CN104142262B - 一种在载玻片表面固定dna碱基的方法 - Google Patents
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Abstract
一种在载玻片表面固定DNA碱基的方法，适用于在载玻片表面固定DNA碱基。将载玻片截成小片，清洗，浸泡在95％HCL和99.7％无水乙醇混合溶液中，酸处理后洗净；然后将载玻片浸入到APTES无水乙醇溶液中，制备成硅烷化载玻片；将硅烷化载玻片浸入到戊二醛水溶液中，反应、冲洗，晾干备用；制备缓冲溶液，在缓冲溶液中加入助溶剂和表面活性剂制备成表面活性剂溶液，加入DNA碱基充分搅拌至完全溶解，制成DNA溶液；取DNA溶液在载玻片上点样，在恒温箱中温育，清净，完成DNA碱基的固定。通过对载玻片的双重修饰，提高载玻片的润湿性，从而提高DNA碱基的固定率；采用激光共焦拉曼光谱仪对碱基进行表征，可避免因采用荧光等分光法所需的荧光标记和基因的扩增杂交等步骤，大大简化了DNA碱基固定步骤。
Description
技术领域
本发明涉及一种固定DNA碱基的方法，尤其是一种适用于在载玻片表面固定DNA碱基的方法。
背景技术
DNA是由腺嘌呤(A，Adenine)、鸟嘌呤(G，Guanine)胞嘧啶(C，Cytosine)、胸腺嘧啶(T，Thymine)四种碱基组成的螺旋结构，其中嘌呤碱基是双环结构，嘧啶碱基是单环结构，在DNA分子结构中，由于碱基之间的氢键具有固定的数目和DNA两条链之间的距离保持不变，使得碱基配对必须遵循一定的规律，即A＝T，G≡C。碱基间的这种一一对应的关系叫做碱基互补配对原则。
基于纳米孔的第三代基因测序仪或者相关的关键技术对于保护我国自己的基因资源具有战略意义。要实现基因测序技术，就必须明晰这四种碱基与生物纳米孔壁相互作用的机理。这一研究的前提是DNA碱基的有效固定，通常选用结合较为固定的共价交联方法。
目前已经有许多方法通过共价结合或特异性吸附在玻璃、单晶硅、聚丙乙烯等载体上，多种官能团修饰的表面用于固定DNA碱基。但这些方法涉及高温(环氧表面)、制备试剂昂贵(异硫氰酸酯表面)、不稳定(巯基表面)等制约因素。另外，在进行DNA碱基固定率检测中，基本采用荧光成像分析法，这就要求DNA碱基的荧光标记，大大增加了碱基固定的时间。因此，寻找制备方法简便、碱基固定稳定且密度高、成本低的载体官能团修饰方法是目前开展碱基特异性作用研究的重要环节。
发明内容
技术问题：本发明的目的是克服已有技术中的不足，提供一种方法简便、碱基固定稳定且密度高、成本低的在载玻片表面固定DNA碱基的方法。
技术方案：本发明的在载玻片表面固定DNA碱基的方法，包括如下步骤：
a.将载玻片截取成10×10mm的小片，用洗洁精浸泡5min，自来水冲洗1-3次，再用去离子水超声清洗5-10min，去离子水冲洗1-3次；
b.取浓度为30％H2O2、98％H2SO4溶液，按体积比为3:7的比例配制成piranha洗液，待piranha洗液冷却至室温后，将载玻片放入piranha洗液中，加热至90℃保温2h，取出载玻片用蒸馏水洗1-3次；
c.取浓度为95％HCL、99.7％无水乙醇溶液，按体积比为1:1的比例混合均匀，将载玻片浸泡在该溶液中加温至37℃恒温，酸处理1h，取出载玻片用去离子水洗净，完成载玻片的预处理，将其保存在蒸馏水中备用，保存期为一周；
