 계면 활성제가 없는 DNA 용액을 제조하였다.
(3)DNA의 점적 및 고정화
DNA 용액을 실시예 6에 기재된 바와 같이 MAS-, APS- 또는 PLL-코팅된 슬라이드 글라스상에 점적하였다. 점적한 후, 슬라이드 글라스를 습윤된 인큐베이터내에서 1시간동안 37℃에서 인큐베이션시키고, 60mJ/cm2에서 자외선으로 조사시키고, 0.2% SDS 용액중에서 1회 세척한 후 증류수로 2회 세척한 후, 저속으로 원심분리하여 물기를 제거하였다. 이어서 슬라이드 글라스를 20분동안 차단 용액중에 적셔 유리 아미노 그룹을 차단하였다. 차단 용액은 2.75g의 숙신 산무수물을 160㎖의 N-메틸-2-피롤리돈중에 용해시키고 추가로 15㎖의 1M 붕산염 완충액(pH 8.0)을 그에 가하여 사용 직전에 제조하였다. 최종적으로, 슬라이드 글라스를 증류수로 2회 세척하고, 원심 분리하여 물질를 제거하고 건조기에 저장하였다.
(4)표적 핵산의 제조
인간 트랜스페린 유전자에 대한 1kb-단편을 실시예 1에 기재된 바와 같이 증폭시키고 이소프로판올 침전에 의해 정제하였다. 키트에 첨부된 지시사항에 따라 레이블 IT Cy5 레이블링 키트(Mirus)를 사용하여 DNA 단편을 Cy5로 형광 레이블링한 후 정제하였다.
(5)표적 핵산과의 혼성화
키트에 첨부된 지시사항에 따라 레이블 IT Cy5 레이블링 키트에 첨가되어 있는 변성 용액 및 중성 용액을 사용하여 상기 언급된 Cy5 레이블링된 DNA 단편을 변성화하고 중성화하였다. 약 10㎕의 생성된 용액을 상기 (3)에서 제조된 각 슬라이드 글라스상에 DNA가 고정화되어 있는 부분상에 점적하였다. 점적을 커버 글라스로 덮어 공기 거품을 포함하지 않도록 하였다. 각 커버 글라스를 종이 본드(Kokuyo)로 봉하고 슬라이드 글라스를 습윤된 인큐베이터에서 12시간동안 65℃에서 인큐베이션시켰다. 종이 본드 및 커버 글라스를 제거한 후, 슬라이드 글라스를 5분동안 60℃에서 2x SSC중에, 5분동안 60℃에서 0.1% SDS를 포함하는 0.2 x SSC중에 세척하였다. 이어서 슬라이드 글라스를 실온에서 0.2xSSC중에서 세척하고 건조하였다.
(6)형광 세기의 정량화 및 고정화율의 산출
점적의의 형광 이미지의 검출 및 형광 세기의 정량화를 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하였다. Cy3에 대한 파장에서 검출된 형광 및 Cy5에 대한 파장에서 검출된 형광을 각각 고정화된 DNA 및 고정화된 DNA와 혼성화된 표적 핵산로부터 유래된 것으로서 분석하였다. 고정화율을 실시예 1에 기재된 바왁 같이 측정하였다. 혈과를 표 9 및 10에 나타내었다. 표 9는 슬라이드 글라스상에서 고정화된 DNA와 혼성화되는 표적 핵산의 양을 나타내는 Cy5에 대한 파장에서 검출된 형광을 나타낸다. 표 10은 Cy3에 대한 파장에서 검출된 형광에 기초하여 계산된 슬라이드 글라스상의 DNA의 고정화율을 나타낸다.
표 9
계면 활성제 표적 핵산에 대한 형광 세기
MAS APS PLL
계면 활성제 비처리데옥시-BIGCHAPn-도데실-β-D-말토사이드수크로오즈 모노라우레이트디기토닌SDS사코실데옥시콜산트윈-20수크로오즈 모노카프레이트 91156250724213577900816027112986391934310666 174827691250817898114312135517612364733375935 193970281696216433135481074615993691953708655
표 10
계면 활성제 고정화율(%)
MAS APS PLL
계면 활성제 비처리데옥시-BIGCHAPn-도데실-β-D-말토사이드수크로오즈 모노라우레이트디기토닌SDS사코실데옥시콜산트윈-20수크로오즈 모노카프레이트 53.149.043.853.047.155.954.148.848.351.1 42.911.745.853.742.759.253.923.355.746.7 46.987.764.665.764.970.364.790.175.465.6
표 9로부터 알 수 있는 바와 같이, APS 및 PLL 슬라이드 글라스를 사용하여, 시험된 모든 계면 활성제에 대한 표적 핵산과의 혼성화에 기인한 형광 세기의 현저한 증가 효과가 관찰되었다. MAS로 처리된 슬라이드 글라스를 사용하여, 수크로오스 모노라우레이트, 수크로오스 모노카프레이트, SDS 또는 사르코실이 첨가된 DNA 용액을 점적한 경우, 유사한 효과가 관찰되었다.