d.将预先处理后的载玻片浸入到配制好的浓度为1～10％的APTES无水乙醇溶液中，室温下反应10-30min，制备成硅烷化载玻片，取出硅烷化载玻片用蒸馏水浸洗1min，晾干备用；
e.将硅烷化载玻片浸入到浓度为10％的戊二醛水溶液中，室温下反应30～60min，取出后在蒸馏水冲洗3～4次，晾干备用；
f.制备缓冲溶液，缓冲溶液为磷酸盐溶液，缓冲溶液的pH为5～11，在缓冲溶液中加入质量分数为1％的助溶剂；
g.选用体积比为1：1的LAS和AEO表面活性剂加入到缓冲溶液中制备成浓度为0.01～2％的表面活性剂溶液，再加入DNA碱基充分搅拌至完全溶解，制成浓度为1.0-10mg/mlDNA溶液；
h.取DNA溶液在载玻片上点样，在温度为36℃的恒温箱中温育10～12h，用浓度为0.2％SDBS溶液清洗2次，再用蒸馏水清洗2-3次，晾干，完成DNA碱基的固定。
所述的助溶剂为苯甲酸钠或水杨酸钠。
有益效果：由于采用了上述技术方案，本发明通过对载玻片进行双重修饰，大大提高了载玻片的润湿性，并进一步提高了DNA碱基的固定率，采用激光共焦拉曼光谱仪对碱基进行表征，可避免因采用荧光或可见光线等的分光法所需的荧光标记基因的扩增和杂交等一系列步骤，大大简化了DNA碱基修饰的步骤。其方法简便、碱基固定稳定且密度高、成本低，在本技术领域内具有广泛的实用性。
具体实施方式
本发明的在载玻片表面固定DNA碱基的方法，具体步骤如下：
a、将载玻片截取成10×10mm的小片，用洗洁精浸泡5min，自来水冲洗1-3次，再用去离子水超声清洗5-10min，去离子水冲洗1-3次；
b、取浓度为30％H2O2、98％H2SO4溶液，按体积比为3:7的比例配制成piranha洗液，待piranha洗液冷却至室温后，将载玻片放入piranha洗液中，加热至90℃保温2h，取出载玻片用蒸馏水洗1-3次；
c、取浓度为95％HCL、99.7％无水乙醇溶液，按体积比为1:1的比例混合均匀，将载玻片浸泡在该溶液中加温至37℃恒温，酸处理1h，取出载玻片用去离子水洗净，完成载玻片的预处理，将其保存在蒸馏水中备用，保存期为一周；
d、将预先处理后的载玻片浸入到配制好的浓度为1～10％的APTES无水乙醇溶液中，室温下反应10-30min，制备成硅烷化载玻片，取出硅烷化载玻片用蒸馏水浸洗1min，晾干备用，一方面对预处理的载玻片进行硅烷化，另一方面降低载玻片的荧光效应；
e、将硅烷化载玻片浸入到配置好的浓度为10％的戊二醛水溶液中，室温下反应30～60min，取出后在蒸馏水冲洗3～4次，晾干备用；
f、制备缓冲溶液，缓冲溶液为磷酸盐溶液，缓冲溶液的pH为5～11，缓冲溶液中加入质量分数为0.1％的助溶剂，以增加DNA碱基的溶解度，所述的助溶剂为苯甲酸钠或水杨酸钠；
g、选用体积比为1：1的LAS和AEO表面活性剂加入到缓冲溶液中制备成浓度为0.01％～2％的表面活性剂溶液，再加入DNA碱基充分搅拌至完全溶解，制成浓度为1.0-10mg/mlDNA的点样液；
h、取DNA点样液在载玻片上点样，在温度为36℃的恒温箱中温育10～12h，用表面活性剂溶液清洗2次，再用蒸馏水清洗2-3次，晾干，完成碱基的固定；
i、采用激光共焦拉曼光谱仪对固定碱基后的载玻片进行检测，分析碱基是否固定成功；
j、采用纳米力学测试系统对载玻片进行无限接近以及横向剪切，根据特异性作用确定碱基的种类。利用激光共焦拉曼光谱仪检测碱基是否成功固定，并采用纳米力学测试系统实现对该碱基固定率及固定强度的检测。
注：1、载玻片必须保持清洁，泡酸后须蒸馏水充分水洗；
2、新鲜配制溶液须经超声处理，使溶液混合均匀并达到除气效果
实施例1、
将载玻片截取成10×10mm的小片，用洗洁精浸泡5min，自来水冲洗1-3次，再用去离子水超声清洗5-10min，去离子水冲洗1-3次；分别取浓度为30％H2O2、98％H2SO4溶液，按体积比为3:7的比例配制成piranha洗液，待piranha洗液冷却至室温后，将载玻片放入piranha洗液中，加热至90℃保温2h，取出载玻片用蒸馏水洗1-3次；取浓度为95％HCL、99.7％无水乙醇溶液，按体积比为1:1的比例混合均匀，将载玻片浸泡在该溶液中加温至37℃恒温，酸处理1h，取出载玻片用去离子水洗净，完成载玻片的预处理，将其保存在蒸馏水中备用；将预先处理后的载玻片浸入到配制好的浓度为1％的APTES无水乙醇溶液中，室温下反应10min，制备成硅烷化载玻片，取出硅烷化载玻片用蒸馏水浸洗1min，晾干备用；将硅烷化载玻片浸入到配置好的浓度为10％的戊二醛水溶液中，室温下反应30min，取出后在蒸馏水冲洗3～4次，晾干备用；配置pH＝5的磷酸盐溶液，并加入质量分数为1％的苯甲酸钠，以增加DNA碱基的溶解度；选用体积比为1：1的LAS和AEO表面活性剂加入到缓冲溶液中制备成浓度为0.02％的表面活性剂溶液，再加入DNA碱基充分搅拌至完全溶解，制成浓度为1mg/mlDNA的点样液；取DNA点样液在载玻片上点样，在温度为36℃的恒温箱中温育12h，用表面活性剂溶液清洗2次，再用蒸馏水清洗2-3次，晾干，完成碱基的固定。
实施例2、
将载玻片截取成10×10mm的小片，用洗洁精浸泡5min，自来水冲洗1-3次，再用去离子水超声清洗5-10min，去离子水冲洗1-3次；分别取浓度为30％H2O2、98％H2SO4溶液，按体积比为3:7的比例配制成piranha洗液，待piranha洗液冷却至室温后，将载玻片放入piranha洗液中，加热至90℃保温2h，取出载玻片用蒸馏水洗1-3次；取浓度为95％HCL、99.7％无水乙醇溶液，按体积比为1:1的比例混合均匀，将载玻片浸泡在该溶液中加温至37℃恒温，酸处理1h，取出载玻片用去离子水洗净，完成载玻片的预处理，将其保存在蒸馏水中备用；将预先处理后的载玻片浸入到配制好的浓度为5％的APTES无水乙醇溶液中，室温下反应20min，制备成硅烷化载玻片，取出硅烷化载玻片用蒸馏水浸洗1min，晾干备用；将硅烷化载玻片浸入到配置好的浓度为10％的戊二醛水溶液中，室温下反应45min，取出后在蒸馏水冲洗3～4次，晾干备用；配置pH＝7的磷酸盐溶液，并加入质量分数为1％的苯甲酸钠，以增加DNA碱基的溶解度；选用体积比为1：1的LAS和AEO表面活性剂加入到缓冲溶液中制备成浓度为0.02％的表面活性剂溶液，再加入DNA碱基充分搅拌至完全溶解，制成浓度为5mg/mlDNA的点样液；取DNA点样液在载玻片上点样，在温度为36℃的恒温箱中温育12h，用表面活性剂溶液清洗2次，再用蒸馏水清洗2-3次，晾干，完成碱基的固定。