또한, 표 10으로부터 알 수 있는 바와 같이, 계면 활성제에 기인한 고정화율 변화는 어느 것도 첨가되지 않은 대조군과 비교할 때, 데옥시-BIGCHAP 및 데옥시콜산이외의 계면 활성제에 대하여 관찰되지 않았다.
실시예 6 및 실시예 7에서 얻은 발견에 기초하여, 도트의 형태, 점적된 DNA용액의 양 및 표적 핵산의 감도를 매우 효과적으로 개선시키기 위해, 슬라이드 글라스의 표면 처리 유형과는 관계없이 비이온성 계면 활성제, 예를 들면, 특히, 수크로오스 모노라우레이트, 수크로오스 모노카프레이트 및 디기토닌을 바람직하게 사용할 수 있다는 것이 증명되었다.
실시예 8
계면 활성제 농도의 도트의 형태 및 점적되는 양에 대한 효과
DNA 용액중 두개의 비이온성 계면 활성제 농도의 그들의 효과에 대한 효과를 조사하였다. 두개의 비이온성 계면 활성제, 즉, 수크로오스 모노라우레이트 및 디기토닌이 실시예 6 및 7에서 점적된 DNA 용액의 양 및 도트의 형태를 개선하기 위해 바람직하게 사용된다고 판단되었다. 간단히, 다양한 농도의 계면 활성제 중 하나를 각각 포함하는 점적용 DNA 용액을 제조하고 실시예 7에 기재된 바와 같이 MAS-, APS- 또는 PLL-코팅된 슬라이드 글라스상에 점적하였다. 점적 후 즉시 각 도트에 대하여 형광 세기 및 형태를 평가하였다. 시험된 각 계면 활성제의 농도는 표 11에 나타내었다. 40개의 점적에 대해 측정된 형광 세기의 평균을 계산하였다. 계산된 값을 표 11에 나타낸다.
표 11
DNA 용액 형광 세기
계면 활성제 농도(%) MAS APS PLL
계면 활성제 비처리 0.000 8750 7437 5016
수크로오스 모노라우레이트 0.1000.0500.0250.0130.001 1502115668134431168810846 1905319474147421338010817 165131751612777102496580
디기토닌 0.1000.0500.0250.0130.001 10729104281040186838624 122431139911554101648737 120269858948582275504
표 11에 나타낸 바와 같이, 수크로오스 모노라우레이트를 농도 0.001% 내지 0.1% 범위로 첨가한 경우, 각 슬라이드 글라스에 대하여 점적된 DNA 용액 양의 증가 효과가 관찰되었다. 디기토닌을 0.025% 내지 0.1%(MAS), 0.001% 내지 0.1%(APS) 또는 0.013% 내지 0.1%(PLL) 범위로 첨가한 경우, 상기 효과가 관찰되었다. 점적되는 DNA 용액의 양이 증가함에 따라 도트의 형태는 개선되는 경향을 가졌다.
슬라이드 글라스를 실시예 7에 기재된 바와 같이 고정화, 표적 핵산과의 혼성화 및 시그날 검출하였다. 결과, 혼성화 후 각 도트내 고정화된 DNA양은 계면 활성제의 농도에 영향을 받지않고 일정하였다. 혼성화 시그날의 형태는 점적 후 즉시 관찰된 것과 유사한 경향을 가졌다.
산업상이용가능성
상기 기재된 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라 통상의 방법으로 얻은 양과 비교할 때 다량의 DNA를 고체 지지체 상에 고정화시킬 수 있다. 지지체로의 고정화율 또는 고정화되는 DNA의 밀도가 본 발명의 방법에 따라 증가될 수 있다. 또한, 표적 핵산을 검출하기 위한 방법에서 검출 감도는 본 발명의 고정화 방법에 따라제조된 DNA가 그 위에 고정화된 물질을 사용하여 증가될 수 있다.
서열 목록 프리 텍스트
SEQ ID NO: 1: 트랜스페린 수용체 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드
SEQ ID NO: 1: 트랜스페린 수용체 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드
SEQ ID NO: 2: 트랜스페린 수용체 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드
SEQ ID NO: 3: 트랜스페린 수용체 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드
SEQ ID NO: 4: 트랜스페린 수용체 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드
SEQ ID NO: 5: 트랜스페린 수용체 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드
SEQ ID NO: 6: 트랜스페린 수용체 유전자의 일부를 증폭시키기 위한 작제된 올리고뉴클레오타이드

Claims (37)

  1. 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 포함하는 완충액중에서 DNA를 지지체와 접촉시키는 것을 포함하는, DNA를 지지체상에 고정화시키는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 모르폴린 유도체가 C1-3알킬 그룹으로 치환된 N-알킬모르폴린인 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 모르폴린 또는 모르폴린 유도체의 염이 광산(mineral acid)과의 염, 유기산과의 염 및 지방산과의 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 염인 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 탄산염이 나트륨염 , 칼륨염, 마그네슘염, 암모늄염 및 트리에틸아민염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 염인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 완충액이 모르폴린, 모르폴린 유도체 및 그의 염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 적어도 하나의 탄산염과 함께 포함하는 방법.