实施例3、
将载玻片截取成10×10mm的小片，用洗洁精浸泡5min，自来水冲洗1-3次，再用去离子水超声清洗5-10min，去离子水冲洗1-3次；分别取浓度为30％H2O2、98％H2SO4溶液，按体积比为3:7的比例配制成piranha洗液，待piranha洗液冷却至室温后，将载玻片放入piranha洗液中，加热至90℃保温2h，取出载玻片用蒸馏水洗1-3次；取浓度为95％HCL、99.7％无水乙醇溶液，按体积比为1:1的比例混合均匀，将载玻片浸泡在该溶液中加温至37℃恒温，酸处理1h，取出载玻片用去离子水洗净，完成载玻片的预处理，将其保存在蒸馏水中备用；将预先处理后的载玻片浸入到配制好的浓度为10％的APTES无水乙醇溶液中，室温下反应30min，制备成硅烷化载玻片，取出硅烷化载玻片用蒸馏水浸洗1min，晾干备用；将硅烷化载玻片浸入到配置好的浓度为10％的戊二醛水溶液中，室温下反应60min，取出后在蒸馏水冲洗3～4次，晾干备用；配置pH＝11的磷酸盐溶液，并加入质量分数为1％的苯甲酸钠，以增加DNA碱基的溶解度；选用体积比为1：1的LAS和AEO表面活性剂加入到缓冲溶液中制备成浓度为0.02％的表面活性剂溶液，再加入DNA碱基充分搅拌至完全溶解，制成浓度为10mg/mlDNA的点样液；取DNA点样液在载玻片上点样，在温度为36℃的恒温箱中温育12h，用表面活性剂溶液清洗2次，再用蒸馏水清洗2-3次，晾干，完成碱基的固定。
Claims (1)
1.一种在载玻片表面固定DNA碱基的方法，其特征在于，包括如下步骤：
a．将载玻片截取成10×10 mm的小片，用洗洁精浸泡5 min，自来水冲洗1-3次，再用去离子水超声清洗5 -10 min，去离子水冲洗1-3次；
b．取浓度为30%H2O2、98%H2SO4溶液，按体积比为3:7的比例配制成piranha洗液，待piranha洗液冷却至室温后，将载玻片放入piranha洗液中，加热至90℃保温2 h，取出载玻片用蒸馏水洗1-3次；
c．取浓度为95%HCL、99.7%无水乙醇溶液，按体积比为1:1的比例混合均匀，将载玻片浸泡在该溶液中加温至37℃恒温，酸处理1h，取出载玻片用去离子水洗净，完成载玻片的预处理，将其保存在蒸馏水中备用，保存期为一周；
d．将预先处理后的载玻片浸入到配制好的浓度为1~10%的APTES无水乙醇溶液中，室温下反应10-30min，制备成硅烷化载玻片，取出硅烷化载玻片用蒸馏水浸洗1 min，晾干备用；
e．将硅烷化载玻片浸入到浓度为10%的戊二醛水溶液中，室温下反应30~60 min，取出后在蒸馏水冲洗3~4次，晾干备用；
f．制备缓冲溶液，缓冲溶液为磷酸盐溶液，缓冲溶液的pH为5~11，在缓冲溶液中加入质量分数为1%的苯甲酸钠；
g．选用体积比为1：1的LAS和AEO表面活性剂加入到缓冲溶液中制备成浓度为0.01~2%的表面活性剂溶液，再加入DNA碱基充分搅拌至完全溶解，制成浓度为1.0-10mg/mlDNA溶液；
h．取DNA溶液在载玻片上点样，在温度为36℃的恒温箱中温育10~12 h，用浓度为0.2%SDBS溶液清洗2次，再用蒸馏水清洗2-3次，晾干，完成DNA碱基的固定。
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