  6. 제 1항 내지 제 5항중 어느 한 항에 있어서, 완충액의 pH가 7 내지 11인 방법.
  7. 제 1항 내지 제 6항중 어느 한 항에 있어서, 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질의 완충액중의 농도가 10 내지 500 mM인 방법.
  8. 제 1항 내지 제 7항중 어느 한 항에 있어서, DNA가 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 유도체인 방법.
  9. 제 1항 내지 제 8항중 어느 한 항에 있어서, 완충액중의 DNA의 농도가 0.1 내지 2.0mg/㎖인 방법.
  10. 제 1항 내지 제 9항중 어느 한 항에 있어서, 완충액이 추가로 적어도 하나의 염을 포함하는 방법.
  11. 제 1항 내지 제 10항중 어느 한 항에 있어서, 완충액이 추가로 적어도 하나의 계면 활성제를 포함하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 11항중 어느 한 항에 있어서, 지지체가 글라스 또는 석영으로부터 제조되거나, 글라스 또는 석영의 표면을 처리하여 제조된 물질인 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 표면을 실란 커플링제 또는 다원 양이온(polycation)으로 처리하는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 13항중 어느 한 항에 있어서, DNA를 변성화하지 않고 고정화시키는 방법.
  15. 제 14항에 있어서, DNA가 더블 스트랜드 DNA인 방법.
  16. 적어도 하나의 계면 활성제를 포함하는 완충액중에서 DNA를 지지체와 접촉시키는 것을 포함하는, DNA를 지지체상에 고정화시키는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 계면 활성제가 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제 및 양쪽성 계면 활성제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 계면 활성제가 수크로오스 모노카프레이트, 수크로오스 모노라우레이트 및 디기토닌(digitonin)으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  19. 제 16항 내지 제 18항중 어느 한 항에 있어서, 완충액이 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 포함하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 완충액의 pH가 7 내지 11인 방법.
  21. 제 19항 또는 제 20항에 있어서, 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질의 완충액중의 농도가 10 내지 500 mM인 방법.
  22. 제 16항 내지 제 21항중 어느 한 항에 있어서, DNA가 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 그의 유도체인 방법.
  23. 제 16항 내지 22항중 어느 한 항에 있어서, 완충액중의 DNA의 농도가 0.1 내지 2.0mg/㎖인 방법.
  24. 제 16항 내지 제 23항중 어느 한 항에 있어서, 완충액이 추가로 적어도 하나의 염을 포함하는 방법.
  25. 제 16항 내지 제 24항중 어느 한 항에 있어서, 지지체가 글라스 또는 석영으로부터 제조되거나, 글라스 또는 석영의 표면을 처리하여 제조된 물질인 방법.
  26. 제 25항에 있어서, 표면을 실란 커플링제 또는 다원 양이온으로 처리한 방법.
  27. 제 16항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, DNA를 변성화하지 않고 고정화시키는 방법.
  28. 제 27항에 있어서, DNA가 더블 스트랜드 DNA인 방법.
  29. 제 1항 내지 제 28항중 어느 하나에 정의된 방법에 따라 제조되는, DNA가 그 위에 고정화된 물질.
  30. 제 29항에 있어서, DNA가 더블 스트랜드 DNA인 물질.
  31. 제 29항 또는 제 30항에 정의된, DNA가 그 위에 고정화된 물질을 사용하여 표적 핵산을 검출하는 것을 포함하는 표적 핵산의 검출 방법.
  32. 제 31항에 있어서, DNA가 그 위에 고정화된 물질을 엄격한 조건(stringent conditions)하에서 표적 핵산과 혼성화시키는 것을 포함하는 방법.
  33. 제 32항에 있어서, 고정화된 DNA를 변성시키지 않고 물질상에 고정화된 DNA를 엄격한 조건하에서 표적 핵산과 혼성화시키는 방법.
  34. 고정화된 DNA를 변성시키지 않고 엄격한 조건하에서 표적 핵산과 혼성화하는데 사용될 수 있는, 더블 스트랜드 DNA 가 지지체상에 고정화되어 있는 물질.
  35. 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질을 포함하는, DNA를 고정화시키기 위한 완충액.
  36. 적어도 하나의 계면 활성제를 포함하는, DNA를 고정화시키기 위한 완충액.
  37. 모르폴린, 모르폴린 유도체, 그의 염 및 탄산염으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 물질 및 적어도 하나의 계면 활성제를 포함하는, DNA를 고정화시키기 위한 완충액.
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